活性聚合物膜 参考引用 本发明申请要求了 2008 年 12 月 17 日提交的题为 “活性聚合物膜” 的澳大利亚临时专 利申请 2008906500 的优先权， 该申请的所有内容作为参考引入。
本发明申请还参考了文献 ： Griesser, HJ (1989), Small scale reactor for plasma processing of moving substrate web, Vacuum 39(5):485-488。该文献的所有 内容作为参考引入。
技术领域
本发明主要涉及活性聚合物膜。更具体地说， 本发明涉及一种包括内嵌无机物纳 米颗粒的聚合物基质的膜。 背景技术微生物感染或污染仍然是医药、 食品加工、 药品加工及环境设置中导致疾病和 / 或腐败的主要原因。 另外， 虽然所有外科手术有伤口感染的风险， 但是在移植手术中或手术 后医疗植入表面的细菌粘附、 定植和 / 或生物膜的形成大大增加了感染的风险。另外， 已知 微生物膜在例如食品、 医药、 化学工业加工设备的表面上形成， 同时也可以在其他的表面如 灌溉设备、 暴雨或污水排水管、 冷却塔或船舶的表面上形成。 生物膜常常会对这些设备带来 严重损坏， 并且微生物膜的形成会引起管道及加工设备的堵塞。
可以采用抑菌剂或杀菌剂控制微生物。抑菌剂能够抑制微生物的进一步生长， 相 应地能够抑制生物膜形成， 或者， 当在医疗环境中使用时， 能够防止感染发展成全面爆发的 疾病 （full blown illnesses） 。另一方面， 杀菌剂能够通过杀死微生物起作用。少量杀菌 剂对于微生物有广谱作用， 并且在某些情况下， 可能需要使用组合药剂控制微生物的生长。 不过， 大多数广谱杀菌剂不适宜用在医疗应用中， 因为它们往往会对较高级生物体的组织 产生有害影响。另外， 尽管抗生素， 通常只对细菌有活性， 提供了治疗或防止人体及其他动 物体中微生物感染又不会产生这种有害影响的可能性， 但是， 不幸地是， 只有少量抗生素制 剂显示广谱的活性 （即， 它们的杀菌活性常常只针对某种细菌种或属） 。而且， 多年来抗生素 的广泛、 频繁的使用已经导致细菌抗生素耐药性或多种耐药性菌株的演化 （如， 耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus ） ; MRSA） 。因此， 抗生 素对某些细菌感染可能无效的。
因此， 大量正在进行的研究工作旨在开发出新的在医疗应用中使用的抑菌剂或杀 菌剂。 这种需求又被减少医院获得性感染率的全球需要、 西方世界的老龄化人口、 对最小化 医疗费用不断增加的关注， 以及不断增加的被告知需要改善的医疗治疗的病人而加剧。从 这个意义上来说， 作为一种手术过程中或手术后抗细菌感染的有前景的方法， 人们对医学 移植及假肢中使用的抗菌涂层和表面的接受度不断增加。 为此， 替代性的抗菌技术， 如纳米 基涂层技术， 有了良好的发展势头。 医疗设备已经被视为用于包括创伤敷料、 导管以及医学 植入如支架和起搏器的抗菌涂层及表面技术的可能备用方式。
银的抗菌性能很多年前已经被认识到了。 由于银的成本并且相对现代抗生素其给 药相对困难， 因此一直到近年来银作为抗菌剂也只引起了少量关注。也就是说， 近年来， 对 于银可能作为抗菌剂使用的关注有所复苏。 例如， 银化合物以及银胶体已被纳入用于烧伤、 急性和慢性创伤的绷带， 用于治疗腿部溃疡。事实上， 已知的产品， 如包括 1% 的磺胺嘧啶银 ® 的 Silvadene 乳膏， 现在已是最广泛使用的用于治疗烧伤相关的感染的抗菌产品。另外， 几项近期研究显示了银离子与大颗粒或纳米颗粒表面结合以减少医疗应用中微生物感染 及细菌粘附和 / 或定植事件的能力。这些医疗应用包括， 例如， 烧伤治疗 （Paddock et al ， 2007 ； Caruso et al ， 2004） 、 导管植入 （Rupp et al ， 2004 ； Yobin and Bambauer， 2003） 、 假 体植入 （Hardman et al ， 2004 ； Gosheger et al ， 2004） 、 关节造形术 （Alt et al ， 2004） 、 假 牙 （O’ Donnell et al ， 2007 ； Ohashi et al ， 2004） 以及其他医疗应用。可能的抗菌涂层及 表面的非医疗应用包括银， 例如， 包括水处理装置及系统 （Chou et al ， 2005 ； Martinez et al ， 2004） 和纺织品 （Paddock et al ， 2007 ； Dubas et al ， 2006 ； Lee et al ， 2003） 。有些文 献综述探索了利用一些方法产生包含银纳米颗粒的抗菌涂层的可能性， 所述方法例如逐层 淀积法 （Dubas et al ， 2006 ； Li et al ， 2006） 、 溶胶 - 凝胶法 （Marini et al ， 2007 ； Mahltig et al ， 2004） 、 电化学法 （Voccia et al ， 2006） 、 离子束淀积法 （Song et al ， 2005） ， 以及化 学气相淀积法 （Martin et al ， 2007） 。
这里所述的是等离子聚合法， 用于形成载有无机物纳米颗粒的聚合物膜。
以这种方式制成的膜适用于涂覆任何合适的基质， 包括那些具有硬的或软的表面 的基质。 它们也可以用于涂覆表面以使合适基质的表面功能化， 例如， 用来给予抗菌活性和 / 或用于防止不想要的细菌粘附、 定植和 / 或生物膜形成或者， 除此以外用于涂覆带有期望 的无机物的光学或电子装置。这里描述的方法可以进一步为生物活性无机物提供缓释层 （如， 抗菌剂） 或者仅仅提供一种将无机物粘附到表面的方法。 发明内容
第一方面， 本发明提供了一种包含可渗透聚合物基质的膜， 所述聚合物基质带有 一种或多种官能团以及在所述聚合物基质内嵌有一种或多种无机物纳米颗粒。
优选地， 无机物为银。
第二方面， 本发明提供了一种用于将一膜应用到合适基质表面上的方法， 所述方 法包括步骤 ： （ⅰ） 通过等离子聚合淀积并聚合包含一种或多种官能团的单体， 以在所述表面形成可 渗透的聚合物基质 ； （ⅱ） 将无机物与所述官能团复合， 以及 （ⅲ） 还原所述无机物， 形成一种或多种所述无机物的纳米颗粒 ； 其中所述一种或多种无机物纳米颗粒嵌入所述聚合物基质中。
该方法适用于制造多层膜， 其中由步骤 （ⅰ） 到 （ⅱ） 制成的膜构成包括第一聚合物 基质的第一膜层， 所述第一聚合物基质带有一种或多种官能团以及， 一种或多种无机物纳 米颗粒嵌入所述第一聚合物基质中， 而该方法进一步包括步骤 ： （ⅳ） 将第二膜层应用到第一膜层的表面。附图说明 图 1 提供了制造 HA- 银等离子聚合物 （pp） 膜的实验方法示意图 ： （a） 图示了正庚 胺 （HA） 的等离子淀积 ； （b） 图示了通过浸入 AgNO3 溶液中将银离子负载到 HA 等离子体膜上 的方法 ； 以及 （c） 图示了通过浸入 NaBH4 中还原银离子形成银纳米颗粒 ； 图 2 阐释了形成在玻璃固体表面上的 HA 膜内银纳米颗粒的形成 ： （a） （ⅰ） 显示了沉 淀了 100nm HA 等离子体膜后玻璃固体表面的不透明性 ； （a） （ⅱ） 显示了 HA 等离子体膜负 载了银离子后玻璃固体表面的不透明性 ； （a） （ⅲ） 显示了用 NaBH4 还原银离子后玻璃固体 表面的不透明性 ； （b） 显示了负载银离子 （下面的线） 并在 NaBH4 中还原后 （上面的线） 的样 本的 UV- 可见光谱图， 其中波长 （nm） 在 X 轴上显示， 吸光度在 Y 轴上显示 ； 图 3 阐释了银纳米颗粒负载浓度的各种调节 ： （a） 显示了厚度 100nm 的 HA- 银膜还原 时间为 30min 时， 浸入 AgNO3 的时间的影响 ； （b） 显示了厚度 100nm 的 HA- 银膜浸入 AgNO3 的时间为 1hr 时， 还原时间的影响 ； 以及 （c） 显示了浸入 AgNO3 的时间为 1hr 并且还原时间 为 30min 时， HA- 银膜的厚度的影响。Y 轴表示最大吸光强度， X 轴表示时间 （min 或 sec） ； 图 4 阐释了 HA 等离子体膜附加层淀积后银离子从 HA- 银等离子体膜中释放的速率调 节： （a） 显示了所述膜浸入磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 中的 21 天期间银离子从膜中释放的速率， 其中正方形表示 HA- 银等离子体膜的释放速率， 圆形表示在 HA- 银等离子体膜表面上附加 淀积的 6nm HA 等离子体膜， 三角形表示在 HA- 银等离子体膜表面上附加淀积的 12nm HA 等 离子体膜 ； 以及 （b） 显示了包含在制备双层等离子体膜的方法。图示下部为固体基质， 中间 部为 HA- 银层， 上部为附加 HA 层 ； 图 5 显示了 HA- 银等离子体膜与 HA 等离子体膜的细菌生长及定植的对比 ： （a） 图示了
HA 等离子体膜上的细菌生长 ； （b） 图示了 HA- 银等离子体膜上的细菌生长及移定植 ； 以及 （c） 显示了包括 6nm HA 等离子体聚合物的第二层膜的双层等离子体膜的细菌生长及定植 ； 图 6 提供了从 HA- 银等离子体膜的样本产生的评估抑菌面积的柱状图， 所述膜放置在 充满 LB 介质及 100μl 的 Escherichia coli K12（MG1655） 菌株的 Petri 培养皿中 ； 图 7 显示了负载银离子并在 NaBH4 中还原后丙烯胺 （AA） 等离子体聚合物膜的 UV- 可见 光谱图， 其中 X 轴为波长 （nm） ， Y 轴为吸光度 ； 图 8 阐释了淀积了 AA 等离子体膜的附加层后银离子从 AA- 银等离子体膜中释放的速 率调节 ： 特别地， 该图显示了所述膜浸入 PBS 中 20 天期间银离子从膜中释放的速率， 其中正 方形表示 AA- 银等离子体膜的释放速率， 圆形表示 AA- 银等离子体膜表面上淀积了附加的 6nm AA 等离子体膜的效果， 指向上方的三角形表示 AA- 银等离子体膜表面上淀积了附加的 12nm AA 等离子体膜的效果， 以及指向下方的三角形表示 AA- 银等离子体膜表面上淀积了 附加的 12nm AA 等离子体膜的效果 ； 以及 图 9 提供了 PEG 接枝 （grafting） 前、 后玻璃基质涂层的 UV- 可见光谱图 （涂层是不含 有 PEG 的 HA- 银等离子体膜 （即 HA+ 银纳米颗粒 （SNP） ） 和含有 PEG 的 HA- 银等离子体膜 （即 HA+SNP+PEG） ） 。 具体实施方式
本发明申请人已经鉴定并开发了各种膜， 以及制造这些膜的方法， 包括其中嵌入 无机物纳米颗粒的聚合物。 这些膜可以提供任何数量的应用， 例如， 制作抗菌涂层或抗菌表面。制造这些膜的方法提供了一种快速、 简单、 方便的将活性聚合物膜应用至表面的工艺。
因此， 第一点， 本发明提供了包含具有渗透性的聚合物基质的膜， 所述聚合物基质 中带有一种或多种官能团以及在所述聚合物基质内嵌有一种或多种无机物纳米颗粒。
这里使用的术语 “膜” 包括任何物理表面层， 它们可以， 例如， 为其应用的下层表面 （如固体表面） 提供某些性能。因此， 上述膜的厚度或组成可以是不规则的或均一的， 同时可 以部分或完全包覆或覆盖下层表面。
根据第一点， 所述膜包含其中嵌有纳米颗粒的聚合物基质， 其对所述无机物具有 渗透性 （例如， 无机物可以扩散进入聚合物基质， 也可以从中扩散出来） 。
所述聚合物基质可以是有孔的， 包括大量的孔， 一般是纳米孔 （如孔的直径约 2nm 到约 4μm， 更优选的为约 5nm 到 1μm） ， 它们可以是分开的、 相连的或两者的组合。无机物 纳米颗粒可以位于聚合物基质的孔中。
优选地， 所述膜包含等离子体聚合物基质。 因此， 这种聚合物基质可以通过等离子 体聚合过程形成， 其中至少聚合一种单体以形成聚合物基质。 更优选地， 所述膜包含有孔的 等离子体聚合物基质。
本领域技术人员熟知包含等离子体聚合物基质的涂层通常可能是 “坚硬的” ， 这可 能由于收缩及坍塌造成涂层失效。 人们怀疑这种涂层的刚性是由等离子体聚合过程中成分 单体的交联引起的。所以， 第一点所述的膜优选地为一薄膜， 包含薄的、 有弹性的聚合物基 质。除了不易于失效的潜在性， 这在医疗应用中是特别重要的， 这种薄膜也很好的适用于 “软的” 应用例如隐形眼镜的表面涂层。第一点所述的膜也包含低交联度的等离子体聚合物 基质， 以提供机械柔韧性。 薄膜可以通过本领域技术人员熟知的任何薄膜淀积方法形成， 包括但不限于， 化学淀积法如电镀、 化学溶液淀积 （CSD） 以及化学气相淀积法 （CVD） ， 物理淀积法如物理 气相淀积法 （PVD） 、 热蒸发、 电子束蒸发、 溅射法、 脉冲激光淀积法以及阴极电弧淀积法 （电弧离子蒸镀 （Arc-PVD） ） ， 以及其他方法如反应溅射法、 分子束外延 （MBE）和拓扑衍生 （topotaxy） 。薄膜厚度优选地约小于 4μm， 更优选地在约 5nm 到约 4μm 之间， 更优选地在 约 5nm 到 500nm 之间， 更优选地在约 5nm 到 150nm 之间， 最优选地从约 5nm 到约 25nm。
这里使用的术语 “官能团” 包括原子或特定的聚合物基质 （或组成聚合物基质的单 体） 的原子基团， 无机物与所述物质通过， 例如， 化学共价键、 化学离子键或化学配位键结合 （例如形成复合物） 。
这里使用的术语 “纳米颗粒” 可以理解为 “纳米” 尺寸的颗粒， 其可以包括各种尺 寸的颗粒， 并且一般平均直径或主截面尺寸范围在 1 到 250nm， 更优选地范围为 5 到 50nm， 最优选地范围为 10 到 25nm。
这里使用的术语 “无机物” 包括基本纯态的无碳元素 （如， 铜、 银或硒） 以及任何主 要由不是碳的元素构成的无机化合物。不过某些含碳的化合物也被认为是无机化合物， 如 碳酸盐、 简单的碳氧化物和氰化物， 以及碳的同素异形体， 而针对本说明书的目的， 包含碳 骨架的化合物和有机金属化合物不能看成是无机化合物。
第一点所述的膜可以作为任意合适的基质表面的涂层使用， 优选地是固体基质。 优选地， 上述表面在使用该种膜时不需要进行预先改性处理。
合适的 “硬” 基质包括金属、 陶瓷、 合成聚合物、 生物聚合物以及医疗应用中常用的
材料， 包括不锈钢、 钛、 聚丙烯钛、 羟磷灰石、 聚乙烯、 聚氨酯、 有机硅聚合物和全氟聚合物。 合适的 “软” 基质包括丙烯酸水凝胶聚合物、 硅氧烷水凝胶聚合物、 纤维绷带、 包扎材料， 以 及合成敷料， 如水凝胶或泡沫敷料。
另外， 可以认为第一点所述的膜适合用于作为制造和包装材料使用的涂层材料， 如塑料 （例如， 聚丙烯、 聚苯乙烯、 聚对苯二甲酸乙二醇酯、 聚酯、 聚酰胺、 聚氯乙烯、 聚氨酯、 聚碳酸酯、 聚偏二氯乙烯和聚乙烯等） 、 金属和金属合金 （例如， 不锈钢、 钢、 铁和锡等） 。另 外， 光学或电子装置中使用的材料， 如硅、 二氧化硅、 铝、 铜及类似材料也可以使用第一点所 述的膜涂覆。
第一点所述的膜优选地包含由单体形成的聚合物基质， 所述单体包括一种或多种 官能团， 可与所述无机物的氧化态形成复合物。因此， 优选的单体包含至少一种官能团， 选 自由羟基、 羰基、 醛基、 酮基、 羧基、 过氧基、 酰胺基、 胺基、 亚胺基、 酰亚胺、 叠氮化物、 氰酸盐 和硝酸盐基团组成的组。不过， 更优选的是包含至少一个胺基的单体。例如， 选自由挥发性 胺组成的组的单体包括， 例如， 烯丙胺、 二 （二甲氨基） 甲基乙烯基硅烷、 二甲基氨基硅烷、 吡 啶和庚胺。本发明的某些实施例中， 上述单体可以选自那些可聚合形成生物相容性聚合物 的物质。 进一步， 某些实施例中， 上述单体可以选自那些可以在聚合后功能化或可以共聚使 得最终聚合物基质功能化的物质。
更优选地， 第一点所述的膜包括选自由烯丙胺、 庚胺及其他挥发性烷基胺组成的组。 在一个特别优选的实施例中， 所述膜包含由正庚胺 （HA） 、 烯丙胺 （AA） 或它们的组 合物形成的聚合物基质。如下文实例中所述， 发现正庚胺和烯丙胺在制造富含胺官能团的 薄膜时非常有用。另外， 已知正庚胺比其他本领域技术人员熟知的富胺单体的挥发性和毒 性都更小， 因此， 包含由正庚胺形成的聚合物基质的膜尤其适用于医疗应用、 食品和 / 或药 物加工应用中。另外， 如下文实例中所示的， 如果需要， 正庚胺和烯丙胺的物理化学性质适 合用于改变嵌入其中的无机物纳米颗粒的浓度 （concentration） 及释放 （release） 。
第一点所述的膜可以用于对合适的带有所述无机物的基质进行功能化， 优选的为 固体基质。这种功能化的基质可以有很多应用， 例如在医疗应用中如作为医学移植的涂 层， 通常作为防止细菌粘附、 定植和 / 或生物膜形成的涂层材料， 在光学中用于生成反射或 抗反射涂层， 以及作为电子设备的涂层表面以形成， 例如， 集成电路、 微处理器和半导体的 层绝缘体、 导体。因此， 所述膜可以用于功能化合适的带有无机化合物的基质， 无机化合物 如三氧化二砷 （例如， 用于涂覆砷半导体或治疗急性粒细胞性白血病） 、 硼酸 （例如， 用于杀 菌或杀虫表面） 、 硫酸镁或氧化镁 （例如， 用于医疗应用的某些范围） 、 二氧化硅 （例如， 在微 电子中作为电绝缘体使用） 、 氧化锌 （例如， 用在化学或生物传感器中、 半导体中或作为药物 营养补充剂使用） 以及类似物质。另外， 上述膜可以用于功能化合适的带有非碳元素如金 属 （例如， 铜、 银、 金、 镁和锌， 或金属合金） 的基质， 用于形成抗菌表面或涂层 （例如用于医 疗装置包括可植入及不可植入的装置如替换关节、 导尿管、 经皮进入导管 （percutaneous access catheter） 、 支架、 和其他假体以及不可植入装置如绷带、 创伤敷料、 隐形眼镜和面 膜以及用于呼吸医用空气及氧气的设备） 或用于涂覆半导体和微处理器， 例如， 硒， 可用于 涂覆太阳能电池或用作营养补充剂， 以及非金属 （例如， 氟， 可用于涂覆假牙） 。
这里上述膜包含元素金属的纳米颗粒， 优选地所述金属选自铜或银 （已被熟知用
作抗菌剂并且给药后能够被高等生物很好地耐受的金属） ， 或它们的混合物。这种膜优选地 通过将特定金属的氧化 （即， 离子的） 形态与官能团复合在聚合物基质中形成带金属离子的 复合物来形成。之后， 所述复合物被还原以形成嵌入聚合物基质中的纳米颗粒。最优选地， 这种膜通过在胺 - 金属离子复合物形成后进行正庚胺和 / 或烯丙胺的等离子体聚合形成。
本发明的抗菌膜 （例如， 包含铜、 银、 硒或它们的混合物的纳米颗粒） ， 适用于一系 列上述提到的医疗应用。这种抗菌膜包含聚合物基质， 其对由纳米颗粒组成的抗菌剂具有 可渗透性。也就是说， 抗菌剂随着时间从纳米颗粒中溶解 （例如， 进入已渗入所述膜的液体 中） 或分离， 并且之后从膜中渗透出到达药剂可发挥其抗菌活性的表面和 / 或四周。因此， 这里的抗菌膜包含例如铜或银纳米颗粒， 聚合物基质优选地可被金属离子 （如， Cu+ 和 Ag+） 渗透。
本发明的抗菌膜 （例如， 包含铜、 银、 硒或它们的混合物的纳米颗粒） ， 也适用于需 要抑制细菌粘附、 定植和 / 或生物膜形成的非医疗应用中。例如， 工业表面常与水流接触， 特别易于生物膜形成， 因此这里所述的抗菌膜适于在这种表面中应用。合适的非医疗应用 的具体实例包括水处理设备的涂层、 冷却塔组件的涂层、 加工设备特别是食品和药品加工 中的设备的涂层， 以及食品及药物包装涂层。另外， 本发明的抗菌膜可以用于给合适的基 质， 优选地为固体基质提供防腐蚀屏障 （即， 该膜可以提供抗腐蚀涂层） 。
而且， 这里所述的膜包含元素金属， 特别是铜、 银和金 （它们的导电性众所周知） 的 纳米颗粒， 该种膜适用于涂覆半导体或微处理器。
在一些实施例中， 第一点所述的膜可以是多层膜 （即， 包括两层或多层膜层） 。因 此， 该膜可包括第一和第二聚合物膜层， 所述第一膜层包含聚合物基质 （优选地有孔） ， 聚合 物基质带有一种或多种官能团以及在所述聚合物基质中嵌有一种或多种无机物纳米颗粒 ； 并且其中所述第二膜层可， 例如， 为该膜提供附加的功能性特性和 / 或改进第一膜层的特 性 （例如， 改变抗菌剂从第一膜层渗透出的速率， 以使多层膜能以可持续的方式释放抗菌剂 或其它的无机物） ， 或者， 使第二膜层对嵌入第一膜层的无机物基本不能渗透， 从而有效地 “捕捉” 所述无机物。第二膜层也可以包含有用的配体如蛋白质或肽 （包括对宿主细胞粘附 和 / 或生长有利的生长因子） 或其它化合物如具有抗生物粘附作用的聚酯 （例如， 聚乙二 醇） 。
因此， 在一些实施例中， 第一点所述的膜包括第一和第二聚合物膜层， 其中所述第 一膜层包含第一聚合物基质 （优选地有孔） ， 所述第一聚合物基质带有一种或多种官能团以 及， 在所述第一聚合物基质中嵌有一种或多种第一无机物纳米颗粒， 并且其中所述第二膜 层包含第二聚合物基质 （优选地有孔） ， 所述第二聚合物基质带有有一种或多种官能团 （例 如， 金属离子复合的官能团） 以及在所述第二聚合物基质内嵌有一种或多种第二无机物纳 米颗粒 （其中， 第一和第二无机物可以是相同的或不同的） ； 在其它的实施例中， 第一点所述 的膜包括第一和第二聚合物膜层， 其中所述第一膜层包含第一聚合物基质 （优选地有孔） ， 所述第一聚合物基质带有有一种或多种官能团以及在所述第一聚合物基质内嵌有一种或 多种无机物纳米颗粒， 并且其中所述第二膜层包含第二聚合物基质， 其能控制所述无机物 的渗透 （例如， 第二聚合物基质可以对所述无机物渗透性很差或所述无机物基本不能渗 透） 。
另外， 至少可以加入一第三膜层， 其可以包含有用的配体如蛋白质或肽， 或其它的化合物如聚酯， 例如， 发挥其特定的生物界面的作用如细胞粘附或防止细胞粘附。
任意第二或第三 （等等）膜层厚度优选地小于约 100nm， 最优选地从约 1nm 到约 50nm， 更有选地从约 5nm 到约 25nm。
并且， 在一些实施例中， 第一点所述的膜可以通过将所述膜接触氧化剂 （例如， 通 过将所述膜置于生物液体中， 或者其它水性物质如冷却塔水、 废水或环境水中） 来 “引发” 无 机物从嵌在聚合物基质内的纳米颗粒中释放出来 （即， 通过渗透） 。
第二点， 本发明提供了一种将膜应用至合适基质表面上的方法， 所述方法包括步 骤： （ⅰ） 通过等离子体聚合法淀积并聚合包含一种或多种官能团 （例如， 金属离子复合的 官能团） 的单体， 在所述表面形成具有渗透性的聚合物基质 ； （ⅱ） 将无机物与所述官能团复合 ； 以及 （ⅲ） 还原所述无机物， 形成一种或多种所述无机物的纳米颗粒 ； 其中所述一种或多种无机物纳米颗粒嵌入所述聚合物基质中。
优选地， 所述聚合物基质是多孔聚合物基质。
等离子体聚合适用于在任意合适的基质， 如上述的硬和软的基质， 的表面淀积和 聚合物单体 （即， 用来制造聚合物基质） 。另外， 等离子体聚合法可以选择合适的可以适当地 对表面改性 （例如， 提供亲水性或疏水性） 的单体。而且， 等离子体聚合法可以操作以使聚合 物基质具有需要的交联度， 反过来， （如果需要） 其能够调节无机物从嵌入的纳米颗粒中任 意外扩散的速率。 聚合单体的步骤优选地通过等离子体聚合法进行， 例如射频辉光放电等离子体聚 合法， 从而形成有孔的等离子体聚合物基质。优选的单体为本发明第一点中所述的。最优 选地， 所述单体为正庚胺、 烯丙胺或它们的组合， 聚合形成的聚合物基质富含胺官能团。
将无机物与官能团复合的步骤可以采用本领域技术人员熟知的任何方法。不过， 优选地， 将无机物与官能团复合的步骤为将步骤 （ⅰ） 中形成的聚合物基质浸入包含所述无 机物的溶液中。 例如， 为了将银离子与富胺官能团的聚合物基质复合， 所述聚合物基质可以 浸入 AgNO3 溶液中 （例如， 浸入 0.02M 溶液中 1hr） 。
还原无机物的步骤可以采用本领域技术人员熟知的任何方法。 不过， 优选地， 还原 无机物的步骤包括将包含复合了官能团的无机物的聚合物基质浸入还原溶液中。例如， 为 了还原银离子以及胺官能团复合物以形成银纳米颗粒， 所述聚合物基质可以浸入 NaBH4 溶 液中 （例如浸入 0.01M 溶液中 30min） 。
可执行第二点所述的步骤 （ⅰ） 、 （ⅱ） 和 （ⅲ） 中的任意一个或多个 （即， 淀积和聚合、 复合和 / 或还原步骤） 以控制嵌入聚合物基质中的无机物纳米颗粒的量。例如， 可执行步骤 （ⅰ） 通过改变聚合物的厚度控制纳米颗粒的量 （例如， 通过控制射频辉光放电 （rfgd） 等离 子体淀积和聚合的持续时间） ， 可执行步骤 （ⅱ） 通过改变聚合物基质在无机物中的浸入持 续时间控制纳米颗粒的量， 可执行步骤 （ⅲ） 通过改变聚合物基质在还原剂中的浸入持续时 间控制纳米颗粒的量。
优选的， 第二点所述的方法不包括任何基质表面的预先改性处理。
第二点所述的方法使得可将一膜涂覆到合适的基质表面， 其中， 该膜的所述聚合 物基质中嵌有一种或多种无机物纳米颗粒。 该纳米颗粒使膜具有需要的性质， 如反射性， 或
可以用于无机物如抗菌银离子的持续释放。 该方法也可以用于所述膜的表面改性或用于附 着一另外的基团 （例如， 在所述表面附着其他的化学反应官能团或另外的膜层或涂层） 。
第二点所述的方法适用于制造多层膜， 其中由步骤 （ⅰ） 到 （ⅲ） 制成的膜构成包含 第一聚合物基质的第一膜层 （优选地有孔） ， 所述第一聚合物基质带有一种或多种官能团以 及在所述第一聚合物基质内嵌有一种或多种无机物纳米颗粒， 该方法进一步包括步骤 ： （ⅳ） 将第二膜层涂覆到第一膜层的表面。
第二膜层可使所述膜具有附加的功能性特征和 / 或对第一点所述的第一膜层进 行改性。
另外， 该方法进一步包括步骤 ： （ⅴ） 在第二膜层表面涂覆第三膜层。
可以选择用于制造多层膜的合适的等离子体聚合条件 （例如用于控制， 例如， 第二 膜层的厚度， 或所述无机物从第一聚合物基质的纳米颗粒中的任意外扩散速率） 以适合特 定多层膜以及预期应用的要求。
下面将通过非限制性实例及相关附图对本发明进行进一步描述。
实例 选择正庚胺 （HA）和烯丙胺 （AA）作为等离子体淀积材料， 提供胺基团功能化的等离 子体膜。尽管所有实例都采用正庚胺和烯丙胺， 应该理解这里所述的方法可以等同地使 用其他功能化单体如二 （二甲氨基）甲基乙烯基硅烷、 二甲基氨基硅烷、 吡啶、 环氧乙烷 （ethylene oxide） 、 烯丙醇、 乙二醇、 甲醚、 丙羧酸、 N- 乙烯基吡咯烷酮、 乙炔或乙烯或具 有其他能够复合内扩散无机材料的基团的功能化单体， 如羟基、 羰基、 醛、 酮、 碳酸酯、 羧 酸、 羧 基、 醚、 酯、 过氧氢基 （hydroperoxys） 、 过氧基 （peroxys） 、 酰 胺、 胺、 亚 胺、 酰 亚 胺、 叠氮化物、 含氮基 （azos） 、 氰酸酯、 异腈、 异氰酸酯 （isocyanates） 、 硝酸盐、 腈、 亚硝酸基 （nitrosooxy） 、 硝基、 亚硝基、 吡啶基、 膦基、 磷酸基、 亚磷酸基、 磺酰基、 磺酸基、 亚磺酰基、 巯基、 硫氰酸盐或二硫化物。特别地， 正庚胺或烯丙胺 （Vasilev et al ， 2009） 可由环己二 胺 （DACH） （Lassen and Malmsten， 1997） 、 1,3- 丙 二 胺 （Gengenbach et al ， 1999） 、 乙二 胺 （Gengenbach et al ， 1996） 、 丁胺 （Gancarz et al ， 2003） 、 炔丙胺和丙胺 （Fally et al ， 1995） 、 丙腈 （Hiratsuka et al ， 2000） 和丙烯腈 （Inagaki et al ， 1992） 取代。
实例 1 嵌有银纳米颗粒的抗菌薄 HA 等离子体聚合物膜材料和方法材料 如制造商提供的使用 HA、 硝酸银、 氢硼酸钠和玻璃基质 （ （Sigma-Aldrich， 圣路易斯， MO， 美国） 。使用 Staphylococcus epidermidis 菌株 ATCC 35984 进行抑菌研究， 该菌株在 根据制造商的说明配制的胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB） 与 0.25% 的葡萄糖中 37℃培养过夜而 制备。抑菌研究后使用 BacLight ™细菌活力试剂盒 （Invitrogen 公司， 加拿大） 观察活和 / 或死细菌和 / 或菌落并采用荧光显微镜 （Olympus BX 40， 激发滤色器 BP460-490， 二色分光 镜 DM505， 滤片 BA515-IF） 对目标放大 40 倍后成像。所有清洗过程采用超纯水进行 （电阻率 18.2 欧姆） 。
等离子体聚合法 等离子体聚合在 Griesser， HJ（1989）所述的定做的反应器中进行， 这里文献作为参考引入。简而言之， 反应室包括 Pyrex 圆筒 （Pyrex cylinder） 和两个 PVC 端板。每个 端板中的环形槽固定一 O 环形密封圈， 其正对上述玻璃圆筒 （glass cylinder） 的抛光末 端。顶盖承载驱动马达和齿轮 （gear） ， 底板承载所有反应器内的部件。所述部件包括由聚 四氟乙烯 （Teflon） 或有机玻璃 （Perspex） 制成的实心支架 （block） 。两个中心面内的支 架固定铜电极， 其尺寸为 18mm×90mm 并且间隔 16mm。气体进口和出口以及电气穿通连接 （feedthrough） 由 O 形环密封。为了拆卸， 顶部端部板和玻璃圆筒可以是悬空的。所述射频 （rf） 功率 （power） 由嵌入支架中并通过快插接头 （push-in fitting） 穿通连接的黄铜导体 提供。除了反应器， rf 发生器和玻璃真空管是标准设计的， 包括冷阱， 都是标准商业产品。
所有例子中采用 13.56MHz 的等离子体发生器在 0.2Torr 的压力下进行淀积。通 过衡量某种功率下的淀积速率调节淀积时间从而获得所需的膜厚度， 从前面的研究已知所 述淀积速率为等离子体每持续 1 秒厚度为 1nm。 玻璃基质首先采用 Piranha 溶液清洗， 充分 地水洗并干燥。等离子体淀积前， 使用 40W 功率将基质用氧等离子清洗 40 秒。
银负载方法 通过将等离子体聚合物膜浸入 0.02M 的 AgNO3 溶液中进行银负载， 标准负载时间为 1hr， 或者在负载时间研究中为 0 到 120min 之间。 银还原方法 通过将负载银的等离子体聚合物膜浸入 0.01M 的 NaBH4 溶液中进行银还原， 标准还原 时间为 30min， 或者在还原时间研究中在 0 到 60min 之间。
UV- 可见光谱 采用 Carry 5 UV- 可见光谱计 （Varian Australia Pty Ltd， 墨尔本， 澳大利亚） 观察 并记录 UV- 可见光谱。
细菌抑制研究 进行细菌抑制研究前， 采用 BacLight ™细菌活力测定法对细菌存储培养物 （bacterial stock culture） 进行定量， 以对活细菌进行定量。每个抗菌测试载玻片放在 12 微孔板的 孔中 （一次性细胞培养， Nunclon ™表面， 丹麦） 并固定其中。载玻片接种 107CFU/ml（近似 200μl） 来自肉汤培养基的 Staphylococcus epidermidis 菌株 ATTCC 35984。所述板在 37℃下温育 4hr 以使细菌菌落形成。 载玻片从 12- 孔板中移出， 并用 2ml PBS （8 g/L NaCl， 0.2 g/L KC1， 1.44 g/L Na2HPO4 以及 0.24 g KH2PO4， 使用 HCl 调整至 pH 为 7.4） 清洗 2 次。 将 200μl 包含 10% 甲醛的盐溶液 （0.9% w/v NaCl 溶液） 的固定剂滴加在每个载玻片上， 并 且将细菌菌落固定在载玻片表面 10 分钟。移除固定剂并将 200μl BacLight ™染色剂在暗 房中滴加在每个载玻片上并以大约 10 次 / 分钟轻轻摇动 15 分钟。然后将染色的载玻片用 盐溶液冲洗， 并准备显影， 将其放在玻璃载玻片表面上， 通过放置油润湿载玻片表面并盖上 盖玻片。载玻片通过荧光显微镜 （Olympus BX 40） Z 显影。
结果与讨论负载银纳米颗粒的 HA 等离子体膜的制造 如图 1（a） 所示， 使用 HA 作为前体以生成薄的富含胺官能团的等离子体聚合物膜。开 始使用定做的反应器 （上面描述的） 将 HA 淀积在干净的玻璃表面。薄等离子体聚合物膜的 原子力成像显示适当地制备的膜包含纳米孔结构 （Vasilev et al， 2008） 。
如图 1（b） 所示， 通过将所述膜浸入 AgNO3 溶液中 1hr 使溶液中的银离子 （Ag+） 与HA 胺基团复合， 从而将银离子嵌入所述膜中。 但是不希望被原理限制， 可以相信上述复合根 据下述反应进行 ：如图 1（c） 所示， 通过将薄的等离子体膜浸入 NaBH4 溶液中将银离子还原为银纳米颗 粒。该过程产生包含嵌入其中的银纳米颗粒的薄膜聚合物表面涂层。
图 2（a） 显示了淀积过程中玻璃基质的光学性能。淀积 100nmHA 等离子体膜后， 玻璃基质仍然是透明的， 并保持初始的光学性能。再次， 浸入 AgNO3 溶液中 （即膜上负载银 离子） 后， 没有观察到可见的玻璃基质的光学性质改变。不过， 通过将基质浸入 NaBH4 溶液 中银离子还原成银纳米颗粒后， 玻璃基质的颜色变成褐黄色。表面光学性质的改变表示嵌 入膜中的银纳米颗粒的存在。
图 2（b） 显示了只负载了银离子的玻璃基质的吸收光谱图， 与银离子还原成银纳 米颗粒的吸收光谱图的对比， 吸收光谱从 UV 光到可见光光谱波长。波长 420nm 处的显著吸 收峰仅出现在还原后， 表明嵌入膜中的银纳米颗粒的等离子体共振波长。
纳米颗粒负载浓度的调节 已经进行几项研究以确定最有效控制嵌入膜中的银纳米颗粒浓度的方法， 结果表明抗 菌等离子体膜可以制成多种抗菌剂量。开始， 进行了一系列研究以了解改变等离子体淀积 条件或抗菌负载条件对嵌入膜中的银纳米颗粒的浓度的影响。测量了在 40W 的淀积功率下 形成的 HA 等离子体膜在波长约 410-420nm 处的等离子体共振强度， 其中进行的调节有 ： + （a） Ag 负载时间， （b） 还原时间， 以及 （c） 膜厚度。
（a） Ag+ 负载时间 浸入 AgNO3 溶液中的时间对 HA 等离子体膜中的银纳米颗粒的最终浓度的影响基于膜 的最大吸收强度确定。除了浸入 AgNO3 溶液中的时间， 其他所有条件保持不变。如图 3 （a） 所示， 在浸入 AgNO3 溶液中的 120min 的时间内吸收强度持续增加， 吸光度最大的增量出现 在开始的 0-40min 内。浸入 60min 后， 吸光度持续增加， 不过， 速率较低。
这些结果表明 HA 等离子体膜浸入 AgNO3 溶液中的时间的增加可以促进 HA 胺官能 团对银离子的获得， 而这反过来， 可以增加银离子还原后形成的银纳米颗粒的浓度。
（b） 还原时间 与上面相同， 还原时间对 HA 等离子体聚合物内形成的银纳米颗粒的最终浓度的影响 通过观察膜的最大吸光度变化来评估。再次， 等离子体聚合条件保持不变， 在 NaBH4 溶液中 的还原时间以规则的间隔监测 60min。如图 3（a） 所示， 开始的 10min 内， 银纳米颗粒的形 成快速进行， 30min 后银纳米颗粒的总浓度几乎加倍。从 30min 到 60min， 尽管观察到的纳 米颗粒的形成持续增加， 还原速率减缓了。
另外， 膜浸入 NaBH4 溶液中较长时间 （即超过 30min） 后观察到最大吸收波长改变 了， 因而观察到波长稍微移向更长的波长， 约 424nm。 这种等离子体共振峰的转移， 一般出现 在较长的还原时间时， 申请人怀疑这种情况可以解释为嵌入 HA 等离子体聚合膜中的银离子用于已有的纳米颗粒的持续生长， 而最初的 30min 里， 出现了成核现象， 并且颗粒成长到 了某种对于所有颗粒都正常的尺寸。
（c） 膜厚度 膜厚度对嵌入 HA 聚合物膜中的银纳米颗粒的浓度的影响通过增加淀积时间来研究， 淀积时间增加反过来会产生较厚的膜。如图 3 （c） 所示， 观察到一种相互关联性， 据此， 膜厚 度增加到 100nm， 嵌入的银纳米颗粒的总浓度快速增加。然而， 膜厚度在约 100nm 到 200nm 之间时， 银纳米颗粒的浓度保持不变， 随后， 银纳米颗粒的浓度逐渐降低。
这些结果表明增加淀积时间会导致 HA 等离子体膜的化学及表面性质的逐步改 变。 申请人怀疑增加淀积时间导致官能团的交联增加， 因此， 减少了可用来形成银离子复合 物的官能团的数量， 并且另外减少了可用来负载银纳米颗粒的孔的数量。
抗菌释放速率的调节 除了控制嵌入膜中的银纳米颗粒的浓度， 也研究了膜中银纳米颗粒的截留特性的改 变， 从而提供了各种抗菌释放速率的膜 （即从即时释放速率到持续释放速率） 。
监测了水溶液中 HA- 银等离子体膜的银释放速率。如图 4（a） 所示 （由正方形表 示） ， 银纳米颗粒在水系统中经过氧化， 这样它们溶解同时银离子洗脱出来。银离子释放速 率的控制能够使膜具有延长的或持续的抗菌银释放。因此， 为了降低银从 HA- 银等离子体 膜中释放的速率， HA- 银等离子体膜的表面淀积了第二薄层 HA， 如图 4（b） 所示。
（a） 使用多层膜控制释放速率 通过监测银离子在 PBS 中 21 天期间的洗脱， 研究了涂覆有附加 6nm 或 12nmHA 等离子 体膜的 HA- 银等离子体膜中银的释放情况。通过在 420nm 处等离子体共振峰的强度改变来 观察银离子从双层膜中的洗脱。图 4（a） 显示了附加 6nm（由圆形表示） 或 12nm（由三角 形表示） HA 等离子体膜的淀积， 与没有附加 HA 等离子体膜的膜 （由正方形表示） 比较， 降低 的银离子释放速率， 。
附加的等离子体膜的厚度增加到 12nm（由三角形表示） 表现出银离子释放速率的 进一步降低， 超过了包括 6nm 膜的膜 （由圆形表示） 。显然， 银离子从 HA- 银等离子体膜中释 放的速率能够通过涂覆附加的表面等离子体涂层有效地控制， 据此银离子的释放速率能够 通过涂覆更厚的表面涂层降低。
HA- 银等离子体膜的抗菌性能 为评估 HA- 银等离子体膜抗菌性能， HA 等离子体膜、 HA- 银等离子体膜和涂覆了 6nmHA 膜的 HA- 银等离子体膜进行了上述的细菌抑制实验。
图 5（a） 显示了细菌容易吸附在不含银纳米颗粒的 HA 等离子体膜上， 并且 4hr 内 开始在表面形成菌落 （colonise） 。 然而， 相同的膜嵌入了银纳米颗粒时， 较少的细菌能吸附 到其表面上， 并且极少的细菌菌落形成能被观察到。另外， 在 HA- 银等离子体膜中观察到了 TM 浅红色菌落的出现， 其表示细菌死亡 （BacLight 染色后染成红色 / 绿色） 。图 5（c） 显示 了通过在 HA- 银等离子体膜表面涂覆附加的 HA 等离子体膜形成的缓释膜中细菌的附着及 生长。经过延长的 6 小时温育期后， 仅观察到少量单细菌粘附在表面上， 出现了 107CFU/ml 的死亡。另外， 未观察到细菌菌落形成的迹象。
HA- 银等离子体膜清楚地表现出了至少一种超过不含银纳米颗粒的膜的抑菌活 性， 并且同样的表现出杀菌性能。不过某些细菌能够在 HA- 银等离子体膜上观察到， 涂覆了附加 HA 等离子体膜的缓释膜表现出了延长的杀菌性能， 极大地减少了涂层表面的细菌数 量。
据此描述的方法提供了一种通过能够淀积在实际中的任意类型的固体表面上的 rfgd 等离子体聚合法制造抗菌涂层的高效方法。另外， 负载至等离子体膜中的银纳米颗粒 的浓度以及抗菌银离子的释放速率能够通过改变淀积时间、 银负载时间、 还原时间来控制， 或通过淀积涂覆了 HA 等离子体膜的附加表面来控制。
实例 2 嵌有铜纳米颗粒的等离子体聚合物膜的制造材料和方法该种制造上述 HA- 银等离子体膜的方法可以容易的用于形成包括其他金属纳米颗粒 的 HA 等离子体膜。Cu+ 和 Se 是已知的抗菌剂， 因此， 铜和 / 或硒纳米颗粒可以用于代替 HA 等离子体膜中的银纳米颗粒。
上述方法经过合适的改进后可以重复使用， 即改变 “银负载方法” 以向 HA 等离子 + + 体膜中负载 Cu 而不是 Ag 。特别地， “银负载方法” 中 0.02M AgNO3 替换为 0.02M CuNO3。可 以想到尽管淀积步骤或还原步骤只需要进行小小的改变， CuNO3 的浓度和铜负载时间还需 要优化。
Cu+ 负载和释放速率将被评估并优化， HA- 铜等离子体膜的抗菌活性可以如上述确定。
实例 3 带有银纳米颗粒的抗菌薄等离子体聚合物膜抗革兰氏阴性细菌的效力 实例 1 中， 发现嵌有银纳米颗粒的抗菌薄等离子体聚合物膜在抑制代表性的革兰氏阳 性细菌， 即所谓的 Staphylococcus epidermidis 菌株 ATTCC 35984， 很有效果。该实例中， 研究评估了这种膜抗革兰氏阴性细菌的效果， 这种细菌通常较难以抑制。
材料和方法细菌抑制研究 进行细菌抑制研究前， 采用 BacLight ™ 细菌活力检测法对 Escherichia coli K12 （MG1655） 菌株的存储培养物进行定量， 定量其中的活细菌。根据上述实例 1 制备 （有或没有 HA 重叠层膜 （overlayer film） ） ， 玻璃基质上的负载了银纳米颗粒的 HA 等离子体膜的正方 2 形样本 （1cm ） 放置在 Petri 培养皿中， 膜侧朝下， 培养皿中装有固体 LB 介质 （富含介质） 和 一圆形玻璃盖片作为对照。随后， 将 100μl 的存储培养物接种至固体介质上。各测试样本 如下 ： 样本 1 仅为 HA 等离子体膜 样本 2 HA- 银等离子体膜 样本 3 包括 HA- 银等离子体膜和 6nm HA 叠层的双层膜 样本 4 包括 HA- 银等离子体膜和 12nm HA 叠层的双层膜 样本 5 包括 HA- 银等离子体膜和 18nm HA 叠层的双层膜结果与讨论包含 HA- 银等离子体膜的样本的 Petri 培养皿在正方形的银负载膜的样本四周显示出 清楚的细菌抑制区域。使用光学显微镜， 估测出抑菌面积。结果显示在图 6 中。明显地， 所 有负载银的样本都有效地抑制了细菌生长。对于双层样本， 厚度超过 12nm 的 HA 等离子体 叠层 （用于降低银释放速率） ， 抑菌面积减少了约 50%。实例 4 嵌有银纳米颗粒的抗菌薄烯丙胺等离子体聚合物膜材料和方法材料 如制造商所提供地使用烯丙胺 （AA） 、 硝酸银、 氢硼酸钠和玻璃基质 （ （Sigma-Aldrich， 圣路易斯， MO， 美国） 。使用 Staphylococcus epidermidis 菌株 ATCC 35984 进行抑菌研究， 菌株在根据制造商的说明配制的胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB） 和 0.25% 的葡萄糖中于 37℃下培 养过夜制得。活和 / 或死细菌和 / 或菌落采用荧光显微镜观察。所有清洗过程采用超纯水 进行 （电阻率 18.2 欧姆） 。
等离子体聚合法 等离子体聚合在定做的反应器 （Griesser， HJ， 1989） 中进行， 如实例 1 简要描述的。采 用 13.56MHz 的等离子体发生器在 0.2Torr 的压力下进行淀积。 通过衡量某种功率下的淀积 速率来调节淀积时间从而获得所需的膜厚度 （例如 18nm） ， 从前面的研究已知所述淀积速率 为等离子体每持续 1 秒厚度增加 1nm。 玻璃基质首先采用 Piranha 溶液清洗， 充分地水洗并 干燥。在等离子体淀积前， 使用 40W 功率将基质用氧等离子清洗 40 秒。在某些例子中， 银 负载及还原后， 涂覆一 AA 叠层以制成一双层膜。 所述叠层的涂覆厚度为 6nm、 12nm 或 18nm。 银负载方法 通过将等离子体聚合物膜浸入 0.02M 的 AgNO3 溶液中进行银负载， 标准负载时间为 1hr。
银还原方法 通过将负载银的等离子体聚合物膜浸入 0.01M 的 NaBH4 溶液中进行银还原， 标准还原 时间为 30min。
UV- 可见光谱 采用 Carry 5 UV- 可见光谱计 （Varian Australia Pty Ltd， 墨尔本， 澳大利亚） 检测 并记录 UV- 可见光谱。
细菌抑制研究 进行细菌抑制研究前， 采用 BacLight ™细菌活力检测法对 S. epidermidis 菌株 ATTCC 35984 的存储培养物进行定量， 定量其中的活细菌。每个抗菌测试载玻片放在 12 微孔板的 孔中 （一次性细胞培养， Nunclon ™表面， 丹麦） 并且固定其中。载玻片接种 107CFU/ml（近似 200μl） 来自存储培养物的 S. epidermidis 菌株。所述板在 37℃下温育 4hr 以使细菌菌 落形成。载玻片从 12- 孔板中移出， 并如实例 1 中所述的进行准备， 采用荧光显微镜进行细 菌显影。
结果与讨论负载银纳米颗粒的 AA 等离子体膜的制造 使用 AA 作为前体， 采用定做的反应器在干净的玻璃表面生成薄的富含胺官能团的等 离子体聚合物膜。通过将所述膜浸入 AgNO3 溶液中 1hr， 将银离子 （Ag+） 与溶液中的 AA 胺基 团复合使银离子嵌入所述膜中。 随后， 通过将薄等离子体膜浸入 NaBH4 溶液中将银离子还原 成银纳米颗粒。图 7 显示了负载有银纳米颗粒的膜的吸收光谱图 （325nm 到 700nm） ； 420nm 处的吸收峰证明了嵌入膜中的银纳米颗粒的等离子体共振波长。
使用多层膜控制释放速率监测银从在水溶液中的 AA- 银等离子体膜中释放的速率。为了降低银释放速率， 第二 薄层 AA（6、 12 或 18nm） 淀积在 AA- 银等离子体膜表面。通过监测 420nm 处等离子体共振 峰的强度改变来监测银离子在 PBS 中 21 天时间段内的洗脱。图 8 显示了附加的 6nm （由圆 形表示） 或 12nm（由指向上方的三角形表示） AA 等离子体膜的淀积， 对比未附加 AA 等离子 体膜的膜 （由正方形表示） 银离子的释放速率降低。另外， 附加的等离子体膜的厚度增加到 18nm 时 （由指向下方的三角形表示） ， 表现出进一步降低的银离子释放速率， 膜上包括 12nm 的膜 （由向上方的三角形表示） 。
HA- 银等离子体膜的抗菌性能 为评估 AA- 银等离子体膜的抗菌性能， 将 AA 等离子体膜、 AA- 银等离子体膜和涂覆了 6nm AA 膜的 AA- 银等离子体膜进行了上述的细菌抑制测试。
采用 AA 等离子体膜观察到的结果与实例 1 中所述的 HA 膜的结果类似。也就是 说， 发现细菌容易吸附在不含银纳米颗粒的 AA 等离子体膜上， 并且在若干小时内开始在表 面形成菌落。相反， 当相同的膜嵌入了银纳米颗粒时， 较少的细菌能吸附到其表面上， 并且 只能观察到极少的菌落形成。 另外， AA- 银等离子体膜表面包括附加的 AA 等离子体叠层膜， 此时仅观察到少量单细菌粘附在表面上 （经过延长的 6 小时温育期） ， 并且未观察到菌落形 成的迹象。
实例 5 配体固定化到嵌有银纳米颗粒的抗菌薄 HA 等离子体聚合物膜上 本发明的抗菌膜具有一种或多种化学反应官能团， 其能够提供机会以提供附加的功能 特性和 / 或改进表面性能。为了证明这一点， 在本实例中， 将聚乙二醇 （PEG） 固定化到具有 胺基的 HA- 银等离子体膜的表面， 该膜根据实例 1 中所述的方法通过还原性胺化作用制得。 该反应的发生仅仅是由于存在表面胺基， 其能与 PEG- 乙醛的醛末端基团共价反应。
材料和方法在 60℃下和 PBS 中反应 12 小时将 PEG“接枝” 到 HA- 银等离子体膜表面。根据标准方 法对产品进行 XPS 分析和检测光谱分析 （survey spectrum analysis） 。
结果与讨论在 PEG 固定化 （ “PEG 接枝” ） 前、 后进行 HA- 银等离子体膜的 XPS 光谱分析。PEG 接枝 前， 从涂层的 XPS 光谱中可以清楚地鉴别出四种元素， 即碳、 氮、 氧 （来自等离子体聚合物膜） 和银 （来自银纳米颗粒） 。高分辨率 XPS 光谱的 C1s 峰表明表面碳的主要形态是脂肪族的 （C-C、 C-H 键） 。相反， PEG 接枝后， 由于接枝的 PEG 贡献 C-O 键， 表面的化学组分中的主要峰 出现在 XPS 光谱的 C1s 区。
检测光谱中也出现了这种改变。由于 PEG 叠层的存在， 银和氮峰的强度降低。由 于 PEG 中存在 C-O， 氧含量也增加了。
另外， 为了表明 PEG 接枝后银纳米颗粒仍留在膜层中， 进行了 UV- 可见光谱分析 （参见图 9） 。 该图表明尽管 PEG 接枝中包含的反应毫无疑问地会导致银纳米颗粒的氧化， 但 是由于银纳米颗粒的存在， PEG 接枝后， 仍然存在等离子体共振吸收。不过， 稍稍向较短的 波长偏移以及强度的微小降低表明氧化过程已经发生了， 但程度有限。
本实例的结果表明银纳米颗粒负载到 HA 等离子体聚合物膜上后， 聚合物基质的 表面仍能得到足够数量的胺官能团， 并且能够用于固定化各种配体， 如化合物以及生物分 子 （蛋白质、 肽等） 。贯穿本说明书的词语 “包括” （comprise） 或者各种如 “包含” （comprises） 或 “包 括” （comprising） 可以理解为意指包括所述的元素、 整体 （integer） 或者步骤， 或者元素、 整体或步骤的组， 但不排除任意其他的元素、 整体或步骤， 或者元素、 整体或步骤的组。
所有说明书中提到的公开这里都作为参考引入。 任何文献、 法规、 材料、 仪器、 文章 或类似物的讨论都包括在本发明说明书内， 其目的仅仅是提供本发明的背景。不应该认为 由于其在本申请的每条权利要求的优先权日期前出现在澳大利亚或其他地方， 任意或所有 这些内容构成部分在先技术基础或者是本发明相关领域的公知常识。
本领域技术人员应该理解可以对本发明如所示的具体实施例进行大量变更和 / 或改进， 而不脱离本发明广义描述的实质或范围。因此， 本发明实施例仅作为示例性使用， 而不是限制性。
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