喜树碱衍生物脂肪乳剂及其制备方法.pdf

一种可工业化制备的喜树碱衍生物脂肪乳剂，包括注射用油、乳化剂、增溶剂聚乙二醇或聚维酮或羟丙基β－环糊精，增加了喜树碱衍生物在脂肪乳油相中溶解度，其包封于脂肪乳油相中，稳定性好，药效增强，如10－羟基喜树碱脂肪乳剂抑瘤率约是其普通注射液的5倍，药物在血液中的驻留时间延长，且毒副作用显著下降。

1、  一种脂肪乳剂，包括喜树碱衍生物、注射用油、乳化剂、增溶剂。

2、  权利要求1的脂肪乳剂，所述喜树碱衍生物选自10-羟基喜树碱、拓扑替肯、伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱、9-氨基-20(S)喜树碱、9-硝基-20(S)喜树碱、10，11-亚甲基二氧基喜树碱、10，11-亚乙基二氧基喜树碱、7-乙基喜树碱、9-氯-10，11-亚甲基二氧基喜树碱、9，10-二氯代喜树碱、7-三甲基硅乙基-10-羟基喜树碱、7-叔丁基甲月亏-喜树碱、7-(4-甲基-1-哌嗪甲基)-10，11-亚乙基二氧基喜树碱以及高喜树碱类衍生物中的一种或几种混合物；注射用油选自大豆油、蓖麻油、茶油、麻油、红花油、棉子油、中长链脂肪酸酯、橄榄油中的一种或几种混合物；乳化剂选自磷脂、普罗流尼中的一种或二种以上混合物；增溶剂选自聚乙二醇、聚维酮和/或羟丙基β-环糊精；还包括抗氧剂。

3、  权利要求2的脂肪乳剂，按重量计，含有喜树碱衍生物0.001％-0.05％、注射用油5-20％、乳化剂2-9％、增溶剂选自聚乙二醇5-20％、聚维酮1-6％或羟丙基β-环糊精1-6％；抗氧剂选用维生素E；高喜树碱类衍生物为BN-80915。

4、  权利要求3的脂肪乳剂，按重量计，含有喜树碱衍生物0.002％-0.04％、注射用油6-18％、磷脂1-5％，普罗流尼1-4％、增溶剂选自聚乙二醇6-18％或羟丙基β-环糊精2-5％，抗氧剂0.01-0.03％；注射用水添至100％。

5、  权利要求4的脂肪乳剂，按重量计，含有喜树碱衍生物0.003％-0.03％、注射用油8-16％、磷脂2-4％，普罗流尼2-3％、增溶剂选自羟丙基β-环糊精2-5％或聚维酮2-5％。

6、  权利要求5的脂肪乳剂，其中磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和/或合成磷脂。

7、  权利要求6的脂肪乳剂，还包括等渗调节剂，注射用水添至100％。

8、  权利要求1-7脂肪乳剂的制备方法，包括如下步骤：
取注射用油、喜树碱衍生物于50-200℃混合，温度至50-80℃时，加入磷脂，混合形成混合液(1)；
将注射用水、乳化剂、等渗调节剂与增溶剂混合，形成水相(2)；
将水相(2)与混合液(1)混合，制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8后，再进行匀化；制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。

9、  权利要求8的脂肪乳剂的制备方法，其特征在于：取注射用油、喜树碱衍生物于100-180℃混合，降温至50-80℃，加入磷脂、抗氧剂混合，形成混合液(1)；将乳化剂与50-80℃的注射用水混合，再与含等渗调节剂和增溶剂的水液混合，形成水相(2)；将水相(2)倒入混合液(1)中，在50-80C条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8；再进行匀化，制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。

10、  权利要求8的脂肪乳剂的制备方法，其特征在于：将注射用油、喜树碱衍生物、磷脂及抗氧剂等于50-80℃混合，形成混合液(1)；将乳化剂与50-80℃的注射用水混合，再与含等渗调节剂和增溶剂的水液混合，形成水相(2)；将水相(2)倒入混合液(1)中，在50-80℃条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8；再进行匀化，制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。

喜树碱衍生物脂肪乳剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种喜树碱衍生物脂肪乳剂及其制备方法，具体为含喜树碱或其衍生物的静脉注射脂肪乳剂及其制备方法。
背景技术
喜树碱衍生物作为选择性DNA拓扑异构酶抑制剂，具有广谱抗肿瘤作用。研究表明喜树碱和许多喜树碱的衍生物在水溶液及血液(PH＝7.4)中不稳定，内酯环E-环开环水解成羟基缩酸盐而失去活性。但是由于喜树碱及其衍生物在水溶液中溶解度低，现有注射剂只能将其在碱性pH条件下水解开环，这就极大降低其体内抗肿瘤功效。另一方面，生物药剂学研究表明，喜树碱衍生物半衰期短，作用维持时间较短，而增加剂量势必会增加与剂量成正比的毒性反应。此外，与其他抗癌药物相似，10-羟基喜树碱对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤力均很大，在化疗过程中患者体质急剧下降，往往坚持不了几个疗程而被迫停药。
脂肪乳常规制备方法系用精制植物油加乳化剂和注射用水充分乳化而制成的油/水型无菌乳剂，其最常见的问题是稳定性差，放置后产生分层。将喜树碱衍生物制备成脂肪乳剂时，由于药物在脂肪乳油相中溶解度极低，按常规配方制备得到的脂肪乳由于无法溶解治疗剂量的药物而产生沉淀。另外喜树碱衍生物如10-羟基喜树碱的消化道毒性反应大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何增加喜树碱衍生物在脂肪乳油相中溶解度，并使其稳定地包封于脂肪乳油相中。使制成的脂肪乳剂稳定性好，放置后药物不析出，且不产生分层。还希望通过剂型与辅料的改进，在喜树碱衍生物活性及药效均有显著提高的前提下，尽可能地减少或降低喜树碱衍生物的毒副作用。
为解决上述问题，本发明提供下述技术方案。
一种脂肪乳剂，包括喜树碱衍生物、注射用油、乳化剂、增溶剂。
所述脂肪乳剂中，喜树碱衍生物选自10-羟基喜树碱、拓扑替肯、伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱、9-氨基-20(S)喜树碱、9-硝基-20(S)喜树碱、10，11-亚甲基二氧基喜树碱、10，11-亚乙基二氧基喜树碱、7-乙基喜树碱、9-氯-10，11-亚甲基二氧基喜树碱、9，10-二氯代喜树碱、7-三甲基硅乙基-10-羟基喜树碱、7-叔丁基甲月亏-喜树碱、7-(4-甲基-1-哌嗪甲基)-10，11-亚乙基二氧基喜树碱以及高喜树碱类衍生物中的一种或几种混合物；注射用油选自大豆油、蓖麻油、茶油、麻油、红花油、棉子油、中长链脂肪酸酯、橄榄油中的一种或几种混合物；乳化剂选自磷脂、普罗流尼中的一种或二种以上混合物；增溶剂选自聚乙二醇、聚维酮和/或羟丙基β-环糊精；还包括抗氧剂。其按重量计，含有喜树碱衍生物0.001％-0.05％、注射用油5-20％、乳化剂2-9％、增溶剂选自聚乙二醇5-20％、聚维酮1-6％或羟丙基β-环糊精1-6％；抗氧剂选用维生素E；高喜树碱类衍生物为BN-80915。
较好的脂肪乳剂，按重量计，含有喜树碱衍生物0.002％-0.04％、注射用油6-18％、磷脂1-5％，普罗流尼1-4％、增溶剂选自聚乙二醇6-18％或羟丙基β-环糊精2-5％，抗氧剂0.01-0.03％；注射用水添至100％。
较好的脂肪乳剂，按重量计，含有喜树碱衍生物0.003％-0.03％、注射用油8-16％、磷脂2-4％，普罗流尼2-3％、增溶剂选自羟丙基β-环糊精2-5％或聚维酮2-5％。
前述脂肪乳剂中的磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和/或合成磷脂；其它还包括等渗调节剂，注射用水添至100％。
前述脂肪乳剂的制备方法，包括如下步骤：
取注射用油、喜树碱衍生物于50-200℃混合，温度至50-80℃时，加入磷脂，混合形成混合液(1)；
将注射用水、乳化剂、等渗调节剂与增溶剂混合，形成水相(2)；
将水相(2)与混合液(1)混合，制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8后，再进行匀化；制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。
脂肪乳剂较好的制备方法：取注射用油、喜树碱衍生物于100-180℃混合，降温至50-80℃，加入磷脂、抗氧剂混合，形成混合液(1)；将乳化剂与50-80℃的注射用水混合，再与含等渗调节剂和增溶剂的水液混合，形成水相(2)；将水相(2)倒入混合液(1)中，在50-80℃条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8；再进行匀化，制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。
脂肪乳剂更为合适的制备方法：将注射用油、喜树碱衍生物、磷脂及抗氧剂等于50-80℃混合，形成混合液(1)；将乳化剂与50-80℃的注射用水混合，再与含等渗调节剂和增溶剂的水液混合，形成水相(2)；将水相(2)倒入混合液(1)中，在50-80℃条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8；再进行匀化，制得含喜树碱衍生物的脂肪乳剂。
本发明由于筛选了特定的增溶剂，不但增加了喜树碱衍生物在脂肪乳油相中溶解度，而且使其稳定地包封于脂肪乳油相中。使制成的脂肪乳剂稳定性好，放置后药物不析出，且脂肪乳剂不产生分层。以脂肪乳作为载体可以解决喜树碱衍生物在制剂学和生物药剂学两方面的问题。由于喜树碱衍生物以闭环形式增溶并稳定地包封于脂肪乳油相中，在到达靶部位前能够保持活性形式，增强其药效，此外，由于包封在乳剂内相中的药物缓慢释放，可能延长药物在血液中的驻留时间。本发明喜树碱衍生物脂肪乳与普通注射液相比，活性及药效均有显著提高，毒副作用显著下降。脂肪乳的营养作用也提高了肿瘤小鼠的生存质量。
下面概述本发明的制备方法：
方法一
将静脉注射用油(5％-20％)用0.2μm膜滤过后投入容器，喜树碱衍生物(0.001％-0.05％)投入到容器中，高温(100-200℃)机械搅拌待药物分散后，降温至(50-80℃)投入磷脂(1％-5％)、可以加入或不加入抗氧剂，继续机械搅拌待磷脂溶解，混合均匀，形成混合液；
将适量注射用水置于另一容器中，加热至(50-80℃)，加入乳化剂如磷脂(1％-5％)、普罗流尼(1％-8％)等搅拌分散，将等渗调节剂甘油(2.5％)，增溶剂如聚乙二醇、聚维酮或羟丙基β环糊精(1％-10％)等用水溶解，以0.2μm膜滤过后加入其中。
将水相在搅拌下倒入混合油相中，在50-80℃条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8；
将制得的初乳移入高压匀质机，二次匀化；
经微孔滤膜过滤，通氮，灌装，压盖。
将灌装好的脂肪乳置于旋转高压灭菌锅中灭菌。
其中注射用油可以选择大豆油、蓖麻油、茶油、麻油、红花油、棉子油、中长链脂肪酸酯、橄榄油中的一种或几种混合物，乳化剂可以选择大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、合成磷脂、普罗流尼等，增溶剂可选择聚乙二醇、聚维酮、羟丙基β-环糊精等。
方法二
(1)静脉注射用油(5％-20％)经0.2μm膜滤过后投入容器，喜树碱衍生物(0.001％-0.05％)也投入到容器中，加热至50-80℃并搅拌均匀，加入磷脂(1％-5％)、可以加入或不加入抗氧剂，继续机械搅拌待磷脂溶解，混合均匀，形成混合液。(2)在另一配制罐中加适量水，加热至50-80℃，加入乳化剂如磷脂(1％-10％)、普罗流尼(1％-8％)搅拌分散。等渗调节剂甘油与增溶剂如聚乙二醇、聚维酮或羟丙基β环糊精(1％-10％)等用水溶解，用0.2μm膜滤过后也加入罐中。(3)将步骤(2)得到的水相在搅拌下倒入步骤(1)得到的混合相中，在50-80℃条件下高速分散后机械搅拌2-3个小时制成初乳，用pH调节剂调节pH至4-8。分散均匀的初乳液，用40μm滤膜滤过，然后经高压乳匀机进行两次乳化。在搅拌下加水至足量，调pH检查半成品。经10μm滤膜滤过、灌装。充氮，加橡胶塞及压铝盖。用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，逐渐冷却。
本发明的特点和效果在于制备方法简单，制备过程中对使用的设备要求不高且无特殊要求，时间短，成本低，利于大批量生产。
具体实施方式
静脉注射级大豆油(辽宁铁岭药用油有限公司)；注射用豆磷脂(上海太伟药业有限公司)；普罗流尼(BASF公司)；中长链脂肪酸酯(Colorcon公司)。
实施例1
将注射用大豆油20g、10-羟基喜树碱20mg投入到容器中，将该容器置于油浴中，加热至150℃左右，搅拌至药物分散，降温至80℃，投入卵磷脂1.5g、维生素E 100mg搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水80ml置于另一容器中，加入普罗流尼4g、聚维酮4g、甘油2.5g及卵磷脂3.5g于80℃搅拌溶解形成水相；将含有10-羟基喜树碱、大豆油和卵磷脂的混和液在80℃、机械搅拌下与含有普罗流尼、甘油、聚维酮(PVP)和卵磷脂的水相混和，并在80℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳，并用枸椽酸调节pH值至6；将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、压盖；用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，逐渐冷却。在4-10℃下贮存。即制成20mg/100ml的10-羟基喜树碱脂肪乳静脉注射液制剂。
稳定性测定方法系采取新鲜制备的脂肪乳，置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，未发现分层，也未见黄色的药物沉淀析出。室温阴凉处贮存半年，乳剂外观、粒径、Zeta电位等理化性质以及含量均未发生明显变化，表明乳剂稳定。
实施例2
将注射用大豆油10g、中链脂肪酸酯5g、10-羟基喜树碱2mg投入到容器中，将该容器置于油浴中，加热至120℃左右，搅拌至药物分散，降温至70℃，投入卵磷脂2.5g、维生素E100mg搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水85ml置于另一容器中，加入普罗流尼5g、聚乙二醇5g、甘油2.5g及卵磷脂4.5g于70℃搅拌溶解形成水相；将含有10-羟基喜树碱、大豆油和卵磷脂的混和液在70℃、机械搅拌下与含有普罗流尼、甘油、聚乙二醇和卵磷脂的水相混和，并在70℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳。将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、熔封；用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，冲热水逐渐冷却。在4-10℃下贮存。即制成2mg/100ml的10-羟基喜树碱脂肪乳静脉注射液制剂。
稳定性测定方法系采取新鲜制备的脂肪乳，置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，未发现分层，也未见黄色的药物沉淀析出。室温阴凉处贮存半年，乳剂外观、粒径、Zeta电位等理化性质以及含量均未发生明显变化，表明乳剂稳定。
实施例3
将注射用大豆油15g、10-羟基喜树碱8mg投入到容器中，将该容器置于油浴中，加热至150℃左右，搅拌至药物分散，降温至70℃，投入1.5g卵磷脂、维生素E 100mg搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水85ml置于另一容器中，加入普罗流尼5g、羟丙基β环糊精3g、甘油2.5g及卵磷脂2.5g于70℃搅拌溶解形成水相。将含有10-羟基喜树碱、大豆油和卵磷脂的混和液在70℃、机械搅拌下与含有普罗流尼、甘油、羟丙基β环糊精和卵磷脂的水相混和，并在70℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳。将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、熔封；用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，冲热水逐渐冷却。在4-10℃下贮存。即制成8mg/100ml的10-羟基喜树碱脂肪乳静脉注射液制剂。
稳定性测定方法系采取新鲜制备的脂肪乳，置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，未发现分层，也未见黄色的药物沉淀析出。室温阴凉处贮存半年，乳剂外观、粒径、Zeta电位等理化性质以及含量均未发生明显变化，表明乳剂稳定。
实施例4
将注射用大豆油10g、9-硝基-20(S)喜树碱6mg投入到容器中，将该容器置于油浴中，加热至120℃左右，搅拌至药物分散，降温至80℃，投入2.5g卵磷脂、维生素E 100mg搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水90ml置于另一容器中，加入普罗流尼4g、甘油2.5g、羟丙基β-环糊精4g、及卵磷脂4.5g于80℃搅拌溶解形成水相。将含有9-硝基-20(S)喜树碱、大豆油和卵磷脂的混和液在80℃机械搅拌下与上述水相混和，并在80℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳。将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、熔封；用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20的条件下灭菌。灭菌完毕后，冲热水逐渐冷却。在4-10℃下贮存。即制成6mg/100ml的9-硝基-20(S)喜树碱脂肪乳静脉注射液制剂。
稳定性测定方法系采取新鲜制备的脂肪乳，置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，未发现分层，也未见黄色的药物沉淀析出。室温阴凉处贮存半年，乳剂外观、粒径、Zeta电位等理化性质以及含量均未发生明显变化，表明乳剂稳定。
实施例5
将注射用大豆油10g、中长链脂肪酸酯5g投入到容器中，将该容器置于油浴中，加热至80℃，加入9-硝基-20(S)喜树碱1mg，搅拌至分散均匀，然后加入2.5g卵磷脂、(可加也可不加维生素E 100mg，)搅拌至磷脂溶解形成均匀混和相。将注射用水85ml置于另一容器中，加入普罗流尼4g、聚维酮3g、甘油2.5g、及卵磷脂4.5g于80℃搅拌溶解形成水相。将含有9-硝基-20(S)喜树碱、大豆油和卵磷脂的混和液在80℃机械搅拌下与上述水相混和，并在80℃下继续机械搅拌1个小时制成初乳。将制得的初乳经高速分散机分散，移入高压均质机，匀化到乳滴粒径检查合格为止；再将初乳乳液经微孔滤膜过滤，灌装，通氮、熔封；用旋转高压灭菌器进行121℃，F0为20地条件下灭菌。灭菌完毕后，冲热水逐渐冷却。在4-10℃下贮存。即制成1mg/100ml的9-硝基-20(S)喜树碱脂肪乳静脉注射液制剂。
稳定性测定方法系采取新鲜制备的脂肪乳，置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，未发现分层，也未见黄色的药物沉淀析出。室温阴凉处贮存半年，乳剂外观、粒径、Zeta电位等理化性质以及含量均未发生明显变化，表明乳剂稳定。
实施例6
药效学研究；
S180腹水瘤模型小鼠制作：在无菌条件下取生长良好的S180腹水瘤，用生理盐水稀释，制成1.0×106个/ml瘤细胞悬液，接种于90只小鼠腹腔内，每只分别为0.2ml。
实验动物及分组：雄性封闭群昆明种小鼠90只，体重18-22g，制成EAC模型鼠，随机分成A、B、C组，每组30只分别为A：生理盐水对照组B：10-羟基喜树碱注射液治疗组C：10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组
实验方法：A组生理盐水对照组每只小鼠尾静脉注射0.9％生理盐水0.2ml.，每天注射一次，连续注射8天
B组10-羟基喜树碱注射液治疗组每只小鼠尾静脉注射10-羟基喜树碱注射液(0.8mg/kg)，每天注射一次，连续注射8天。
C组本发明10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组每只小鼠尾静脉注射0.08mg/ml 10-羟基喜树碱脂肪乳(0.8mg/kg)，每天注射一次，连续注射8天。
在给药周期内小鼠饲喂常备饲料常备饲料，正常饮水。8天后断锥处死小鼠，分离出腹水瘤体，去掉表皮组织精确称重，并计算抑瘤率。
抑瘤率＝(A-B)/A×100％(A为生理盐水对照组的平均瘤重，B为治疗组的平均瘤重)
比较10-羟基喜树碱注射液治疗组和10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组的抑瘤率是否存在显著性差异。
实验结果：连续注射8天后，生理盐水对照组平均瘤重为2.9克，10-羟基喜树碱注射液治疗组平均瘤重为2.6克，抑制率为10.34％；10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组平均瘤重为1.5克，抑制率为48.27％。10-羟基喜树碱注射液治疗组和10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组的抑瘤率存在显著性差异(p＜0.01)。10-羟基喜树碱脂肪乳抑瘤率约是注射液的5倍，由于10-羟基喜树碱以闭环形式包封于脂肪乳的乳滴内，活性及药效均有显著提高。
另外，10-羟基喜树碱注射液治疗组在给药期间食欲下降，8天后平均体重减轻10-40％，并有小鼠死亡，尸解见胃肠有出血点，这与10-羟基喜树碱对消化道毒性反应有关。但是10-羟基喜树碱脂肪乳治疗组平均体重增加5-10％，且无一死亡，对、胃肠道解剖未见有出血点。进一步表明，10-羟基喜树碱以内酯闭环形式增溶于脂肪乳中，毒副作用显著下降。脂肪乳的营养作用也提高了肿瘤小鼠的生存质量。