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1、10申请公布号CN104099311A43申请公布日20141015CN104099311A21申请号201310129942522申请日20130415C12N9/42200601C12P19/14200601C12N1/19200601C12R1/80200601C12R1/8420060171申请人青岛蔚蓝生物集团有限公司地址266061山东省青岛市崂山区苗岭路29号高速大厦12A07室72发明人肖志壮徐晓东付娟王霁昀刘安邦王海刘鲁民刘国栋陈梅曲音波74专利代理机构北京汇泽知识产权代理有限公司11228代理人张瑾54发明名称一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用57摘要本发明涉。
2、及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，所述工程菌携带有能表达斜卧青霉（PENICILLIUMDECUMBENS）的木聚糖酶基因的表达载体。利用本发明的毕赤酵母工程菌高效表达的木聚糖酶，在酸性条件下具有很高的活性，且对底物专一性高。所述木聚糖酶可被广泛用于低聚木糖的生产。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表6页附图2页10申请公布号CN104099311ACN104099311A1/1页21一种木聚糖酶，其具有1）SEQIDNO1所示的氨基酸序列；或者2）在SEQIDNO1中取代、缺失或添加一。
3、个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚糖酶活性的氨基酸序列。2权利要求1所述的木聚糖酶，其编码基因为1）核苷酸序列SEQIDNO2所示的DNA分子；或者2）在严格条件下与SEQIDNO2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的DNA分子。3一种木聚糖酶，其在PH4070的范围内能保持80以上的活性，在温度4070的范围内，能保持50以上的活性，最适PH值为50，最适反应温度为60。4权利要求1至3中任一项所述的木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。5一种重组毕赤酵母工程菌，其携带有含权利要求1至3中任一项所述木聚糖酶的编码基因的表达载体。6权利要求5所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的表达。
4、载体为PPIC9K。7权利要求5或6所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。8权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌在在生产低聚木糖中的用途。9一种生产低聚木糖的方法，该方法包括（1）发酵培养权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌，获得木聚糖酶；（2）用获得的木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。10权利要求9所述的生产低聚木糖的方法，其中所述的低聚木糖产物中低聚木二糖低聚木七糖的含量高于70，低聚木二糖低聚木四糖含量高于50，单糖含量低于30。权利要求书CN104099311A1/6页3一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应。
5、用技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用。技术背景0002低聚木糖亦称木寡糖（XYLOOLIGOSACCHARIDES），是由210个D木糖以1,4木糖苷键结合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一个重要成员。低聚木糖有明显的双歧杆菌增殖作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大多数肠道菌对低聚木糖的利用都比较差，能抑制肠道有害菌的生长发育；低聚木糖不被消化，与其他的低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，可满足患有诸如糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要；低聚木糖有抗龋齿，有利于口腔健康；低聚。
6、木糖促进人体对钙的吸收，防止老化和骨质疏松症。低聚木糖已经广泛应用于医药保健品、乳品饮料、食品和饲料等。0003低聚木糖的生产通常是采用物理、化学及酶解等方法水解富含木聚糖的原料，然后对产物进行提取精制。制备低聚木糖的原料是木聚糖，它在玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木等农林产品中含量相对较高，平均可达30左右。目前生产低聚木糖的主要方法是酶法水解木聚糖。利用内切木聚糖酶水解木聚糖底物得到的以木二糖、木三糖为主要成分的混合物。而酶解法的关键在于木聚糖酶对应底物的适应性，即选择合适的木聚糖酶。0004很多微生物如细菌、霉菌和放线菌等均能产生木聚糖酶。木聚糖酶来源不同，结构和性质也不尽相同，其酶解。
7、木聚糖后释放出的寡糖链长也不相同。而木二糖、木三糖和木四糖是低聚木糖中功效较好的组分，因此这几种组分在酶解产物中含量越高越好。目前人们研究和应用最多的是细菌和霉菌来源的木聚糖酶，其酶解木聚糖的产物中木二糖木四糖的含量比较低，而木糖及其他链长度组分含量较高。因此，现在急需开发出性能更好、专一性更强的木聚糖酶，更广泛的应用于低聚木糖的生产。发明内容0005本发明的目的是提供一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程技术手段，将斜卧青霉（PENICILLIUMDECUMBENS）的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有。
8、较高的活性。该酶对底物的专一性强，利用其酶解作用生产的低聚木糖中二糖、三糖和四糖的含量高，适用于高效生产低聚木糖。0006申请人经过大量的筛选后，发现将克隆自斜卧青霉的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，毕赤酵母表达的木聚糖酶对底物的专一性很强，从而促成本发明。0007一方面，本发明提供了一种克隆自斜卧青霉的木聚糖酶，该木聚糖酶的最适PH值为50，在PH4070的范围内能保持80以上的活性；最适反应温度为60，在温度4070的范围内，能保持50以上的活性。说明书CN104099311A2/6页40008本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶，其具有00091）SEQIDNO1所示的氨基酸序列；或者00102。
9、）在SEQIDNO1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚糖酶活性的氨基酸序列。0011本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因为00121）核苷酸序列SEQIDNO2所示的DNA分子；00132）在严格条件下与SEQIDNO2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的DNA分子。0014在本发明的一个优选实施方案中，上述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因具有SEQIDNO2所示的核苷酸序列。0015本发明所述木聚糖酶能针对性的酶解木聚糖。酶解产物中低聚木二糖低聚木七糖的含量高于70，低聚木二糖低聚木四糖含量高于50，单糖含量低于30。0016因此，本发明另一方面提供了。
10、上述木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。0017另一方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该工程菌携带有能表达所述斜卧青霉木聚糖酶基因的表达载体。0018在本发明的一个实施方案中，所述的表达载体为PPIC9K，筛选标记为遗传霉素。0019在本发明的一个实施方案中，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。0020另一方面，本发明提供了上述毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的用途。0021另一方面，本发明还提供了用于克隆木聚糖酶编码基因的引物对，其核苷酸序列为0022引物F5GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG3（SEQIDNO3）0023引物R5TAAAGC。
11、GGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA3（SEQIDNO4）0024另一方面，本发明提供了一种生产低聚木糖的方法，该方法包括0025（1）发酵培养本发明所述的毕赤酵母工程菌，获得本发明所述的木聚糖酶；0026（2）用所述木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。0027本发明所述的含木聚糖的原料包括但不限于玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木等。0028在本发明的低聚木糖产物中，低聚木二糖低聚木七糖的含量高于70，低聚木二糖低聚木四糖含量高于50，单糖含量低于30。0029发明优点0030本发明构建了高效表达斜卧青霉木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，其生产的木聚糖酶在酸性范围内具。
12、有较高的酶活性，最适PH值为50，在PH4070的范围内能保持80以上的活性；最适反应温度为60，在温度4070的范围内，能保持50以上的活性。该木聚糖酶具有很强的底物专一性，能针对性的酶解木聚糖。本发明的木聚糖酶可应用于低聚木糖的生产，产物中低聚木二糖低聚木七糖的含量高于70，低聚木二糖低聚木四糖含量高于50，单糖含量低于30，应用前景广泛。附图说明0031图1、木聚糖酶基因XYNQ1的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。说明书CN104099311A3/6页50032图2、构建的重组表达载体PPIC9KXYNQ1示意图。0033图3、毕赤酵母工程菌发酵上清液SDSPAGE电泳图，箭头所示为重组木聚。
13、糖酶XYNQ1。0034图4、重组木聚糖酶XYNQ1的发酵曲线。0035图5、重组木聚糖酶XYNQ1的PH特性分析。0036图6、重组木聚糖酶XYNQ1的反应温度分析。具体实施方式0037下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J萨姆布鲁克（SAMBROOK）等编写的分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。0038实施例0039实施例1斜卧青霉木聚糖酶基因的克隆0040查阅GE。
14、NBANK中的基因序列，找到糖苷水解酶10家族中的一个木聚糖酶基因，该基因来源于斜卧青霉（PENICILLIUMDECUMBENS），GENBANK号为HQ2866381。通过上海捷瑞生物工程有限公司合成该木聚糖酶基因，命名为XYNQ1，并对合成基因进行了密码子优化，优化后的基因序列为SEQIDNO2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO1。0041采用PCR反应克隆木聚糖酶基因XYNQ1片段，引物和反应条件如下0042引物1F5GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG30043引物2R5TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA30044反应。
15、条件为94变性5MIN；然后94变性30S，56复性30S，72延伸90S，30个循环后，72保温10MIN。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图1所示，XYNQ1基因为大小1167BP的片段。0045实施例2重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建004621、表达载体的构建0047将克隆得到的木聚糖酶基因XYNQ1片段，用限制性内切酶ECORI和NOTI进行双酶切，100L酶切体系如下木聚糖酶基因XYNQ1PCR产物40L、10HBUFFER10L、10BSA10L、ECORI5L、NOTI5L、DDH2O30L。37酶切4H后，琼脂糖凝胶电泳回收。0048将表达载体PP。
16、IC9K先用限制性内切酶ECORI进行单酶切，100L酶切体系如下表达载体PPIC9K20L、10HBUFFER10L、ECORI5L、DDH2O65L。37酶切4H后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶NOTI进行单酶切，100L酶切体系如下PPIC9K回收片段20L、10HBUFFER10L、10BSA10L、10TRITON10L、NOTI5L、DDH2O45L。37酶切4H后，琼脂糖凝胶电泳回收。0049将经ECORI和NOTI双酶切的XYNQ1片段与表达载体PPIC9K相连接，构建表达载体PPIC9KXYNQ1，如图2所示。连接体系如下表达载体PPIC9K5L、XYNQ1。
17、片段3L、10T4LIGASEBUFFER1L、T4LIGASE1L。22连接过夜，转化到大肠杆菌DH5，挑取转说明书CN104099311A4/6页6化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒PPIC9KXYNQ1。005022、转化与筛选0051将重组酵母表达质粒PPIC9KXYNQ1用SALI进行线性化，线性化片段用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。005223、发酵验证0053挑取单个阳性。
18、转化子转接于BMGY培养基中，30，250RPM振荡培养1D后，再转入BMM培养基中，30，250RPM振荡培养，每天添加05的甲醇。诱导表达4D后，离心去除菌体，将上清液进行SDSPAGE电泳检测（图3）。如图3所示，箭头所指处即为本发明的重组表达木聚糖酶XYNQ1，分子量为40KDA左右。上清液中木聚糖酶活力测定结果显示，摇瓶水平下木聚糖酶XYNQ1的表达量达到160U/ML。将上述阳性转化子命名为巴斯德毕赤酵母XYNQ1（PICHIAPASTORISXYNQ1）。0054木聚糖酶酶活力检测方法如下0055取2ML浓度为1的木聚糖底物（PH55乙酸乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37平。
19、衡10MIN，再加入2ML经PH55乙酸乙酸钠缓冲液适当稀释并经37平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37精确保温反应30MIN。反应结束后，加入5MLDNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5MIN，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ML，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540NM处测定吸光值AE。0056酶活单位定义在37、PH值为55的条件下，每分钟从浓度为5MG/ML的木聚糖溶液中释放1MOL还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。0057酶活计算公式00580059式中XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ML；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；。
20、C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，1502G/MOL；T为酶解反应时间，MIN；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1MMOL1000MOL。0060实施例3毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的应用0061在10升发酵罐上进行上述毕赤酵母工程菌的发酵。0062发酵培养基配方硫酸钙11G/L、磷酸二氢钾55G/L、磷酸二氢铵55G/L、硫酸钾203G/L、硫酸镁164G/L、氢氧化钾165G/L、消泡剂005。0063发酵生产工艺PH值50、温度30、搅拌速率300RPM、通风量1015（V/V）、溶氧控制在20以上。0064整个发酵过程分为三个阶段第一阶段为菌体培养阶段，按7比例接入种子。
21、，30培养2426H，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80以上，表明该阶段结束，为期约3060MIN；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20以上，培养时间在150180H之间。发酵结束后，将发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。通过测定不同时间段发酵液中的菌体量和木说明书CN104099311A5/6页7聚糖酶XYNQ1的酶活，制得发酵进程曲线。结果如图4所示，毕赤酵母工程菌最终的发酵酶活能达到1500U/ML。0065实施例4木聚糖酶的酶学性质测定006641、最适反应PH的测定0067采用PH值分别为20、25、30、。
22、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，将发酵的上清液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应PH值的缓冲液配制，在37下分别进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100，计算相对酶活，做PH相对酶活曲线。结果如图5所示，本发明生产的木聚糖酶XYNQ1最适反应PH值为50，为酸性木聚糖酶，在PH4070的范围内能保持80以上的活性。006842、最适反应温度的测定0069在PH55条件下，分别测定30、35、40、45、50、55、60、65、70温度时发酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100，计算相对酶活，做温度相对酶活曲线。结果如图6所示，。
23、本发明生产的木聚糖酶XYNQ1最适反应温度为60，在温度4070的范围内，能保持50以上的活性。0070实施例5木聚糖酶在生产低聚木糖中的应用0071将玉米芯进行清洗、粉碎，在高温、高压、弱酸性条件下蒸煮处理；蒸煮液降温至4050后，按30005000U/L添加量加入本发明生产的木聚糖酶，搅拌均匀后，维持在4050约7小时，进行充分酶解。酶解结束后，将蒸煮液升温煮沸10MIN，滤纸过滤取上清液。将得到的上清液进行活性炭脱色处理，按照国标QBT29842008低聚木糖所述方法测定各糖组分的含量，测定结果如下表所示。0072从下表可以看出，利用本发明生产的木聚糖酶XYNQ1水解玉米芯后得到的产物中。
24、，低聚木二糖低聚木七糖的含量高于70，低聚木二糖低聚木四糖含量高于50，单糖含量低于30。实验结果表明，本发明的木聚糖酶可广泛用于低聚木糖的生产，能有效提高低聚木糖的产量。0073序号糖组分含量1木七糖553792木六糖758983木五糖653094木四糖1143625木三糖1490516木二糖2407337葡萄糖103399说明书CN104099311A6/6页88木糖1272479阿拉伯糖6862说明书CN104099311A1/6页9序列表青岛蔚蓝生物集团有限公司一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用4PATENTINVERSION341410PRT斜卧青霉（PENICILLI。
25、UMDECUMBENS）木聚糖酶蛋白14101METVALHISLEUSERALATHRSERLEULEULEUALAALAGLYILELEU151015PROASNLEUALALEUGLYALAGLYLEUASNASPALAALALYSALAILE202530GLYGLNVALTYRPHEGLYSERALATHRASPASNPROGLULEUSERASP354045SERALATYRVALLYSGLNLEUSERASNTHRALAASPPHEGLYGLNILE505560序列表CN104099311A2/6页10THRPROGLYASNSERGLNLYSTRPASPALATHRGLUPROS。
26、ERARGASN65707580VALPHETHRPHESERGLYGLYASPTHRVALALALYSLEUALAGLNSER859095ASNGLYGLNLYSLEUARGCYSHISASNLEUVALTRPHISSERGLNLEU100105110PROSERTRPVALTHRASNGLYASNPHEASNASNALATHRLEUILESER115120125ILEMETLYSASNHISILETHRASNLEUVALGLNHISTYRLYSGLYGLN130135140CYSTYRALATRPASPVALVALASNGLUALALEUASNGLUASPGLYSER14515015516。
27、0TYRARGGLNSERVALTRPTYRASNTHRILEGLYPROALATYRLEUPRO165170175ILEALAPHEALATHRALAALASERVALASPPROTHRVALLYSLEUTYR180185190TYRASNASPTYRASNILEGLUTYRSERGLYALALYSALAALAGLYALA195200205ARGARGILEVALGLULEUVALGLNSERTYRGLYALALYSILEASPGLY序列表CN104099311A103/6页11210215220VALGLYLEUGLNALAHISPHEILEVALGLYSERTHRPROSERLYSASP。
28、225230235240ASPGLNLYSLYSVALMETALAGLYTYRTHRALATYRGLYVALGLUVAL245250255ALAILETHRGLULEUASPILEARGMETASNLEUPROSERTHRASNALA260265270GLNLEUTHRGLNGLNALATHRASPTYRSERASNTHRVALSERALACYS275280285VALGLUTHRLYSASNCYSVALGLYILETHRILETRPASPTRPTHRASP290295300LYSTYRSERTRPVALPROSERTHRPHESERGLYGLNGLYALAALACYS305310315320。
29、PROTRPASPSERASNPHEGLNLYSLYSPROALATYRASNALAILELEU325330335ASNALALEUASNALAGLYSERSERTHRGLYGLYGLYSERPROTHRTHR340345350THRTHRTHRTHRTHRALAALAALATHRTHRTHRTHRALAPROGLYGLY355360365序列表CN104099311A114/6页12SERGLYSERTHRGLYGLYMETALAGLNHISTRPGLYGLNCYSGLYGLY370375380ASNGLYTRPTHRGLYPROTHRTHRCYSALASERPROTYRTHRCYSGLN3。
30、85390395400ALASERASNPROTRPTYRSERGLNCYSLEU40541021233DNA斜卧青霉（PENICILLIUMDECUMBENS）木聚糖酶基因112332ATGGTCCACTTGTCTGCCACCTCTTTGTTGTTGGCAGCTGGTATTTTGCCAAACTTGGCT60TTGGGAGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAGGCAATCGGTCAAGTCTACTTTGGATCTGCA120ACCGACAACCCAGAATTGTCTGACTCTGCATATGTCAAGCAGTTGTCTAACACCGCTGAT180TTCGGTCAGATCACACCAG。
31、GAAACTCTCAAAAATGGGACGCCACCGAACCATCTAGAAAT240GTCTTCACTTTCTCTGGAGGAGACACAGTCGCAAAGTTGGCTCAGTCTAACGGTCAAAAG300TTGAGATGTCACAACTTGGTCTGGCATTCTCAGTTGCCTTCTTGGGTCACAAACGGTAAC360TTCAATAATGCCACTTTGATCTCTATCATGAAAAACCACATCACTAATTTGGTCCAGCAC420TATAAAGGACAGTGCTATGCCTGGGATGTTGTTAATGAGGCCTTGAATGAGGACGGATCT480序列表C。
32、N104099311A125/6页13TATAGACAGTCTGTTTGGTACAACACTATCGGACCAGCTTATTTGCCTATCGCCTTTGCA540ACAGCCGCATCTGTCGATCCTACTGTCAAATTGTATTACAACGATTACAATATCGAATAC600TCTGGTGCCAAGGCCGCAGGAGCTAGAAGAATCGTCGAGTTGGTTCAGTCTTACGGAGCA660AAAATCGATGGAGTTGGATTGCAAGCCCACTTTATTGTCGGATCTACCCCATCTAAAGAT720GACCAAAAGAAGGTCATGGCTGGATACAC。
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34、CTGGTGGTGGATCTCCAACTACTACCACTACAACTACCGCTGCTGCC1080ACAACAACCACCGCTCCAGGAGGTTCTGGTTCTACAGGAGGAATGGCCCAACATTGGGGT1140CAGTGTGGTGGTAACGGTTGGACTGGACCTACCACATGCGCTTCTCCATACACATGCCAA1200GCCTCTAATCCTTGGTATTCTCAATGCTTGTAA1233334DNA人工合成引物1343GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG34序列表CN104099311A136/6页14433DNA人工合成引物1334TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA33序列表CN104099311A141/2页15图1图2说明书附图CN104099311A152/2页16图3图4图5图6说明书附图CN104099311A16。