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1、10申请公布号CN104211795A43申请公布日20141217CN104211795A21申请号201310208475522申请日20130530C07K14/47200601A61K38/17200601A61P9/00200601A61P37/00200601C12N15/11200601C12N15/63200601C12N1/21200601C12N1/1920060171申请人武汉大学地址430072湖北省武汉市八一路珞珈山16号72发明人李文鑫吴英亮曹志贱陈宗运韩松74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵冯琼54发明名称靶向钾离子通道KV13活性多。
2、肽的分子设计及制备与应用57摘要本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向钾离子通道KV13活性多肽的分子设计及制备与应用。本发明提供的多肽具有如SEQIDNO1所示的氨基酸序列。该多肽比现有技术中作为钾离子通道KV13阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用，是靶向钾离子通道KV13的高效低毒的阻断剂。51INTCL权利要求书2页说明书21页序列表22页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书21页序列表22页附图5页10申请公布号CN104211795ACN104211795A1/2页21一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，具体为VALGL。
3、YILEASNVALX1CYSLYSHISSERGLYGLNCYSLEULYSPROCYSLYSX2ALAGLYMETARGPHEGLYLYSCYSILEASNGLYLYSCYSX3CYSTHRPROLYS；其中，X1为ASP、GLU、LYS或ARG；X2为LYS、ARG、ASP或GLU；X3为HIS、ASP或GLU。2根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其具有如SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的氨基酸序列。3根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，还包括其氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的多肽。4根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述修饰包括磷酸。
4、化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。5如权利要求14任一项所述多肽作为钾离子通道KV13阻断剂的应用。6如权利要求14任一项所述的多肽在制备治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用。7根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。8根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述的血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。9根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼。
5、疮或银屑病。10根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述多肽及药学上可接受的辅料。11根据权利要求10所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射制剂。12根据权利要求11所述的药物，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。13根据权利要求11所述的药物，其特征在于，所述注射制剂为粉针剂或注射液。14编码如权利要求14任一项所述多肽的DNA分子。15根据权利要求14所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQIDNO2所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序列。16根据权利。
6、要求14所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQIDNO3所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQIDNO6所示的核苷酸序列。17根据权利要求14所述的DNA分子，其特征在于，编码具有如SEQIDNO4所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQIDNO7所示的核苷酸序列。18一种包括如权利要求1417任一项所述DNA分子的重组载体。19根据权利要求18所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中的表达载体选自PGEX系列、PET系列、PQE系列或PMAL系列中的任一种。20一种包括如权利要求18或19所述重组载体的转化体。21根据权利要求20所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主细胞。
7、为大肠杆菌、权利要求书CN104211795A2/2页3酵母菌或真核细胞表达体系。22如权利要求14任一项所述多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤1将编码所述多肽的DNA分子克隆到表达载体获得重组载体；步骤2将所述重组载体转化入宿主细胞，获得转化体；步骤3培养转化体，经诱导表达、分离、纯化，即得。23根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，编码所述多肽的DNA分子具有SEQIDNO5、SEQIDNO6或SEQIDNO7所示的核苷酸序列。24根据权利要求22或23所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQIDNO5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO811所示。。
8、25根据权利要求22或23所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQIDNO6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1215所示。26根据权利要求22或23所述的制备方法，其特征在于，克隆所述如SEQIDNO7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1619所示。权利要求书CN104211795A1/21页4靶向钾离子通道KV13活性多肽的分子设计及制备与应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向钾离子通道KV13活性多肽的分子设计及制备与应用。背景技术0002钾离子通道KV13是一种位于细胞膜上的蛋白质，它在淋巴结、血管内皮、脾等不同组织中均。
9、有分布，并执行相关的生理功能。近年来，不同病理研究发现了钾离子通道KV13具有显著的表达上调现象，并成为了治疗不同疾病的药物靶标。例如，在T细胞介导的自身免疫性疾病多发性硬化症中，效应记忆T细胞（EFFECTORMEMORY，TEM）活化后，细胞膜上钾离子通道KV13表达数目从约300个上调到约1500个。同样，在T细胞介导的自身免疫性疾病类风湿性关节炎和I型糖尿病中，TEM细胞活化后细胞膜上钾离子通道KV13表达数目从约300个上调到约1500个。在器官移植免疫排斥反应中活化后的TEM细胞膜上也发现了钾离子通道KV13的高表达现象。此外，在血管内膜增生过程中和急性冠状动脉综合症，研究发现了血。
10、管平滑肌细胞和T细胞膜上钾离子通道KV13的差异表达。鉴于钾离子通道KV13在不同疾病中功能，筛选设计高效低毒靶向钾离子通道KV13的药物成为新药研发新方向。0003蝎活性肽BMKTX是于1997年从蝎毒液中分离发现的多肽，它作用于钾离子通道KV13的IC50为02NM（BIOCHEMISTRY,1997,361347313482），它的氨基酸序列如SEQIDNO20所示。0004在2007年，基于蝎活性肽BMKTX作为结构模板，申请人运用计算机辅助设计的方法替换BMKTX中的3个氨基酸残基，即同时将GLY11、ILE28、ASP33分别替换为ARG11、THR28、HIS33，设计了高效作用。
11、于钾离子通道KV13的多肽ADWX1，活性IC50为189PM，比其结构模板蝎活性肽BMKTX活性提高了约50倍（在专利ZL2007100536790中ADWX1多肽名称为LWX1；STRUCTURALBASISOFAPOTENTPEPTIDEINHIBITORDESIGNEDFORKV13CHANNEL,ATHERAPEUTICTARGETOFAUTOIMMUNEDISEASEJBIOLCHEM,2008,2831905819065）。但是，试验发现ADWX1多肽同时高效作用于钾离子通道KV13同源的钾离子通道KV11，作用活性IC50为065NM。由于ADWX1多肽作用钾离子通道KV11高。
12、达065NM，说明ADWX1多肽对于钾离子通道KV13的选择性不强，在高剂量使用时具有潜在的毒副作用。相关多肽作用于钾离子通道KV11毒性也被观察到。如多肽SHLL5作用于钾离子通道KV11和KV13活性IC50分别为74NM和69PM，当治疗大鼠多发性硬化症的剂量达到600微克/千克/天时，40的大鼠在治疗的第5天发生了死亡。证明作用于钾离子通道KV13的多肽在高剂量使用时可能会作用于钾离子通道KV11并产生毒性。可见，筛选与设计高效低毒（即高活性且高选择性）靶向钾离子通道KV13多肽药物仍具有挑战性。发明内容说明书CN104211795A2/21页50005有鉴于此，本发明要解决的技术问题。
13、在于提供靶向钾离子通道KV13活性多肽的分子设计及制备与应用，本发明提供的钾离子通道KV13活性多肽不作用于除KV13以外的其他钾离子通道。0006本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，具体为VALGLYILEASNVALX1CYSLYSHISSERGLYGLNCYSLEULYSPROCYSLYSX2ALAGLYMETARGPHEGLYLYSCYSILEASNGLYLYSCYSX3CYSTHRPROLYS；0007其中，X1为ASP、GLU、LYS或ARG；0008X2为LYS、ARG、ASP或GLU；0009X3为HIS、ASP和GLU。0010基于申请人建立的多肽靶标蛋。
14、白质相互作用的“人工控制识别”新分子工程技术JOURNALOFPROTEOMERESEARCH,2010,931183125），本发明以含有37个氨基酸残基的蝎活性肽BMKTX为模板，计算机辅助分别设计了与BMKTX模板酸性氨基酸残基分布不同、活性表面各不相同但序列高度相似具有如SEQIDNO1所示氨基酸序列的多肽。0011作为优选，本发明提供的多肽具有如SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的氨基酸序列。0012具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽序列中只在第19位上含有1个酸性氨基酸残基ASP；具有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列的多肽序列中只在第33位上含有1。
15、个酸性氨基酸残基ASP；而具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列的多肽序列中包含两个酸性氨基酸残基，分别是位于第6位的ASP和位于第33位的ASP。具有如SEQIDNO2、SEQIDNO3或SEQIDNO4所示的氨基酸序列的多肽与模板BMKTX多肽相比都具有各不相同的活性表面。模板BMKTX多肽的氨基酸序列中，主要以重要功能氨基酸残基位于第23位的ARG（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）和位于第24位的PHE附近区域的ALPHA螺旋和BETA折叠间的转角结构区域为活性表面识别钾离子通道KV13；而具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基位于第23位的ARG和位于第2。
16、6位的LYS（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第29位的ASN等反向平行的BETA折叠结构区域为活性表面识别钾离子通道KV13；具有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基位于第8位的LSY（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第9位的HIS和位于第15位的LYS等ALPHA螺旋的前半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道KV13（具有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列的多肽的ALPHA螺旋在钾离子通道KV13上方呈“竖立”状态）；具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列的多肽主要以重要功能氨基酸残基位于第15位的LSY（为堵塞钾离子通道孔的氨基酸残基）、位于第18。
17、位的LYS和位于第19位的LYS等ALPHA螺旋的后半部分结构区域为活性表面识别钾离子通道KV13（具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列的多肽的ALPHA螺旋在钾离子通道KV13上方呈“水平”状态）。0013由于具有SEQIDNO24所示氨基酸序列的多肽与模板BMKTX多肽以各不相同的活性表面识别钾离子通道KV13，它们活性也发生了显著变化BMKTX模板多肽IC50为091NM、具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽IC50为0015NM、具有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列的多肽IC50为0375NM、具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列的多肽IC50为73NM。通过对其它不同钾。
18、离子通道活性测试发现，3个新设计的多肽均不作于钾离说明书CN104211795A3/21页6子通道KV11、KV12、KV71、KV111、KCA22、KCA23、KCA31等，比现有技术中作为钾离子通道KV13阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用。因此，本发明提供的多肽是靶向钾离子通道KV13的高效低毒的阻断剂。0014作为优选，本发明提供的多肽还包括如SEQIDNO1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的多肽。0015优选的，修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。0016优选地，如SEQIDNO1所示氨基酸序列中取代一个氨基酸的多肽具有如S。
19、EQIDNO2144中任一项所示的氨基酸序列。0017本发明提供的多肽作为钾离子通道KV13阻断剂的应用。0018动物实验表明，本发明提供的多肽可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎。鉴于钾离子通道KV13在不同疾病药物治疗中的靶标功能，因此本发明提供的多肽可作为钾离子通道KV13阻断剂的应用。因此，本发明提供的多肽可以用于制备治疗或预防钾离子通道KV13相关疾病的药物。钾离子通道KV13相关疾病包括迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病。0019本发明还提供了上述多肽在制备治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药。
20、物中的应用。0020本发明提供的多肽治疗或预防的迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。0021本发明提供的多肽治疗或预防的血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。0022本发明提供的多肽治疗或预防的自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼疮或银屑病。0023作为优选，用于治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物包括本发明提供的多肽及药学上可接受的辅料。0024优选的，本发明提供的药物为口服制剂或注射制剂。0025更优选的，口服制剂为片剂、胶。
21、囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。0026更优选的，注射制剂为粉针剂或注射液。0027本发明还提供了能够编码本发明提供多肽的DNA分子。0028由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明提供的多肽的核苷酸序列，均在本发明的保护范围内，本发明在此不做限定。0029在本发明的实施例中，编码具有如SEQIDNO2所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序列。0030编码具有如SEQIDNO3所示氨基酸序列多肽的DNA分子具有如SEQIDNO6所示的核苷酸序列。0031编码具有如SEQIDNO4所示氨基酸序列多肽的DNA分子。
22、具有如SEQIDNO7所示的核苷酸序列。0032本发明还提供了一种包括能够编码本发明提供多肽的DNA分子的重组载体。0033作为优选，本发明提供的重组载体中表达载体选自PGEX系列、PET系列、PQE系列说明书CN104211795A4/21页7或PMAL系列中的任一种。0034优选的，本发明提供的重组载体中表达载体选自PGEX系列。0035更优选的，本发明提供的重组载体中表达载体为PGEX6P1。0036本发明还提供了一种包括本发明提供的重组载体的转化体。0037本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌或真核细胞表达体系。0038作为优选，本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌。003。
23、9优选的，本发明提供的转化体的宿主细胞为大肠杆菌ROSETTA系列菌株或BL21系列菌株。0040更优选的，本发明提供的转化体的宿主细胞为宿主细胞为ROSETTA系列的DE3菌株。0041本发明提供的多肽的制备方法，包括如下步骤0042步骤1将编码本发明提供的多肽的DNA分子克隆到表达载体获得重组载体；0043步骤2将重组载体转化入宿主细胞，获得转化体；0044步骤3培养转化体，经诱导表达、分离、纯化，即得。0045本发明提供的多肽的制备方法中，编码多肽的DNA分子具有SEQIDNO5、SEQIDNO6或SEQIDNO7所示的核苷酸序列。0046本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQIDN。
24、O5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO811所示。0047本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQIDNO6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1215所示。0048本发明提供的多肽的制备方法中，克隆如SEQIDNO7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1619所示。0049作为优选，本发明提供的多肽的制备方法，步骤1具体包括如下步骤0050步骤A以蝎毒CDNA为模板，扩增编码本发明提供的多肽的DNA分子，经纯化获得扩增产物；0051步骤B取扩增产物及表达载体，经分别双酶切后连接，即得。0052优选的，扩增反应体系为0053005。
25、4优选的，扩增反应程序为0055说明书CN104211795A5/21页80056优选的，纯化具体为凝胶电泳回收。0057优选的，双酶切采用的限制性内切酶为ECORI和XHOI。0058作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤2中，在将重组载体转化入宿主细胞前，将重组载体首先转化入大肠杆菌DH5，筛选出转化入重组载体的阳性菌株，培养并提取质粒，将质粒转化入宿主细胞。0059作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，诱导表达采用的诱导剂为IPTG。0060作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，分离具体为取诱导表达的转化体，收集菌体，经破碎后取上清液，经亲和层析获得融合蛋白溶液。。
26、0061作为优选，本发明提供的多肽的制备方法的步骤3中，纯化具体为取融合蛋白溶液，经浓缩、酶切后，除杂。0062优选的，酶切采用小肠激酶。0063优选的，除杂采用高效液相色谱法。0064本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，具体为VALGLYILEASNVALX1CYSLYSHISSERGLYGLNCYSLEULYSPROCYSLYSX2ALAGLYMETARGPHEGLYLYSCYSILEASNGLYLYSCYSX3CYSTHRPROLYS；其中，X1为ASP、GLU、LYS或ARG；X2为LYS、ARG、ASP或GLU；X3为HIS、ASP和GLU。本发明提供的多肽是以。
27、蝎活性肽BMKTX为模板，计算机辅助分别设计的与BMKTX模板酸性氨基酸残基分布不同、活性表面各不相同但序列高度相似的多肽。在多肽或蛋白质的结构与功能关系的经典概念上，具有相似的氨基酸残基序列便具有相同的活性表面和相似的功能。在本发明中，申请人突破多肽或蛋白质的结构与功能关系的经典概念，设计具有相似的氨基酸残基序列多肽具有截然不同的活性表面。在多肽空间结构水平上，本发明提供的多肽中酸性氨基酸残在处于分子表面三角形不同位置。与野生型BMKTX多肽相比，由于仅替换了几个氨基酸残基，圆二色谱实验显示了本发明提供多肽的结构与野生型BMKTX多肽相似。但当它们与靶标离子通道KV13的“酸性”孔区（带有2。
28、0个酸性氨基酸残基结构区域）相互作用时，运用不同多肽酸性氨基酸残基与靶标钾离子通道“酸性”孔区差异的静电排斥原理，使本发明提供的多肽将分别采用与野生型BMKTX多肽不同的“活性表面”识别靶标钾离子通道，从而具有不同的药理学功能。通过生物学试验证实了本发明提供的多肽均以各不相同的活性表面识别钾离子通道KV13，它们活性也发生了显著变化BMKTX野生型多肽IC50为091NM、具有如SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽只在第19位含有1个酸性氨基酸残基的，其IC50为0015NM；具有如SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽只在第33位含有1个酸性氨基酸残基，其IC50为0375NM、具有如SEQI。
29、DNO4所示氨基酸序列的多肽在第6位和第33位含有两个酸性氨基酸残基，其IC50为73NM。通过对其它不同钾离子通道说明书CN104211795A6/21页9活性测试发现，且新设计的多肽均不作于钾离子通道KV11、KV12、KV71、KV111、KCA22、KCA23、KCA31等，比现有技术中作为钾离子通道KV13阻断剂应用的多肽具有更高选择性和更低的潜在毒性作用。因此，本发明提供的多肽是靶向钾离子通道KV13的高效低毒的阻断剂。附图说明0065图1示本发明提供的重组多肽以及重组野生型BMKTX模板多肽的色谱分离纯化图；其中，图1（A）示采用与本发明实施例13提供的方法制备的重组野生型BMK。
30、TX模板多肽的色谱分离纯化图，126MIN对应的色谱峰为BMKTX模板多肽；图1（B）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，129MIN对应的色谱峰为SEQIDNO2所示氨基酸序列的重组多肽；图1（C）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，131MIN对应的色谱峰为SEQIDNO3所示氨基酸序列的重组多肽；图1（D）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的重组多肽的色谱分离纯化图，126MIN对应的色谱峰为SEQIDNO4所示氨基酸序列的重组多肽；0066图2示本发明提供的重组多。
31、肽以及重组野生型BMKTX模板多肽的质谱分析图；其中，图2（A）示采用与本发明实施例13提供的方法制备的重组野生型BMKTX模板多肽的质谱分析图；图2（B）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；图2（C）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；图2（D）示本发明实施例13制备的具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的重组多肽的质谱分析图；0067图3示酸性氨基酸残基在本发明提供的多肽以及野生型BMKTX模板多肽结构中的分布特点；其中，图3（A）示野生型BMKTX模板多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（B）示具有SE。
32、QIDNO2所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（C）示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；图3（D）示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽中酸性氨基酸的分布特点；0068图4示本发明提供的多肽以及野生型BMKTX模板多肽的圆二色谱分析图；其中，图4（A）示野生型BMKTX模板多肽的圆二色谱分析图；图4（B）示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；图4（C）示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；图4（D）示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽的圆二色谱分析图；0069图5示本发明提供的多肽以及野生型BMK。
33、TX模板多肽的阻断靶标钾离子通道KV13电流与多肽浓度依赖关系分析图，其中，曲线1示野生型BMKTX模板多肽阻断靶标钾离子通道KV13电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道KV13电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线3示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道KV13电流与多肽浓度依赖关系曲线；曲线4示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道KV13电流与多肽浓度依赖关系曲线；0070图6示本发明提供的多肽及其突变体对钾离子通道KV13电流的抑制作用；其说明书CN104211795A7/21页10中，纵坐标。
34、为突变体多肽的药理学活性除以野生型多肽药理学活性的比值；图6（A）示野生型BMKTX模板多肽及其突变体对钾离子通道KV13电流的抑制作用，其中，柱1示野生型BMKTX模板多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；柱215依次示具有SEQIDNO2134所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；图6（B）示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道KV13电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；柱28依次示具有SEQIDNO3541所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；图6（C）示具。
35、有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道KV13电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；柱211依次示具有SEQIDNO4251所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；图6（D）示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽及其突变体对钾离子通道KV13电流的抑制作用，其中，柱1示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；柱28依次示具有SEQIDNO5258所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV13电流的抑制作用；0071图7示本发明提供的多肽以及野生型BMKTX模。
36、板多肽以各不相同的活性表面识别靶标钾离子通道KV13的复合物结构图；其中，图7（A）示野生型BMKTX模板多肽的活性表面识别靶标钾离子通道KV13的复合物结构图；图7（B）示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道KV13的复合物结构图；图7（C）示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道KV13的复合物结构图；图7（D）示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽的活性表面识别靶标钾离子通道KV13的复合物结构图；0072图8示本发明提供的多肽对不同钾通道电流的抑制作用图；其中，图8（A）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV11电流的抑制作。
37、用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV11电流的抑制作用；图8（B）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV11电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV11电流的抑制作用；图8（C）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV11电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV11电流的抑制作用；图8（D）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV12电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV12电流的抑制作用；图8（E）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV12电流的抑制作用，曲线。
38、2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV12电流的抑制作用；图8（F）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV12电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV12电流的抑制作用；图8（G）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV71电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV71电流的抑制作用；图8（H）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV71电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV71电流的抑制作用；图8（I）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV71电流的抑制作用，曲线2示具有。
39、SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV71电流的抑制作用；图8（J）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV111电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽说明书CN104211795A108/21页11对钾离子通道KV111电流的抑制作用；图8（K）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV111电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV111电流的抑制作用；图8（L）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV111电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV111电流的抑制作用；图8（M）中曲线1示阴性。
40、对照对钾离子通道KV22电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV22电流的抑制作用；图8（N）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV22电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV22电流的抑制作用；图8（O）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV22电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV22电流的抑制作用；图8（P）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV23电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV23电流的抑制作用；图8（Q）中曲线1示阴性对照对钾。
41、离子通道KV23电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV23电流的抑制作用；图8（R）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV23电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV23电流的抑制作用；图8（S）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV31电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV31电流的抑制作用；图8（T）中曲线1示阴性对照对钾离子通道KV31电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV31电流的抑制作用；图8（U）中曲线1示阴性对照对钾离子通道。
42、KV31电流的抑制作用，曲线2示具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽对钾离子通道KV31电流的抑制作用。具体实施方式0073本发明提供了靶向钾离子通道KV13活性多肽的分子设计及制备与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。0074本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。0075其中，TAQ酶采用购自T。
43、AKARA公司的TAKARATAQTM附加反应用缓冲液、DNTP混合液；0076表达载体PGEX6P1购自PHARMACIA公司；0077大肠杆菌DH5、大肠杆菌ROSETTADE3购自中国典型培养物保藏中心；0078限制性内切酶购自TAKARA公司；0079T4连接酶购自FERMENTAS公司；0080回收采用的试剂盒为购自FERMENTAS公司的DNAEXTRACTIONKIT；0081测序工作由华在基因公司完成；0082质粒快速提取试剂盒购自武汉摩尔肽公司；0083小肠激酶（EK）购自武汉摩尔肽公司；0084IPTG（异丙基D硫代吡喃半乳糖苷）购自华美生物工程公司。说明书CN104211。
44、795A119/21页120085本发明实施例中的回收、双酶切、连接、转化步骤，皆参照上述产品的说明书进行。0086下面结合实施例，进一步阐述本发明0087实施例1具有如SEQIDNO57所示的核苷酸序列的DNA分子的获得00881、扩增引物设计0089以具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQIDNO5所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO811所示；0090以具有如SEQIDNO6所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQIDNO6所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1215所示；0091以具有如SEQIDN。
45、O7所示的核苷酸序列为模板序列设计扩增引物，扩增如SEQIDNO7所示核苷酸序列的DNA分子采用的引物序列如SEQIDNO1619所示。0092在设计引物过程中，添加连接载体所需的酶切位点及用于切割融合蛋白的蛋白酶酶切位点。0093具体引物序列如表1所示0094表1扩增引物序列00950096说明书CN104211795A1210/21页130097注其中下划线表示限制性酶切位点，方框表示蛋白酶酶切位点对应的核苷酸序列。00982、扩增具有如SEQIDNO57所示的核苷酸序列的DNA分子0099以蝎毒CDNA为模板，以序列如SEQIDNO811所示的引物扩增具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序。
46、列；以序列如SEQIDNO1215所示的引物扩增具有如SEQIDNO6所示的核苷酸序列；以序列如SEQIDNO1619所示的引物扩增具有如SEQIDNO7所示的核苷酸序列；0100PCR扩增反应体系为以对具有SEQIDNO5所示的核苷酸序列扩增为例01010102说明书CN104211795A1311/21页140103对具有SEQIDNO5所示的核苷酸序列扩增的扩增体系与此相似。0104对具有SEQIDNO57所示的核苷酸序列扩增的PCR反应程序为01050106实施例2包括如SEQIDNO57所示的核苷酸序列DNA分子的转化体构建0107以包括如SEQIDNO5所示的核苷酸序列DNA分子的。
47、转化体构建过程为例0108将对具有SEQIDNO5所示的核苷酸序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小为111BP的目的片段，得到具有如SEQIDNO5所示的核苷酸序列的DNA分子。0109采用ECORI和XHOI对回收得到的DNA分子进行双酶切，凝胶电泳并回收获得具有粘性末端的如SEQIDNO5所示核苷酸序列的DNA分子。双酶切步骤参照产品说明书进行。采用T4连接酶，将其连接入经ECORI和XHOI双酶切的表达载体PGEX6P1，获得包括如SEQIDNO5所示的核苷酸序列DNA分子的重组载体。采用热激法，将包括如SEQIDNO5所示的核苷酸序列DNA分子的重组载体转化入大肠杆菌DH5。
48、感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板培养基上，37培养12小时后，从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，将每个单菌落分别在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37培养5小时，然后用PCR扩增的方法对每个单菌落的液体培养物进行鉴定。鉴定采用的引物为本发明提供的扩增引物中的两条，具体鉴定PCR扩增体系为0110说明书CN104211795A1412/21页150111鉴定PCR扩增程序为01120113采用琼脂糖凝胶电泳对鉴定结果进行分析，扩增出现大小为111BP的片段单菌落液体培养物为阳性菌种，选取阳性菌种进行测序，选取测序结果与SEQIDNO5所示核苷酸序列一致的菌种，培养后提取质粒，将提取得到。
49、的质粒采用热激法转化入大肠杆菌ROSETTADE3的感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板培养基上，37培养12小时后，从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，将每个单菌落分别在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37培养5小时，然后用PCR扩增的方法对每个单菌落的液体培养物进行鉴定。鉴定PCR的体系和程序与前相同，鉴定为阳性的菌种即为包含如SEQIDNO5所示的核苷酸序列DNA分子的转化体。0114包括如SEQIDNO67所示的核苷酸序列DNA分子的转化体构建过程与构建包括如SEQIDNO5所示的核苷酸序列DNA分子的转化体的过程一致。0115实施例3具有如SEQIDNO24所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化0116以具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列多肽的表达和纯化为例0117将实施例2中鉴定结果为阳性的菌株接种于3ML含有100G/ML氨苄青霉素的LB培养基中，37培养12小时后，将培养液转接至1L新鲜的含有100G/ML氨苄青霉素的LB培养基中，37培养4小时后，加入IPTG使终浓度为01MM，37条件下诱导表达4小时。0118收集诱导后菌液中的菌体，悬浮于缓冲液50MMTRISCL,10MMEDTA，PH80中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得上清通过GST亲和层析，。