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1、10申请公布号CN104099316A43申请公布日20141015CN104099316A21申请号201310123976322申请日20130411C12N11/08200601C12N11/04200601C08L51/02200601C08J3/2420060171申请人中国科学院大连化学物理研究所地址116023辽宁省大连市中山路457号72发明人马小军刘袖洞于炜婷丁东慧许冠哲74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人马驰54发明名称基于疏水改性海藻酸钠材料的两亲结构微球及制备和应用57摘要本发明涉及一种基于疏水改性海藻酸钠材料的两亲结构微球新产品。其特征在于微球。
2、产品为粒径104000微米的微球，产品特征是两亲结构微球由海藻酸钠（SA）为主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVAC）为主材的水凝胶结构。这种微球产品可作为酶或者细胞的固定化载体用于非水相生物催化。51INTCL权利要求书2页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图1页10申请公布号CN104099316ACN104099316A1/2页21基于疏水改性海藻酸钠材料的两亲结构微球，其特征在于微球产品为粒径104000微米的微球，两亲结构微球由海藻酸钠（SA）为主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVA。
3、C）为主材，形成海藻酸钠端亲水区和聚乙酸乙烯酯端疏水区。2按照权利要求1所述的微球，其特征在于产品中的海藻酸钠（SA）为主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVAC），其海藻酸钠主链平均分子量1005000KDA，接枝产物SAGPVAC的分子量为34360KDA，侧链接枝率150。3按照权利要求1所述的微球，其特征在于酶或微生物细胞包埋微球中或吸附于微球上；所述亲水区提供了保持酶或微生物细胞生物活性的水凝胶环境，疏水区增强疏水分子的扩散传递。4一种权利要求1、2或3所述微球的制备方法，其特征在于微球产品的制备按照生物活性酶或微生物细胞的引入方式分为直接包埋法或吸附法；其中，直。
4、接包埋法的制备步骤是1用生理盐水将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成浓度为520G/L（W/V）的溶液；2将步骤1制备的溶液与具有催化功能的酶或微生物细胞混匀；3将步骤2制备的含有酶或微生物细胞的混合溶液，采用挤出或乳化的方式形成球形液滴；4将步骤3制备的球形液滴通过化学交联剂或PH交联引发凝胶化反应，形成包埋酶或者微生物细胞的两亲结构微球；吸附法的制备步骤是1用生理盐水将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成浓度为520G/L（W/V）的溶液；2将步骤1制备的溶液采用挤出或乳化的方式形成球形液滴；3将步骤2制备的球形液滴通过化学交联剂或PH交联引发。
5、凝胶化反应，形成两亲结构微球；4将步骤3制备的微球浸泡在酶或者微生物细胞的混悬液中，吸附酶或微生物细胞，从而制备成吸附酶或者微生物细胞的两亲结构微球。5按照权利要求4所述微球的制备方法，其特征在于上述制备的包埋或吸附酶或微生物细胞的两亲结构微球可以与聚阳离子进一步反应成膜，制备成包埋有酶或微生物细胞的两亲结构微胶囊。6按照权利要求5所述微球的制备方法，其特征在于微球制备过程中所用聚阳离子包括壳聚糖及其衍生物、或聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亚胺及其衍生物中一种或二种以上，或上述二种以上聚阳离子的共聚物，分子量在1KDA500KDA。7按照权利要求4所述微球。
6、的制备方法，其特征在于微球制备过程采用的挤出方式包括静电喷雾挤出、锐孔压力挤出、或压电陶瓷挤出方式，在挤出方式下所用的化学交联剂包括钙、钡、锌中一种或二种以上的可溶性盐溶液，化学交联剂浓度为013MOL/L。权利要求书CN104099316A2/2页38按照权利要求4所述微球的制备方法，其特征在于微球制备过程采用的乳化方式包括乳化外部凝胶化方式，在该方式下所用的化学交联剂包括钙、钡、锌中一种或二种以上的可溶性盐溶液；化学交联剂浓度为013MOL/L或，微球制备过程采用的乳化方式还包括乳化内部凝胶化方式，在该方式下，需要将步骤（1）制得的溶液与不溶性钙盐均匀混合，所用的PH交联剂包括盐酸、醋酸溶。
7、液中一种或二种以上；体积浓度0110；所述不溶性钙盐包括碳酸钙、柠檬酸钙、草酸钙等中一种或二种以上；质量浓度1100G/L。9按照权利要求4所述微球的制备方法，其特征在于直接包埋法中步骤2时，将步骤1制备的溶液与具有催化功能的酶或微生物细胞混合；其中，酶包埋量011000MG/ML,微生物细胞包埋量1061011/ML。10按照权利要求1、2或3所述微球的应用，其特征在于微球产品作为酶或细胞的固定化载体，用于非水相生物催化。权利要求书CN104099316A1/5页4基于疏水改性海藻酸钠材料的两亲结构微球及制备和应用技术领域0001本发明涉及一种微球产品，具体地说是一种用于酶或细胞固定化的两亲。
8、结构微球产品及其在非水相生物催化领域的应用。背景技术0002生物催化的主要挑战是将生理状态下作用的酶转变为工业过程中苛刻条件下执行功能的催化剂,其中非水相生物催化是工业生物催化的一个重要方面。而生物催化剂酶或细胞的活性和稳定性保持是非水相生物催化需要解决的关键问题。0003从工程学的角度，固定化技术是一个简单易行且行之有效的手段，可以保持或提高生物催化剂在非水相中活性和稳定性。但传统的亲水性固定化载体应用于非水相介质时，疏水底物或产物难以扩散传递，成为整个生物催化过程的限速步骤。0004国际上关于两亲结构固定化载体的研究现状如下在四甲氧基硅烷中添加盐酸或氯铂酸的异丙醇溶液作为催化剂，经过水解或。
9、者升温至303K引发反应聚合，得到海藻酸钙凝胶网络包裹硅胶微球形式的亲、疏水骨架结构以包埋细胞或酶，用于生物转化KAWAKAMIKANDFURUKAWASY,ALCOHOLOXIDATIONACTIVITYOFWHOLECELLSOFPICHIAPASTORISENTRAPPEDINHYBRIDGELSCOMPOSEDOFCAALGINATEANDORGANICSILICATEAPPLIEDBIOCHEMISTRYANDBIOTECHNOLOGY,1997,672331。用聚羟乙基丙烯酸酯和聚硅氧烷复合材料，经紫外引发自由基聚合形成多孔膜，通过浸泡方式将酶吸附在纳米尺度的亲水区，而其中分布的疏。
10、水区用于疏水底物的扩散YIYY,KERMASHAS,NEUFELDRMATRIXPHYSICOCHEMICALPROPERTIESAFFECTACTIVITYOFENTRAPPEDCHLOROPHYLLASEJOURNALOFCHEMICALTECHNOLOGYANDBIOTECHNOLOGY,2005,801213951402。但是，上述两种体系反应条件苛刻，引入了非生物相容的化学催化剂、溶剂及疏水性成分，破坏了生物催化剂需要的温和水环境，导致其活性和稳定性明显下降。吴宏等使用了过硫酸钾为引发剂，将已经成型的海藻酸钙水凝胶与乙酸乙烯酯进行非均相接枝共聚反应，得到了接枝度为1074的改性胶珠（。
11、吴宏，萧聪明，周立春，等，KSP引发醋酸乙烯酯与海藻酸钙小球接枝共聚反应J化工科技，2002,10（5）1718）；方艳红等选择了过硫酸铵为引发剂，将海藻酸钙水凝胶与乙酸乙烯酯进行非均相接枝共聚反应，得到了接枝度1927的改性胶珠（方艳红，萧聪明，吴宏，等海藻酸钠水凝胶与VAC的接枝共聚反应J华侨大学学报（自然科学版），2005，26（2）138140）。但是，此种非均相共聚方法存在较大问题1、改性海藻酸钙的接枝度远超100，说明在海藻酸钙胶珠表面包覆形成的聚乙酸乙烯酯成为了主要结构，海藻酸钙的比例大幅降低，因此这类胶珠不能保持海藻酸钙原有的特性。2、当海藻酸钙胶珠用于包埋细胞或者敏感的生物活。
12、性物质时，在成型胶珠上接枝共聚反应会导致生物物质活性损失。本发明采用乙酸乙烯酯与海藻酸钠分子进行溶液聚合，通过控制乙酸乙烯酯的溶液共聚活性及聚合反应条件，制备出接枝度可控150的疏水改性海藻酸钠材料，该产品仍保持亲水性海藻酸钠主链结构，而且可以溶解并加工成海藻酸钙胶珠或水凝胶，不会对包埋的生物物质活性造成影响。说明书CN104099316A2/5页50005因此，在传统的固定化载体技术中，如何既提供亲水环境以保持生物催化剂的活性和稳定性，又提供疏水环境以促进疏水底物/产物传递，仍是非水相生物催化研究面临的重要挑战。发明内容0006针对上述问题，本发明将预先制备好的疏水改性后的海藻酸钠（SA）为。
13、主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVAC）为主材，将制备好的上述两亲海藻酸钠材料与生物活性功能的酶或微生物细胞混合，避免了在成型胶珠上接枝聚合反应导致的活性损失。具体是指0007技术方案0008一种基于疏水改性海藻酸钠材料的两亲结构微球，微球产品为粒径104000微米的微球，两亲结构微球由海藻酸钠（SA）为主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVAC）为主材，形成海藻酸钠端亲水区和聚乙酸乙烯酯端疏水区。0009所述亲水区提供了保持酶或微生物细胞生物活性的水凝胶环境，疏水区增强疏水分子的扩散传递，该微球产品可用于非水相生物催化。0010产品中主要成分是海藻。
14、酸钠（SA）为主链、聚乙酸乙烯酯（VAC）为侧链的接枝共聚物（SAGPVAC），其中，海藻酸钠主链平均分子量1005000KDA，接枝产物SAGPVAC的分子量为34360KDA，侧链接枝率150。0011接枝率的计算公式（参考文献梁景程，杨慧娟元素分析法测定高分子量PP接枝率R2007全国高分子学术论文报告会，2007）0012，MM1M2，0013C表示利用元素分析测得的接枝共聚物的碳含量，C1表示纯海藻酸钠的碳百分含量，C2表示纯聚乙酸乙烯酯的碳百分含量，M1表示共聚物中海藻酸钠的质量，M2表示聚乙酸乙烯酯的质量，M为元素分析测试中接枝共聚物的总质量。其中，M1，M2未知，利用上述公式计。
15、算得到，再以SAGPVAC中PVAC的质量M2除以SAGPVAC的总质量M，即为SAGPVAC产物的接枝度GY。0014其中，疏水改性材料产品的制备步骤为00151）去离子水配制海藻酸钠溶液（浓度550G/L），于水浴锅中加热至5070。00162）氮气保护下，加入过硫酸钾（KPS）溶液，浓度为0510MMOL/L，随后加入乙酸乙烯酯单体，乙酸乙烯酯单体与海藻酸钠的溶液体积比为120012，反应0510小时，即得到含有SAGPVAC的水溶液。00173）将上述水溶液醇沉、离心3000RPM后收集沉淀物，醇洗后干燥即得乙酸乙烯酯接枝海藻酸钠的材料产品。0018步骤3）中所述醇为乙醇，醇沉时其于溶。
16、液中的终质量浓度为5090。0019微球产品的制备按照生物活性酶或微生物细胞的引入方式分为直接包埋法或吸附法；0020其中，直接包埋法的制备步骤是00211用生理盐水将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成说明书CN104099316A3/5页6浓度为520G/L（W/V）的溶液；00222将步骤1制备的溶液与具有催化功能的酶或微生物细胞混匀；00233将步骤2制备的含有酶或微生物细胞的混合溶液，采用挤出或乳化的方式形成球形液滴；00244将步骤3制备的球形液滴通过化学交联剂或PH交联引发凝胶化反应，形成包埋酶或者微生物细胞的两亲结构微球；0025聚物材料（SAGPVAC）。
17、配制成浓度为520G/L（W/V）的溶液；00262将步骤1制备的溶液采用挤出或乳化的方式形成球形液滴；00273将步骤2制备的球形液滴通过化学交联剂或PH交联引发凝胶化反应，形成两亲结构微球；00284将步骤3制备的微球浸泡在酶或者微生物细胞的混悬液中，吸附酶或微生物细胞，从而制备成包埋酶或者微生物细胞的两亲结构微球。0029上述制备的包埋酶或微生物细胞的两亲结构微球可以与聚阳离子进一步反应成膜，制备成包埋有酶或微生物细胞的两亲结构微胶囊。0030其中，微球制备过程采用的挤出方式包括静电喷雾挤出、锐孔压力挤出、压电陶瓷挤出等方式，在挤出方式下所用的化学交联剂包括钙、钡、锌的可溶性盐溶液。00。
18、31微球制备过程采用的乳化方式包括乳化外部凝胶化方式，在该方式下所用的化学交联剂包括钙、钡、锌的可溶性盐溶液。0032微球制备过程采用的乳化方式还包括乳化内部凝胶化方式，在该方式下，需要将步骤（3）制得的混合溶液与不溶性钙盐均匀混合，所用的PH交联剂包括盐酸、醋酸溶液等；0033所述不溶性钙盐包括碳酸钙、柠檬酸钙、草酸钙等。0034微球制备过程中所用聚阳离子包括壳聚糖及其衍生物，或聚赖氨酸，聚鸟氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亚胺及其衍生物，及上述聚阳离子的共聚物，分子量在1KDA500KDA。0035微球产品作为酶或细胞的固定化载体，用于非水相生物催化。0036上述操作。
19、其它参数范围均为公知技术，具体参考文献见实施例。0037本发明的有益效果00381、本发明产品由于预先制备出两亲海藻酸钠材料，使得在微球制备整个过程中，都在生理条件下实现，利于生物催化剂（酶或微生物细胞）的活性和稳定性保持。00392、与传统的水凝胶微球相比，本发明的这种新型两亲结构微球产品，在作为酶或细胞的固定化载体用于非水相生物催化时，其油溶性底物或产物可快速扩散出微球，减少产物抑制，提高细胞活性。附图说明0040图1为实施例1制备的包埋有酵母细胞的两亲结构海藻酸钠壳聚糖微胶囊照片说明书CN104099316A4/5页7图中标尺为100M。具体实施方式0041将原料分子量为100KDA的海。
20、藻酸钠4G溶于100ML去离子水中，配制40G/L的海藻酸钠溶液，设置水浴温度为60。待水浴温度稳定后，在氮气保护下加入过硫酸钾溶液作为引发剂，过硫酸钾浓度为7MMOL/L。再加入100ML的乙酸乙烯酯单体，8H后停止反应。反应结束后，将已冷却了的反应液加入搅拌状态中的250ML无水乙醇中进行沉析，将沉析液进行转速3000RPM的离心后收集沉淀。将沉淀倒在直径15厘米的培养皿上，干燥后即得到SAGPVAC产物。0042微球采用如下方法制备获得静电液滴挤出法参考文献INVIVOCULTUREOFENCAPSULATEDENDOSTATINSECRETINGCHINESEHAMSTEROVARYC。
21、ELLSFORSYSTEMICTUMORINHIBITIONHUMANGENETHERAPY2007,18474481；锐孔挤出法参考文献一种高经济鱼类微球开口饵料的制备方法，中国发明专利，2005101367697、乳化外部凝胶化法参考文献POLYMBULL，2009，63599607、乳化内部凝胶化法参考文献乳化内部凝胶化工艺制备固定化酵母微胶囊，化工学报，2009，603710717或膜乳化法参考文献PREPARATIONOFUNIFORMCALCIUMALGINATEGELBEADSBYMEMBRANEEMULSIFICATIONCOUPLEDWITHINTERNALGELATION。。
22、JOURNALOFAPPLIEDPOLYMERSCIENCE,2003，87（5）848852。0043实施例100441将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成浓度为15G/L（W/V）的溶液；00452将08G2苯乙醇溶于80ML步骤1制备的溶液中，搅拌均匀后，静置除气泡；00463将步骤2制备的混合液在高压静电场作用下，通过注射器泵，滴加到100MM氯化钙溶液中具体制备条件参考INVIVOCULTUREOFENCAPSULATEDENDOSTATINSECRETINGCHINESEHAMSTEROVARYCELLSFORSYSTEMICTUMORINHIBITIONH。
23、UMANGENETHERAPY2007,18474481，即形成两亲结构海藻酸钙凝胶微球；00474将步骤3制备出的微球放入20ML水20ML癸二酸二丁酯的水油混合相中进行扩散试验，在扩散0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时各时间点从扩散体系中取样，液相色谱测定溶液中2苯乙醇含量，色谱条件流动相甲醇水5050，检测波长260NM，柱温30，流速08ML/MIN，进样10L；00485考察2苯乙醇向微球内的扩散行为，结果显示，微溶于水的2苯乙醇2PHENYLETHANOL在两亲结构微球中的扩散速率明显加快，累积扩散量是亲水结构微球的2倍。0049。
24、比较例100501将08G2苯乙醇溶于80ML15G/L海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，静置除气泡；00512将上述混合液在高压静电场作用下，通过注射器泵，滴加到100MM氯化钙溶液中，制备条件同实施例1，即形成传统亲水结构海藻酸钙凝胶微球；00523将步骤2制备出的微球5ML置于20ML水20ML癸二酸二丁酯的水油混合相中进行2苯乙醇释放试验，于10MIN、20MIN、30MIN、1H、2H、4H、8H、12H、24H取样1ML；说明书CN104099316A5/5页800534液相色谱法测定2苯乙醇含量，色谱条件同实施例1，结果显示，微溶于水的2苯乙醇2PHENYLETHANOL在传统亲水结构。
25、海藻酸钙微球中的释放速率明显低于实施例1中的两亲结构微球，累积释放量是两亲结构微球的一半。0054实施例200551将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成浓度为15G/L（W/V）的溶液；00562将步骤1制备的溶液与酵母细胞种子液混合，细胞接种量在5106/ML溶液；00573将步骤2制备的溶液与碳酸钙粉均匀混合制备成混悬液；00584将步骤3制备的混悬液，与液体石蜡，通过油包水乳化，形成油包水乳液；00595在步骤4的乳液中，引入冰醋酸凝胶引发剂，即通过乳化内部凝胶化技术，形成包埋有酵母细胞的两亲结构海藻酸钙凝胶微球；00606将步骤5制备的微球与壳聚糖成膜反应10分。
26、钟后，生理盐水清洗，即获得包埋有酵母细胞的两亲结构微胶囊；00617将步骤6制备的包埋有酵母细胞的两亲结构微胶囊于培养液中培养72小时，微囊内酵母细胞生长增殖成细胞团见附图1；00628将步骤7获得的微胶囊于含有L苯丙氨酸底物的培养液（葡萄糖20G/L、蛋白胨20G/L、酵母膏10G/L、L苯丙氨酸6G/L）中发酵，并用癸二酸二丁酯萃取2苯乙醇产物，在两亲结构微球的保护下，细胞活性保持6天以上，并持续保持生物催化活性，2苯乙醇产物在4G/L以上。0063实施例300641将海藻酸钠聚乙酸乙烯酯接枝共聚物材料（SAGPVAC）配制成浓度为20G/L（W/V）的溶液；00652将50G/L脂肪酶溶。
27、液与步骤1制备的溶液混合，搅拌均匀后，静置除气泡；00663将步骤2制备的混合液在高压静电场作用下，通过注射器泵，滴加到100MM氯化钙溶液中，即形成两亲结构海藻酸钙凝胶微球；00674配制5G/L壳聚糖溶液，凝胶微球与壳聚糖溶液按体积15混合交联，得到载脂肪酶两亲海藻酸钙壳聚糖微球；00685将步骤4制备出的微球用于催化橄榄油、菜油等油脂部分反应条件参考脂肪酶的固定化及其催化合成生物柴油石油化工,2009,3813361341固定化脂肪酶性质及其应用研究生物加工过程,2007,514549，其中橄榄油的转化率接近90，且高于游离酶10以上；固定化脂肪酶连续使用5次，仍可保持约60酶活。说明书CN104099316A1/1页9图1说明书附图CN104099316A。