用于结核病诊断和预防的蛋白.pdf

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1、10申请公布号CN104211787A43申请公布日20141217CN104211787A21申请号201310209991X22申请日20130531C07K14/195200601C12N15/31200601C12N15/63200601C12N5/10200601C07K16/12200601G01N33/68200601C12Q1/04200601A61K38/16200601A61K39/04200601A61P31/0620060171申请人中国医学科学院病原生物学研究所地址100005北京市东城区东单三条48号72发明人刘立国金奇张笑冰张维佳74专利代理机构中国国际贸易促进委。

2、员会专利商标事务所11038代理人刘向昕54发明名称用于结核病诊断和预防的蛋白57摘要本发明涉及用于结核病诊断和预防的蛋白，含有所述蛋白的试剂盒，以及所述蛋白在制备试剂盒或制备预防或治疗结核病的药物中的用途。具体地，本发明从结核分枝杆菌的全基因组中筛选到21种具有良好免疫原性的蛋白，其可用于检测结核分枝杆菌的感染或诊断结核病，敏感性、特异性好；或者用于制备疫苗，以预防或治疗结核病。51INTCL权利要求书1页说明书16页序列表23页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书16页序列表23页附图1页10申请公布号CN104211787ACN104211787A。

3、1/1页21分离的蛋白，其选自以下蛋白RV0388C、RV0415、RV0493C、RV0582、RV0695、RV0813C、RV0819、RV0891C、RV1095、RV1131、RV1455、RV1675C、RV1853、RV1864C、RV2234、RV2961、RV3052C、RV3102C、RV3707C、RV3767、RV1773C以及在不同结核分枝杆菌中与上述21种蛋白功能相同的蛋白。2权利要求1的蛋白，其选自氨基酸序列分别如SEQIDNO1SEQIDNO20、SEQIDNO105所示的蛋白。3分离的核酸，其编码权利要求1或2所述的蛋白；例如，所述核酸的核苷酸序列分别如SEQ。

4、IDNO21SEQIDNO40、SEQIDNO106所示。4重组载体，其含有权利要求3所述的核酸。5重组细胞，其含有权利要求4所述的载体。6抗体，其能够特异性地结合权利要求1或2所述的蛋白；例如，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。7组合物（例如药物组合物或疫苗组合物），其含有权利要求1或2的蛋白、权利要求3的核酸、权利要求4的重组载体、权利要求5的重组细胞或权利要求6的抗体。8试剂盒或检测试剂，其含有权利要求1或2的蛋白、或者权利要求6的抗体，所述试剂盒或检测试剂用于检测结核分枝杆菌（例如H37RV）或用于结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核病，例如肺结核或肺外结核）的诊断。9权利要求1或2。

5、的蛋白、或者权利要求6的抗体在制备用于预防或治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核病，例如肺结核或肺外结核）的药物（例如疫苗）中的用途。10权利要求1或2的蛋白、或者权利要求6的抗体在制备用于检测结核分枝杆菌或用于诊断结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核病，例如肺结核或肺外结核）的试剂盒或检测试剂中的用途。权利要求书CN104211787A1/16页3用于结核病诊断和预防的蛋白技术领域0001本发明属于医药技术、生物学、免疫学领域，涉及用于结核病诊断和预防的蛋白、与所述蛋白特异性结合的抗体，以及含有所述蛋白或抗体的组合物或试剂盒、所述蛋白或抗体用于制备结核病诊断试剂盒中的用途以及用于制备。

6、预防或治疗结核病的药物中的用途。背景技术0002结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战（1KHASNOBISS,ESCUYERVE,CHATTERJEEDEMERGINGTHERAPEUTICTARGETSINTUBERCULOSISPOSTGENOMICERAEXPEROPINTHERTARGETS,2002,62140）。据WHO报告全球己受到结核菌感染者约20亿人，现有肺结核病人约2000万，每年新发病例8001000万，每年死于结核病约300万，相当于每10秒钟就有一个人死于结核病（2HTTP/WWWWEBTB。

7、ORG/）。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染1015人。0003回顾近五十年来全球结核病斗争历程，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐观的估计形。

8、势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”，并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。0004值得注意的是，全球90的结核病病人在发展中国家。世界性的艾滋病流行不仅增加结核病内源性复燃的发病机会，也增加了外源性再感染的危险，加速了结核病疫情的恶化。据WHO流行病学报告结核病是HIV（）者的第一杀手（32）。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。中国是世界上结核病疫情负担最重的22个国家之一，结核病人数仅次于印度而居世界第二。

9、，属于高流行地区，疫情呈“三高一低”，即患病率高（523/10万）、死亡率高（209/10万），耐药率高（原发耐药率281，获得耐药率411）、年递降率低（肺结核患病率年递降率28）。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，我国有55亿人感染了结核菌，现有肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人200万。2005年估计有结核病患者500万人，其中80的患者在农村。我国每年死于结核病的人数为死于其它各类传染病人数总和的2倍以上，是中国十大致死疾病之一。因此，有效的预防和控制结核病的发生，以及针对既有结核病的治疗就显得尤其紧迫，刻不容缓。说明书CN104211787A2/16页4000。

10、5结核病的预防WHO已将卡介苗（BCG）列入扩大免疫计划范畴。然而，针对肺结核的免疫保护作用的报道差异甚大，从080不等。另外，随着HIV感染的流行，已有报告AIDS病人接种BCG后引起全身播散性感染。0006结核病的治疗到目前为止结核病的治疗方法是抗生素菌治疗，是以细菌学为基础的。化学治疗不仅是治疗和控制疾病的有力手段，而且也是结核病防治规划的重要组成部分。成功的化学治疗与管理，将会带来疫情的改善，包括感染率、患病率及死亡率的下降。然而，尽管这些抗结核药物能发挥一定的治疗效果，但是随之带来的副作用也是不容忽视的，耐药、多重耐药超耐药菌株不断出现，新药研发的速度远远低于耐药的产生的速度。彻底根。

11、除结核杆菌是世界难题。0007结核病毒诊断主要有以下几种方法0008（一）痰菌检查1痰涂菌检查，痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。2痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时68周，应用受到限制。0009（二）射线检查胸部线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专。

12、业医生确证。0010（三）肺结核病免疫学诊断1常用的有结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一。假阳性率高，容易误诊。2血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，如38KDA及其许多包含38KDA抗原在内的融合蛋白抗原，用于体液免疫方面的诊断，但也不可避免的出现假阳性率。3BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5聚合酶链反应（PCR），特异性较差，优点是敏感性可达98100。0011（四）其他检查，只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1纤维支气管镜检查可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检。

13、查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2胸腔镜和纵隔镜检查均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3超声波检查主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。0012在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题，因此迫切需要需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法，以快速、准确地诊断结核病。发明内容0013本发明的发明人以结核分枝杆菌（MTB）的基因组为模板，利用INVITROGEN公司提供的GATEWAY技术，表达全部ORF编码的蛋白质，经过WESTERBLOT方法检测临床血浆，获得具有较高敏感性、特异性的抗原，为。

14、临床诊断、疾病治疗、预防控制提供了坚实的物质基础。具体地，本发明包括以下几方面0014本发明第一方面涉及分离的蛋白，其选自以下蛋白RV0388C、RV0415、RV0493C、说明书CN104211787A3/16页5RV0582、RV0695、RV0813C、RV0819、RV0891C、RV1095、RV1131、RV1455、RV1675C、RV1853、RV1864C、RV2234、RV2961、RV3052C、RV3102C、RV3707C、RV3767、RV1773C以及在不同结核分枝杆菌中与上述21种蛋白功能相同的蛋白。0015在本发明的实施方案中，上述21种蛋白来自结核分枝杆菌。

15、H37RV。0016在本发明的实施方案中，上述21种蛋白的GENBANK号分别为57116729、15607556、15607634、15607722、15607835、15607953、15607959、15608031、15608235、15608271、15608593、15608813、15608990、15609001、15609371、15610098、15610189、15610239、15610843、15610903、15608511。0017在本发明的实施方案中，所述分离的蛋白选自氨基酸序列分别如SEQIDNO1SEQIDNO20、SEQIDNO105所示的蛋白。0018在。

16、本发明的实施方案中，所述不同结核分枝杆菌是指不同型别的结核分枝杆菌，例如为临床分离的敏感菌株或耐药菌株。0019本发明第二方面涉及分离的核酸，其编码本发明第一方面所述的蛋白。0020在本发明的实施方案中，所述核酸编码蛋白RV0388C、RV0415、RV0493C、RV0582、RV0695、RV0813C、RV0819、RV0891C、RV1095、RV1131、RV1455、RV1675C、RV1853、RV1864C、RV2234、RV2961、RV3052C、RV3102C、RV3707C、RV3767、RV1773C。0021在本发明的实施方案中，所述核酸的核苷酸序列分别如SEQID。

17、NO21SEQIDNO40、SEQIDNO106所示。0022本发明第三方面涉及重组载体，其含有本发明第二方面所述的核酸。0023在本发明中，所述载体为本领域公知的基因工程载体，例如为克隆载体或表达载体。所述表达载体例如为原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。0024本发明第四方面涉及重组细胞，其含有本发明第三方面所述的重组载体。0025在本发明中，所述细胞为本领域公知的宿主细胞，例如为原核细胞或真核细胞。0026在本发明的实施方案中，所述细胞为大肠杆菌细胞。0027本发明第五方面涉及抗体，其能够特异性地结合本发明第一方面所述的蛋白。0028根据本发明第五方面的抗体，其为单克隆抗体或多克隆抗体。

18、。0029本发明第六方面涉及组合物，其含有本发明第一方面的蛋白、第二方面的核酸、第三方面的重组载体、第四方面的重组细胞或第五方面的抗体。0030在本发明中，所述组合物例如为药物组合物或疫苗组合物。所述药物组合物还可以含有药学上可接受的辅料；所述疫苗组合物还可以含有制备疫苗所需的免疫佐剂，例如为铝佐剂。0031本发明第七方面涉及试剂盒或检测试剂，其含有本发明第一方面的蛋白、或者第五方面的抗体，所述试剂盒或检测试剂用于检测结核分枝杆菌或用于结核分枝杆菌感染所引起的疾病的诊断。0032本发明第八方面涉及本发明第一方面的蛋白、或者第五方面的抗体在制备用于预防或治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核。

19、病，例如肺结核或肺外结核）的药物中的用途。0033在本发明中，所述药物例如为疫苗，所述疫苗为预防性疫苗或治疗性疫苗。0034本发明第九方面涉及本发明第一方面的蛋白、或者第五方面的抗体在制备用于检说明书CN104211787A4/16页6测结核分枝杆菌或用于诊断结核分枝杆菌感染所引起的疾病（例如结核病，例如肺结核或肺外结核）的试剂盒或检测试剂中的用途。0035本发明还涉及一种在体内或体外检测结核分枝杆菌的方法，包括使用本发明的第一方面的蛋白或第五方面的抗体的步骤；具体地，所述方法为抗原或抗体检测方法，例如WESTERNBLOT或ELISA法。在本发明的实施方案中，所述检测方法为ELISPOT法。。

20、0036本发明还涉及一种诊断结核病的方法，包括使用本发明的第一方面的蛋白或第五方面的抗体的步骤；具体地，所述方法为抗原或抗体检测方法，例如WESTERNBLOT或ELISA法。在本发明的实施方案中，所述检测方法为ELISPOT法。0037以下对本发明做进一步描述。0038在本发明中，结核分枝杆菌（MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS）也被称为结核杆菌，是引起结核病的病原菌。0039结核分枝杆菌H37RV是1905年分离出来的并被全球广泛应用于生物医学研究的菌株，有完整毒性的肺结核动物模型。0040本发明的RV0388C、RV0415、RV0493C、RV0582、RV0695、R。

21、V0813C、RV0819、RV0891C、RV1095、RV1131、RV1455、RV1675C、RV1853、RV1864C、RV2234、RV2961、RV3052C、RV3102C、RV3707C、RV3767、RV1773C这21种蛋白来源于结核分枝杆菌MTUBERCULOSISH37RV。0041由于不同结核分枝杆菌菌株的基因组不同，表达的蛋白可能不同，因此本发明还涉及不同结核分枝杆菌菌株中与上述21种蛋白功能相同的蛋白。0042在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌为H37RV。0043在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌感染所引起的疾病是指结核病；所述结核病包括肺结核和肺外。

22、结核，所述肺外结核例如为骨关节结核、结核性脑膜炎、肾结核、肠结核、泌尿系统结核等。0044在本发明中，所述蛋白具有良好的免疫原性，可以利用本领域公知的方法制备单克隆抗体或多克隆抗体。例如可以将蛋白与有效量的免疫佐剂混合，注射入动物例如马、羊、小鼠体内，以制备得到抗体。0045同时，由于本发明的蛋白能够有效刺激体内免疫系统，产生特异性的免疫反应，生成特异性抗体，可以将本发明的蛋白制备成疫苗，用于预防或治疗结核杆菌引起的疾病。0046在本发明中，所述“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如为抗原、抗体间的结合。0047在本发明中，所述用于检测结核分枝杆菌或诊断结核病的样品例如可以为被检测者的血液、。

23、痰液、组织、淋巴细胞等。0048发明的有益效果0049本发明筛选到21种具有良好免疫原性的结核分枝杆菌蛋白，其与结核分枝杆菌感染病人血清结合的敏感性、特异性好，优于38KDA蛋白。所述蛋白可用于结核分枝杆菌感染病人的诊断，或者作为抗原用于制备预防/治疗结核分枝杆菌感染的疫苗。附图说明0050图1初筛蛋白WESTERNBLOT反应强度分布示意图，其中RV0934为38KDA蛋白。0051图212种蛋白纯化后的WESTERNBLOT图；其中泳道1为蛋白分子量标准预染说明书CN104211787A5/16页7蛋白分子量标准（FERMENTAS，SM0671），泳道213为表达蛋白，泳道14为牛血清白。

24、蛋白（BSA），泳道15为38KDA蛋白，蛋白上样量均为100NG。具体实施方式0052下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。0053INVITROGEN公司的GATEWAY技术为蛋白的重组和表达提供了这种可能，它是从PCR产物开始创建GATEWAYTM入门克隆。这种方法是通过合并ATTB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和PDONRTM包含ATTP位点以及GA。

25、TEWAYTMBPCLONASETM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有ATTL重组位点。这个入门克隆可以与GATEWAYTM目的载体PDEST17进行重组表达，快速高效得到目的蛋白（3WALHOUTAJ,TEMPLEGF,BRASCHMAETALGATEWAYRECOMBINATIONALCLONINGAPPLICATIONTOTHECLONINGOFLARGENUMBERSOFOPENREADINGFRAMESORORFEOMESMETHODSENZYMOL,2000,3285755924RACHAELMGOLDSTONE,NICOLEJMO。

26、RELAND,GHADERBASHIRI,ETALANEWGATEWAY_VECTORANDEXPRESSIONPROTOCOLFORFASTANDEFFICIENTRECOMBINANTPROTEINEXPRESSIONINMYCOBACTERIUMSMEGMATISPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION57200881875AHIGHTHROUGHPUTSCREENTOIDENTIFYSECRETEDANDTRANSMEMBRANEPROTEINSINVOLVEDINDROSOPHILAEMBRYOGENESISPNAS19989599739978）0054实施例。

27、1结核分枝杆菌基因的扩增和蛋白的表达00551实验方法005611目的基因的获取0057111根据结核分枝杆菌（MTB）H37RV的开放阅读框（ORFS）基因序列，用PRIMERDESIGNER设计引物序列，按照GATEWAY系统的引物设计方案，为引物序列添加ATTB臂，由北京新擎科公司完成引物的合成。0058其中正向ATTB引物臂为0059GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC（SEQIDNO41）；0060反向ATTB引物臂为0061GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA（SEQIDNO42），0062完成引物设计，举例如表1所示。006。

28、3112基因序列的获取0064提取H37RV（ATCC27294，来源于北京结核病预防控制所）的基因组DNA，以H37RV基因组为模板，用添加了ATTB臂的正反向引物来扩增不同ORFS，表1是部分引物的示例。0065表1部分合成引物表0066说明书CN104211787A6/16页800670068PCR体系为006950LPCR体系0070说明书CN104211787A7/16页90071（酶、缓冲液等购自TAKARA公司，大连）0072PCR反应条件为98热启动（初试温度为94），97变性1MIN，60退火1MIN，72延伸3MIN，30个循环。最后72温育，30MIN。0073113DN。

29、A琼脂糖凝胶电泳0074取5LPCR扩增产物在08琼脂糖凝胶进行电泳，用DNAMARKERDL2,000作标准分子量，在紫外灯下观察电泳结果，并进行拍照。0075114PCR产物的回收，按QIAQUICKSPIN试剂盒操作说明进行。0076共得到3536个目的基因。007712GATEWAY系统的BP反应0078121重组是从PCR产物创建GATEWAYTM入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并ATTB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和PDONRTM载体包含ATTP位点以及GATEWAYTMBPCLONASETM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，获得包含目的基因的入门克隆，同。

30、时目的基因两侧具有ATTL重组位点。这个入门克隆可以与任何GATEWAYTM目的载体进行重组。0079反应体系同时设阳性对照，PEXP7TET50NG/L，取1L，其余用水补。以下为反应体系0080ATTBPCR产物10NG/L最终量15150NG7L0081PDONRTM2111L0082TE缓冲液,PH808L0083从低温冰箱取出BPCLONASETMIIENZYMEMIX冰上融解，漩涡震荡二次，每次2S，上述反应体系的每孔样品中加入2LBPCLONASETMIIENZYMEMIX，震荡二次，轻微离心；将离心后的样品迅速放回低温冰箱；样品取出后25C孵育过夜；每孔2G/L蛋白激酶K加入1。

31、L，37C，1H，终止反应。将连接好的反应产物，转化大肠杆菌感受态细胞，培养。0084122重组质粒的鉴定按照参考文分子克隆（9J萨姆布鲁克,DW拉塞尔主编分子克隆实验指南M第三版12171265）执行，挑取转化后的大肠杆菌单克隆菌落接种，散布在50L灭菌超纯水中，99变性，做菌落PCR，验证是否为阳性克隆，同时分出25L接种在含有卡那霉素抗性96孔板中（LB培养基）；37孵育过夜，准备提取质粒。菌落PCR引物的选择根据PDONR221质粒而来，此菌落扩增是从M13噬菌体开始的，选用M13正向引物GTAAAACGACGGCCAGT（SEQIDNO101），反向引物CAGGAAACAGCTATG。

32、AC（SEQIDNO102），阳性对照H37RV基因组DNA05L，其它成分同下，25L体系，用水补齐；阴性对照不加菌。008525LPCR体系说明书CN104211787A8/16页1000860087PCR反应条件为98热启动97变性1MIN，60退火1MIN，72延伸3MIN，30个循环。最后72温育30MIN。008808琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆菌落（大小正确的即为阳性）以待下一步提质粒建立入门克隆；0089123取上述鉴定正确的阳性克隆培养，提质粒，在96孔V型底板中得到纯化后的质粒DNA（纯化试剂盒购于MILLPORE，货号LSKP09604）。0090共得到3372个入门克隆。

33、。009113LR反应BP反应产生入门克隆，LR反应是含ATTL位点的入门克隆和包含ATTR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。0092131反应体系，同时设阳性对照PENTRTMGUS（卡那霉素抗性）0093入门克隆50150NG7L0094目的载体150NG/L，PDEST171L0095TE缓冲液PH808L0096132从低温冰箱取出LRCLONASETMIIENZYMEMIX冰上融解，漩涡震荡二次，每次2S，上述反应体系的每孔样品加入2LLRCLONASETMIIENZYMEMIX，震荡二次，轻微离心；将LRCL。

34、ONASETMIIENZYMEMIX迅速放回低温冰箱；25C孵育过夜；每孔加入2G/L蛋白激酶K1L，终止反应。将连接好的反应产物，转化感受态细胞0097133质粒提取同上，以表达质粒PCR来验证阳性结果，25L体系，引物的选择ATTB位点已经恢复，0098正向引物ATTB1GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC（SEQIDNO103）0099反向引物ATTB20100GGGGACCACTTTGTCCAAGAAAGCTGGGTCCTA（SEQIDNO104）。0101阳性对照H37RV基因组DNA05L，其它成分同下，用水补齐25L。阴性对照未加DNA。010225LP。

35、CR体系说明书CN104211787A109/16页1101030104PCR反应条件为同112。010508琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆菌落（大小正确的即为阳性）即得到表达克隆。0106共获得3245个表达克隆。010714将表达克隆转化到表达菌株0108141携带目的基因的表达质粒带有氨苄青霉素抗性，将上述鉴定阳性的表达质粒转化到表达菌株BL21（DE3）和携带氯霉素抗性BL21感受态细胞中，挑取单克隆菌落，接种到含不同抗性的LB液体中，37，200R/MIN，过夜；0109142IPTG诱导表达0110取141中过夜生长的96孔板中的菌液50L120稀释到1MLLB（AMP抗性）的96孔。

36、板（2板）中，37培养细菌，300R/MIN，大约34H，到OD60006080111异丙基D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导步骤0112取100MM加入96孔板中，至终浓度IPTG1MM200X稀释，例如LML培养基中加5L。96孔板中为AMP抗性培养基0113一板37，250R/MIN，诱导过夜，一板28，250R/MIN，诱导过夜，设未加IPTG的阴性对照和GUS阳性对照。然后4，3950R/MIN离心5MIN，弃上清，后进行上样样品的处理。0114注共四个诱导表达条件，2个菌株BL21（DE3）、BL212个温度28、37。0115143SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳0116上层浓缩胶（ST。

37、AKINGORCONCERTRATIONGEL）5缓冲液PH68，0117下层分离胶（SEPARATIONORRESOLVINGGEL）12缓冲液PH880118取142获得的上样样品，进行SDSPAGE凝胶电泳。0119共表达蛋白1916个。01202结果0121通过以上各步骤，共得到3536个目的基因，3372入门克隆，3245个表达克隆，表达蛋白1916个，表2为表达蛋白的功能分布。0122表2表达蛋白的功能分布0123说明书CN104211787A1110/16页1201240125由上表可见，表达蛋白对全基因组有很好的覆盖率。0126实施例2表达蛋白的纯化0127蛋白纯化是进行下游实。

38、验的必要条件，原核细胞表达后可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来方可可以去除外源的杂蛋白造成的假阳性，要高效率高纯度的蛋白需要通过高通量的蛋白纯化。本发明的表达蛋白为含有6HIS标签的原核表达，因此采用HISTAG序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯说明书CN104211787A1211/16页13化。纯化试剂盒为96WELLPLATESHISMULTITRAPFFGEHEALTHCARE，USA。012821菌种复活及扩增0129制备菌种复苏及扩增所需LB培养基，待其冷却后。

39、加入相应抗生素（氨苄青霉素储存浓度50MG/ML，使用浓度50G/ML；氯霉素储存浓度50MG/ML，使用浓度34G/ML），将实施例1鉴定的蛋白表达菌株种从低温冰箱取出，解冻后每管接种10L菌种。37，200R/MIN，过夜。0130菌种扩增、表达及菌种保存扩增LB中同样加入相应浓度抗生素，150扩增（视情况120），约2小时左右至OD600值06（留1ML不加抗生素的LB做阴性对照，任意接一个菌用于测量OD值）。菌种OD600值至06时，先各取1ML菌液做未诱导对照，其余加入IPTG终浓度为1毫摩尔，依原诱导条件37或28，200R/MIN，过夜诱导1216小时。剩余菌液用于保存菌种，各两。

40、管。（甘油终浓度15）013122先从诱导后菌液中取2ML，4，6000R/MIN，15MIN收集沉淀，溶解于100L纯水中，做诱导后对照其余菌液4，6000R/MIN，15MIN收集菌体沉淀，留200L上清，浓缩，检测是否属于分泌性蛋白。013223沉淀称重，以510ML裂解液/G溶解。013324加入01MG/ML溶菌酶，1MM苯甲基磺酰氟（PMSF）（终浓度），10个单位的核酸酶，4搅拌30MIN。013425超声裂解。10SEC超声，10SEC间歇，共1015分钟。注意一直在冰上操作。0135每超声一个样品，彻底清洗探头。0136264，12000R/MIN，20MIN分别收集上清液与。

41、沉淀。0137在进行纯化之前先取上清和沉淀做可溶性鉴定，根据蛋白分布决定纯化方法。013827裂解上清液可直接用于纯化，注留30L上清液做对照。沉淀以洗涤液重新溶解，洗涤一次。0139284，12000R/MIN，20MIN收集沉淀，称重，重新以结合缓冲液（含8M尿素）溶解，1020MG/ML，室温作用1小时。0140294，12000R/MIN，20MIN收集变性上清液，直接用于纯化，留30L做对照。0141210填料混合物预先处理，乙醇沉降，用纯水冲洗一次，缓冲液平衡。0142211裂解上清液和变性上清液经045UM滤膜过滤，与适量填料结合1小时。（裂解上清液应一直放在冰上）0143212。

42、收集流出液。0144213以结合缓冲液洗涤12次，分别收集洗涤液。0145214以1ML不同浓度洗脱液洗脱目的蛋白，分别收集洗脱液。0146215SDSPAGE分析。0147216BCA试剂盒蛋白定量（THERMOSCIENTIFICPIERCEBCAPROTEINASSAYKIT）。0148按试剂盒程序操作。01492结果0150纯化共得到1600个蛋白，其余的316个蛋白在纯化过程中没有得到，原因可能如下01511纯化过程按包涵体纯化，如果是可溶性蛋白可能会丢失；2大规模纯化没有再说明书CN104211787A1312/16页14对这些蛋白进行再次纯化；3可能是表达量非常低，小体积纯化得不。

43、到。0152实施例3WESTBLOT分析0153WESTERNBLOT技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗同位素或非同位素的酶来检测，此方法可检测1NG抗原蛋白。0154病人样品，来自深圳第三人民医院，为结核病诊断初治病人，酶联免疫斑点试验（ELIAPOT）阳性，取200份结核病人血清样本混合，经除大肠杆菌抗体后用于初筛反应中的WESTERNBLOT一抗。015538KDAGENBA。

44、NK登录号为NC_0009622,GI15608080最为常用，是最早发展的商用诊断试剂盒抗原对活动性肺结核的诊断非常有效，其缺点是对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性结核患者和合并HIV感染的结核患者效果较差（6FRANCOJ,CAMARENAJJ,NOGUEIRAJM,ETALSEROLOGICALRESPONSEWESTERNBLOTTOFRACTIONSOFMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSONICATEANTIGENINTUBERCULOSISPATIENTSANDCONTACTSINTJTUBERCLUNGDIS5109589627RENUKAR,SUJIA。

45、ISUNEETHA,KARUNASAGILIETALDIAGNOSTICROLEOFTHEANTIBODYRESPONSETOTHE38KDA,16KDAPROTEINSANDLIPOARABINOMANNANOFMYCOBACTERIUMTUBCULOSISINDIANJOURNALOFCLINICALBIOCHENISTRY2005,201123128）。因此本实验用38KDA作为阳性对照，检测表达抗原的抗原免疫效果。01561纯化蛋白WESTERNBLOT015711取实施例2纯化得到的蛋白进行SDSPAGE电泳，上样量100NG/孔并设阳性对照孔38KDA抗原蛋白IMMUNODIAGN。

46、OSTICSINCUSA及阴性对照孔BSA。015812转膜SDSPAGE电泳，电泳后的凝胶，不经染色，直接用BIORAD公司MINITRANSBLOTELECTROPHORETICCELL转印装置将蛋白带电转印到NC膜上，以065MA/CM2电转印50MIN。015913封闭将NC膜于TBS中漂洗一下，再将其放入可加热封接的杂交盒中，以滤膜面积01015ML/CM2的量加入封闭液含2BSA的TBST，4过夜。016014一抗（样品血浆）处理取200份结核病人血清样本混合，经除大肠杆菌抗体后用于WESTERNBLOT一抗。016115与一抗结合弃封闭液，将膜取出，将硝酸纤维素膜转移到新的杂交盒。

47、中，按01015ML/CM2的量加入用TBST稀释的一抗（1500），平放于摇床上室温温育1H。TBST洗3遍，每次5MIN。016216与二抗结合将滤膜转移到新的杂交袋中，按01015ML/CM2的量加入用TBST以110000稀释的荧光标记的羊抗人二抗（ALEXAFLUOR647，ODDYSSEY），室温温育1H。TBST洗3遍，每次5。再用TBS洗2遍，每次5MIN。016317扫膜用ODYESSEY扫描仪进行扫膜，单通道波长700NM、分辨率169。016418用BIORAD的QUANTITYONE软件分析扫描灰度，分析样品与38KDA抗原蛋白相比抗原反应的强弱，并以表达蛋白与38KD。

48、A之比值（RATIO）作为判断反应的强弱。说明书CN104211787A1413/16页15016519取初筛反应较强的12个蛋白重复WESTERNBLOT，进行复筛。结核病人血清按入组人员情况分为两组活动性肺结核5人、肺外结核10人，每个病人血浆分别去除大肠杆菌抗体，然后分别用于检测。同样通过分析扫描灰度，分析样品与38KDA抗原蛋白相比抗原反应的强弱，并以表达蛋白与38KDA之比值（RATIO）作为判断反应的强弱。01662结果0167初筛的WESTERNBLOT结果中，有清晰条带的共有516个蛋白，其中118个与38KDA（RV0934）灰度比在40以上，29个优于38KDA（见图1、表。

49、3），这29个蛋白的相关信息见表4，复筛12个蛋白的WESTERNBLOT结果见图2。12个蛋白复筛的WESTERNBLOT灰度与38KDA蛋白的比值见表5。0168表329个蛋白的WESTERNBLOT灰度与38KDA蛋白的比值01690170说明书CN104211787A1514/16页160171表4初筛后的29个蛋白列表0172说明书CN104211787A1615/16页170173经查证，29个反复验证蛋白中除RV0487，RV0612，RV2147C，RV3242C，RV3261，RV3359，RV3406C，RV3637外，其他都未见报道用于结核病的诊断。0174表5复筛不同组候选人与38KDA反应强度比值0175说明书CN104211787A1716/16页180176可以看出，复筛结果与初筛结果相符，这些蛋白可以作为结核病诊断的分子标识。0177尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。说明书C。