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1、10申请公布号CN104109253A43申请公布日20141022CN104109253A21申请号201410341143922申请日20140717C08J3/24200601C08H1/00200601A61K47/42200601C07D207/4620060171申请人四川大学地址610065四川省成都市武侯区一环路南一段24号72发明人李国英解朵刘文涛74专利代理机构成都科海专利事务有限责任公司51202代理人邓继轩54发明名称一种以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法57摘要本发明公开了一种以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特点是将牛皮胶。
2、原海绵用PH为74的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，得到46MG/ML的胶原溶液。再将二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨基的摩尔数之比为121混合，在冰浴中搅拌13MIN，然后将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温48H，使胶原自聚集成纤维，得到以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。本发明制备得到的胶原凝胶产品用于药物缓释。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104109253ACN104109253A1/1页21一种以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺。
3、酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特征是该方法包括以下步骤1胶原溶液的制备将牛皮胶原海绵用PH为74的磷酸盐缓冲液，在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为46MG/ML的胶原溶液；2胶原凝胶的制备将二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨基的摩尔数之比为121混合，在冰浴中搅拌13MIN，再将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温48H，使胶原自聚集成纤维，得到基于二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯交联的胶原凝胶。2如权利要求1所述以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特征在于二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯的制备将二元羧酸、N羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺按照物质的量比。
4、为0511212混合，按每1份N羟基琥珀酰亚胺加入3570份丙酮溶解配制成溶液；并在常温下反应1224H，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯。3如权利要求1或2所述以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特征在于二元羧酸为丙二酸、己二酸或癸二酸中的任一种。4如权利要求13之一所述以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法制备得到以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。5如权利要求3所述以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶用于药物缓释。权利要求书CN104109253A1/5页3一种以。
5、二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法技术领域0001本发明涉及一种以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，属于蛋白质的资源化利用领域。背景技术0002胶原是细胞外基质的主要成分，主要给细胞提供抗张力和弹性，在细胞的迁移和发育中起着重要的作用。胶原具有独特的三股螺旋结构，赋予了其优异的生物学性能，如低免疫原性、良好的生物相容性、细胞再生性和可降解性，因此被广泛的应用于生物医学材料领域。0003在生理条件下，胶原溶液中分子间的相互作用可以使其自聚集成胶原纤维，自聚集的胶原纤维之间会形成网络结构并将溶液中的溶剂束缚在其内部使其不能自由移动，从而形成胶原凝胶，它被广泛的。
6、应用于药物缓释领域。然而，胶原本身自聚集成胶原纤维而形成的凝胶的稳定性还不够，一般在胶原凝胶中引入交联剂使其进一步固定。在动物体内胶原纤维的共价交联由赖氨酰氧化酶催化完成的，它能将赖氨酸和羟赖氨酸的氨基氧化成醛基，醛基之间或醛基与周围的氨基之间发生反应形成交联键。我们运用这种仿生的方法，在胶原中加入交联剂进一步固定胶原纤维，提高胶原凝胶的性能。0004戊二醛和碳化二亚胺EDC是目前应用最为广泛的胶原凝胶的交联剂。SHEU等人的研究表明在胶原凝胶中加入02的戊二醛，可以使凝胶的弹性模量从4320PA大幅度增大到7230PA，但用交联后的胶原凝胶培养细胞时会抑制细胞的繁殖。SHEUMT,HUANG。
7、JC,YEHGC,ETALCHARACTERIZATIONOFCOLLAGENGELSOLUTIONSANDCOLLAGENMATRICESFORCELLCULTUREBIOMATERIALS,2001,221317131719所以说，给胶原凝胶中引入戊二醛会增加其细胞毒性，这在很多文献中都被证实。HIDEKIMORI等人以125MM的EDC为交联剂，胶原成纤维和交联同时进行，将胶原凝胶的弹性模量由441PA提高到798PA。HMORI，KSHIMIZU，MHARADYNAMICVISCOELASTICPROPERTIESOFCOLLAGENGELSINTHEPRESENCEANDABSENC。
8、EOFCOLLAGENFIBRILSMATERIALSSCIENCEANDENGINEERINGC,2012,3220072016这种交联剂有着较低的细胞毒性，但是，这种交联剂没有成为交联键的一部分，交联是“零长度交联”，用量较大若达到相同的交联度，其用量是含有六个碳原子交联剂用量的近百倍。GRABAREKZGERGELYJZEROLENGTHCROSSLINKINGPROCEDUREWITHTHEUSEOFACTIVEESTERSANALYTICALBIOCHEMISTRY,1990,18511311350005羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯是一类新型低毒的蛋白质类交联剂。HIROFUMISAITO。
9、等人制备出了柠檬酸N羟基琥珀酰亚胺酯CAD和苹果酸N羟基琥珀酰亚胺酯MAD。该交联剂有较高的反应活性和良好的生物相容性。但用这种交联剂制备得到的胶原凝胶，与未加交联剂的胶原凝胶相比其弹性模量没有提高，CAD交联甚至会降低胶原凝胶的弹性模量。HSAITO,TTAGUCHIETALPHRESPONSIVESWELLINGBEHAVIOROFCOLLAGENGELS说明书CN104109253A2/5页4PREPAREDBYNOVELCROSSLINKERSBASEDONNATURALLYDERIVEDDIORTRICARBOXYLICACIDSACTABIOMATERIALIA,2007,3899。
10、4这种胶原凝胶不稳定，容易破碎，不利于药物缓释领域中的应用。发明内容0006本发明的目的是针对现有胶原凝胶性能的不足而提供了一种以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特点是用二元羧酸、N羟基琥珀酰亚胺NHS、二环己基碳二亚胺DCC合成了一种天然、无毒的交联剂，并将该交联剂用于胶原凝胶的改性，制备热稳定、吸水性、机械性能更好的胶原凝胶，用于药物缓释领域。0007本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为摩尔份数。0008以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法包括以下步骤00091胶原溶液的制备0010将牛皮胶原海绵用PH为74的磷酸盐缓。
11、冲液，在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为46MG/ML的胶原溶液；00112胶原凝胶的制备0012将二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨基的摩尔数之比为121混合，在冰浴中搅拌13MIN，再将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温48H，使胶原自聚集成纤维，得到基于二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯交联的胶原凝胶。0013所述二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯的制备0014将二元羧酸、N羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺按照物质的量比为0511212混合，按每1份N羟基琥珀酰亚胺加入3570份丙酮溶解配制成溶液；并在常温下反应1224H，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶。
12、，真空干燥得到二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯。0015二元羧酸为丙二酸、己二酸或癸二酸中的任一种。0016以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法制备得到以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。0017以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶用于药物缓释。0018性能测试00191、热稳定性测试0020将10MG胶原凝胶封存于铝坩埚中，并以10MG的磷酸盐缓冲液为参比，在氮气保护下，以5/MIN的升温速率从3080扫描样品，并记录样品的差热分析DSC曲线，吸热曲线的峰值作为胶原凝胶的热变性温度。结果详见图1所示。结果表明，联剂交联后的胶原凝胶的热稳定性较未交联的。
13、胶原凝胶有很大改善，为45975447。00212、含水量测试0022先将胶原凝胶在室温下置于50ML去离子水中，浸泡3天，每天换液两次，让其充分吸水。接着用滤纸轻轻擦拭凝胶表面，除去吸附在其表面的水，再称量凝胶的重量，记为凝胶的湿重。最后将凝胶冷冻干燥后称重，记为凝胶的干重。按照公式说明书CN104109253A3/5页50023含水量凝胶的湿重凝胶的干重/凝胶的干重1000024结果详见表1所示。结果表明，胶原凝胶的含水量为1800028000，胶原凝胶具有优良的吸水性，使用以二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂也不会降低胶原凝胶的含水量，仍具有优良的吸水性。00253、动态粘弹性测试002。
14、6将胶原凝胶置于GEMINI200型流变仪平行板夹具中直径为40MM，板间距为2000MM，对其应力应变扫描后，在线性粘弹性区域内选择应变大小为2，并设定温度为20，再测定不同胶原凝胶的动态粘弹性随频率00110HZ的变化曲线。结果详见表2所示。结果表明，胶原凝胶的弹性特征远远大于粘性特征，主要表现为弹性凝胶，不易破碎，在1HZ时，弹性模量在15098PA39827PA。0027本发明具有如下优点00281、本发明制备的二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂有着良好的生物相容性和反应活性，且毒性低。00292、本发明是以丙二酸、己二酸和癸二酸为原料制备不同碳链长度的二元羧酸N羟基琥珀酰亚胺酯作为。
15、胶原凝胶的交联剂，将二元羧酸作为交联键的一部分留在胶原纤维内部，将两个或两个以上的胶原分子用羧酸的碳骨架连接起来，从而提高胶原凝胶的稳定性。与“零长度交联”的碳化二亚胺EDC相比，达到相同交联度的用量要低很多。00303、本发明的胶原凝胶是在生理条件下制备出来的，制备出的胶原凝胶除具有优良的低免疫原型、生物相容性，可降解性，还具有优良的吸水性、热稳定性及弹性特征，用于组织工程和药物缓释等领域。附图说明0031图1为DSC曲线图具体实施方式0032下面通过实施例对本发明做具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员，可以。
16、根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。0033实施例10034将牛皮胶原海绵用PH为74的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为5MG/ML的胶原溶液；将己二酸、NHS、DCC按照物质的量比为05111混合，按每1份N羟基琥珀酰亚胺加入50份丙酮溶解配制成溶液，在常温下搅拌反应20H，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到己二酸N琥珀酰亚胺酯。将己二酸N琥珀酰亚胺酯酯溶解在二甲基亚砜中，按照NHS己二酸/NH2比例为151滴加到胶原溶液中，在冰浴中搅拌1MIN后，将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温6H，使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝。
17、胶的热稳定性为4997，含水量为24000，弹性特征远大于粘性特征，在1HZ时弹性模量为28882PA。0035实施例20036将牛皮胶原海绵用PH为74的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为说明书CN104109253A4/5页64MG/ML的胶原溶液；将癸二酸、NHS、DCC按照物质的量比为0522混合，按每1份N羟基琥珀酰亚胺加入35份丙酮溶解配制成溶液，在常温下搅拌反应12H，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到癸二酸N羟基琥珀酰亚胺酯。将癸二酸N羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲基亚砜中，按照NHS癸二酸/NH2比例为21滴加到胶原溶液中，在冰浴中搅拌15M。
18、IN后，将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温4H，使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝胶的热稳定性为5447，含水量为28000，弹性特征远大于粘性特征，在1HZ时在弹性模量为39827PA。0037实施例30038将牛皮胶原海绵用PH为74的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为6MG/ML的胶原溶液；将丙二酸、NHS、DCC按照物质的量比为11112混合，按每1份N羟基琥珀酰亚胺加入70份丙酮溶解成溶液，在常温下搅拌反应24H，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到丙二酸N羟基琥珀酰亚胺酯。将丙二酸N羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲基亚砜中，按照NHS。
19、丙二酸/NH2比例为11滴加到胶原溶液中，在冰浴中搅拌3MIN后，将胶原混合溶液置于温度37的水浴锅中恒温8H，使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝胶的热稳定性为4597，含水量为18000，弹性特征远大于粘性特征，在1HZ时弹性模量为15098PA。0039应用实例0040将实施例1制备的胶原凝胶应用于四环素的药物缓释。先制得四环素溶液的标准曲线。将胶原凝胶浸泡于含有四环素的PH为74的磷酸盐缓冲液中，其中四环素在缓冲液中的质量分数为40，静置48H，得到含有四环素的胶原凝胶，并检测浸泡胶原凝胶前后缓冲液的吸光值，测定四环素的载药量。称取5MG的胶原凝胶置于透析袋中，随后将透析袋放入装有50ML的PH为74的磷酸盐缓冲液的离心管中，于温度37水浴中振摇，开始每隔半小时，5H后每隔1H取1ML缓冲液测定四环素的含量，同时加入1ML缓冲液于离心管中。测得四环素的载药量为35，四环素的最终释放量为593。0041表1为水含量测试结果00420043表2为动态粘弹性测试结果0044说明书CN104109253A5/5页7说明书CN104109253A1/1页8图1说明书附图CN104109253A。