用于清除水、工业废水和土壤中耐降解化学品的生物制品及使用该制品的方法.pdf

本发明涉及一种新型的生物制品，用于水、土壤、工业废水的净化去除诸如农药和油的耐降解化学品，其中该生物制品为按重量比(1-2):(1-2):1的菌株恶臭假单胞菌VKPM B-10997、枯草芽孢杆菌VKPM B-10999和红串红球菌VKPM Ac-1882的组合。该生物制品可进一步包含吸附剂、有机和矿物补充剂和促进剂。所述生物制品可用于耐降解农药和油的分解。该生物制品具有植物生长促进和杀菌活性。本发明还涉及所提供的生物制品的应用。

权利要求书
1.  保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM）保藏号为B-10997的菌株恶臭假单胞菌、保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM）保藏号为B-10999的菌株枯草芽孢杆菌、和保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM）保藏号为Ac-1882的菌株红串红球菌的组合。

2.  含有菌株恶臭假单胞菌VKPM B-10997、枯草芽孢杆菌VKPMB-10999和红串红球菌VKPM Ac-1882的组合的制品。

3.  根据权利要求1或2所述的制品，包括按重量比(1-2):(1-2):1的菌株恶臭假单胞菌VKPM B-10997、枯草芽孢杆菌VKPM B-10999和红串红球菌VKPM Ac-1882的组合。

4.  根据权利要求2或3的制品，所述制品进一步包括吸附剂或被固化在吸附剂上，并且可选地包括矿物、有机和/或促进添加剂。

5.  根据权利要求2-4中任一项权利要求所述的制品净化土地、土壤、水或工业废水去除耐降解农药或油的用途，该用途通过将有效量的根据权利要求2-4中任一项权利要求所述的制品引入污染的土壤、土地、水或废水中实现。

6.  根据权利要求5所述的制品的用途，其中，耐降解农药选自：如2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）、氯苯氧基乙酸（CPAA）、苯氧基乙酸（PAA）的氯苯氧基乙酸类，2,4-二氯苯酚和苯酚、吡虫啉。

7.  根据权利要求2-4任中一项权利要求所述的制品促进植物生长活性和/或作用杀真菌制剂的用途。

8.  根据权利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品的干组合物在耕作、耕种或播种时被引入土地，优选以1公顷土地10kg的量引入。

9.  根据权利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品以水溶液形式的通过灌溉引入土地中。

10.  根据权利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品引入土壤中是通过将所述制品的悬浮液处理的种子引入土壤来实施的，可选择地，加入诸如蚯蚓粪的营养物。

说明书用于清除水、工业废水和土壤中耐降解化学品的生物制品及使用该制品的方法
技术领域
本发明涉及一种新型生物制品，该制品用于被耐降解的、归类为危险品的、诸如广泛应用于农药的化学品污染的水、土壤和工业废水的净化。
背景技术
专利RU2323970和RU2237711中描述了生物制剂–生物分解剂（biodestruktors）以及其处理土壤和土地、去除包含短杆菌（Bacillus brevis）和节杆菌种属（Arthrobacter species）的油和石油产品的用途。专利RU208667描述了包括微生物恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的混合菌群。
还已知有效用于除去油中的脂肪族馏分的生物制剂：基于菌株深红红球菌VKM Ac-1513D和红串红球菌(Rhodococcu erythropolis)VKMAc-1514D的“Roder”产品，基于细菌菌株假单胞菌和酵母的“Lenoil”、“Devoroil”、“Ekobel”产品。
已知使用假产碱假单胞菌菌株NRRL B-18087（专利US4804629）分解氯代芳香族农药（2,4-二氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸），通过细菌菌株放射形土壤杆菌（发明人证书SU1250572）中和有机磷农药残留和其有毒代谢物。发明人证书SU1560487描述了使用小球藻BKM-A-10和栅藻类（Scenedesmus acuminalus）UA-2-7a破坏3,4-二氯苯胺的方法。专利 US4803166中描述了使用细菌恶臭假单胞菌YNK-1分解2-氯苯甲酸；专利DE3729127中记载了单独或组合使用微生物莫拉克斯氏菌属和节细菌属分解磷酸盐污染物和氯化烃。
已知使用担子菌类的黄孢原毛平革菌降解诸如DDT、聚氯苯酚类、苯并芘类、二恶英类的化合物（专利US4891320）。
菌株恶臭假单胞菌-106是二甲基苯基甲醇和苯酚[1,2]的活性分解剂，细菌假单胞菌破坏芳香族和杂环化合物，最近常见于废水中[3,4,5]，并且菌株假单胞菌破坏固体和液体介质中的芳香族化合物。
一些博物馆菌株诺卡氏菌属、节细菌属、小单孢菌属[7,8,9]具有破坏如西玛津和莠去津的氯代三嗪衍生物的能力。
专利US6632363描述了包括疏水载体和细菌枯草芽孢杆菌的组合物及其用于提高含有诸如农药的水的质量的使用方法。
Ksenofontova O等描述了作为最活性的降解菌的从芽孢杆菌和假单胞菌属得到的需氧菌菌株，其破坏如下农药：氯噻嗪、胡桃醌、半醌、nitrolon、kartocid和karate（"农药影响下的土壤微生物演化"，萨拉托夫州立大学学报出版社，化学和生物生态学部，2007,vol.7,No.2,p.66）。
专利RU2410170描述了净化有机化合物污染的土壤的方法，该有机化合物包括农药，例如，二氯联苯（DHB），该净化方法通过加入在200-300℃预处理的海绿石的吸附剂和红球菌属细菌菌株完成。
在所有这些中和有毒化学品（有毒物质）的方法中，都通过提供某些种类的微生物来分解特定化学品。通常描述的是在水培养基中通过利用作为碳和能量唯一来源的异生物质的微生物分解农药，或者需要额外使用吸 附剂。所有这些培养物的显著缺点是它们针对特定物质的狭隘的特异性，以及它们不具有预备形式并且不能实际用于处理被诸如农药的难降解化学品污染的水、工业废水和土壤。
专利RU2093478描述了细菌菌株恶臭假单胞菌VKM1301、枯草芽孢杆菌VKM B-1742D和红串红球菌VKM Ac-1339D以1:1:1的比例的组合，用以净化水和土壤、去除油和石油产品以及钻井泥浆中含有的聚合物添加剂，及其应用。然而，该组合净化被诸如农药的顽固抗降解化学品污染的水、土壤和工业废水的应用目前尚不可知。
已知提高土壤肥力并促进介质的自然微生物群落的生物制品“Biava”（专利RU2248255）。生物制品包含淀粉糖化的、解蛋白的和固氮的微生物，如细菌属假单胞菌、芽孢杆菌。该制品的缺点是其复杂成分，包括超过25种不同的不适于结合相互作用的有机体，这使得生产和保持菌株变得困难。所述专利中还描述了通过将生物制品“Biava”引入土壤的应用。该制品不是植物生长的促进剂，并且不具有对诸如农药或除草剂的顽固化学品的降解能力，农药或除草剂选自如下氯苯氧乙酸：2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）、苯酚、2,4-二氯苯酚、CPAA和下面描述的其他化合物。这些化合物是环境中最持久和最顽固的。如人类等摄入这些化学品可导致器官、组织和神经系统的严重疾病。食物中存在这些化学品被认为是不可接受的（例如，参见Tinsley,I.污染行为中的化学概念.从英文翻译.M.:Mir,1992,p.281）。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于处理（中和）被诸如农药、苯酚的顽固化学品污染的土壤、水和工业废水的新型生物制品，同时提供应用该制品的方法。本发明的制品“PHENOX”改善环境的净化、去除有毒物质，并因此提高生长在处理过的土壤中的消费品的质量。此外，由细菌细胞实施的将有毒物质微生物降解为无害化合物发生在土壤中。该生物制品在工业废水的处理中显示出高效性。
本发明涉及用于处理土地、土壤、工业废水去除诸如农药的耐降解的化学品的生物制品（“PHENOX”）。提供的生物制品是新菌株恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌和红串红球菌按照质量比(1-2):(1-2):(1)的比例的组合，该制品可进一步包括吸附剂或者被固化于吸附剂上，以及包括矿物质、有机或促进添加剂。
所述新菌株恶臭假单胞菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（VKPM），保藏号为：B-10997（SEQ ID No.3）。
所述新菌株枯草芽孢杆菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM），保藏号为：B-10999（SEQ ID No.1）。
所述新菌株红串红球菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM），保藏号为：Ac-1882（SEQ ID No.2）。
要求保护的制品“PHENOX”与现有技术方案相比的区别是细菌菌株的特定组合和给出的优选质量比。
附图说明
图1是菌株的质粒图谱：2-9是恶臭假单胞菌VKPM B-10997，10-17是红串红球菌VKPM Ac-1882。
在用于分解顽固农药时，该制品特别有效，顽固农药选自：诸如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）、2,4-二氯苯氧基-α-丙酸（Dichloroprop，2,4-DR）、2-甲基-4-氯苯氧基-α-丙酸（Mekoprop，2M-4HP,MSRR）、2,4,5-三氯苯氧基-α-丙酸（2,4,5-TP，Silvex）、2,4-二氯苯氧基-α-油（2,4-dichlorophenoxy-α-oil，2,4-DV）、甲基-[1-[（丁基氨基）羰基]-1H-苯并咪唑-2-基]氨基甲酸酯的氯苯氧乙酸类和基于氯苯氧乙酸类的制品（苯菌灵、多菌灵、草除灵（benazol））；imidor，其中活性物质为新烟碱吡虫啉；zontran，其中活性物质为赛克嗪、HCCH（即，六氯环己烷、hexachloranhexatox、dolmix、或sineks）CPAA（氯苯氧乙酸）、PAA（苯氧乙酸）、六氯苯酚、1,1-二（4’-氯苯基）-2,2-二氯乙烷（DDT）和2,4-二氯苯酚，以及酚类。特别地，当用于持久性农药的分解、去除诸如2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）、氯苯氧基乙酸（CPAA）、苯氧基乙酸（PAA）的氯苯氧乙酸类，以及2,4-二氯苯酚和苯酚，和吡虫啉时，该制品非常有效。
与在先已知制品不同，本发明的制品对种子发芽和栽培植物生长具有额外生长促进作用，并且还具有杀菌活性。
本发明还包括所提供的生物制品“PHENOX”的应用方法。该方法包括在污染的土地、土壤或废水中引入有效量的所述制品。
优选地，向室温耕作中的田地引入每公顷10kg干物质的量的所述制品，优选地，在15-35℃的温度。优选使用方法是以水溶液的形式进行灌溉。还 可以通过添加诸如蚯蚓粪的生物发生元素的用所述制品悬浮液处理的种子将所述制品引入土地，或者在犁地或播种期间将干剂型的所述制品以粉末形式引入土地。
还可通过播种添加了诸如蚯蚓粪的添加剂的用所述制品悬浮液处理的种子，将所述制品引入土壤。在添加了蚯蚓粪、氮和磷肥的容器中用水稀释所述制品。
在犁地或播种期间将所述制品的干剂型以粉末形式引入土地是可能的。根据本发明的所述制品“PHENOX”对植物生长具有促进作用，并且对土壤具有良好改良能力的所述制品的菌株给环境带来有效中和。菌株恶臭假单胞菌和红串红球菌携带降解的D-质粒，并且可以将对农药和其他有害物质的破坏能力传递给土壤、水、废水中的原有细菌种群，从而加大清除污染物。使用该制品的优点是土壤中农药的分解率高达86%并且在液体介质中高达99%。
所提供的制品的活性基础是土壤细菌菌株恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、红串红球菌的组合。所有这些培养物具有同时针对多种异生物质的polisubstratum特异性，异生物质为：诸如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）的氯苯氧乙酸类，苯酚，2,4-二氯苯酚，CPAA和实施例中指出的其他物质。它们的混合物确保提升环境除去有毒化合物的净化功能。作为吸附剂的高岭土和压碎的细泥炭还被用作有机添加剂；作为有机矿物质和生长促进补充剂的蚯蚓粪，其提取物和甲壳质包含基质。使用前，所述制品的干粉用温水（25-30℃）在容器（水桶、罐）中搅匀至均匀悬浮液。10g所述制品搅拌至10升水中。推荐加入氮磷钾肥（azophoska） -基于硝酸铵的复合肥料（5g/10l）或堆肥（5g/10l），在使用（通过喷壶浇灌土壤（10-20l/10m2）或处理种子100-150ml/100g）前，1-3小时内悬浮液定期搅拌以通气和微生物活化。
所述生物制品通过独立的深层培养获得的，通常在标准生物技术设备上20-30小时内培养所述细菌的3个菌株获得的。种子通过在加入农药的合成培养基中培养菌株获得，并且该材料被用于播散在大体积发酵器中。
菌株恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、红串红球菌细胞的累积干生物量（accumilated dry biomass）是以(1-2):(1-2):1的比率混合的。加入载体-吸附剂和其他添加剂（1010-11的源浓缩物和至少5×108CFU/mL的液体制品）后，干制品的总滴度为至少5×108CFU/g。对于所提出的制品的工业生产和包装，使用标准生物技术和包装设备和材料。
所提供的生物制品（“PHENOX”）消除化学品渗入植物、蔬菜和浆果植物中，促进种子萌发和植物生长，抑制植物病原真菌的生长。
“PHENOX”用于处理被诸如农药、苯酚、或许油的化学品污染的水、工业废水、土壤和植物种子。“PHENOX”中包含所述菌株是新颖的。
所述菌株枯草芽孢杆菌B-10999是通过富集培养法从南乌拉尔的化学工业企业的工业区的土壤样品中分离出的。所述菌株枯草芽孢杆菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM），保藏号为：B-10999。枯草芽孢杆菌的菌株在16S rRNA基因（SEQ ID No.1）的核苷酸序列分析的基础上被鉴定。编码16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列（长度不小于500个碱基对）与声明的类型具有99%的相似度。
培养-形态特征。菌株枯草芽孢杆菌具有该种类的典型的培养-形态特征。杆菌，其尺寸是0.2-0.5乘以1.5-3μm，单个，通常成对出现。它们形成椭圆形和圆形的内生孢子。鞭毛被置于整个细胞的表面。当生长在肉类-胨发酵液中时，培养物形成展开的消光膜，然而，培养基依然清澈。当振动液体培养基时，不发生生物质的完全分散。菌落是干燥的、带有波状边缘细微起皱的。马铃薯切片上的生长是丰富的奶油色光滑的、极大尺寸褶皱的菌落形态。革兰氏阳性。
生理和生物化学特征。菌株枯草芽孢杆菌在28℃温度下在葡萄糖-蛋白胨培养基、LB琼脂和发酵液、葡萄糖-矿质培养基中生长良好。该菌株在作为唯一碳源的含有L-脯氨酸、DL-亮氨酸、α-酮戊二酸、DL-α-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D(+)-木糖、L-天门冬酰胺、甲壳质、DL-丝氨酸、葡萄糖、苯酚和氯苯氧苯酚的培养基中生长。菌株枯草芽孢杆菌可在冻干状态下被贮藏。核查菌株的存活能力是通过每12个月一次在M9和LB的葡萄糖-蛋白胨琼脂中栽培来实施的。当其在5℃下贮藏在这些培养基的斜面培养基上时-每3个月实施一次重栽。菌株枯草芽孢杆菌是非病原性和非毒性微生物。静脉注射感染小白鼠不显示动物病原特性。
菌株红串红球菌Ac-1882通过富集培养法从南乌拉尔的化学工业企业工业区的土壤样品中分离出的。所述菌株红串红球菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM），保藏号为：Ac-1882。菌株红串红球菌在16S rRNA基因（SEQ ID No.2）的核苷酸序列分析的基础上被鉴定。编码16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列（长度不小于500个碱基对）与声明的类型具有99%的相似度。
培养-形态特征。菌株红串红球菌具有该种类的典型的培养-形态特征。细胞为杆状、很少分叉，直径为0.6-0.8μm、长度为3-8μm。细胞呈适度多态，常排列成V形，具有明确的球菌-杆菌-球菌生长周期：在24-36小时的时候杆状细胞开始缩短，并且球状和卵圆细胞的比例增加。长成的菌落被染色为橙色。菌落的稠度是糊状的。革兰氏阳性。
生理和生物化学特征。菌株红串红球菌在28℃温度下在葡萄糖-蛋白胨培养基、LB琼脂和发酵液、葡萄糖-矿质培养基中生长良好。该菌株在作为唯一碳源的含有L-脯氨酸、D-阿拉伯糖、DL-α-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D(+)-木糖、L-天门冬酰胺、DL-丝氨酸、酪蛋白、葡萄糖、苯酚和氯苯氧苯酚的培养基中生长。菌株红串红球菌可在冻干状态下被贮藏。核查菌株的存活能力是通过每12个月一次在M9和LB的葡萄糖-蛋白胨琼脂中栽培来实施的。当其在5℃下贮藏在这些培养基的斜面培养基上时-每3个月实施一次重栽。菌株红串红球菌是非病原性和非毒性微生物。静脉注射感染小白鼠不显示动物病原特性。
菌株恶臭假单胞菌B-10997通过富集培养法从南乌拉尔的化学工业企业工业区的土壤样品中分离出的。所述菌株恶臭假单胞菌被保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM），保藏号为：B-10997。菌株恶臭假单胞菌在16S rRNA基因（SEQ ID No.3）的核苷酸序列分析的基础上被鉴定。编码16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列（长度不小于500个碱基对）与声明的类型具有99%的相似度。
培养-形态特征。菌株恶臭假单胞菌具有该种类的典型的培养-形态特征。能动的杆菌，极性位于鞭毛。细胞的尺寸是1-4乘1.3-5.4μm。肉-蛋白 胨琼脂上的菌落呈浅灰色，菌落内，在其背面有一个红褐色的色素。不产生孢子。菌落的稠度是半流体的。革兰氏阳性。
生理和生物化学特征。菌株恶臭假单胞菌在28℃温度下在葡萄糖-蛋白胨培养基、LB琼脂和发酵液、葡萄糖-矿质培养基中生长良好。该菌株在作为唯一碳源的含有L-酪氨酸、DL-色氨酸、D(+)-木糖、D(-)-甘露醇、L-谷氨酸、DL-亮氨酸、α-酮戊二酸、DL-α-丙氨酸、D-核糖、L(+)-阿拉伯糖、L-谷氨酰胺、纤维素、L-天门冬酰胺、甲壳质、DL-丝氨酸、果胶、葡萄糖、酪蛋白、和苯酚和氯苯氧苯酚的培养基中生长。菌株恶臭假单胞菌可在冻干状态下被贮藏。核查菌株的存活能力是通过每12个月一次在M9和LB的葡萄糖-蛋白胨琼脂中栽培来实施的。当其在5℃下贮藏在这些培养基的斜面培养基上时-每3个月实施一次重栽。菌株恶臭假单胞菌是非病原性和非毒性微生物。静脉注射感染小白鼠不显示动物病原特性。
具体实施方式
实施例1
菌株中质粒降解农药的鉴定。细菌的破坏性可通过染色体外的元素决定[Don,Pemberton,1985;Ghosaletal.,1985]。这些元素-质粒在菌株恶臭假单胞菌VKPM B-10997和红串红球菌VKPM Ac-1882中找到。它们通过碱裂解法从这些菌株中分离出（Maniatis T.,Fritsch,E.,和Sambrook,J.Methods of genetic engineering.Molecular cloning:Trans.from English./Ed.AA Baev.-M.:Mir,1984.p.480），并且随后质粒产品在标准条件下在琼脂糖胶中分馏（Maniatis等,1984）-（参见图1菌株的质粒图谱：2-9是恶臭假单胞菌VKPM B-10997，10-17是红串红球菌VKPM Ac-1882）。
实施例2
制品中包含的菌株的兼容性。产品的细菌枯草芽孢杆菌VKPM B-1099、红唇红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPM B-10997的菌株间不存在拮抗活性是通过基质中接触线中的菌株的生长和通过琼脂块的方法决定的。在LB琼脂培养基上，涂一下菌株枯草芽孢杆菌VKPM B-10999，并且垂直于它涂一下菌株红串红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPMB-10997。在下一个营养培养基的杯体上，涂冲程红串红球菌Ac-1882，并且垂直于它涂菌株枯草芽孢杆菌B-10999和恶臭假单胞菌B-10997。在培养基的第三个杯体上，涂一下恶臭假单胞菌B-10997，并且垂直于它涂菌株枯草芽孢杆菌B-10999和红串红球菌Ac-1882。在接触线附近，未观察到任何抑制菌株生长的现象。当使用琼脂块进行实验时，在LB培养基上的其中一种菌株的菌苔上放置另外两种菌株的3天培养物的块。无实验示出抑制菌株的生长。这表明菌株间不存在拮抗活性以及它们可能有效结合的应用。
生物制品“PHENOX”的组合物的实施例
实施例3
生物制品“PHENOX”，其形式为干燥粉末。细胞的干生物量（浓缩）-枯草芽孢杆菌VKPM B-10999为不小于5×109CFU/g，恶臭假单胞菌VKPMB-10997为至少5×109CFU/g并且红串红球菌VKPM Ac-1882为至少5×108CFU/g，三者比例为(1-2):1:(1-2)（质量份数-76.5-90%)；不引入或引入1-10%的吸附剂-细磨泥灰和/或0.1-1%的还包含的矿物盐和微量元素-蚯蚓粪的促进添加剂；水，不多于10.0%；活细胞的总滴度为至少1010CFU/g。
实施例4
生物制品“PHENOX”，其形式为干燥粉末。5-30%的细胞的干生物量-枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、恶臭假单胞菌VKPM B-10997和红串红球菌VKPM Ac-1882的比例为1:1:1；1-10%的吸附剂-细磨泥灰和/或0.1-1%的还含有矿物盐和微量元素-蚯蚓粪的促进添加剂；水，不多于10.0%；吸附剂和填料高岭土-加至100%；活细胞的总滴度为至少5×108CFU/g。
实施例5
生物制品“PHENOX”，其形式为-干燥粉末。5-30%的细胞的干生物量-枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、红串红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPM B-10997的比例为1:1:1；水，不多于10.0%；高岭土-加至100%；活细胞的总滴度为至少5×108CFU/g。
实施例6
液体形式的生物制品“PHENOX”：细菌枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、红串红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPM B-1099的细胞以1:1:1的比例（总滴度-109CFU/ml)在不加添加剂或加入生物活性物质（培养料或蚯蚓粪提取物-1-5ml/l或细磨培养料或蚯蚓粪0.1%和/或甲壳质或壳聚糖或含有放射物质的甲壳质-0.05-0.4%）的培养基中。可贮藏在0-8℃至少3个月，在18-25℃时多达15天。当在18-25℃的温度贮藏时，可将活细胞的数量降低到107CFU/ml滴度。
通过以下实施例解释所提供的制品的使用方法。
实施例7
制品“PHENOX”处理水中的吡虫啉的应用。将100mg量的以下组分的干粉形式的制品“PHENOX”：比例为1:2:1的细菌细胞浓缩物，总滴度为 5x1010CFU/g（根据实施例1的制品的组合物），引入200ml的被活性成分的浓度为1mg/L和2mg/L的农药（杀虫剂）吡虫啉污染的自来水中。此外，在水培养基中加入矿物盐添加剂（g/l）：Na2HPO4.7H2O-6.4g/l；KH2PO4-1.5g/l；NaCl-0.25g/l；NH4Cl0.5g/l。为了对照，使用被以浓度为1mg/L和2mg/L的吡虫啉污染的、有矿物盐、无生物制品的水样品。这些样品在室温下用混合器（120rpm）持续搅拌下培养。该实验重复3次。水中吡虫啉的含量在第1、3、5、7、10天通过标准柱层析法确定（Rudakov等，2004）。数据的变异系数不超过5%。
表1
使用制品“PHENOX”时水中吡虫啉含量的动态

生物制品的使用导致污染的水中吡虫啉含量显著降低。在第10天，起始水污染为1ml/l吡虫啉的农药浓度降低为0.28mg/l（减少72%）。在引入剂量为2mg/l的生物制品的污染的水中，吡虫啉的浓度降至0.64mg/l（减少68%）。这些数据表明生物制品“PHENOX”可以清除水中的吡虫啉。
实施例8
生物制品“PHENOX”用于净化水去除苯酚的应用。将以下组分的液体形式的生物制品“PHENOX”：细菌细胞的比例为1:1:1，滴度为5×109CFU/g （根据实施例1的制品组合物，不添加促进成分），以体积的0.01%的量加入到苯酚污染的水中（苯酚含量是100mg/l）。在水培养基中，还加入0.5g/l量的矿物氮-磷肥。为了曝气和混合，通过泵将空气定期提供给装有污染的水的容器中。水的温度维持在约22-25℃。水中苯酚的测定通过标准光度测量法实施（Rudakov等，2004）。该实验重复3次。数据的变异系数不高于7%。
表2
用制品“PHENOX”处理水后的苯酚含量的动态
培养时间苯酚浓度,Mg/l0天100.0第1天73.0第3天67.0
当使用制品“PHENOX”时，水中苯酚浓度在第一天降低27%，并且在第三天-降低33%（表2）。
实施例9
制品“PHENOX”用于净化水去除二氯苯酚的应用。该实验根据实施例8实施，但使用菌株比例2:1:1并且使用二氯苯酚2,4-DCP污染的水（二氯苯酚的含量是100mg/l）。
表3
用制品“PHENOX”处理水后的二氯苯酚含量的动态
培养时间2,4-DCP浓度，mg/l0天100.0第1天30.0
第3天21.9
当使用制品“PHENOX”净化水去除二氯苯酚时，2,4-DCP浓度在第一天培养降低70%（表3）。
实施例10
制品“PHENOX”用于净化水去除4-氯苯氧乙酸的应用。该实验根据实施例8实施，但使用菌株比例1:2:1并且使用4-氯苯氧乙酸4-CPAA污染的水（4-CPAA的含量是100mg/l）。
表4
用制品“PHENOX”处理水后的4-氯苯氧乙酸含量的动态
培养时间4-CPAA浓度，mg/l0天100.0第1天96.3第3天95.8第5天94.1第7天92.5第9天90.0第11天68.7第13天63.9第15天62.0
使用制品“PHENOX”净化水去除4-氯苯氧乙酸，第9天水中4-CPAA浓度降低约10%，并且第15天减低38%（表4）。
实施例11
制品“PHENOX”用于净化水去除2,4-二氯苯氧乙酸的应用。该实验根据实施例8实施，但使用2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D污染的水（2,4-D的含量是100mg/l）。
表5
用制品“PHENOX”处理水后的2,4-二氯苯氧乙酸含量的动态
培养时间2,4-D浓度，mg/l0天100.0第1天95.3第3天89.4第5天81.5第7天74.3第9天70.0第11天68.6第13天66.9第15天65.0
当使用制品“PHENOX”净化水去除2,4-二氯苯氧乙酸时，2,4-D含量至第3天下降11%，第9天下降30%并且第15天下降35%。
实施例12
制品“PHENOX”用于净化水去除2,4,5-三氯苯氧乙酸的应用。该实验根据实施例8实施，但使用2,4,5-三氯苯氧乙酸2,4,5-T污染的水（2,4,5-T的含量是100mg/l）。
表6
用制品“PHENOX”处理水后的2,4,5-三氯苯氧乙酸含量的动态
培养时间2,4,5-T浓度，mg/l
0天100.0第1天96.3第3天85.0第5天64.8第8天55.0
当使用制品“PHENOX”净化水去除2,4,5-三氯苯氧乙酸时，与初始水平相比，2,4,5-T含量至第3天降低15%，至第8天降低45%（表6）。
实施例13
制品“PHENOX”用于净化水去除苯酚的应用。该实验根据实施例12实施，但使用干燥粉末形式的制品“PHENOX”（根据实施例3，具有滴度5×1011CFU/g，并且引入蚯蚓粪-0.1%）。
表7
用制品“PHENOX”处理水后的苯酚含量的动态
培养时间苯酚浓度,mg/l0天100.0第1天70.0第3天45.0
当使用带有催化添加剂的干燥粉末形式的制品“PHENOX”净化水去除苯酚时，与初始水平相比，其含量在第1天结束时降低30%，在第3天结束时降低55%（表7）。
实施例14
制品“PHENOX”用于净化水去除2,4-二氯苯氧乙酸的应用。该实验根据实施例13实施，但使用根据实施例3的制品，不带有蚯蚓粪，而具有 1011CFU/g的滴度并使用2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D污染的水（2,4-D的含量是100mg/l）。
表8
用制品“PHENOX”处理水后的2,4-二氯苯氧乙酸含量的动态
培养时间2,4-D浓度，mg/l0天100.0第2天81.3第4天64.2第6天61.8第8天60.5第10天59.0
当使用制品“PHENOX”净化水去除2,4-二氯苯氧乙酸时，导致2,4-D的浓度从初始值的平缓降低-第10天将至59%（表8）。
实施例15
制品“PHENOX”用于净化水去除二氯苯酚的应用。该实验根据实施例13实施，但使用二氯苯酚2,4-DCP污染的水（二氯苯酚的含量是100mg/l）。表9
用制品“PHENOX”处理水后的二氯苯酚含量的动态
培养时间2,4-DCP浓度，mg/l0天100.0第2天96.2第4天91.4第6天86.9第8天80.5第10天75.7
第12天70.1第14天64.9第16天60.8第18天58.7第20天56.6第22天53.0
当使用制品“PHENOX”净化水去除二氯苯酚时，2,4-DCP的浓度从初始值在第22天将至53%（表9）。
实施例16
制品“PHENOX”用于净化水去除2,4,5-三氯苯氧乙酸的应用。该实验根据实施例8实施，但使用带有促进添加剂并且滴度109CFU/g的制品并且使用2,4,5-三氯苯氧乙酸2,4,5-T污染的水（2,4,5-T的含量是100mg/l）。
表10
用制品“PHENOX”处理水后的2,4,5-三氯苯氧乙酸含量的动态
培养时间2,4,5-Т浓度，mg/l0天100.0第2天70.0第4天35.2第6天33.8第8天33.1第10天32.6第12天31.0第14天31.9第16天38.7第18天35.8第20天28.6
第22天30.1第24天31.4第26天18.3第28天16.0
“PHENOX”处理后水中2,4,5-T含量持续下降-至第2天下降30%，至第12天下降69%，并且至第28天下降84%（表10）。
实施例17
生物制品“PHENOX”用于净化水去除酚类化合物的应用。干燥粉末形式的生物制品“PHENOX”的组分如下：10%的量的细胞干生物量-比例为1:1:1的枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、红串红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPM B-10997、1%的蚯蚓粪、不超过10%的水、高岭土-加至100%，活细胞滴度-2×109CFU/g（根据实施例4制备）。使用前，制品的干燥粉末在容器中（水桶、罐）的温水（25-30℃）中均匀混合直至获得均一悬浮液。在具有工作容积的容器中，配有搅拌器或用于气泡发生的装置，引入1.0kg的生物制品，并加入0.5kg的氮磷钾肥和200l的工艺温水。为了激活微生物，悬浮液用空气搅拌或通气24小时。然后，制备制品的工作悬浮液，并且10kg肥料（氮磷钾肥）和1kg石灰加入容器中具有10m3体积的废水中。装有废水的容器每天用空气通气。酚类化合物污染的“Ufahimprom”的废水污染物是30.4mg/升。通过生物制品“PHENOX”除去酚类化合物的废水处理效率通过在废水中不加添加剂而加入矿物肥料进行评价（表11）。
表11
用生物制品“PHENOX”去除酚类化合物净化水的动态

在引入生物制品“PHENOX”第二天后，废水中去除酚类化合物的净化程度达到66.4%，并且在第5天达到大于99%。应用生物制品“PHENOX”处理酚类化合物的效率随着在废水中添加矿物盐而增加，在第2天废水净化去除酚类化合物的程度已达到89.5%，并且在第7天废水中除去酚类化合物为99.997%（表11）。
实施例18
生物制品“PHENOX”用于处理工业废水去除酚类化合物的应用。处理工业废水根据前述实施例实施，不加入肥料、而使用“Novo-UfimskyNPZ”JSC“Dubitel”公司的废水。
表12
用生物制品“PHENOX”去除酚类化合物净化工业废水的动态

在引入生物制品“PHENOX”第一天后，去除石化公司废水中酚类化合物的净化程度是66.7%，并且在第5-7天达到87.5%。在第3-7天间，应用生物制品“PHENOX”净化制革工业废水去除苯酚的效率是79.4%（表12）。
实施例19
制品“PHENOX”破坏水介质中的油的应用。具有1×1010CFU/g的滴度的干燥粉末形式的该制品（根据实施例3的组合物）以100mg的量引入200ml的水中，该水被加入盐（K2HPO4-0.05%，NH4Cl-0.05%，CaCO3-0.001%）的原油（浓度为1%）污染。接种该制品和氮、磷、钾和石灰的矿物盐后的油污染的水在室温下每日搅拌的静止状态下培养10天。对照是未引入该制品的变化。该实验重复3次。在第三天，观察到水体积中的深色片，以及表面上小于油对照变化的污点。在制品变化的第5天，观察到水表面上少量油斑，烧瓶壁上约一半的油膜被破坏。实验的第10天，在水的表面和容器壁上观察到少量的油。
在第10天，样品中油的质量浓度通过分光光度法依照石油产品在光谱的红外区域3.42微米的波长上的选择性吸收在浓度计KH-2（生产公司：LLCPEP SIBEKOPRIBOR，新西伯利亚）中测定[The method of measurement of mass concentration of NP in the samples of drinking water,natural and wastewater by infrared spectrophotometry PND F14.1:2:4.168-2000.Novosibirsk,1998,17p.]。数据的变异系数不大于5%。制品的应用降低了28%水中石油量（从对照变异的2652mg/l降至生物制品变异的1915mg/ml）。
实施例20
该制品的细菌菌株对土壤的改良。在土壤中制品的细菌菌株的种群的动态在模型实验中进行研究。每1g土壤具有3×108个细胞量的悬浮液被置于装有50g过滤的表土的玻璃烧瓶中。该实验包括3个变量：不带异生物质（对照）和2,4-D浓度为100MPC和10000MPC。土壤中2,4-D的MPC 是0.1mg/kg。土壤湿度是满容量的60％。周期性，制品“PHENOX”的菌株在加入2,4-D作为唯一碳源和能量源的极少盐的琼脂培养基M9上分离。在第一个30天内，对照土壤中细菌菌株的菌落形成单位（CFU）的数量增加，然后这些细菌的种群密度下降（表13）。在2,4-D污染中，引入后的第一个2.5星期中细菌种群密度高于对照组，然后其逐步下降。在多数污染的土壤中，“PHENOX”的细菌种群急剧增加，并超过对照组中这些菌株的种群密度10-50倍。该“PHENOX”细菌数量的上升是由于使用异生物质作为营养源。该变异中，土壤中“PHENOX”细菌数量的降低发生在30之后。在第52天，所有变体中引入菌株的种群密度在类似水平上，表明污染土壤中2,4-D浓度的降低，以及其他可能参与农药降解的微生物。
这些微生物对土壤的改良表现良好。类似的数据从其他类型土壤的实验中获得-灰色森林土、灰化土和异生物质以三种浓度100MPC、1000MPC、10000MPC。土壤中2,4-D的MPC是0.1mg/kg。这显示出在这些类型的土壤中应用本发明的制品的可能。
表13
引入被农药2,4-D污染的过滤表土的制品“PHENOX”的菌株数的动态


实施例21
生物制品“PHENOX”处理被农药2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）污染的土壤的的应用。将耕地地平线的土壤（100g）通过2mm直径的筛过滤，并置于500ml的玻璃烧瓶中。2,4,5-T以100mg/g的量引入土壤中并彻底混合。滴度为109CFU/g（根据实施例5）的生物制品“PHENOX”被接种至带有土壤的瓶中，润湿至满容量的60％并且混合。烧瓶用带保鲜膜的棉塞封闭并且在恒温器中在25℃下恒湿恒温培养。土壤中2,4,5-T的测定通过标准方法实施（The method of pesticides measurement in soil,M.E.,Medicine,1984,-p.256p.）。该实验重复3次。数据的变异系数不高于8%。
表13*
使用生物制品“PHENOX”净化土壤去除2,4,5-T的动态

14天内使用生物制品“PHENOX”去除2,4,5-T的土壤净化程度是15%，21天内是27.4%，并且30天内是31.9%，并且，在第48天达到66.5%。在用生物制剂“PHENOX”培养土壤30天后，2,4,5-T的分解率明显增加（表13*）。
实施例22
制品“PHENOX”瓦解土壤中农药（杀真菌剂）TMTD的的应用。实验地点：混凝土地面、用于农药贮藏的仓库附近（阿尔泰山地区，比斯克城，Prigorodnaya街4号）。在夏季里，在开放的混凝土地面上设置适宜的3m2（1×3m）的样地区，在三个位点1×1m用20cm高的木隔板划界。样地的底部用塑料薄膜铺满以防止土壤中的污染物向混凝土地面扩散。样地用一层厚度为15cm的表土填充。地面上60cm的高度，样地用非织物覆盖材料（纺粘型织物）覆盖。在土壤中，引入50g/m2的比率的农药（杀真菌剂）二硫化四甲基秋兰姆（TMTD）、50g/m2量的蚯蚓粪、100g/m2的富集微量元素的矿物氮和磷肥料以及400g/m2的基于泥炭的有机肥料，并彻底混合。干燥粉末组合物形式的制品“PHENOX”：10%的细菌细胞、1%的蚯蚓粪、89%的高岭土，300g滴度是5×109CFU/g（根据实施例4）的该制品溶解在15升水（25-30℃）中并定期搅动培养24小时以促进通气和激活微生物。用喷壶将生物制品的悬浮液以5升/m2的比例喷洒在样地表面。样地的表面还按5升/m2土壤的比例进一步浇水。将制品“PHENOX”处理后的、TMTD污染的土壤进行松土以促进通气，并且用一薄层锯末覆盖。如必要，并且万一无降雨，将样地中的土壤不定期松土并润湿至满容量的60-70％。为了评估用样品居中方法去除TMTD以土壤净化的效果，每1.5和3个月取样品。样品中TMTD的定量含量由层析法确定。数据的变异系数不高于5%。用制品“PHENOX”处理后的1.5个月，土壤中TMTD的含量降低53%，3个月降低75%。
实施例23
制品“PHENOX”分解土壤中农药（除草剂）氯双脲（dichlorolurea）的应用。该实验与实施例22类似操作。将农药（除草剂）氯双脲以50g/m2的比例引入土壤中，用制品“PHENOX”处理1.5个月后，土壤中二硫化四甲基秋兰姆TMTD的含量降低59%，三个月后降低78%。
实施例24
制品“PHENOX”净化土壤去除氯代芳香族化合物的应用。实验地点：罗斯托夫州Salski地区。样地特点：被氯代芳香族化合物污染的农业用地。
在夏季里，标记出530m2（尺寸66m×8m）的露天样地区域，用0.5m保护区域划分为170m2的区域。该实验重复3次。在污染的土壤中，引入100g/m2的蚯蚓粪、10g/m2比率的矿物氮和磷肥料。干燥粉末组合物形式的制品“PHENOX”：10%的细菌细胞、1%的蚯蚓粪、89%的高岭土，为了获得工作溶液，以10g/m2的量的滴度是5×109CFU/g（根据实施例4）的该制品溶解在容器中，并在温水（25-30℃）中均匀混合至均一悬浮液。将生物制品的工作悬浮液以10l/m2的比例施加在土壤表面。该施加通过任何用于此目的的机器和装置喷洒来实施。该处理在日均土壤温度至少是+5℃但不超过+30℃时执行。引入的生物制品和废料通过翻耕、挖掘、耕作或其他耕种方法在污染的土壤上层作业。土壤被定期松土以促进通气，并润湿至满容量的60-70％（如必要，万一无降雨）。两个星期后，场地的土壤被犁地并润湿。为了评估用样品居中方法去除氯代芳香族化合物以土壤净化的效果，每1.5和3个月取样品。样品中芳香族化合物的定量含量由标准方法（Rudakov等，2004）确定。数据的变异系数不高于9%。用制品“PHENOX”处理后的1.5个月，土壤中芳香族化合物的含量降低35%，3个月降低68%。
实施例25
制品（1:1:1的比例）的杀真菌活性的评估。制品的细菌菌株枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、红串红球菌VKPM Ac-1882和恶臭假单胞菌VKPMB-10997的杀真菌活性通过琼脂块标准法（Egorov，1976）确定。带有固体营养培养基的培养皿播种植物病原真菌苔培养物。使用真菌菌株，导致根部的破坏、萎蔫、斑点、根腐病的-尖孢镰刀菌、链格孢菌（Alternariatennuisima）、互隔交链孢霉，以及织物的叶子和果实上的灰霉病的-葡萄孢菌，农作物的腐败-白地霉。每种培养物被播种到2杯察氏培养基，并且在其表面放置细菌菌株块，在标准LB琼脂上切成5天菌苔。放置4块用每个培养基上的植物病原学真菌播种的细菌菌株。在5℃培养杯体2天（用于琼脂中抗菌物的扩散），然后在25℃下和真菌抑制生长区域的存在下定植。
表14
制品的细菌菌株的杀真菌活性

*-为没有抑制区域。
植物病原真菌的实验中，为菌株恶臭假单胞菌B-10997，并为菌株枯草芽孢杆菌B-10999、红串红球菌Ac-1882建立所有明显引起根部感染和腐烂 的受测真菌的杀真菌活性（表14）。即，该细菌制品具有针对决定植物的各种真菌性病害的病原菌的杀真菌活性。
制品的植物生长促进活性
实施例26
该制品促进萝卜植物生长的应用。该制品是以下组分的干燥粉末形式：10%量的细菌细胞（比例为1:1:1的枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、恶臭假单胞菌VKPM B-10997和红串红球菌VKPM Ac-1882的细胞干生物量）、89%的高岭土，滴度为5×109CFU/g的该制品溶解在10ml蒸馏水（1:10的稀释）中并随后准备以1:100和1:1000的连续稀释。将带有白尖的各种“玫瑰红”的萝卜种子撒在培养皿滤纸上，每个培养皿中25个种子。该实验重复4次。使用自动分液器将2ml每培养皿的量的制品悬浮液处理种子。对照变化组是在蒸馏水中发芽的种子、以及用0.05%的促进植物生长的植物激素型的吲哚丁酸（IBA）溶液处理的种子。带有处理后种子的培养皿在湿度箱中在自然光和室温下培养。在第5天测量根的长度、嫩枝的长度和植物的干重。数据的变异系数不高于5%。
表15
使用生物制品“PHENOX”时萝卜植物的生长


该制品的悬浮液采集红萝卜的生长和生物质的积累。最好效果在制品的1:100的水性悬液中观察到。1:100稀释的制品将5天的萝卜根的长度从69增加至81mm（17%）、幼苗长度从30增加至42mm（40%）并且植物干重增加37%，从0.27至0.37g（表16）。
实施例26
制品“PHENOX”促进卷心菜植物生长的应用。该实验用类似实施例25的方式执行（制品的含量：10%的细胞干生物量-比例为1:1:1的枯草芽孢杆菌VKPM B-10999、恶臭假单胞菌VKPM B-10997和红串红球菌VKPMAc-1882；89%的吸附剂-细磨泥炭；1%的蚯蚓粪）。卷心菜种类“Slava”的种子用稀释的制品处理。植物根和嫩枝的长度在5天后测量。
表16
使用制品时卷心菜种类“Slava”的生长参数

制品的水性悬液（所有受测稀释）增加根长度多达50%-从46至63-69mm，并且在1:100和1:1000的稀释时增加嫩枝长度19%-从31至 37mm（表16）。结果表明在卷心菜种类“Slava”的根生长上，该制品有很强的促进效果。
实施例27
制品促进苜蓿（clover）种子萌发和植物生长的应用。该实验按实施例26中执行。红花苜蓿种子用稀释的产品处理。5天后，测量根的长度和幼苗的长度、发芽率和植物干重。
表17
使用生物制品“PHENOX”时红花苜蓿的生长参数

1:10稀释的制品增加植物的线性参数-根长度89%（从18至34mm）以及幼苗长度33%（从30至40mm）。1:100稀释的制品能促进发芽率12%-从88至100%，并且增加干重114%-从0.07至0.15g（表17）。因此，该制品在根生长和苜蓿的植物质量增长上具有很强的促进效应。
实施例27
该制品促进黄瓜植物生长的应用。该实验按实施例26中执行。“Russkaya Rubashka F1”型黄瓜的种子用制品的稀释液处理。根幼苗的长度、发芽率和植物干重在6天后测量。
表18
使用生物制品“PHENOX”时黄瓜植物的生长参数

制品的水性悬液具有Russkaya Rubashka F1型黄瓜生长的促进效应。例如，1:10制品的水性稀释液增加根长度61%-（从46至74mm），增加幼苗长度24%-从33至41mm，增加发芽率16%-从84至100%，以及增加植物干重37%-从0.46至0.63g（表18）。制品的最好的效果是在黄瓜根生长上。
实施例27
该制品促进甜菜种子发芽率的应用。该实验类似于实施例26执行。“Detroit”型甜菜种子通过制品的稀释液处理。第7天测定种子发芽率。
表19
使用生物制品“PHENOX”时甜菜种子的发芽参数


制品1:100时的稀释液增加甜菜种子发芽率7%-从92至99%（表19）。
实施例28
该制品促进洋葱植物生长的应用。该实验按类似实施例27的方式执行。“Karmen”型洋葱种子用1:100和1:1000的稀释液的制剂处理。根和幼苗的长度、发芽率和植物干重在10天后测量。
表20
使用生物制品“PHENOX”时洋葱植物生长参数

制品在1:1000的稀释液增加根长度23%从30至37mm，增加幼苗长度9%从57至62mm，并且增加植物干重32%，从0.19至0.25g（表20）。
实施例29
该制品促进胡萝卜植物生长的应用。该实验按类似实施例28的方式执行。“Krasniy Velikan”型胡萝卜种子用制品的稀释液处理。植物干重在10天后测量。
表21
使用生物制品“PHENOX”时胡萝卜植物生长参数

制品在1:1000的稀释液增加胡萝卜幼苗干重67%-从0.03至0.05（表21）。
土壤、水和工业废水中农药的存在用Rudakov O.B.和其他人（Sputnik khromotografista.-Voronezh:Vodoley,2004.-p.528）描述的测定农药的气象色谱法测量。
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仅接收局使用

仅国际局使用