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纯化的蛋白质
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年7月29日提交的美国临时申请系列No.61/513,453；2012年1月27日提交的美国临时申请系列No.61/591,727的优先权。将这些临时申请的完整内容通过引用并入本申请。
背景
白细胞介素-1α(IL-1α)和β(IL-1β)是免疫调节细胞因子的家族的原型成员并且在调节免疫系统中具有几个显著作用。IL-1α和IL-1β结合白细胞介素-1受体I(IL-1RI)，从而导致第二受体白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)的衔接。被IL-1α和IL-1β激动(agonized)的信号转导导致放大的T细胞反应，包括初始T细胞的增殖和存活以及T_H17细胞的发育。
概述
本文中表征了非天然存在的细胞因子结构域，其可用于，除其它以外，调节对白细胞介素-1受体I(IL-1RI)的细胞信号反应，治疗障碍，以及检测和/或结合细胞受体以及其它试剂。
本文中还表征了白细胞介素-1(IL-1)嵌合抑制剂的纯化制剂和用于纯化这样的蛋白质的方法。嵌合抑制剂可包括至少两种不同白细胞介素的表面特性，例如，与IL-1RI相互作用的表面特性。表面特性可来自IL-1β和IL-1Ra、IL-1α和IL-1RA或所有这三种细胞因子。IL-1嵌合抑制剂的合成可产生具有未知效应的产物相关种类。本文中表征的本发明提供了以大大减少的量的这样的产物相关种类产生蛋白质制剂的方法。令人惊讶地，方法中使用的阳离子和阴离子柱对于除去大量的产物相关种类是有效的。
在一个方面，本公开内容表征了提供嵌合细胞因子蛋白的方法。方法包括在例如至少1升培养基中培养包含质粒的大肠杆菌(E.coli)细胞，所述质粒包含在诱导型启动子系统控制之下的编码嵌合细胞因子蛋白的核酸序列。培 养体积可以是例如1L至15,000L，例如，5L至10,000L。例如，培养体积可大于2L、10L、90L、100L、400L、500L、800L、1000L、5000L、8000L、10,000L或12,000L。例如嵌合细胞因子蛋白包括与实施例1中的氨基酸序列具有至少90、95、98或100%的同一性的氨基酸序列，例如P03、P04或P05。例如，蛋白质是P05。核酸序列可包括实施例1中列出的核酸序列例如编码P05的序列。
可将细胞培养在具有比LB培养基更丰富的营养物含量的培养基中。例如，将细胞生长在包含至少0.5%或1%或1.2%胰蛋白胨、至少1%、2%、2.2%或2.4%的酵母提取物、至少0.5mM EDTA(例如，0.05mM至0.8mM EDTA)和/或至少0.1、0.2或0.4%甘油的培养基中。可用微量元素补充培养基。可在培养过程中给细胞喂饲葡萄糖，例如至少3、5、6、7、8或9g/L/hr。可以例如根据培养基pH、OD和/或细胞生长条件，以超过一个速率，例如至少两个不同的速率喂饲细胞。
例如，在培养过程中，例如以5-60、30-60、40-60或20-40%的溶解氧给细胞充氧。可将培养基维持在pH6-7.5或6.7-7.2或6.9–7.1。
例如，可在大于5、10、20、30、35或40的OD下，例如，通过添加IPTG来诱导细胞。例如，诱导型启动子系统包括在一个或多个lac操纵子的控制下的T7启动子和编码T7聚合酶的基因。可将编码核酸序列有效地连接于T7启动子。
方法还可包括例如在金属螯合剂存在的情况下裂解大肠杆菌细胞以提供包含嵌合细胞因子蛋白的裂解物。金属螯合剂可以是例如EDTA或EGTA。例如，其是EDTA并且以大于2.5mM，例如大于2.6、3、4、5、7或8mM，例如，4–11mM的浓度存在。可使用包含金属螯合剂的裂解缓冲液裂解细胞。
裂解缓冲液可具有低于8.0、7.9、7.5、7.1、7.0、6.9，例如，5.0至7.0或5.9至7.5或5.9至7.1的pH。裂解缓冲液可具有低于0.1%Triton X-100的去垢剂浓度/胶束浓度。例如，裂解缓冲液不含去垢剂。裂解缓冲液可具有低于500mM、400mM、300mM、200mM、100mM、50mM或10mM的NaCl或低于具有这样的NaCl浓度的盐溶液的电导率。
方法还可包括例如通过不超过3或2个柱层析步骤从裂解物纯化嵌合细胞因子蛋白。因此，可将裂解物用于制备如本文中所述的例如用于阳离子交 换层析的负载制剂(load preparation)。
在一些实施方案中，方法可包括下列层析步骤的至少1、2或3个步骤：(i)阳性交换步骤，(ii)阴离子交换步骤，和(iii)羟基磷灰石柱层析步骤。
在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白使用不超过一个柱层析步骤来进行纯化。例如，嵌合细胞因子蛋白在第一柱层析步骤后纯度为至少50、60、70、80、90或95%。
在一些实施方案中，用于层析柱的负载制剂包括一个或多个过滤步骤，例如使用0.8/0.45μm的过滤(Sartorius2)；和/或0.45/0.2μm的过滤(Sartorius2)。
在一个方面，本发明表征了使用阳离子交换柱和阴离子交换柱以及羟基磷灰石柱纯化嵌合细胞因子蛋白制剂的方法。可从在至少500mL、1升、2升或5升或更多培养基中培养的细胞例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞回收嵌合细胞因子蛋白制剂，其中大肠杆菌细胞包含具有在诱导型启动子下表达嵌合细胞因子蛋白的核酸序列的质粒。
在一个实施方案中，将嵌合细胞因子蛋白制剂用于阳离子交换柱(CEX)；用不洗脱嵌合细胞因子蛋白的洗涤缓冲液洗涤阳离子交换柱，利用洗脱缓冲液从阳离子交换柱洗脱结合的蛋白质以提供包含嵌合细胞因子蛋白的CEX洗脱物。随后将CEX洗脱物例如在其中嵌合细胞因子蛋白大体上不结合阴离子交换表面的条件下用于阴离子交换表面；和收集从阴离子交换柱(AEX流通液)通过的流通液，将其加载至陶瓷羟基磷灰石柱(CHA)。缓冲条件是使嵌合细胞因子蛋白结合CHA柱的条件。随后从柱洗脱纯化的蛋白质。完整蛋白质对污染性蛋白质亚型例如des-Ala蛋白质亚型、甲二磺酰化蛋白质亚型和乙酰化蛋白质亚型的比率在纯化后增加。例如，在一个实施方案中，纯化制剂包含少于10%的蛋白质的des-Ala形式，少于10%的蛋白质的乙酰化形式和少于10%的蛋白质的甲二磺酰化形式。在另一个实施方案中，纯化制剂包含少于百万分之50的宿主蛋白质。
纯化的蛋白质制剂可包含例如70%至100%，例如，80%至99%的完整蛋白质；0%至15%，例如，2%至7%的Des-Ala蛋白质亚型；0%至10%，例如，0.1%至4%的甲二磺酰化蛋白质亚型；和0%至15%，例如，0%至5%的乙酰化蛋白质亚型。
在另一个方面，本公开内容表征了方法，其包括：将包含嵌合细胞因子 蛋白的完整形式和任选地minus-Ala(例如，des-Ala)、甲二磺酰化和乙酰化形式的一种或多种的负载制剂用于阳离子交换表面；用不洗脱嵌合细胞因子蛋白的洗涤缓冲液洗涤阳离子交换表面，和用洗脱缓冲液洗脱阳离子交换表面以提供包含嵌合细胞因子蛋白的完整形式的CEX洗脱物。例如嵌合细胞因子蛋白的完整形式包括与实施例1中的氨基酸序列具有至少90、95、98或100%的同一性的氨基酸序列，例如P03、P04或P05。例如，蛋白质是P05。核酸序列可包括实施例1中所列的核酸序列，例如，编码P05的序列。完整蛋白质例如P05蛋白的Des-Ala形式、甲二磺酰化和乙酰化形式是蛋白制剂例如P05蛋白质制剂中的杂质，其通过本发明中表征的纯化方法来除去。完整蛋白质的des-Ala形式是蛋白质的完整形式，其中N末端Ala已通过蛋白水解除去；完整蛋白质的甲二磺酰化形式是具有附加的N末端甲硫氨酸的完整蛋白质；嵌合细胞因子蛋白的乙酰化形式是乙酰化完整蛋白质或完整蛋白质的乙酰化甲二磺酰化形式。
例如，负载制剂可具有小于5、4、3.5或3.3mS/cm的电导率。负载制剂可不含去垢剂。负载制剂可具有小于6.0、5.8、5.6或5.4的pH，例如约5.3。在一些实施方案中，从先前未被层析的裂解物制备负载制剂。方法可包括例如使用弱酸，例如使用醋酸(例如，通过添加少于800、600、400、300或优选约200mM醋酸的溶液)将裂解物调整至低于6.0的pH以制备负载制剂。可以例如通过离心和/或过滤澄清负载制剂。负载制剂可具有低于5、4、3或2g/L的蛋白质浓度。在一些实施方案中，作为总的嵌合细胞因子蛋白的百分比，负载制剂包含少于30%、25%或20%的嵌合细胞因子蛋白的des-Ala形式，少于30%、25%或20%的嵌合细胞因子蛋白乙酰化形式和少于30%、25%或20%的嵌合细胞因子蛋白甲二磺酰化形式。在一些实施方案中，作为总的嵌合细胞因子蛋白的百分比，负载制剂包含5%至20%或7%至17%的des-Ala形式；1%至10%或2%至7%的甲二磺酰化形式；和5%至20%或8%至15%的乙酰化形式。阳离子交换表面可以是例如强阳离子交换(CEX)表面。在一些实施方案中，表面包括磺丙基官能团。表面可以是可被填充进柱子中的基质(CEX基质)。例如，CEX基质包括交联的聚(苯乙烯-二乙烯苯)珠粒。示例性CEX基质包括CM-Sepharose、CMC-纤维素、和Fast flow。
可以以例如低于40mg/ml的CEX基质的浓度加载嵌合细胞因子蛋白。 例如，基质具有50-200、80-140或88-120微摩尔Na+/ml的离子容量(ioniccapacity)。
在一些实施方案中，CEX基质存在于0.5–20ml的柱子中或10mL至1000L的柱子中，例如大于10mL、15mL、20mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、6L、10L、50L、100L、250L、500L、600L、700L或800L的柱子中。例如，用大于1、5或10个柱体积洗涤柱子。可用小于5、4、3.5、3.3mS/cm的电导率的缓冲液洗涤柱子。例如，洗涤缓冲液具有低于40、30或25mMNaCl；和/或洗涤缓冲液具有至少5、10或15mM NaCl或相当浓度的其它盐。洗涤缓冲液可包含醋酸。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有低于6.5、6.0、5.9、5.6或5.5，例如，5–5.5，例如，约5.3或5至5.5，例如，约5.9的pH。
在一些实施方案中，洗脱不包括梯度。例如，洗脱包括分步洗脱。分步洗脱可包括使用具有高于结合缓冲液和每一种先前的洗脱缓冲液的pH的洗脱缓冲液。分步洗脱是从例如低于5.7的pH至高于5.7的pH，例如，从低于5.6的pH至高于5.85的pH，例如从低于5.5的pH至高于5.9的pH，例如，从约5.3的pH至至少6.0的pH或从约5.3的pH至至少6.8的pH。分步洗脱可包括应用具有增加的盐浓度和/或增加的电导率的洗脱缓冲液。例如，盐浓度从低于或等于30mM NaCl的浓度增加至大于或等40mM NaCl或相当浓度的其它盐的浓度。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的主要盐是NaCl。
洗脱缓冲液可具有大于3.5、4、5、5.5、6mS/cm例如5.5–7，例如6-7，例如约6.6mS/cm的电导率。洗脱缓冲液可包括具有在至少pH5.9-6.1的范围内的缓冲能力的缓冲液。例如，洗脱缓冲液包括MOPS，例如，至少50mMMOPS，例如100-250mM MOPS。洗脱缓冲液还可包括至少20mM MOPS、pH高至约8.0。
嵌合细胞因子蛋白的完整形式和des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式可以例如以不同的动力学和/或不同的盐浓度或pH从阳离子交换表面差异洗脱。例如，例如在分步或梯度洗脱过程中，des-Ala形式在完整形式之后洗脱，乙酰化形式在甲二磺酰化形式和完整形式之前洗脱，甲二磺酰化形式在完整形式之前洗脱。
方法可用于例如通过使一种或多种des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%来相对于des-Ala形式、 乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种富集完整形式。例如，洗脱物中的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种少于20%、15%、12%、10%或8%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法可用于通过使des-Ala形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少10%、20%、40%60%或70%或更多来相对于des-Ala形式富集完整形式。例如，洗脱物中的des-Ala形式少于20%、15%、12%、10%或8%的总的嵌合细胞因子蛋白。例如，洗脱物中的des-Ala形式为2%至20%、3%至10%或4%至7%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法可用于通过使乙酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少70%、80%、90%或99%来相对于乙酰化形式富集完整形式。例如，洗脱物中的乙酰化形式少于10%、5%、3%、1%或0.5%的总的嵌合细胞因子蛋白。例如，洗脱物中的乙酰化形式为0.01%至5%、1%至3%或2%至2.5%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法还可用于通过使甲二磺酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少10%、20%、40%、70%或80%来相对于甲二磺酰化形式富集完整形式。例如，洗脱物中的甲二磺酰化形式少于10%、8%、5%、3%或2%的总的嵌合细胞因子蛋白。例如，洗脱物中的甲二磺酰化形式为1%至10%、2%至8%或3%至5%的总的嵌合细胞因子蛋白。
在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白的回收率大于20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%，例如，60%至80%。在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白在CEX洗脱物中的纯度为至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。例如，在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白在CEX洗脱物中的纯度为至少70%至99%、80%至98%、90%至95%。通常地，宿主细胞蛋白质(HCP)浓度相对于负载制剂减小。宿主细胞蛋白质是指与受体结合剂不同的制剂中的蛋白质，例如是从其制备受体结合剂的宿主细胞的内源蛋白质，通常地大肠杆菌蛋白质。
例如，CEX洗脱物具有低于1000ppm、800ppm、600ppm或500ppm的HCP。在一些实施方案中，HCP浓度降低至少70%、80%、90%或99%。例如，HCP浓度降低80%至99.99%或90%至99.5%。
在一个方面，本发明表征CEX洗脱物，其包含例如完整的嵌合细胞因子蛋白和任选地蛋白质的des-Ala形式、甲二磺酰化形式和乙酰化形式。洗 脱物可包含80%至99%的完整蛋白质(例如，80%、85%、90%或95%或更多的完整蛋白质)；3%至20%的des-Ala种类(例如，5%、10%、15%或20%des-Ala种类)；0.1%至15%的甲二磺酰化种类(0.2%、0.5%、1%、5%或10%的甲二磺酰化种类)；和0%至5%的乙酰化种类(0.001%、0.01%、0.1%、1%或3%的乙酰化种类)。
在一些方面，将CEX洗脱物在例如其中嵌合细胞因子蛋白大体上不结合阴离子交换表面的条件下用于阴离子交换表面。在其它实施方案中，使用结合-和-洗脱阴离子交换层析处理CEX洗脱物。
方法可用于纯化过程，例如，其包括总共不超过3或2个额外的柱层析步骤。在一些实施方案中，使用单个柱层析步骤。例如，在层析步骤中不进行梯度洗脱。
另一个方法包括将包含嵌合细胞因子蛋白的制剂用于阴离子交换表面；和从阴离子交换表面收集流通液(AEX流通液)。可将方法与例如阳离子交换层析组合使用，例如，如上文和本文中描述的。例如，AEX流通液包含为用于阴离子交换表面的制剂的例如1/2、1/10或1/50倍的HCP。内毒素和核酸例如DNA相对于用于阴离子交换表面的制剂可得以减少。在一些实施方案中，使用的制剂包含低于5000ppm的HCP，AEX流通液包含低于1000、500、400或300ppm的HCP。在一些实施方案中，AEX流通液中的HCP进一步减少50%、60%、70%、80%或90%。在一些实施方案中，AEX流通液中的HCP减少50%至90%、60%至80%或65%至75%。
例如，阴离子交换表面是强季铵阴离子交换器。在一些实施方案中，阴离子交换表面包括Capto^TM Q阴离子交换树脂。在一些实施方案中，阴离子交换表面包括HQ阴离子交换树脂。在一些实施方案中，阴离子交换表面具有50-400或100-300微摩尔Cl-/ml的离子容量。阴离子交换柱的体积可在40mL至20L的范围内。例如，阴离子交换柱可具有约50mL、500mL、1L、5L、10L、20L、50L、80L、100L、120L、150L、300L、500L、600L或700L的体积。
阴离子交换表面可以是膜。
在一个方面，本发明表征了AEX流通液，其包含完整的嵌合细胞因子蛋白和任选地蛋白质的des-Ala形式、甲二磺酰化形式和乙酰化形式。流通液可包括例如80%至99%的完整蛋白质(例如，80%、85%、90%或95%或更 多的完整蛋白质)；3%至20%的des-Ala种类(例如，5%、10%、15%或20%的des-Ala种类)；0.1%至15%的甲二磺酰化种类(0.2%、0.5%、1%、5%或10%的甲二磺酰化种类)；和0%至5%的乙酰化种类(0.001%、0.01%、0.1%、1%或3%的乙酰化种类)。
另一个方法包括在例如其中嵌合细胞因子蛋白结合CHA柱的条件下将包含嵌合细胞因子蛋白的制剂用于陶瓷羟基磷灰石柱(CHA)；和在例如其中嵌合细胞因子蛋白从CHA柱释放的条件下洗脱CHA柱，和收集包含纯化的嵌合细胞因子蛋白的洗脱物。例如，从CHA柱的洗脱物收集的纯化的嵌合细胞因子蛋白包含更少的宿主细胞蛋白质；和/或减少量的嵌合细胞因子蛋白的形式例如des-Ala、乙酰化和甲二磺酰化形式的形式。在一些实施方案中，从CHA柱的洗脱物收集的制剂包含低于500ppm、200ppm、100ppm或低于50ppm的HCP。在一些实施方案中，CHA柱的洗脱物中的HCP进一步减少50%、60%、70%、80%、90%、92%、96%或98%。在一些实施方案中，CHA柱的洗脱物中的HPC减少50%至99%、60%至98%或80%至95%。
嵌合细胞因子蛋白的完整形式和des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式可以以不同的动力学和/或以不同的盐浓度或pH从CHA交换表面差异洗脱。例如，在例如分步或梯度洗脱过程中，des-Ala形式在完整形式之前洗脱，甲二磺酰化形式在Des-Ala形式之前洗脱。
方法可用于例如通过使一种或多种des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%来相对于des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种富集完整形式。例如，洗脱物中的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种少于20%、15%、12%、10%或8%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法可用于通过使des-Ala形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少10%、20%、40%60%或70%或更多来相对于des-Ala形式富集完整形式。例如，洗脱物中的des-Ala形式是1%至10%、2%至8%或3%至6%的总的嵌合细胞因子蛋白。洗脱物中的des-Ala形式可少于20%、15%、12%、10%或8%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法可用于通过使乙酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少70%、80%、90%或99%来相对于乙酰化形式富集完整形式。例如，CHA洗脱物中的乙酰化形式少于10%、5%、3%、1%或0.5%的总的嵌合细 胞因子蛋白。例如，洗脱物中的乙酰化形式为0.01%至5%、1%至3%或2%至2.5%的总的嵌合细胞因子蛋白。
方法还可用于通过使甲二磺酰化形式的百分比减少至少1%、3%、5%、7%或8%或至少10%、20%、40%、70%、80%或90%来相对于甲二磺酰化形式富集完整形式。例如，洗脱物中的甲二磺酰化形式少于10%、5%、2%、1%、0.5%或0.05%的总的嵌合细胞因子蛋白。例如，洗脱物中的甲二磺酰化形式为0.05%至10%、1%至8%或3%至5%的总的嵌合细胞因子蛋白。
在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白的回收率大于50%、60%、80%或90%，例如，80%至99%。在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白在CHA洗脱物中的纯度为至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%。例如，在一些实施方案中，嵌合细胞因子蛋白在CHA洗脱物中的纯度为至少70%至99%、80%至98%、90%至95%。通常地，HCP浓度相对于负载制剂减小。
例如，CHA洗脱物具有少于1000ppm、800ppm、600ppm或500ppm的HCP。在一些实施方案中，HCP浓度减少至少70%、80%、90%或99%。例如，HCP浓度减少80%至99.99%或90%至99.5%。
CHA柱的体积可以为例如150mL至500L。例如，阴离子交换柱可具有约200mL、220mL、500mL、1L、5L、10L、30L、100L、500L、600L、700L或800L的体积。
在一个方面，本发明表征CHA洗脱物，其包含例如完整嵌合细胞因子蛋白和任选地蛋白质的des-Ala形式、甲二磺酰化形式和乙酰化形式。洗脱物可包括例如80%至99%的完整蛋白质(例如，80%、85%、90%或95%或更多的完整蛋白质)；0.1%至15%的des-Ala种类(例如，2%、5%或10%的des-Ala种类)；0.1%至10%的甲二磺酰化种类(0.01%、0.5%、1%或5%的甲二磺酰化种类)；和0%至5%的乙酰化种类(0.001%、0.01%、0.1%、1%或3%的乙酰化种类)。
本文中描述的纯化方法还可包括评价材料以检测des-Ala形式、乙酰化形式和/或甲二磺酰化形式。例如，评价包括分析性弱阳离子交换层析。
纯化方法还可包括进行额外的层析步骤、陶瓷羟基磷灰石步骤和/或超滤/渗滤。
嵌合细胞因子蛋白的总回收率可以为30%、40%、50%、60%、70%或80%的起始蛋白质制剂。嵌合细胞因子蛋白的回收率可以为30%至90%、40%至80%或50%至70%的总起始蛋白质。
在另一个方面，本公开内容表征了包含嵌合细胞因子蛋白的纯化制剂。例如，嵌合细胞因子蛋白是实施例1中所列的蛋白质，例如P03、P04或P05或与这样的蛋白质具有至少90%的同一性的蛋白质。例如，蛋白质是P05。完整形式对des-Ala形式的比率为至少1:1、2:1、3:1、5:1、8:1或10:1，完整形式对乙酰化形式的比率为至少1:1、2:1、3:1、5:1、8:1或10:1，以及完整形式对甲二磺酰化形式的比率为至少1:1、2:1、3:1、5:1、8:1或10:1。
嵌合细胞因子蛋白可具有大于90%、92%、94%或95%的纯度。例如，纯化制剂包含至少50%、60%、70%、80%、90%的完整形式作为总的蛋白质的百分比。例如，des-Ala形式少于50%、40%、30%、20%、15%或10%的制剂中的蛋白质，和/或少于50%、40%、30%、20%、15%或10%的总的嵌合细胞因子蛋白。完整、des-Ala、乙酰化和甲二磺酰化形式的相对量可通过分析法例如分析性弱阳离子交换层析来测定。制剂可包括少于10%的含量的嵌合细胞因子蛋白的其它形式(即，除des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的其它形式)。
纯化制剂中的嵌合细胞因子蛋白的浓度可以为至少0.001mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/mL或50mg/ml。例如，蛋白质为10-100mg/ml、1mg/mL–20mg/mL、1–50mg/ml、10–50mg/ml或25–75mg/ml或40–105mg/ml。
制剂可以是含水制剂并且还可包括缓冲剂和药学上可接受的盐。制剂可以是无菌含水制剂(例如，包括注射用水)。制剂可具有不同的体积，并且可包含至少1mg、100mg、1g、10g、50g、100g或1kg的完整蛋白质。
可冷冻干燥制剂。制剂，例如如果含水，可进行冷冻或可在4℃-8℃或室温保存。在一些实施方案中，制剂(例如，液体制剂或冻干制剂)在室温(例如，21℃至25℃，例如，23℃)稳定至少两周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少1年或更长。在一个实施方案中，制剂稳定冷冻(例如，在-20℃或-70℃或-80℃)至少6个月、至少1年、至少2年或更长时间。在一些实施方案中，制剂包括少于20%、15%、10%或5%的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式。
制剂可大体上不含核酸和内毒素。例如，其具有低于1000ppm、500ppm、400ppm、300ppm、200ppm、100ppm或50ppm的HCP水平。
在一些实施方案中，制剂包括本文中描述的缓冲条件。在一些实施方案中，制剂具有5-6、6-7或7-8，例如，5.5-7.5的pH。在一些实施方案中，制剂具有小于10mS/cm、8mS/cm、7mS/cm、6mS/cm、5mS/cm或4mS/cm的电导率。制剂可包括MOPS或其它缓冲剂，例如Tris或醋酸盐。制剂可不含去垢剂。制剂可包含磷酸盐或可不含磷酸盐。制剂可包含螯合剂。
制剂可包含盐、张度剂和去垢剂的一种或多种。盐可以是例如柠檬酸钠、醋酸钠、氯化钠等。示例性张度剂包括山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖和甘油。示例性去垢剂包括例如泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇的其它脂肪酸酯以及聚氧乙烯醚。
在一个实施方案中，制剂包含1mg/mL至30mg/mL嵌合细胞因子蛋白、5mM至15mM柠檬酸钠、2%至8%山梨醇、0.05%至0.15%泊洛沙姆188，pH5.5-6.5。在另一个实施方案中，制剂包含1mg/mL至20mg/mL嵌合细胞因子蛋白、10mM柠檬酸钠、5%山梨醇、0.1%泊洛沙姆188，pH6.0。
在一个实施方案中，制剂还包含类固醇。类固醇可以是例如地塞米松、肤轻松(fluocinolone)、氟轻松(fluocinolone acetonide)、曲安西龙、曲安奈德或其盐或混合物。
在一个方面，制剂适合用于施用至眼中，例如，局部地施用至眼中。
在一个方面，本发明表征了评估制剂的方法，所述制剂包含本文中描述的细胞因子蛋白，例如包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的蛋白，所述方法包括获得(例如直接获得)如下水平的一个或多个或全部水平的测定：(a)所述蛋白质的des-Ala形式的水平；(b)所述蛋白质的乙酰化形式(其中乙酰化形式可以是全长序列例如嵌合细胞因子蛋白或des-Ala形式的全长序列的乙酰化形式)的水平；或(c)所述蛋白质的甲二磺酰化形式(其中甲二磺酰化形式可以是全长序列例如嵌合细胞因子蛋白的全长序列的甲二磺酰化形式)的水平。方法还可包括将a、b和c的全部的一项或多项的测定水平与参照值相比较，其中每一项可具有其自己的参照值。例如，方法可包括如下方面的一个或多个或全部方面：可将a的测定水平与des-Ala形式的水平的参照值相比较，可将b的测定水平与乙酰化形式的水平的参照值相比较，可将c的测定水平与甲二磺酰化形式的水平的参照 值相比较。
在一个实施方案中，从例如所述蛋白质的商购可得样品；另一个批次，例如所述蛋白质的更早批次；由管理机构推荐、公布或要求的数值组；发表的说明书或标准；由药典当局例如美国药典(U.S.PHARMACOPEIA)推荐、公布或要求的数值组测定参照值。
测定可包括例如层析分析例如弱阳离子交换层析分析。
在一个实施方案中，方法包括确定制剂是否具有预先选择的与参照照值的关系，例如其是否大于、等于或小于参照值。
在一个实施方案中，对测定的反应，处理制剂，其中处理包括选择、接受、加工成药品、运送、配制、贴标签、包装或销售制剂的一项或多项。
在一个实施方案中，改变对施用的反应、用于产生蛋白质的方法的参数。在实施方案中，在已完成给定的改变后重复测定。
如果乙酰化、甲二磺酰化或完整形式的一种或多种的水平按例如重量/重量计低于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%，则处理制剂，其中处理包括选择、接受、加工成药品、运送、配制、贴标签、包装或销售制剂的一项或多项。
制剂可以例如通过将前体制剂经历纯化步骤来制备。制剂还可通过将前体制剂与层析基质例如阳离交换、阴离子交换或或羟基磷灰石基质接触来制备。制剂还可通过将前体制剂与层析基质例如阳离子交换、阴离子交换或羟基磷灰石基质的一种或多种或全部接触来制备。在一个实施方案中，制剂可通过将前体制剂与以下列顺序与阳离子交换、阴离子交换和羟基磷灰石基质接触来制备。
在一些实施方案中，制剂是纯化过程中的中间物，在该情况下，制剂可以是例如来自层析过程的浓缩或稀释的洗脱液。
制剂可包括例如来自阳离子交换柱的洗脱液，例如来自阳离子交换柱的浓缩或稀释的洗脱液或制剂可包括来自阴离子交换柱的洗脱液。
在一个实施方案中，方法还包括将前体制剂经历纯化步骤。例如，可将前体制剂与层析基质例如阳离子交换、阴离子交换或羟基磷灰石基质的一种或多种或全部接触。与前体制剂的接触可以是与阳离子交换基质，和随后与阴离子交换基质，和随后与羟基磷灰石基质的接触。
处理可包括例如配制用于给眼内施用的制剂。
在一个实施方案中，将评价储存在例如计算机可读记录中。
本发明的一个方面表征了通过例如下列步骤评价蛋白质制剂的方法：提供来自在羟基磷灰石柱上纯化的蛋白质制剂的分离的级分，其中蛋白质具有与SEQ ID NO:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列，和利用弱阳离子交换(wCEX)层析分析级分以测定蛋白质的des-Ala形式、乙酰化形式或甲二磺酰化形式的一种或多种的水平。如果蛋白质的des-Ala形式、酰化形式或甲二磺酰化形式的一种或多种以低于10%的水平存在，则例如通过选择、接受、加工成药品、运送、配制、贴标签、包装或销售制剂来处理制剂。
在一个方面，本发明表征了例如通过提供蛋白质的制剂的分离的级分，使用根据权利要求93所述的方法进行分析，来分析制备包含与SEQ IDNO:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的蛋白质的制剂的过程的方法，如果蛋白质的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种以少于10%的百分比存在，则至少部分基于分析维持所述过程。
在另一个方面，本发明表征了例如通过提供制剂中蛋白质的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种的水平的wCEX测定，来处理包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的蛋白质制剂的方法，如果蛋白质的des-Ala形式、乙酰化形式和甲二磺酰化形式的一种或多种以少于10%的百分比存在，则处理所述制剂，其中处理包括选择、接受、加工成药品、运送、配制、贴标签、包装或销售制剂的一项或多项。在一个
处理可包括例如配制用于眼内施用的制剂。
在一个实施方案中，处理包括测定蛋白质的活性。
在另一个方面，本公开内容表征了分离的蛋白质，包括包含来自至少两个亲代细胞因子结构域的氨基酸残基(例如受体结合特性、表面特性、β链)和来自少两个亲代细胞因子结构域的环的细胞因子结构域。
在一些实施方案中，细胞因子结构域结合IL-1RI并且包括来自不同亲代细胞因子结构域，例如来自受体激动剂和受体拮抗剂(例如IL-1β和IL-1Ra或IL-1α和IL-1Ra)，来自IL-1β的IL-1α或来自IL-1Ra、IL-1α和IL-1Ra的全部三种的受体结合特性。受体结合特性可对应于位点A和B中的残基、区段或区域。关于这样的对应于位点A和B的残基、区段和区域，在IL-1(IL-1β、IL-1α和IL-1Ra)的背景中，参见下文中进一步的定义。
关于位点A，细胞因子结构域可具有：(a)(i)与第一亲代细胞因子结构域中的对应残基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的位点A残基；(a)(ii)与第一亲代细胞因子结构域中的对应残基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的延伸的位点A残基；(a)(iii)与第一亲代细胞因子结构域中的对应区域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位点A区段A1和A2；和/或(a)(iv)与第一亲代细胞因子结构域的对应区域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位点A区域。
关于位点B，细胞因子结构域可具有：(b)(i)与第二亲代细胞因子结构域中的对应残基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的位点B残基；(b)(ii)与第二亲代细胞因子结构域中的对应残基具有至少60%、70%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%的同一性的延伸的位点B残基；(b)(iii)与第二亲代细胞因子结构域的对应区域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位点B区段B1、B2和B3；和/或(b)(iv)与第二亲代细胞因子结构域的对应区域具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%或100%的同一性的位点B区域。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包括特性：(a)(i)和b(i)、(a)(ii)和b(ii)、(a)(iii)和(b)(iii)或(a)(iv)和(b)(iv)，例如，其中每一个特性进一步通过80、85、88、90、92、95或100%的同一性来定义。例如，第一亲代细胞因子结构域可以是IL-1β，并且第二亲代细胞因子结构域可以是IL-1Ra。例如，第一亲代细胞因子结构域可以是IL-1α，并且第二亲代细胞因子结构域可以是IL-1Ra。
细胞因子结构域还可在结构域中的一个或多个位置上包括减弱与细胞因子第二受体(例如，IL-1RAcP)的相互作用的来自第二亲代细胞因子结构域的氨基酸。例如，第二亲代细胞因子结构域是IL-1Ra。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括一个或多个来自IL-1Ra的位点C和/或D区段(例如，C1、D1、D2、D3、D4和/或D5)或与这样的区段具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的序列。例如，细胞因子结构域包括(i)与IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同 一性的位点C残基；(ii)与IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位点D残基；(iii)与IL-1Ra中的对应残基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的C1区段；或(iv)与在至少3、4或5个残基上与IL-1Ra中的对应残基相同的D2区段。细胞因子结构域可包括特性(i)和(ii)或(ii)和(iii)，例如，其中每一个特性进一步通过80、85、88、90、92、95或100%的同一性来定义，或(iii)和(iv)
结构域可包括来自至少两个不同的人IL-1家族细胞因子结构域的区域，其中区域选自A区域(具有A1和A2区段)、B区域(具有B1、B2和B3区段)、C区域和D区域(具有D1、D2、D3、D4和D5区段)。
细胞因子结构域可包括来自不同细胞因子结构域的位点A区域和位点B区域。位点A区域可来自天然存在的受体激动剂或拮抗剂；位点B区域可来自天然存在的受体激动剂。其可包括来自天然存在的受体拮抗剂的位点C区域和/或来自天然存在的受体拮抗剂的位点D区域。
例如，结构域可以是嵌合结构域，其具有在长度上为至少5、6、10、15、20或25个氨基酸并且与来自至少两个不同亲代细胞因子结构域例如第一和第二亲代细胞因子结构域的对应区段具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性的区段。亲代细胞因子结构域可以是IL-1RI结合细胞因子，例如IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。在一些实施方案中，不存在于来自第一亲代细胞因子结构域的区段中的氨基酸来自两个或更多个其它亲代细胞因子结构域。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包括至少两个在长度上具有至少5、6、10、15、20或25个氨基酸的区段，所述区段与第一亲代细胞因子结构域的对应区段具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性，并且不存在于这样的区段上的氨基酸与第二亲代细胞因子结构域中的对应残基具有显著(例如，至少50、60、70、80、85、88、90、92、95或100%)同一性。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包含(i)至少两个在长度上具有至少5、6、10、15、20或25个氨基酸的区段，所述区段与第一亲代细胞因子结构域的对应区段具有至少80、85、88、90、92、95或100%的同一性，和(ii)至少1、2或3个例如在长度上具有至少5、6、7、8、10或15个氨基酸的区段，所述区段与第二亲代细胞因子结构域相同。
例如，细胞因子结构域可包括具有20-50、25-50、30-45或30-40个氨基酸(例如，29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)的第一区段，和具有20-45、20-40、25-40或25-35个氨基酸(例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35)的第二区段，每一个区段与第一亲代细胞因子结构域(例如，IL-1Ra)相同(或至少80、85、88、90、92、95或98%的同一性)，和与第二亲代细胞因子结构域(例如，IL-1β或IL-1α)相同(或至少80、85、88、90、92、95或98%的同一性)的第三区段。例如，第三区段在长度上可以为55-90、60-90、60-85或70-85个氨基酸，例如，在长度上为75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85个氨基酸。
在一些实施方案中：第一区段可以是与WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9，在本文中也称为A1区段，对应于SEQ ID NO:3的残基16-40和根据IL-1β编号的残基11-36)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的区段。第二区段可以是与SEQ ID NO:3(IL-1Ra)的残基120-140或120-141(对应于残基121-139或121-140(根据IL-1β编号))具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的区段。第三区段可以与来自IL-1β(SEQ ID NO:1)的残基45-100或42-120具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性。
在一些情况下，第一区段可以是与SEQ ID NO:3的残基14-45(对应于根据IL-1β编号的残基9-41)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的区段。第二区段可以是与SEQ ID NO:3的残基120-145(对应于根据IL-1β编号的残基121-145)或SEQ ID NO:3的残基120-147(对应于根据IL-1β编号的残基121-147)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的区段。在一些实施方案中，至少残基11-41和120-147(根据IL-1β编号)总体上与IL-1Ra中对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性。
在一些实施方案中，第一IL-1家族细胞因子结构域的区段之一的末端位于SEQ ID NO:1的氨基酸41的5、4、3、2或1个氨基酸内，并且第一IL-1家族细胞因子结构域的区段之一的末端位于SEQ ID NO:1的氨基酸121的5、4、3、2或1个氨基酸内。
在一些实施方案中，结构域包括在SEQ ID NO:1的氨基酸42的5、4、3、2或1个氨基酸内的位置上具有N末端并且在SEQ ID NO:1的氨基酸120 的5、4、3、2或1个氨基酸内具有C末端的区段、和／或在SEQ ID NO：1的氨基酸121的5、4、3、2或1个氨基酸内的位置上具有N末端并且在SEQID NO：1的氨基酸145的5、4、3、2或1个氨基酸内具有C末端的区段。在一些实施方案中，结构域中对应于残基11-41和120-147(根据IL-1β编号)的位置上的残基总体上与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100％的同一性。结构域还可基于IL-1细胞因子家族成员的例如在与前述位置类似的位置上的序列。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包括下列序列的1、2、3或更多个：
WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO：9)；NLEEK(SEQ ID NO：10)；
RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO：11)；AMEADQP(SEQ ID NO：12)；
FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO：13)；和／或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括下列序列的1、2、3或更多个：
VQGEESNDKI(SEQ ID NO：14)；KKKMEKRF(SEQ ID NO：15)；和
FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN
YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO：16)；
和／或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100％的同一性的序列。
在一些实施方案中，β1β2、β2β3、β8β9和β10β11环的一个或多个或全部与来自IL-1拮抗剂例如IL-1Ra的对应的环具有至少80、85、88、90、92、95或100％的同一性。在一些实施方案中，β4β5、β5β6、β6β7和β7β8环的一个或多个或全部与来自与人亲代细胞因子不同的IL-1家族细胞因子结构域的对应环具至少80、85、88、90、92、95或100％的同一性，所述对应环与β1β2、β2β3、β8β9和β10β11环最相似。例如，β4β5、β5β6、β6β7和β7β8环的一个或多个或全部与来自IL-1激动剂例如IL-1β的这样的环具有至少80、85、88、90、92、95或100％的同一性。在一些实施方案中，β11β12环与来自IL-1拮抗剂例如IL-1Ra的对应环具有至少80、85、88、90、92、95或100％的同一性。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包含与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11的1、2、3个或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括与IL-1β的β4、β6、β7和β8或IL-1β的β4、β5、β6、β7和β8的1、2、3个或全部具有至少80、 85、88、90、92、95或100%的同一性的序列。
在一些实施方案中，细胞因子结构域不包含与SEQ ID NO:3的氨基酸I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110或I46-G118具有超过80、85、90、95或100%的同一性的区段。在一些实施方案中，细胞因子结构域不包含与SEQ ID NO:1的氨基酸N7-V41、R11-M36、N102-D145或Y121-D145具有超过80、85、90、95或100%的同一性的区段。
一般而言、细胞因子结构域不是天然存在的。其与人IL-1家族细胞因子结构域相异。例如，其与IL-1Ra(SEQ ID NO:3)、IL-1β(SEQ ID NO:1)和/或IL-1α(SEQ ID NO:2)具有少于98、95、90、85、80、75、70、65、60或55%的同一性。细胞因子结构域还可与这样的细胞因子具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%的同一性。例如，嵌合结构域可与IL-1Ra、IL-1β和IL-1α具有30-95%、40-90%或45-85%的同一性。例如，嵌合结构域可与IL-1β具有40-90%的同一性和与IL-1Ra具有35-85%的同一性；与IL-1β具有40-80%的同一性和与IL-1Ra具有45-80%的同一性；与IL-1β具有45-72%的同一性和与IL-1Ra具有45-80%的同一性；与IL-1β具有45-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-80%的同一性；与IL-1β具有50-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-70%的同一性；与IL-1β具有60-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-68%的同一性；与IL-1β具有65-72%的同一性和与IL-1Ra具有54-60%的同一性；或与IL-1β具有68-72%的同一性和与IL-1Ra具有54-57%的同一性。例如，嵌合结构域可与IL-1α具有40-90%的同一性和与IL-1Ra具有35-85%的同一性；与IL-1α具有40-80%的同一性和与IL-1Ra具有45-80%的同一性；与IL-1α具有45-72%的同一性和与IL-1Ra具有45-80%的同一性；与IL-1α具有45-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-80%的同一性；与IL-1α具有50-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-70%的同一性；与IL-1α具有60-72%的同一性和与IL-1Ra具有53-68%的同一性；与IL-1α具有65-72%的同一性和与IL-1Ra具有54-60%的同一性；或与IL-1α具有68-72%的同一性和与IL-1Ra具有54-57%的同一性。
在一些实施方案中，细胞因子结构域与IL-1Ra相异，并且结合受体，同时包括天然存在的受体拮抗剂(例如IL-1Ra)的位点C和/或位点D特征。例如，结构域与人IL-1β和/或IL-1Ra具有少于98、95、92、90、85和80% 的同一性。例如，结构域与IL-1Ra具有40-95%、40-90%或45-85%的同一性。结构域还可与IL-1家族细胞因子激动剂例如IL-1α或IL-1β具有40-95%、40-90%或45-85%的同一性。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括：来自第一亲代细胞因子的至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85%的氨基酸，其为细胞因子信号转导的激动剂。
在一些实施方案中，细胞因子结构域与受体激动剂(例如IL-1β或IL-1α)的氨基酸同一性(例如，至少大于5、10、15或20%)大于与受体拮抗剂(IL-1Ra)的同一性，但用作IL-1RI的拮抗剂。
在一些实施方案中，细胞因子结构域是完全嵌合的，例如，结构域中的每一个氨基酸来自亲代细胞因子结构域之一，例如两个亲代细胞因子结构域之一或3个或更多个亲代细胞因子之一。例如，亲代细胞因子结构域是人细胞因子结构域或非人灵长类动物细胞因子结构域。在一些实施方案中，细胞因子结构域是部分嵌合的，例如结构域中的所有氨基酸不全来自亲代细胞因子结构域之一。
例如，分离的蛋白质结合IL-1RI并且通过受体调节信号转导，例如，激动或拮抗IL-1RI受体信号转导活性。在一些实施方案中，蛋白质当与IL-1β反应性人细胞接触时未显著诱导IL-6的产生，和/或大体上不诱导IL-1β反应性受体基因的产生(例如，以10μg/ml、100μg/ml或1mg/ml的浓度)。一般而言，蛋白质通过IL-1β(例如，在本文中描述的细胞测定中以0.1ng/ml的浓度)，以小于100、50、20、10或5nM的IC50抑制信号转导。蛋白质可以通过IL-1β以小于IL-1Ra的IC50(例如，至少小于10、20或50%)的IC50抑制信号转导。
在某些实施方案中，细胞因子结构域例如以与亲代细胞因子结构域之一相同或更好的亲和力结合。在一些实施方案中，细胞因子结构域以小于100nM、50nM、20nM、10nM、5nM或1nM或小于500pM、400pM、100pM或50pM的K_D结合IL-1RI。例如，缔合常数可大于1×10⁴、3×10⁴、1×10⁵或1×10⁶M^-1s^-1，解离常数可小于1×10^-3、1×10^-4、6×10^-4或6×10^-5s^-1。
在一些实施方案中，细胞因子结构域以比IL-1β或IL-1Ra更好的亲和力(例如，更低的K_D)和/或更慢的解离结合IL-1RI。例如，细胞因子结构域可以以小于或等于IL-1Ra的解离常数的解离常数和/或以大于或等于IL-1β的缔合常数结合IL-1RI。
细胞因子结构域在长度上可为约120-180个氨基酸，在长度上可为140-170个氨基酸，在长度上可为148-160个氨基酸，或在长度上可为150-156个氨基酸。在一些实施方案中，结构域在长度上为152个氨基酸，在长度上为153个氨基酸或在长度上为154个氨基酸。通常地，结构域包括至少10、11或12个β-链，并且是稳定折叠的。在一些实施方案中，细胞因子结构域具有至少38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃或64℃的Tm，如本文中描述的。其可具有51-61℃、51-66℃、56-61℃或56-66℃的Tm。在一些实施方案中，细胞因子结构域在至少48℃、50℃、51℃、55℃、57℃、58℃或59℃后才开始展开。例如，其在生理缓冲液中具有至少在IL-1Ra和/或IL-1β的Tm的10℃或5℃内的Tm。在一些实施方案中，其在生理缓冲液中比IL-1Ra和/或IL-1β更具热稳定性。例如结构域在生理缓冲液中可具有比IL-1Ra和/或IL-1β的Tm高至少2℃、4℃6℃、7℃或8℃，例如在约0.5mg/ml的浓度下比IL-1Ra和/或IL-1β的Tm高约5-12℃、5-10℃或7-10℃的Tm。
蛋白质可包括本文中描述的其它特性。
在另一个方面，本公开内容表征了包括嵌合IL-1家族细胞因子结构域的分离的蛋白质。IL-1细胞因子家族成员的实例包括IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10和IL-33。细胞因子结构域可包括前述细胞因子之一的受体结合区域或包括一种或多种这样的细胞因子的元件的蛋白质序列。例如，细胞因子结构域可包括两个或更多个IL-1细胞因子家族成员的嵌合结构域。
在一个实施方案中，嵌合结构域包括至少一个长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个氨基酸并且具有与第一IL-1家族细胞因子相同的氨基酸(或与其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)的区段，和长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸并且具有与第二IL-1家族细胞因子相同的氨基酸(或与其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)的另一个区段。嵌合结构域可与第一和第二IL-1家族细胞因子的之一或两者具有少于90、85、80或75%的同一性。
在一个实施方案中，第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。在另一个实施方案中，第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7和IL-1F8。在另一个实施方案中，第一IL-1家族细胞因子选自激动剂并且第二家族细胞因子选自拮抗剂。在一些实施方案中，嵌合结构域包括少于120、110、100、90或80个来自相同亲代细胞因子结构域的连续氨基酸。
在一个实施方案中，嵌合结构域在至少50、60、70、80、90、100、110或120个位置上与第一IL-1家族细胞因子相同，并且在至少50、60、70、80、90、100、110或120个位置(包括可单独地与这两种细胞因子相同的位置)上与第二IL-1家族细胞因子相同。
在一个实施方案中，嵌合结构域包括至少2、3或4个不连续区段，每一个具有至少5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的长度并且具有与第一IL-1家族细胞因子的对应区段相同的氨基酸(或与其具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)，并且在其余位置上包括主要来自第二IL-1家族细胞因子的氨基酸。在一个实施方案中，嵌合结构域包括4、5、6或7个区段，其中相邻区段来自不同的亲代IL-1家族细胞因子结构域。例如，结构域中的每一个氨基酸位于来自天然存在的人IL-1家族细胞因子结构域的长度为至少5或个6氨基酸的肽中。在一个实施方案中，嵌合结构域包括如下区段的至少1、2或3个：(i)来自IL-1β的长度为至少50、60、65、70或75个氨基酸的区段、(ii)来自IL-1Ra的长度为至少15、20、25个氨基酸的区段；和(iii)来自IL-1Ra的长度为至少15、20、25个氨基酸的另一个区段。
在一个实施方案中，不连续区段包括根据IL-1β中的这样的位置的编号的残基(i)1-6和45-61、(ii)1-6和86-95、(iii)45-61和86-95、(iv)1-6和148-153、(v)45-61和148-153或(vi)86-95和148-153。来自第一IL-1家族细胞因子的3个不连续区段可包括例如根据IL-1β中的这样的位置的编号的残基1-8、42-120和141-153、残基1-10、37-125和131-153或残基1-6、45-61、86-95和148-153。嵌合结构域在其余位置上可与第二IL-1家族细胞因子具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。在一个实施方案中，不连续区段的边界的一个或多个位于其中第一和第二IL-1家族细胞因子相同或保守的位置上。蛋白质可具有本文中描述的其它特性。
在另一个方面，本公开内容表征了分离的IL-1抑制剂，包括结合IL-1RI的IL-1家族细胞因子结构域。例如，IL-1抑制剂包括上述或本文中其它地方描述的一个或多个特性。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括：(a)在下列位置ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141(根据IL-1β的编号)上与IL-1Ra相同的氨基酸，和(b)在下列位置：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152上与IL-1β相同的氨基酸。在一些实施方案中，位点A区段A1和A2与IL-1Ra的对应区段具有至少80%的同一性(总体上)。在一些实施方案中，位点B区段B1、B2和B3与IL-1β的对应区段具有至少80%的同一性(总体上)。例如，位点A区段A1和A2与IL-1Ra的对应区段具有至少90%的同一性(总体上)；并且位点B区段B1、B2和B3与IL-1β的对应区段具有至少90%的同一性(总体上)。例如，位点A区段A1和A2与IL-1Ra的对应区段相同；以及位点B区段B1、B2和B3与IL-1β的对应区段相同。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包括与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11具有至少80%的同一性(总体上)的序列和与IL-1β的β链β4、β6、β7和β8具有至少80%的同一性(总体上)的序列。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11相同的序列和与IL-1β的β链β4、β6、β7和β8相同的序列。在一些实施方案中，上文中鉴定的来自IL-1β的区段和特性来源于IL-1α或IL-1β或IL-1α的组合。
在一些实施方案中，IL-1抑制剂包括下列性质的一个或多个(例如，至少2、3、4、5、6或7个)：(i)与IL-1β、IL-1α或IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位点A或位点B残基(和/或延伸的位点A和延伸的位点B残基)；(ii)在总体上与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的A1和A2区段；(iii)在总体上与IL-1β或IL-1α中的对应残基具有至少80%的同一性的B1、B2和B3区段；(iv)与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位点A区域；(v)与IL-1β或IL-1α中对应的残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位 点B区域；(vi)与IL-1Ra或IL36Ra中对应的残基具有至少50、60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的位点C和/或位点D残基，(vii)与IL-1Ra中对应的残基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的C1区段；(viii)在至少3、4或5个残基上与IL-1Ra中对应的残基相同的D2区段。细胞因子结构域与IL-1Ra相异，例如，细胞因子结构域与IL-1Ra具有少于99、98、95、90、85、80、75、70、65、60%的同一性和/或与IL-1Ra具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%的同一性，例如与IL-1Ra具有40-95%、40-90%或45-85%的同一性。在一些实施方案中，细胞因子结构域不包含与SEQ ID NO:3的氨基酸I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110或I46-G118具有大于80、85、90、95或100%的同一性的区段。在一些实施方案中，细胞因子结构域不包含与SEQ ID NO:1的氨基酸N7-V41、R11-M37、N102-D144或Y121-D144具有大于80、85、90、95或100%的同一性的区段。
在一些实施方案中，抑制剂以小于100、50、20、10、5或1nM的K_D结合IL-1RI。在一些实施方案中，抑制剂以比IL-1β或IL-1Ra更好的亲和力(例如，更低的K_D)和/或更慢的解离速率结合IL-1RI。
在一些实施方案中，抑制剂，当与IL-1β反应性人细胞接触时大体上不诱导IL-6表达。一般而言，抑制剂通过IL-1β，例如例如以小于100、50、20、10或5nM的IC50抑制信号转导。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包括下列序列的1、2、3或更多个：WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9)；NLEEK(SEQ IDNO:10)；RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11)；AMEADQP(SEQ ID NO:12)；FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性。在一些实施方案中，细胞因子结构域包括下列序列的1、2、3或更多个：VQGEESNDKI(SEQID NO:14)；KKKMEKRF(SEQ ID NO:15)；和FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO:16)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%的同一性的序列。抑制剂可包括本文中描述的其它特性。
在另一个方面，本公开内容提供了分离的蛋白质，其包括与本文中描述的序列例如表4和实施例1中所列的序列(例如，P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列)或实施例1、5、6或本文中其它地方的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或100%的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列包括至少至少一个置换、插入或缺失。氨基酸序列可包括少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个非保守置换或少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个总的置换。氨基酸序列可包括至少1、2、3、4或5个置换例如保守置换。
还提供了分离的蛋白质，所述蛋白质在P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列或实施例1、5、6中或本文中其它地方的序列的N末端包括甲硫氨酸，以及包括P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07或实施例1、5、6中或本文中其它地方的序列的氨基酸序列，其中N末端上的丙氨基酸不存在。这些形式分别代表完整蛋白质的甲二磺酰化和des-Ala亚型。还提供了乙酰化的分离的蛋白质。乙酰化形式包括乙酰化的完整蛋白质、乙酰化甲二横酸酯化蛋白质和乙酰化des-Ala亚型。前述序列可包括本文中公开的其它特性。例如，序列还可在例如相对于IL-1RI结合序列的N末端或C末端包括标签，例如六组氨酸序列。序列还可包括改变IL-1RI结合序列的稳定性或药代动力学的部分。序列还可包括血清白蛋白和/或其Fc结构域或其一个或多个结构域，例如一个或多个免疫球蛋白恒定结构域或一个或多个白蛋白结构域。蛋白质可具有本文中描述的其它特性。在一些实施方案中，分离的蛋白质由本文中公开的序列或嵌合结构域组成或基本上由所述序列或结构域组成。
在其它方面，本公开内容提供了分离的蛋白质，其包括具有本文中描述的细胞因子结构域例如表4中所列的细胞因子结构域的环状排列形式的结构域和/或包括SEQ ID NO:3的结构域。蛋白质还可在互换形式的N或C末端具有任选地通过接头间隔的异源序列(例如Fc结构域或白蛋白)。蛋白质可具有本文中描述的其它特性。
本公开内容还表征了包含一种或多种本文中描述的受体结合剂(例如包括嵌合细胞因子结构域的蛋白质)的药物组合物。组合物可以是眼科药物组合物、局部组合物或用于胃肠外施用的组合物。
在另一个方面，本公开内容表征了调节受试者的免疫或炎症反应的方法。方法可包括以有效地调节受试者的免疫或炎症反应的量给受试者施用包含本文中描述的受体结合剂的组合物。
在另一个方面，本公开内容表征了治疗受试者的IL-1介导的障碍的方法。方法包括给受试者施用包含可结合IL-1RI的蛋白，例如本文中描述的受体结合剂的组合物。例如，障碍可以是自身免疫障碍例如类风湿关节炎或幼年型慢性关节炎、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、强直性脊柱炎、白塞氏综合征、炎性肠病、哮喘、脉管炎或银屑病。障碍可以是与聚集体形成相关的障碍，例如，高尿酸血症、痛风、糖尿病(包括非胰依赖性糖尿病)、阿尔茨海默病、第二反应性淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病或帕金森氏病。障碍可以是CAPS(CIAS1相关周期性综合征)障碍或本文中描述的其它障碍。
在另一个方面，本公开内容表征了治疗受试者的IL-1介导的眼障碍的方法。方法可包括给受试者施用包含可结合IL-1RI的蛋白例如本文中描述的受体结合剂的组合物。例如，组合物是给受试者的眼或周围区域局部施用的眼科组合物。在一个实施方案中，障碍是干眼障碍。在一些实施方案中，受试者不显示全身性自身免疫性病的表现。在一些实施方案中，受试患有斯耶格伦氏综合征。在一些实施方案中，受试者具有移植物抗宿主病(GVHD)。在其它实施方案中，障碍是葡萄膜炎。
在另一个方面，本公开内容表征了抑制IL-1活性的方法。方法包括将可结合IL-1RI的受体结合剂与响应IL-1的细胞或与受试者接触。一般而言，以有效地抑制与细胞相关的IL-1活性或受试者中的IL-1活性的量提供蛋白质。可将蛋白质离体地与来自受试者的细胞接触。
在另一个方面，本公开内容表征了分离的核酸，其包括一个或多个编码本文中描述的蛋白质的序列或本文中(例如，表5中)描述的核酸，与这样的核酸杂交或与这样的核酸具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或100%的同一性的序列。示例性杂交序列可在长度上具有至少200、300、400、420或450个核苷酸，例如长度为420-480个核苷酸。核酸还可包括本文中公开的其它特性。
还表征了重组宿主细胞，其包含包括一个或多个编码本文中描述的蛋白质的序列的核酸及其多肽链。受体结合剂可通过这样的方法产生，所述方法 包括将宿主细胞维持在允许受体结合剂表达的条件下，和任选地例如从细胞或与宿主细胞相关的培养基回收受体结合剂。例如，可从细胞的裂解物纯化受体结合剂。可以例如利用赋形剂、稳定剂和缓冲剂的一种或多种配制纯化的受体结合剂。
还表征了提供嵌合蛋白质结构域的方法。方法包括鉴定至少2个具有共同折叠的亲代蛋白质(例如，第一亲代蛋白质和第二亲代蛋白质)、定位第一亲代蛋白质内的至少两个区段和构建核酸，所述核酸具有编码包括两个来自第一亲代蛋白质的区段和在其余位置上主要来自第二亲代蛋白质的残基的嵌合氨基酸序列的序列。结构域可以是主要由β-折叠片组成的结构域或主要由α-螺旋组成的结构域或具有这样的元件的组合的结构域。例如，结构域可具有细胞因子的折叠。第一和第二亲代蛋白质可通过同源性例如10-40%氨基酸的同一性相关。在一些实施方案中，来自第一蛋白质的区段位于单个折叠的蛋白质结构域内，并且嵌合氨基酸序列包括与第一和第二亲代蛋白质中的对应结构域不同一的折叠蛋白质结构域的形式。在一些实施方案中，两个亲代蛋白质具有不同的功能性质，并且嵌合结构域可具有亲代蛋白质之一或两者的性质。在一些实施方案中，嵌合结构域具有一个来自第一亲代蛋白质的结合界面，和另一个来自第二亲代蛋白质的结合界面。
在本文中参考IL-1家族细胞因子中与位点A、B、C和D相关的不同区域、区段和残基。这样的残基、区段和区域在人IL-1β(SEQ ID NO:1)的序列中的定位及对应的位置提供于下文中和图1中：
位点A。IL-1β中的位点A残基包括：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、SER21、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLU128、ASN129和MET130，其它IL1细胞因子家族成员的对应残基(在本文中称为“位点A残基”)。在某些特别地与IL-1β相关的上下文中，参考“延伸的位点残基”，其包括位点A残基以及GLN149和PHE150，以及其它IL1细胞因子家族成员的对应残基。此外，其可能定义如图4中所示的“位点A区域”，包括例如A1区段(在IL-1β中对应于SEQ IDNO:1的11-36)和A2区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的125-131)和其它IL1细胞因子家族成员中的对应区段。
位点B。IL-1β中的位点B残基包括：ALA1、PRO2、ARG4、GLN48、GLU51、ASN53、ILE56、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105和 ASN108、以及其它IL1细胞因子家族成员的对应残基(在本文中称为“位点B残基”)。在某些特别地与IL-1β相关的上下文中，参考“延伸的位点B残基”，其包括位点B残基以及在图4中的位点B区域外的PHE46和SER152。此外，其可能定义如图4中所示的“位点B区域”，包括例如B1区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的1-5)、B2区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的48-56)和B3区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的92-98)，以及其它IL1细胞因子家族成员中的对应区段。
位点C。IL-1β中的位点C残基包括：ILE104、ILE106、ASN107、LYS109、GLU111、THR137、LYS138、GLY139、GLY140、GLN141、THR144和ASP145以及其它IL1细胞因子家族成员的对应残基(在本文中称为“位点C残基”)。此外，其可能定义如图4中所示的“位点C区域”，包括例如C1区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的136-145)和其它IL1细胞因子家族成员中的对应区段。
位点D。IL-1β中的位点D残基包括：LEU6、THR9、LYS63、GLU64、LYS65和ASN66以及其它IL1细胞因子家族成员的对应残基(在本文中称为“位点D残基”)。此外，其可能定义如图4中所示的“位点D区域”，包括例如D1区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的6-9)、D2区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的37-41)、D3区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的63-66)、D4区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的86-91)和D5区段(在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的150-153)，以及其它IL1细胞因子家族成员中的对应区段。
位点A、B、C和D的残基和区域的位置的进一步鉴定可通过所述细胞因子与图4中显示的序列的比对来发现。
本文中参照的IL-1β(人)的氨基酸序列是：APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQ ID NO:1)。
本文中参照的IL-1α(人)的氨基酸序列是：SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTI TGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA(SEQ ID NO:2)。
本文中参照的IL-1Ra(人)的氨基酸序列是：RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED(SEQ ID NO:3)。本文中使用的术语IL-1β、IL-1α和IL-1Ra是指各自成熟的蛋白质。
本文中参照的和图4中显示的β折叠片是指下列序列：
表1

如下进行两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(术语在本文中可互换使用)的计算。按照本文中提供的比对，或在适当的比对不存在的情况下，按照如使用Needleman和Wunsch算法(如使用Blosum62评分矩阵以及为10的缺口罚分和为1的缺口延伸罚分在EMBOSS包的Needle算法中执行的)产生的最佳评分测定的最佳比对对齐序列。参见Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453；Kruskal,J.B.(1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编著),Time warps,string edits and macromolecules：the theory and practice of sequence comparison,第1-44页Addison Wesley,和可从欧洲生物信息研究所(CambridgeUK)EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000),Rice,P.等人,A.,Trends in Genetics16,(6)第276—277页获得的和可在ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html和emboss.open-bio.org/wiki/Appdoc:Needle上在线获得的工具。随后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的(如本文中所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数。为了测定一个目标序列与一组参照序列的集体同一性，如果位置与参照序列的组的任一个或多个中的对应位置上的至少一个氨基酸相同，则该位置被认为是同一的。关于成列的区段、特性或区域，可整体地地计算这样的列表的所有成员的同一性以获得总体百分比同一性。
本文中提供了与本文中公开的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性的序列。
如本文中所用，术语“获得”或“获取”是指通过“直接获得”或“间接获得”物理实体或值来获得物理实体或值例如数值的拥有。“直接获得”意指进行获得物理实体或值的方法(例如，进行合成或分析方法)。“间接获得”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接受物理实体或值。间接获得物理实体包括进行这样的方法，所述方法包括物理物质例如起始材料的物理改变。示例性改变包括从两个或更多个起始材料产生物理实体，剪切或片段化物质，分离或纯化物质，将两种或更多种分开的实体组合成混合物，进行包括断裂或形成共价键或非共价键的化学反应。直接获得值包括进行这样的方法，所述方法包括样品或另一种物质的物理改变，例如，进行包括物质例如样品、分析物或试剂的物理改变的分析方法(在本文中有时称为“物理分析”)，进行分析法，例如包括如下步骤的一个或多个的方法：将分析物或其片段或其它衍生物与另一种物质分离或纯化所述分析物或其片段或其它衍生物；将分析物或其片段或其它衍生物与另一种物质例如缓冲剂、溶剂或反应物组合；或通过例如断裂或形成分析物的第一与第二原子之间的共价或非共价键改变分析物或其片段或其它衍生物的结构；或通过例如 通过断裂或形成试剂的第一与第二原子之间的共价或非共价键改变试剂或其片段或其它衍生物的结构。
如本文中所用，术语“对应于”用于指定目标多肽相对于参照多肽的氨基酸残基的位置。一般地，位置是通过本文中提供的比对指定的位置(例如，图4)。
如本文中所用，术语“在高严格条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6(将其通过引用并入本文)中。含水和无水法描述于该参考资料中并且可使用任一种方法。高严格杂交条件包括在约45℃于6X SSC中杂交，随后在65℃于0.2X SSC,0.1%SDS中或大体上相似的条件下进行1次或多次洗涤。本文中提供了分离的核酸，其包含在高严格条件下与编码本文中公开的氨基酸序列的核酸和与本文中例如实施例1中公开的核酸杂交的序列。
本文中提及的天然存在的蛋白质明确地包括这样的蛋白质的人形式，以及还有来自其它哺乳动物物种的形式。
本文中引用的所有专利、公布的专利申请和出版的参考资料为了所有目的通过引用并入本文。
附图概述
图1是根据X射线晶体学数据测定的P04的结构的图。来自IL-1Ra的残基的主链以黑色显示，来自IL-β的残基的主链以灰色显示。
图2描述了结合至人IL-1RI的胞外结构域的P05蛋白的模型的3个视图。在P05中，以黑色描述IL-1Ra残基，以白色描述IL-1β残基。
图3描述其中以黑色描述IL-1Ra残基和以白色描述IL-1β残基的嵌合蛋白质的模型。模型描述蛋白质：P01(图3A)、P03(图3B)、P04(图3C)、P05(图3D)、P07(图3E)和P06(图3F)。
图4提供了几个人IL-1家族细胞因子：IL-1β(SEQ ID NO:1)、IL-1α(SEQID NO:2)、IL-1Ra(SEQ ID NO:3)、IL-33(SEQ ID NO:4)、IL-36Ra(SEQ IDNO:5)、IL-36α(SEQ ID NO:6)、IL-36β(SEQ ID NO:7)和IL-36γ(SEQ ID NO:8)的比对。在比对下鉴定了本文中的文本中参考的区段。此外，还鉴定了b-折叠片和这样的折叠片之间的环。
图5A是P01的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)的列表。图5B是P02的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)的列表。图5C是P03的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)的列表。图5D是P04的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)的列表。图5E是P05的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)的列表。来自IL-1β的区段以粗斜体字显示。也参见下文中的实施例1。
图6是显示从表达受体结合剂的大肠杆菌细胞纯化的蛋白质的示例性样品的SDS-PAGE凝胶的图像。15和20kDa分子量标准示于左边。泳道如下：分子量标准(泳道1和6)、提取物(泳道2和7)、通过阳离子交换层析(泳道3和8)纯化的材料、通过额外地阴离子交换层析纯化的材料(泳道4和9)以及这样的材料的还原样品(泳道5和10)。泳道2-5是P05纯化，泳道6-10是P04纯化。也参见实施例2。
图7A是显示P06、P07和P01蛋白相对于IL-1β和阴性对照β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)蛋白的激动信号转导的能力的表和附随条线图。图7B是描述P01在不同IL-1β浓度上对IL-1β的拮抗的图。
图8A是描述在0.1ng/ml IL-1β(人)存在的情况下P03(六组氨酸标记的)、P04(六组氨酸标记的)、P05(六组氨酸标记的)和IL-1Ra对IL-1β的拮抗的图。图8B是描述在0.1ng/ml IL-1β(人)存在的情况下，包含P01、P02、P03、P04和P05以及IL-1Ra的未标记形式的裂解物对IL-1β的拮抗和使用各自裂解物中蛋白质的浓度的评估的图。
图9包括显示下列蛋白：IL-1β(图9A)、IL-1Ra(图9B)、P04(图9C)和P05(图9D)的对固定的可溶性IL-1RI的结合动力学的SPR数据的图。
图10A是描述如实施例7中描述的IL-1Ra、IL-1β、P03、P04和P05的热变性的图。图10B描述图10A中的图的阴性第一衍生物。
图11A是显示干眼模型中小鼠在第0、3、7、9和11天的平均角膜染色评分±SEM(如通过两个独立研究的每眼角膜的荧光染色测试的)的条线图。小鼠不接受处理(n=18)、接受10mg/ml P05(n=19)或1.25×PBS、媒介物(n=20)。星号显示如下P05相对于媒介物的统计显著性：*(P<0.05)和**(P<0.005)。
图11B是表示来自单独的实验的数据的条线图，所述条形图显示干眼模型中小鼠在第0、3、7、9和11天的平均角膜染色评分±SEM。小鼠未接受处理(n=8)、接受1.25×PBS媒介物(n=8)、10mg/ml鼠血清白蛋白(MSA)(n =8)或10mg/ml P05(n=9)。星号显示如下P05相对于鼠血清白蛋白的统计显著性：*(P<0.05)和***(P<0.0005)。
图11C是包括在与图11B相同的实验中利用(0.05%环孢素乳剂)处理的小鼠(n=8)的数据的条线图。星号显示如下P05相对于鼠血清白蛋白的统计显著性：**(P<0.005)和***(P<0.0005)。
图12A描述了覆盖在其结构的计算模型(灰色)上的P04的X射线晶体学结构(黑色)的结构。图12B举例说明P04的K64与E39之间的相互作用；图12C举例说明P04的C末端残基Q149和S152与K40和R9之间的相互作用。
图13是包括描述洗涤和在pH6.0和35%B进行的洗脱的洗脱特征谱的扩展的层析谱的图。
图14是包括描述洗涤和在pH6.0和35%B进行的洗脱的洗脱特征谱的扩展的层析谱的图。
图15是显示在pH6.0和35%B使用洗脱从实验纯化的蛋白质的示例性样品的SDS-PAGE凝胶的图像。
图16是显示在pH6.0和30%B使用洗脱从实验纯化的蛋白质的示例性样品的SDS-PAGE凝胶的图像。
图17A、17B、17C和17D是比较在2L和100L蛋白质生产系列中进行的终分批补料发酵过程的图。
详述
细胞因子的IL-1家族包括几个成员，其全都具有由6个β-链组成的共同b-三叶形折叠，所述6个β-链形成被另外6个β-链盖住的β-桶。这些细胞因子的人和其它哺乳动物形式的一级结构是已知的。几个人IL-1家族成员的示例性结构比对示于图1中。
我们已发现，除其它以外，IL-1折叠是高度可塑的。具体地，可将来自不同成员的组件组合以提供激动或拮抗细胞因子信号转导的蛋白质。这些蛋白质的实例包括嵌合细胞因子结构域，其在另一种细胞因子或细胞因子共有序列的背景中包括例如来自一种细胞因子的2或更多个区段或表面残基，从而产生来自不同IL-1家族细胞因子的受体相互作用位点的非天然存在的组合。
IL-1家族细胞因子可包括至少两个主要受体相互作用位点(称为位点A和位点B)。位点A和B参与与主要细胞因子受体(例如，IL-1RI)的接触。在IL-1Ra和IL-1β的情况下，例如两种蛋白质在位点A和B上显著不同，以便IL-1Ra在位点B中产生比在位点A中更少的受体接触。
我们已发现，可能构建包括来源于一种细胞因子的位点A和来源于另一种细胞因子的位点B的结构功能性嵌合细胞因子结构域。IL-1折叠的可塑性允许构建多种嵌合细胞因子结构域来拮抗IL-1信号转导。
此外，IL-1家族细胞因子可包括两个二级受体相互作用位点(称为位点C和位点D)，其参与激动和/或拮抗，并且可决定细胞因子与其第二细胞因子受体(例如，IL-1RAcP)相互作用的能力。来自天然受体拮抗剂(例如IL-1Ra)的位点C和/或位点D残基的包含可赋予拮抗性质。可构建嵌合细胞因子结构域，其包括来自一种或多种IL-1激动剂(例如IL-1β和IL-1α)和/或IL-1受体拮抗剂(例如IL-1Ra)的位点A和B之一或两者以及来自IL-1受体拮抗剂(例如IL-1Ra)的位点C和D之一或两者。因此，可能产生拮抗信号转导和包括来自IL-1激动剂的位点B残基的嵌合细胞因子结构域。
示例性组合也提供于下面的表2中。
表2

ABCD1.IL-1β或1αIL-1β或1αIL-1RaIL-1β或1α2.IL-1β或1αIL-1β或1αIL-1β或1αIL-1Ra3.IL-1β或1αIL-1β或1αIL-1RaIL-1Ra
4.IL-1RaIL-1β或1αIL-1RaIL-1β或1α5.IL-1RaIL-1β或1αIL-1β或1αIL-1Ra6.IL-1RaIL-1β或1αIL-1RaIL-1Ra
来源序列可与鉴定的细胞因子结构域的人序列相同，或可相对于人序列包含突变，例如以便它们与各自区域中人序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的同一性，例如，它们可包括来自每一个区域的一个或多个区段。
可选择位点A残基和位点B残基的来源来最大化对于主要受体的亲和力。例如，为了结合IL-1RI，位点A残基可来源于IL-1Ra，位点B残基可来源于IL-1β。
嵌合细胞因子结构域可具有结合IL-1家族受体的能力，例如，以小于10^-8、10^-9或10^-10的K_D，例如以在相同条件下的天然受体配体(例如，IL-1β、IL-1α或IL-1Ra)的K_D的10或100倍内的K_D或小于在相同条件下的天然配体(例如，IL-1β、IL-1α或IL-1Ra)的K_D的K_D结合人IL-1RI。此外，在某些实施方案中，嵌合细胞因子结构域以比其亲代细胞因子结构域的至少一个的更小的K_D、更快的K_on或更慢的K_off结合。
结合IL-1家族受体并且拮抗受体信号转导的嵌合细胞因子结构域可用作受体结合剂，例如，以治疗由下述IL-1家族细胞因子信号转导介导的障碍。例如，在一些实施方案中，嵌合细胞因子结构域结合IL-1RI并且拮抗IL-1信号转导。例如，其具有小于100、10、1、0.6或0.3nM的IC₅₀。
在某些实施方案中，细胞因子结构域可与第一IL-1家族细胞因子结构域具有至少40、45或50%的同一性，但少于完全同一性，例如少于95、90、85或80%的同一性。同时，细胞因子结构域还可以与第二IL-1家族细胞因子结构域具有至少40、45或50%的同一性，但少于完全同一性，例如少于95、90、85或80%的同一性。第一和第二IL-1家族细胞因子结构域可彼此具有少于50%的同一性。例如，第一IL-1家族细胞因子结构域可以是激动剂(例如，IL-1β或IL-1α)，然而第二IL-1家族细胞因子结构域可以是受体拮抗剂(例如，IL-1Ra)。
在一些实施方案中，细胞因子结构域内至少80、85、90、92、94、95、97、98、99或100%的位置具有这样的性质，即在每一个这样的位置上，存在的氨基酸与第一IL-1家族细胞因子结构域或与第二IL-1家族细胞因子结构域(或如果第一和第二IL-1家族细胞因子在特定位点上相同则两者)是相同的。当细胞因子结构域中100%的氨基酸位置具有该性质时，结构域是两种细胞因子的完全嵌合体。嵌合细胞因子结构域还可从超过两种细胞因子来制备，并且还可相对于其亲代细胞因子具有突变(例如，一个或多个其中存在的氨基酸与其亲代细胞因子的每一个中的对应氨基酸相异的特定位置)。
细胞因子结构域可具有来自不同IL-1细胞因子结构域的位点A、B、C和D残基，并且同样地可具有来自不同IL-1细胞因子结构域的位点A、B、C和D区域。
位点A。例如，在某些实施方案中，细胞因子结构域在上文中鉴定的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个上或上文中鉴定的延伸的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17、18、19或20个上，包含来自受体拮抗剂(例如，IL-1Ra)或激动剂的残基或这样的残基或至少50、65、75、80、90、95或100%的这样的残基的保守置换。在一些实施方案中，细胞因子结构域包含与受体拮抗剂(例如，IL-1Ra)或激动剂(例如，IL-1β或IL-1α)中的区段A1、A2或A1+A2具有至少70、75、80、85、88、90、92、95或100%的同一性的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域与本文中鉴定的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个残基或上文中鉴定的延伸的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个上，包含与IL-1激动剂(例如，IL-1β残基)相同的残基和这样的残基或至少50、65、75、80、90、95或100%的这样的残基的保守置换。
位点B。在某些实施方案中，细胞因子结构域在本文中鉴定的位点B残基的至少2、3、5、8、9、10、11、12、13、14或15个上包含与IL-1激动剂(例如，IL-1β或IL-1α残基)相同的残基或这样的残基或至少50、65、75、80、90、95或100%的这样的残基的保守置换。在一些实施方案中，细胞因子结构域包含与IL-1细胞因子激动剂(例如，IL-1β或IL-1α)中的区段B1、B2、B3、B1+B2、B1+B3、B2+B3或B1+B2+B3具有至少70、75、80、85、88、90、92、95或100%的同一性的残基。
位点C。在某些实施方案中，细胞因子结构域在本文中鉴定的位点C残基的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个上包含与受体拮抗剂(例如，IL-1Ra残基)相同的残基或这样的残基或至少50、65、75、80、90或100%的这样的残基的保守置换。在一些实施方案中，细胞因子结构域包含与受体拮抗剂(例如，IL-1Ra)中的区段C1具有至少50、65、75、80、90或100%的同一性的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域可包含例如如下氨基酸的一个或多个：对应于SEQ ID NO:1的THR137的位置上的疏水氨基酸残基(例如， Met或Ile)、或对应于SEQ ID NO:1的GLN141的位置上的疏水性例如脂肪族氨基酸(例如，Val或Ile)，和对应于SEQ ID NO:1的ASP145的位置上的非酸性氨基酸例如碱性氨基酸(例如，Lys或Arg)，以及对应于其在其它IL-1细胞因子中的位置上的这样的残基。证据显示Asp145对于IL-1RAcP的募集是非常重要的，因此对非酸性残基的突变破坏激动剂活性，并且可用于赋予拮抗性质。因此，在某些实施方案中，非酸性氨基酸例如碱性氨基酸(例如，Lys或Arg)或疏水性氨基酸位于对应于SEQ ID NO:1的ASP145的位置上。
位点D。在某些实施方案中，细胞因子结构域在本文中鉴定的位点D残基的至少1、2、3、4、5或6个上包含与受体拮抗剂(例如，IL-1Ra残基)相同的残基或这样的残基或至少50、65、75、80、90、95或100%的这样的残基的保守置换。在一些实施方案中，细胞因子结构域包含与受体拮抗剂(例如，IL-1Ra)中的区段D1、D2、D3、D4、D5、D1+D2、D1+D2+D3及其组合具有至少50、65、75、80、90、95或100%的同一性的残基。
IL-1β中的几个残基与IL-1RI接触或与IL-1RI靠近，例如：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、ALA127、GLU128、ASN129、MET130、GLN141、GLN149、PHE150和SER152。除至上述位置的指定外，这些残基可被分类成两组：组1和组2。
IL-1β中的示例性组1残基包括：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141和其它IL-1细胞因子家族成员中的对应残基。延伸的组1残基包括相互作用组1残基和1ITB结构中上述残基的4埃内的残基。IL-1β中的示例性组2残基包括：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152以及其它IL-1细胞因子家族成员中的对应残基。延伸的组2残基包括相互作用组2残基和1ITB结构中上述残基的4埃内的残基。在某些实施方案中，细胞 因子结构域在上文中鉴定的组1残基的至少15、16、17、18、19、20或21个上包含IL-1β残基。在某些实施方案中，细胞因子结构域在上文中鉴定的组2残基的至少15、16、17、18、19、20、21或22个上包含IL-1β残基。在一些实施方案中，细胞因子结构域在延伸的组1残基的至少15、16、17、18、19、20或21个上包含IL-1β残基。在一些实施方案中，细胞因子结构域在延伸的组2残基的至少15、16、17、18、19、20或21个上包含IL-1β残基。
可用作受体结合剂的其它变体包括具有来源于两个或更多个IL-1细胞因子家族成员的序列的蛋白质。这样的变体的实例包括基于IL-1β和IL-1Ra的嵌合结构域。例如，变体可包括来自IL-1Ra的组1的一个或多个氨基酸残基(例如，来自IL-1Ra的所有组1残基)和来自IL-1β的组2的一个或多个氨基酸残基(例如，来自IL-1β的所有组2残基)。
示例性嵌合蛋白质在下列氨基酸位置(即，基于与IL-1β中的这些位置的对应性)：SEQ ID NO:1的残基1-8、42-120和141-153；SEQ ID NO:1的残基1-6、45-61、86-95和148-153；和SEQ ID NO:1的残基1-10、37-125和131-153上与IL-1β具有显著(例如，至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%)的同一性。
其余残基可与IL-1Ra具有显著(例如，至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%)的同一性。例如，下列氨基酸位置可与IL-1Ra具有显著的同一性：SEQ ID NO:1的残基9-41和121-140；SEQ ID NO1的残基7-44、62-85和96-147；和SEQ ID NO:1的残基11-36和126-130。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在IL-1β的除了氨基酸位置Gln48–Asn53以外的至少2、4、5、10或20个位置上与IL-1β相同并且，例如，细胞因子结构域与除IL-1β外的细胞因子具有显著例如至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%的同一性。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的1-8的位置上包括至少3、4、5、6、7或8个与IL-1β相同的残基。例如，其在对应于：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4和LEU6的3、4或全部5个的位置上包含与IL-1β相同的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在与SEQ ID NO:1的45-61的位置对应的位置上包含至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个与IL-1β相同的残基。例如，其在对应于PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56和PRO57的3、4、5、6、7或8个的位置上包含与IL-1β相同的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的86-95的位置上包含至少5、6、7、8、9或10个与IL-1β相同的残基。例如，其在对应于LYS92、LYS93和LYS94的1、2或全部3个的位置上包含与IL-1β相同的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的148-153的位置上包含至少3、4、5或6个与IL-1β相同的残基。例如，其在对应于GLN149、PHE150和SER152的1、2或全部3个的位置上包含与IL-1β相同的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于IL-1β的THR147的位置上不包含苏氨酸。例如，该位置可以是芳香族氨基酸例如酪氨酸。对应于IL-1β的THR147的位置上的芳香族氨基酸可堆叠在在几个实施方案中存在于位置11(根据IL-1β编号)上的另一个芳香族氨基酸(例如，色氨酸)上。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于IL-1β的CYS8的位置上不包含芳香族氨基酸。例如，该位置可以是除苯丙氨酸外或除芳香族氨基酸外的氨基酸。例如，其可以是半胱氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸。该位置位于其它大残基特别地MET44和MET148(根据IL-1β编号)的附近。优选，并非全部3个位置8、43和148是大残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的30-36的位置上包含至少5、6或7个与IL-1Ra相同的残基，例如至少5、6或7个与YLQGPNV(SEQ ID NO:43)相同的残基。例如，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的11-36的位置上包含至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25或26个与IL-1Ra相同的残基。细胞因子结构域还可在对应于SEQ ID NO:1的145的位置上包含碱性残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：(a)对应IL-1β的Val40的位置上的谷氨酸和对应于IL-1β的Lys65的位置上的赖氨酸；(b)对应于IL-1β的Thr9的位置上的精氨酸和对应于IL-1β的Gln149的位置上的谷氨酰胺； 和/或(c)对应于IL-1β的V41的位置上的赖氨酸和对应于IL-1β的Ser152的位置上的丝氨酸。
细胞因子结构域还可在对应于126-132的位置上包含至少4、5、6或7个与IL-1Ra相同的残基，例如至少4、5、6或7个与MEADQPVS(SEQ IDNO:44)相同的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的62-85的位置上包含至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23或24个与IL-1β相同的残基。
在一些实施方案中，细胞因子结构域包含下列氨基酸序列的一个或多个(例如，全部4个)：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、IDVSFV(SEQ ID NO:46)、KKMDKR(SEQ ID NO:47)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)；下列序列的一个或多个(例如，全部4个)：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、IDVSFV(SEQ IDNO:46)、NKLSFE(SEQ ID NO:49)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)；下列序列的一个或多个(例如，全部4个)：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、EEKFSM(SEQ IDNO:50)、RFVFIR(SEQ ID NO:51和VTKFTM(SEQ ID NO:52)；下列序列的一个或多个(例如，全部4个)：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、EEKFSM(SEQ IDNO:50)、FESAAC(SEQ ID NO:53)和VTKFTM(SEQ ID NO:54)；或下列序列的一个或多个(例如，全部4个)：LNCRIW(SEQ ID NO:55)、EEKFSM(SEQID NO:50)、PNWFLC(SEQ ID NO:56)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)。
嵌合蛋白质可用于多种目的。例如，它们可用于增强或减弱受体信号转导活性，检测表达受体的细胞或纯化它们所结合的细胞或蛋白质。
在下文的实施例1中提供了基于IL-1β和IL-Ra的嵌合细胞因子结构域的特定实例，其包括拮抗IL-1信号转导的下列示例性细胞因子结构域：
P01。P01结构域包含来自IL-1Ra的对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Val48、Ile60-Val83和Asp95-Tyr147的3个区段，和来自IL-1β的其余4个区段。总体上，P01结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的74个(约48%的同一性)和来自IL-1Ra的119个氨基酸(约77%的同一性)。这些百分比加起来超过100%，因为P01和本文中公开的其它示例性蛋白质中的许多氨基酸是在IL-1β与IL-1Ra之间是保守的氨基酸，因此为IL-1β和IL-1Ra的百分比同一性作出贡献。
P02。P02结构域包含来自IL-1Ra的对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Val48、Ile60-Val83和Ser110-Tyr147的3个区段和来自IL-1β的其余4个区段。总体上，P02结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的85个(约55%的同一性)和来自IL-1Ra的108个氨基酸(约70%的同一性)。
P03。P03结构域包含来自IL-1Ra的对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Lys45和Phe100-Lys145的两个区段和来自IL-1β的其余3个区段。总体上，P03结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的94个(约61%的同一性)和来自IL-1Ra的91个氨基酸(约64%的同一性)。
P04。P04结构域包含来自IL-1Ra的对应于SEQ ID NO:3的氨基酸氨基酸Ala12-Lys45和Ala114-Lys145的两个区段和来自IL-1β的其余3个区段。总体上，P04结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的104个(约68%的同一性)和来自IL-1Ra的89个氨基酸(约58%的同一性)。
P05。P05结构域包含来IL-1Ra的对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Arg14-Lys45和Phe120-Tyr147的两个区段和来自IL-1β的其余3个区段。总体上，P05结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的108个(约70%的同一性)和来自IL-1Ra的85氨基酸(约55%的同一性)。
可类似地构建其它嵌合蛋白质。例如，可在IL-1α与IL-1Ra之间制备嵌合蛋白质，例如，具体地对于上述实例的每一个，结构域包含与来自IL-1α而非IL-1β的对应残基组合的IL-1Ra的已鉴定的区段。
蛋白质修饰和置换。蛋白质序列例如本文中描述的那些序列可以例如通过产生一个或多个保守置换来改变。可产生保守置换以保留功能或使功能产生适度的变化。示例性保守置换描述于下表中。
表3

可基于它们对如下方面的潜在效应选择置换：(a)置换附近的主链结构例如折叠片或螺旋构象，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性或(c)侧链的体积和分枝。可基于侧链性质分类氨基酸残基：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；asn；gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响主链构象的残基：gly、pro；和(6)芳香族：trp、tyr、phe。
非保守置换可包括用这些种类之一的成员置换不同种类的成员。保守置换可包括用这些种类之一的成员置换相同种类的另一个成员。
还可在氨基酸的亲水指数的上下文中评价特定残基的重要性。基于其疏水性和电荷特征给每一个氨基酸赋予亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。关于亲水氨基酸指数及其重要性的论述，参见，例如，Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-131。
蛋白质的序列可通过任何方法来改变，所述方法包括寡核苷酸介导的 (定点)诱变(Carter等人,Nucl.Acids Res.,13:4331,1986；Zoller等人,Nucl.Acids Res.,10:6487,1987)、盒式诱变(Wells等人,Gene,34:315,1985)、限制性选择诱变(Wells等人,Philos.Trans.R.Soc.London,317:415,1986)和PCR诱变。也参见In Vitro Mutagenesis Protocols：第3版,Braman(编著),HumanaPress,(2010)ISBN：1607616513和PCR Cloning Protocols：From MolecularCloning to Genetic Engineering,Chen和Janes(编著),HumanaPress,(2002)ISBN：0896039730。
扫描氨基酸分析可用于评价沿着连续序列的1个或多个氨基酸。方法可包括将区域中的每一个或几乎每一个氨基酸突变成特定氨基酸，例如，突变成相对小的中性氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸。通常选择丙氨酸，因为其消除了β-碳原子旁的侧链，并且不太可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells,Science,244：1081-1085,1989)。其还是最常见的氨基酸并且频繁地发现于被包埋和暴露的位置(Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)；Chothia,J.Mol.Biol.,150:1,1976)。还可改造扫描过程以使之适合用于产生更明显的变化，例如可将带电荷的残基改变成具有相反电荷的残基，可用具有大侧链的残基替代具有短侧链的残基。例如，精氨酸扫描是可用于替代丙氨酸扫描或除了丙氨酸扫描以外的方法。可将扫描用于区域中的每一个残基或用于具有特定性质的残基，例如蛋白质表面上或表面附近的残基，或可能存在于蛋白质的表面上或蛋白质的表面附近的残基。
可以例如通过进行基于同源性的建模、能量最小化和/或其它建模，使用已知的解析的结构对蛋白质、其结构域之一或包括蛋白质的复合物的结构进行建模。这样的方法包括：Accelrys Software Inc.,Discovery,Release3.0,San Diego：Accelrys Software Inc.,2010,AMBER^TM建模软件(Case等人(2005)J.Computat.Chem.26,1668-1688和Case等人(2010),AMBER11,University of California,San Francisco,CA USA)以及CHARMM^TM建模软件(Molecular Simulations Inc.)。通常也参见Baker和Sali,Science294(5540):93-6,2001)。还可以例如使用X-射线晶体学和/或NMR光谱学直接测定结构。
描述IL-1家族细胞因子的结构的示例性PDB结构包括：1I1B、1ILR、1IRA、1ITB、2I1B、2ILA、2KLL、4I1B、5I1B、6I1B、7I1B、8I1B、9ILB和1MD6(可在来自RCSB-Rutgers,Piscataway NJ,USA的pdb.org上在线获得，和从美国国立医学图书馆(Bethesda,MD,USA)获得)。例如，单独的和与 受体IL-1RI复合的IL-1β的结构已被解析。参见，例如，Finzel等人(1989)J.Mol.Biol.209：779-791,PDB1ITB,和Vigers等人(1997)Nature386：190-194。IL-1Ra与IL-1RI一起的结构已被解析。参见，例如，PDB1IRA和Schreuder等人,(1997)Nature386：194-200。
可以例如使用计数机软件例如碱基局部对准检索工具(BLAST)、PSI-BLAST、PHI-BLAST、WU-BLAST-2,和/或MEGABLAST通过序列比对来帮助同源性建模。参见Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215,403-410；Altschul等人,1996,Methods in Enzymology266,460-480；和Karlin等人,1993,PNAS USA90,5873-5787。用于对齐大分子(氨基酸序列和核酸序列)的其它算法包括FASTA(Pearson,1995,Protein Science4,1145-1160)、ClustalW(Higgin等人,1996,Methods Enzymol.266,383-402)、DbClustal(Thompson等人,2000,Nucl.Acids Res.28,2910-2926)和MolecularOperating Environment(Chemical Computing Group,Montreal,Quebec CanadaH3A2R7)。此外，可使用集成至GCG序列比对软件包的ALIGN程序(2.0版)中的Myers和Miller的算法(Myers&Miller,CABIOS4,11-17,1988)。
IL-1β和IL-1Ra的共有序列可通过比较两个序列和鉴定为相同的或高度保守的残基来获得。本文中描述的嵌合细胞因子结构域可具有至少60、70、80、90、95或100%的这样的相同残基或高度保守的残基。示例性共有序列是：DXXQKX_{8-9}L-AXXLQGX_{18-28}LGX_{7}LSCVXXXDXXXLQLEXVX_{8-9}KXXKRFXFX_{10}FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX_{5-6}GXXXTXFXXQ(SEQID NO:57)，其中X独立地是任何氨基酸并且下标数字或范围是发生数量。本文中描述的嵌合细胞因子结构域可与共有序列具有至少60、70、80、90、95或100%的同一性(其中对于同一性不计数X残基)。可以以类似方式鉴定其它共有序列。
IL-1细胞因子家族成员的其它变体可使用基于展示的系统或其它基于文库的筛选来制备和评价。例如，可展示或表达蛋白质变体，以及评价其结合IL-1细胞因子家族成员的受体的能力。例如，可评价本文中描述的IL-1β、IL-1Ra或细胞因子结构域的变体的结合IL-1RI的可溶性胞外结构域的能力。基于展示的系统的一般描述包括下列内容：对于细胞展示，Chao等人NatProtoc.2006；1(2):755-68；Colby等人Methods Enzymol.2004；388:348-58； Boder等人,Methods Enzymol.2000；328:430-44)，对于噬菌体展示(例如，Viti等人,Methods Enzymol.2000；326:480-505和Smith(1985)Science228:1315-1317)，以及对于核糖体展示(例如，Mattheakis等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022和Hanes等人(2000)Nat Biotechnol.18:1287-92；Hanes等人(2000)Methods Enzymol.328:404-30；和Schaffitzel等人(1999)J ImmunolMethods.231(1-2):119-3。
虽然本文中许多实施方案使用人IL-1细胞因子序列作为亲代结构域来举例说明，但也可使用其它序列。许多例如来自其它物种的其它IL-1细胞因子是已知的并且是可获得的，并且可见于公共数据库例如Entrez(美国国立医学图书馆,Bethesda MD)和EBI-EMBL(Hinxton,Cambridge UK)。来自UNIPROT数据库(可在UniProt.org上获得和参见The UniProt Consortium,Nucleic Acids Res.D142-D148(2010))的这样的序列的实例包括下列：

本文中描述的细胞因子结构域还可包括存在于变体细胞因子结构域中的置换，所述变体细胞因子结构域能够结合IL-1RI。例如，SEQ ID NO:1的位置15(对应于SEQ ID NO:3的位置20)可以是Met或Asn。SEQ ID NO:1的位置30(对应于SEQ ID NO:3的位置34)可以是Gly、His、Trp或Met。
IL-1β和IL-1Ra的其它示例性变体包括Boraschi等人(1996)Frontiers inBioscience：A Journal and Virtual Library1,d270-308,Evans等人,J.Biol.Chem.,270:11477(1995)和Greenfeder等人,J.Biol.Chem.,270:22460(1995)中描述的那些变体。例如，IL-1β的变体包括R11G、R11A、Q15H、E105G和T147G。参见，例如，Evans等人。IL-1Ra的变体包括W16Y、Q20M、Q20N、Y34G、Y34H、Y34W、Y34M、Y147G、Y147H、Y147M、K145D、H54P、V18S、T108K、C116F、C122S、C122A、Y147G、H54P、H54I和Evans等人和Greenfeder等人,J.Biol.Chem.,270:22460(1995)中的其它变体。细胞因子结构域可在前述位置之一上包含与IL-1Ra相同的残基。细胞因子结构域还可在对应的位置上包含与前述突变之一不同的残基。
此外，IL-1家族细胞因子可包含一个或多个未配对的半胱氨酸残基。可将一个或多个，例如2、3或全部这样的未配对的半胱氨酸残基突变成另一种氨基酸，例如，不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸。例如，P01在SEQID NO:17的位置67、70、116和122上包含半胱氨酸。可用另一种氨基酸例如不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸置换1、2、3或全部4个这样的半胱氨酸。P02在SEQ ID NO:18的位置67、70、116和122上包含半胱氨酸。可用另一种氨基酸例如不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸置换1、2、3或全部4个这样的半胱氨酸。P03在SEQ ID NO:19的位置70、116和122上包含半胱氨酸。可用另一种氨基酸例如不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸置换1、2或全部3个这样的半胱氨酸。P04在SEQ ID NO:20的位置70,116和122上包含半胱氨酸。可用另一种氨基酸例如不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸置换1、2或全部3个这样的半胱氨酸。P05在SEQ ID NO:21的位置8、70和122上包含半胱氨酸。可用另一种氨基酸例如不带电荷的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸置换1、2或全部3个这样的半胱氨酸。
还可环状排列IL-1家族细胞因子结构域，包括本文中描述的嵌合细胞因子结构域。例如，可重置来自结构域的C末端区段以便其为原始N端和N末端区段(通常在C末端区段切除后包含原始蛋白质的剩余部分)的N末端。两个重置的区段可通过接头(例如，约3至10个氨基酸的)分隔。一般而言，除顺序变化外，排列前的结构域中的全部氨基酸得以保留。在一些实施方案中，用于排列的切点可存在于柔性区域，例如柔性环例如b6-b7(例如，对应SEQ ID NO:3的71-80的氨基酸)或b7-b8环(例如，对应于SEQ ID NO:3的84-99的氨基酸)中。
在一些实施方案中，本文中描述的受体结合剂例如包含IL-1家族细胞因子结构域的受体结合剂具有小于30、25、22、20、19、18或约17kDa的分子量。在一些实施方案中，受体结合剂具有大于18、19、20、22、25、30、40、45或50kDa的分子量。例如，受体结合剂可包括其它肽、聚合或非聚合组分，例如改变试剂药代动力学、稳定性、免疫原性和/或分子量的组分。蛋白质可包含其它修饰，例如翻译后或合成修饰。在某些实施方案中，受体结合剂未被糖基化。在其它实施方案中，受体结合剂包括至少一个糖基化。
例如，本文中描述的受体结合剂可包含另外的结构域和特性。例如，可将受体结合剂直接或间接融合至抗体蛋白质的结构域，例如，融合至Fc结 构域或一个或多个恒定结构域(例如，CH1、CH2或CH3)。例如，结构域可以是人结构域或人结构域的变体。Fc结构域或一个或多个恒定结构域可位于受体结合剂的N末端或C末端。
Fc结构域可获自任何适当的免疫球蛋白，例如来自人抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM的抗体。在一个实例中，Fc结构域包含从Fc结构域的大致位置Cys226上的氨基酸残基或从大致位置Pro230至羧基端的序列。Fc结构域通常包含两个恒定结构域CH2结构域和CH3结构域，和任选地包含CH4结构域。在其Fc区域中具有置换的抗体以及增加的血清半衰期也描述于WO00/42072,WO02/060919；Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004))中。IgG重链的残基编号是如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NH1,MD(1991)中关于其中的人IgG1EU抗体的编号的EU指数的编号。
在一个实施方案中，受体结合剂包括增加体内血清半衰期的挽救受体-结合表位，如例如美国专利5,739,277和Ghetie等人,Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000))中描述的。在一些实施方案中，表位包含在融合至受体结合剂的Fc区域中。
在一个实施方案中，受体结合剂包含血清白蛋白序列或这样的蛋白质的结合FcRn受体的部分或结合血清白蛋白例如人血清白蛋白的序列。例如，可将结合血清白蛋白的某些肽与受体结合剂例如序列DICLPRWGCLW(SEQID NO:22)缔合。也参见，Dennis等人J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
受体结合剂可被修饰来包含增加试剂的尺寸和稳定性的序列，例如WO2008/155134或WO2009/023270中描述的序列。这样的序列通常不具有生物活性，例如，其不调节由IL-1细胞因子家族成员介导的信号转导。可使用多种稳定多肽序列，例如富含甘氨酸和/或丝氨酸以及其它氨基酸例如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸的序列。例如，序列可被设计来具有至少30、40、50、60、70、80、90或100%的甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，连接至蛋白质的稳定多肽序列的组合长度可为至少20、25、35、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900或超过1000或2000个氨基酸。可将稳定序列例如融合至生物活性肽，例如融合至受体结合剂的N或C末端。稳定序列的 融合可导致融合蛋白质相对于未修饰蛋白质的流体动力学半径的显著增加，这可通过超速离心、大小排阻层析或光散射来检测。在一些实施方案中，稳定序列包含少数下列氨基酸或不包含下列氨基酸：半胱氨酸(以避免二硫键形成和氧化)、甲硫氨酸(以避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脱酰胺)和天冬氨酸。稳定序列可被设计来包含倾向于减小对蛋白水解降解的敏感性的脯氨酸残基。
结合测定
受体结合剂与其靶的相互作用可使用任何适当的方法来分析，所述方法包括例如放射免疫测定、细胞结合测定和表面等离子体共振技术(SPR)。使用放射性碘化的蛋白质竞争的示例性细胞结合测定描述于Boraschi等人,J.Immunol.,155(10):4719-25(1995)中。
SPR或生物分子相互作用分析(BIA)可实时检测生物特异性相互作用而无需标记任何相互作用物。BIA芯片的结合表面上质量的变化(表明结合事件)导致表面附近的光折射率的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)。折射率的变化产生可检测信号，可将所述信号测量为生物分子之间实时相互作用的指标。使用SPR的方法描述于例如Raether,1988,Surface PlasmonsSpringer Verlag；Sjolander和Urbaniczky,1991,Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和由BIAcore InternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的在线资源中。系统或ReichertSR7000DC Dual Channel SPR可用于在动力学、亲和力或特异性方面实时比较相互作用和对相互作用进行评级，而无需使用标记物。受体结合剂对于细胞因子受体胞外结构域(例如，IL-1RI的胞外结构域)的结合亲和力可在接近生理条件(例如10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005%Tween-20)下使用SPR来测量。还可使用不依赖于SPR的其它方法例如来测量结合和亲和力。
来自结合测定的信息可用于提供受体结合剂对靶的结合的平衡解离常数(K_D)和动力学参数(例如，K_on和K_off)的精确定量测量。这样的数据可用于比较不同蛋白质、靶和条件。该信息还可用于开发结构-活性关系(SAR)。例如，可将变体蛋白质的动力学和平衡结合参数与参照或亲代蛋白质的参数相比较。可鉴定与特定结合参数例如高和亲和力和缓慢K_off的相关的给定位置 上的变体氨基酸。可将该信息与结构建模组合(例如，使用同源性建模、能量最小化或利用x射线晶体学或NMR的结构测定)。
用于评价亲和力的蛋白质可以以重组形式产生，并且可包含适合用于纯化或固定的标签例如FLAG标签、myc标签、血凝素标签、His标签或Fc结构域融合。受体蛋白(例如IL-1RI和IL-1RAcP)的胞外结构域可以通过例如在细菌或昆虫细胞中表达，例如在Sf9细胞中使用杆状病毒表达来以重组形式产生。可以例如使用芯片将适当的受体蛋白固定在BIAcore系统中，所述芯片包含结合它们的标签的试剂，例如，利用对于Fc结构域是特异性的IgG或其它标签涂覆的芯片。
细胞活性测定。可以例如在基于细胞的测定中评价受体结合剂用作受体拮抗剂的能力。例如，可能评价受体结合剂对IL-1RI的抑制。IL-1活性的几个示例性测定描述于Boraschi等人(同上)中，包括T细胞增殖测定、IL-6和IL-8产生测定和钙流入的抑制。
在一个示例性测定中，评价受体结合剂抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞释放的能力。IL-1β-刺激的细胞因子在MRC5细胞中释放的抑制与试剂体内抑制IL-1介导的活性的能力相关。测定的细节描述于Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,Ch.6.2.1-6.2.7,John Wiley and Sons Inc.,2000中。简而言之，将人MRC5人成纤维细胞(ATCC#CCL-171,ManassasVA,USA)在多孔板中生长至汇合。利用滴定的剂量的受体结合剂和对照处理细胞。随后在滴定的试剂和/或对照存在的情况下将细胞与100pg/ml的IL-1β接触。不用IL-1β刺激阴性对照细胞。使用IL-6ELISA试剂盒(例如，BDPharmingen,Franklin Lakes,NJ,USA)测量每一个处理的细胞的组中释放的IL-6的量。可使用的对照包括单独的缓冲液、IL-1Ra和针对IL-1β的抗体。
还可体内评价受体结合剂的效率。示例性测定描述于Economides等人,Nature Med.,9:47-52(2003)中。简而言之，利用滴定的剂量的受体结合剂和对照腹膜内注射小鼠。注射后24小时，以1mg/kg的剂量用重组人IL-1β皮下注射小鼠。IL-1β注射后2小时(峰值IL-6反应时间)，处死小鼠，收集血液，进行处理以获得血清。利用ELISA测定血清IL-6水平。可基于实验性动物血清中检测到的IL-6针对对照中检测到的IL-6的比率来计算百分比抑制。
IL-1体内活性的其它示例性测定描述于Boraschi等人(同上)，包括厌食症、低血糖症和中性白细胞增多症测定。
生产。受体结合剂可通过在重组宿主细胞中表达来产生，而且还可通过其它方法例如体外转录和翻译以及化学合成来产生。
对于细胞表达，可将一个或多个编码受体结合剂的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入可复制载体以用于克隆或表达。各种载体是公共可获得的。载体可以例如是质粒、粘粒、病毒基因组、噬菌粒、噬菌体基因组或其它自主复制序列。可通过多种方法将适当的编码核酸序列插入载体。例如，可对适当的限制性内切核酸酶位点进行工程化(例如，使用PCR)。随后可将限制性消化和连接用于将编码核酸序列插入在适当的位置。载体元件通常包括一个或多个复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
受体结合剂可通过分离，还可通过至一个或多个其它组件例如信号序列、表位或纯化部分以及标记物的融合来重组地产生。受体结合剂可包括白细胞介素-1家族成员的前结构域，例如，随后可通过蛋白水解处理除去所述前结构域。
对于细菌表达，可产生具有或不具有信号序列的受体结合剂。例如，可在细胞内产生其，以便其积累在包涵体中或可溶性级分中。还可例如通过添加原核生物信号序列，例如适当的前导序列(例如来自碱性磷酸酶、青霉素酶或耐热肠毒素II)来分泌其。用于表达的示例性细菌宿主细胞包括任何可转化的大肠杆菌K-12株(例如大肠杆菌BL21、C600、ATCC23724；大肠杆菌HB101NRRLB-11371、ATCC-33694；大肠杆菌MM294ATCC-33625；大肠杆菌W3110ATCC-27325和大肠杆菌BLR(DE3))、枯草杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)或其它杆菌的菌株。细菌系统中产生的蛋白质通常不存在糖基化。因此，在一些实施方案中，本文中描述的受体结合剂大体上不含糖基化，例如不含哺乳动物或其它真核细胞的糖基化修饰。
可在酵母宿主细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属(Hanseula)或巴斯德毕赤酵母中中表达受体结合剂。对于酵母表达，还可在细胞内或通过分泌，例如使用酵母转化酶前导序列或α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属)或酸性磷酸酶前导序列或白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公布的EP362,179)来产生受体结合剂。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可用于指导蛋白质分泌，例如来自相同或相关物种的分泌性多肽的信 号序列以及病毒分泌前导序列。或者，可产生具有白细胞介素-1家族成员的前结构域例如IL-1α或IL-1β前结构域的受体结合剂。
表达和克隆载体都包含使得载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。这样的序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适合用于大多数革兰阴性细菌；2m质粒复制起点适合用于酵母；各种病毒复制起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)用于哺乳动物细胞的克隆载体。
表达和克隆载体通常包含选择基因或标记。常见选择基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒性例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的抗性，(b)互补营养缺陷型缺陷(例如酵母属中的URA3标记)或(c)提供不可从复合培养基获得的关键营养物，例如编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。各种标记也可获得用于哺乳动物细胞，例如DHFR或胸苷激酶。可将DHFR与缺乏DHFR活性的细胞系(例如CHO细胞系)(如由Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所述制备和繁殖的)结合使用。
表达和克隆载体通常包含有效地连接至编码受体结合剂的核酸序列的启动子以指导mRNA合成。适合与原核宿主一起使用的示例性启动子包括b-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等人,Nature,275:615(1978)；Goeddel等人,Nature,281:544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP36,776)和杂交启动子例如tac启动子(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还可包含适当定位的Shine-Dalgarno序列。T7聚合酶系统还可用于驱动置于T7启动子控制之下的核酸编码序列的表达。参见，例如，pET载体(EMD Chemicals,Gibbstown NJ,USA)和宿主细胞，例如如可从EMDChemicals和US5,693,489获得的Novagen用户方案TB053中描述的。例如，可将这样的载体与BL21(DE3)细胞和BL21(DE3)pLysS细胞组合用于产生蛋白质(例如，至少0.05、0.1或0.3mg/ml的细胞培养物)。可使用的其它细胞系包含B834、BLR、HMS174、NovaBlue(包括具有pLysS质粒的细胞)的DE3溶素原。
与酵母一起使用的示例性启动子包括3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman等人,J.Biol.Chem.,255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等人,J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968)；Holland,Biochemistry,17:4900(1978))例如烯醇化 酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶和丙酮酸激酶的启动子。其它示例性酵母启动子是诱导型的并且具有受生长条件控制的转录的额外有利方面。诱导型启动子的实例包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和响应麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。
可以例如通过从病毒(例如多瘤病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40))的基因组获得的启动子，通过异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子以及通过热激启动子在哺乳动物宿主细胞中控制编码受体结合剂的mRNA从载体的表达。还可使用异源启动子系统例如响应四环素的启动子。参见，Urlinger,S.,等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(14):7963–7968。转录还可由顺式或反式定位的增强子序列驱动。示例性哺乳动物增强子序列包括珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素的增强子序列。其它实例包括复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧上的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。可将增强子在受体结合剂的编码序列的位置5'或3'上拼接入载体，但优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还可包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒DNA或cDNA的非翻译区域的5'以及偶尔地3'获得。这些区域在编码受体结合剂的mRNA的非翻译部分包含转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。表达载体还可包含一个或多个内含子序列。
还可在昆虫细胞例如Sf9或SF21细胞中使用pFAST-BAC^TM系统表达受体结合剂。其它示例性杆状病毒表达载体可获自Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad CA,USA。还可在哺乳动物细胞中表达受体结合剂。例如，还可使用哺乳动物来源的细胞系。哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7品系(ATCC CRL1651)(Gluzman等人,Cell23:175,1981)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK(ATCC CRL10)细胞系，以及来源于非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL70)的CV1/EBNA细胞系(如由McMahan等人(EMBO J.10：2821,1991)描述 的)。已描述了用于将DNA引入哺乳动物细胞的已建立的方法(Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990,pp.1569)。
适合用于在重组细胞中合成受体结合剂的其它方法、载体和宿主细胞描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版,Sambrook等人(编著),Cold Spring Harbor Press,(2001)(ISBN：0879695773)中。
当在细胞中表达后，可从培养基、包涵体或细胞裂解物回收受体结合剂。可通过各种物理或化学方法，例如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂(例如，去垢剂)来破碎细胞。
可将受体结合剂从可在细胞裂解物或细胞培养基中发现的其它细胞蛋白质或多肽纯化出来。可使用蛋白质纯化的各种方法，这样的方法在本领域是已知的并且描述于例如Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990)；和Scopes,Protein Purification：Principles and Practice,Springer-Verlag,NewYork(2010)(ISBN：1441928332)中。纯化方法的实例包括：通过在离子-交换柱上进行分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上或阳离子-交换树脂例如DEAE上的层析；层析聚集；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如G-75的凝胶过滤；除去污染物例如IgG的蛋白A柱；和亲和柱(例如，结合蛋白质的表位标记形式的金属螯合柱和具有各种结合与受体结合剂缔合的任何纯化部分的配体的柱子)。纯化法可包括两个不同离子-交换层析步骤的组合(例如，阳离子交换层析，随后阴离子交换层析或反之亦然)。可通过多种方法包括盐和/或pH梯度或阶梯从离子交换树脂洗脱受体结合剂。在一些实施方案中，受体结合剂包括纯化部分(例如表位标签和亲和柄)。这样的部分可用于亲和层析和可任选地通过蛋白水解切割除去。
离子交换层析还可用作离子交换分离技术。离子交换层析基于分子的总电荷之间的差异分离分子，并且可用于将受体结合剂的完整形式与这样的蛋白质的其它形式分离。
可将阴离子或阳离子取代物连接至基质以形成用于层析的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代物包括二乙胺基乙基(DEAE)、季铵基乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子取代物包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)和磺酸盐(S)。纤维素离子交换树脂例如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可获自Whatman Ltd.(Maidstone,Kent,U.K)。和其它交联离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM- 和以及DEAE-、Q-、CM-和和FastFlow可获自Pharmacia AB。DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物例如DEAE-650S或M和CM-650S或M可获自Toso Haas Co.(Philadelphia,PA,USA)。
阳离子交换表面具有共价结合的带负电荷的配体的离子交换表面，从而其具有游离阳离子以与溶液中与表面接触的阳离子交换。示例性表面包括阳离子交换树脂，例如其中共价结合的基团是羧酸盐或磺酸盐的那些阳离子交换树脂。商购可得的阳离子交换树脂包括CMC-纤维素、和Fast Flow(Pharmacia)。
阴离子交换表面是具有共价结合的带正电荷的基团例如季胺基团的离子交换表面。示例性阴离子交换表面是阴离子交换树脂例如DEAE纤维素、TMAE、QAEFast Q(Pharmacia)和QFastFlow。
受体结合剂的示例性纯化方案包括在裂解缓冲液中裂解大肠杆菌，随后进行深度过滤。随后将材料经历阳离子交换层析(CEX)。随后在CEX洗脱物在阴离子交换层析(AEX)步骤中于阴离子交换介质上方流过。可将AEX FT经历抛光步骤。随后通过超滤/渗滤处理材料例如以浓缩材料或使材料脱盐。可基于理论截留分子量("NMWCO")选择超滤/渗滤膜以将蛋白质保留在渗余物中，同时允许低分子材料例如盐通过滤膜。可以例如取决于产物的期望终pH和电导率，在终缓冲液交换步骤中使用任何缓冲液或无菌水。
可将受体结合剂在多种溶液(包括水、PBS和缓冲液)中贮存。示例性缓冲液包括醋酸钠pH4.5、醋酸钠pH4.7、醋酸钠pH4.9、醋酸钠pH5.1、醋酸钠pH5.3、醋酸钠pH5.5、琥珀酸盐pH5.2、琥珀酸盐pH5.4、琥珀酸盐pH5.6、琥珀酸盐pH5.8、组氨酸pH5.7、组氨酸pH6.0、组氨酸pH6.3、组氨酸6.6、磷酸钠pH6.5、磷酸钠pH6.7、磷酸钠7.0、磷酸钠pH7.3、磷酸钠pH7.7、咪唑pH6.5、咪唑pH6.8、咪唑pH7.2、Tris pH7.0、Tris pH7.5、Tris pH7.7。缓冲剂可以以例如约1-100mM、5-50mM、10-50mM或5-25mM的浓度存在。溶液还可包含盐例如NaCl(例如，50mM、150mM或250mM以及其间的范围)、精氨酸(例如，以约1%、2%、3%、4%、5%、7.5%和其间的范围)、蔗糖(例如，以约1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、8.5%、10%、15%和其间的范围)、甘油(例如，以约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、 8.5%、10%、15%和其间的范围)和/或去垢剂例如TX-100和Tween-80(聚山梨酯)(例如，以约0.001%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%和其间的范围)。
受体结合剂可以以至少50mg、100mg、500mg、1g、5g、10g或更多的量存在于组合物中。
分析法。宿主细胞蛋白质(HCP)是指制剂中与受体结合剂不同的蛋白质，例如是从其制备受体结合剂的宿主细胞的内源性蛋白质，通常地大肠杆菌蛋白。优选地，宿主细胞蛋白质以低于10000、1000、900、800或700ppm(百万分之一)的浓度存在。可以例如通过ELISA或其它检测法来检测HCP。例如，ELISA可使用针对HCP的多克隆抗体。示例性试剂盒可获自CygnusTechnologies(CN#F410；Southport NC USA)。另一种示例性试剂盒使用AlphaScreen技术(大肠杆菌HCP试剂盒,产品编号AL261C/F,Perkin Elmer,Waltham MA USA)。
可以例如使用高压液相色谱评价包含或潜在地包含受体结合剂的材料。示例性分析技术包括弱阳离子交换高效液相色谱(wCEX-HPLC)、大小排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、反相液相色谱、ESI-MS、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。其它分析技术包括光散射光谱测定法。
在几个实施方案中，受体结合剂的N末端区域包含与来自IL-1β的N末端区域的肽例如肽APVRS(SEQ ID NO:58)相同的序列。表达这样的蛋白质的重组细胞(特别地大肠杆菌细胞)可产生完整蛋白质以及其它亚型，包括des-Ala亚型、乙酰化亚型和具有额外的甲硫氨酸(例如，Ala1的N末端)的亚型。在氨基酸位置2上包含脯氨酸的受体结合剂(其中N末端残基在位置1上)可对由大肠杆菌蛋白酶例如氨肽酶P产生的切割易感，所述氨肽酶P具有对于X-PRO的切割特异性。该切割可除去N末端氨基酸。例如，P03、P04和P05在位置2上具有脯氨酸。P03、P04和P05的完整形式在长度上具有153个氨基酸并且始于丙氨酸，然而des-Ala种类在长度上具有152个氨基酸并且始于脯氨酸。甲二磺酰化亚型在长度具有154个氨基酸并且始于甲硫氨酸，其为Ala1的N末端。
分析技术例如上述那些分析技术可用于区分完整形式与其它形式，例如des-Ala种类、乙酰化des-Ala种类或甲二磺酰化种类。示例性分析技术是 wCEX-HPLC。例如，可如下面实施例9中所述，使用DionexWCX-104x250mm柱(产品编号054993)评价P05。可通过与质谱串联的C4反相(RP)-HPLC评价WCX-HPLC峰值。完整P05具有理论质量：17700.4Da并且可检测为17700.4Da。des-Ala种类可检测为17629.4Da，其比完整P05的质量少71Da。71Da的质量减少对应于单个丙氨酸残基的去除。甲二磺酰化完整P05种类可检测为17830.80Da，甲基化甲二磺酰化P05种类可检测为17845.59Da。乙酰化形式可以例如通过胰蛋白酶肽作图(通过C18反相高效液相色谱(RP/HPLC))来检测。
药物组合物。可将受体结合剂配制为药物组合物。通常地，组合物是无菌的并且包含缓冲剂、药学上可接受的盐和赋形剂或稳定剂的一种或多种。例如，组合物可以是含水组合物。可按照用于生物学的标准方法配制本文中描述的受体结合剂。参见，例如，Gennaro(编著),Remington：The Science and Practiceof Pharmacy,第20版,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN：0683306472)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版.,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN：0683305727)；Kibbe(编著),Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版(2000)(ISBN：091733096X)；Protein formulation and delivery,McNally和Hastedt(编著),Informa Health Care(ISBN：0849379490)(2007)。
用于药物组合物的受体结合剂通常具有至少10、20、50、70、80、90、95、98、99或99.99%的纯度，并且通常不含人蛋白质。其可以是组合物中的唯一蛋白质或组合物中唯一的活性蛋白质。还可将其与一种或多种其它活性蛋白质例如一种或多种其它纯化的活性蛋白质例如相关或无关蛋白质组合。在一些实施方案中，组合物可以以约0.001–10%，例如，0.001–0.1%、0.01–1%或0.1%-10%的浓度包含受体结合剂。
因此，本文中还表征了本文中描述的试剂的纯化和分离形式。术语“分离的”是指从其原始环境(例如，从其产生受体结合剂的细胞或材料)取出的材料。药物组合物可大体上不含热原材料，大体上不含核酸，和/或大体上不含细胞酶和组分，例如聚合酶、核糖体蛋白以及伴侣蛋白。
药物组合物可包含药学上可接受的载体。如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何或全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。“药学上可接受的盐”是指保留亲代化合 物的期望的生物活性，但不赋予任何不期望的毒理学效应的盐(参见例如，Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)，例如，酸加成盐和碱加成盐。
在一个实施方案中，利用一种或多种赋形剂例如氯化钠和磷酸缓冲液(例如，磷酸氢二钠七水合物、磷酸二氢钠)和聚山梨酯配制受体结合剂。可在例如缓冲液中例如以约5-100、5-30、30-50或50-100mg/ml的浓度提供其，可将其在2-8℃保存。药物组合物还可以以多种其它形式存在。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型例如液体溶液(例如，可注射和不溶液性溶液)、分散体或悬浮液以及脂质体。优选形式可取决于施用和治疗性应用的预期模式。用于本文中描述的试剂的组合物通常以可注射或不溶性溶液的形式存在，或用于局部或经眼递送(参见下文)。
药物组合物通常是无菌的并且在制造和贮存条件下是稳定的。还可测试药物组合物以确保其满足用于施用的监管和工业标准。可将组合物配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。无菌可注射液可通过将本文中描述的试剂以需要的量与上文中列举的成分的一种或其组合(按需)一起掺入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常地，分散体通过将本文中描述的试剂掺入无菌媒介物来制备，所述媒介物包含基本分散介质和来自上文中列举的那些成分的需要的其它成分。在将无菌粉剂用于制备无菌可注射液的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法产生本文中描述的试剂的粉剂+来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的期望成分。可以通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来对可注射组物的延长的吸收进行工程化。
例如，可将受体结合剂与聚合物例如大体上无抗原性聚合物例如例如聚环氧乙烷或聚氧化乙烯缔合。在一些实施方案中，将聚合物例如直接或间接地共价连接至受体结合剂。适当的聚合物按重量计显著地变化。可使用具有从约200变化至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)的数均分子量的聚合物。例如，可将受体结合剂缀合至水溶液性聚合物，例如，亲水性聚乙烯聚合物例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这样的聚合物的非限定性列表包括聚环氧乙烷同聚物例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙酰多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，只要嵌段共聚物的溶解度得以维持 即可。其它有用的聚合物包括聚羟烯烃例如聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；分枝的或未分枝的多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如多聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同聚多糖和异聚多糖例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖例如透明质酸的多糖单位；糖醇的聚合物例如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素或乙酰肝素。
在某些实施方案中，可利用将保护化合物免受快速释放的载体制备受体结合剂。可将其作为受控释放制剂递送，通过植入或微型胶囊化递送系统进行递送。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯和聚乳酸。通常参见例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编著,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978。
施用。可通过多种方法给受试者例如人受试者施用受体结合剂，所述方法是例如静脉内施用(以推注的方式)或通过在一段时间内连续输注，通过肌内、肌内、动脉内、硬膜内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、滑膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外注射、胸骨内注射和输注。其它施用模式包括局部(例如，经皮肤或粘膜)或吸入(例如，鼻内或肺内)途径。对于许多应用，施用途径是如下之一：静脉内注射或输注、皮下注射或肌内注射。
可以以固定剂量或以mg/kg剂量施用受体结合剂。可静脉内(IV)或皮下(SC)施用它。可以例如每日、每隔一日、每三日、每四日或每五日、每周、每3至5周，例如每4周或每月施用受体结合剂一次。
药物组合物可包含“治疗有效量”的本文中描述的试剂。试剂的治疗有效量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物引发个体的期望的反应(例如至少一个障碍参数的改善或障碍的至少一个症状的改善)的能力(和任选地待施用的任何额外试剂的效应)而变化。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害效应远小于治疗有益效应的量。通常以治疗有效量施用受体结合剂。
可使用医疗装置例如植入物、输注泵、皮下注射针和无针皮下注射装置来施用药物组合物。装置可包括一个或多个例如用于贮存药物组合物的容器，并且可被构造来递送单位剂量的受体结合剂，和任选地第二试剂。剂量可以是固定剂量，即适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上分开的单位；每一个单位可包含与药物载体结合和任选地与另一种试剂结合的经计算产生期望的治疗效应的预定量的受体结合剂。
在一些实施方案中，为了治疗本文中描述的障碍，可以以足以诱导至少一个反映障碍的严重度的指标持续改善的量和时间给患有障碍的受试者施用受体结合剂。如果受试者在至少两个相隔1至4周的场合上显示改善，则改善被认为是“持续的”。改善的程度可基于体征或症状来测定，也可使用发给受试者的问卷例如生活质量问卷。
可评估反映疾病程度的各种指标以确定治疗的量和时间是否充足。选择的指标的基线值通过在施用第一剂量的受体结合剂之前进行的受试者检查来确立。优选地，在施用第一剂量的约60天内进行基线检查。
改善可通过重复施用一定剂量的受体结合剂直至受试者对于选择的指标表现高于基线的改善来诱导。在治疗慢性病况中，改善的程度可通过在至少一个月或更长，例如1、2或3个月或更长或无限期的时期中重复施用来获得。在治疗急性病况中，可施用试剂进行1至6周的时期或甚至施用单个剂量。
虽然治疗后疾病的程度可根据一个或多个指标表现改善，但可以以相同的水平或以减小的剂量或频率无限期地持续治疗。还可以例如在病症改善或消失后中断治疗。一旦治疗减少或中断，如果症状将重现可重新开始治疗。
治疗。受体结合剂例如结IL-1RI和拮抗IL-1信号转导的受体结合剂可用于治疗“IL-1介导的障碍”，所述障碍包括(i)至少部分通过IL-1激动引起的，(ii)与IL-1信号转导组分(例如IL-1α、IL-1β或IL-1RI)的升高的水平或活性或升高的IL-1信号转导相关的、和/或(iii)通过减小IL-1活性改善的任何疾病或医学病况。IL-1介导的障碍包括急性和慢性障碍，包括免疫障碍和炎性障碍。IL-1介导的障碍包括全身性和非全身性障碍。已确认IL-1α和IL-1β是牵涉感染性反应以及炎性疾病(包括类风湿关节炎)的强效促炎细胞因子。在具有严重自身免疫性障碍、缺血和各种癌症的患者中已观察到增加的IL-1产生，从而IL-1牵涉这些疾病和相关疾病。
通常也参见Sims和Smith,The IL-1family：regulators of immunity,Nature Reviews Immunology,doi:10.1038/nri2691(2010)。
术语“治疗”是指将本文中描述的试剂，例如以有效地改善与障碍例如本文中描述的障碍相关的病况、症状或参数，或防止障碍进展至统计上显著的程度或对于本领域技术人员来说是可检测的程度的量、方式和/或模式，给受试者例如患者施用。治疗可以期望治疗、治愈、缓和、减轻、改变、恢复、改善、缓解、好转或影响障碍、障碍的症状或对障碍的易感性。有效量、方式或模式可取决于受试者而变化，并且可针对受试者进行定制。示例性受试者包括人、灵长类动物和其它非人哺乳动物。还可预防性提供受体结合剂来减小障碍或其症状发生的风险。
IL-1介导的障碍可以是自身免疫障碍。IL-1介导的自身免疫障碍的实例包括：类风湿关节炎、强直性脊柱炎、白塞氏综合征、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、哮喘、银屑病、I型糖尿病和本文中鉴定的其它障碍。可给患有这样的IL-1介导的自身免疫障碍或处于发生所述障碍的风险中的受试者施用本文中描述的受体结合剂。IL-1介导的障碍可以是炎性障碍例如下文中描述的障碍。可给患有这样的IL-1介导的炎性障碍或处于发生所述障碍的风险中的受试者施用本文中描述的受体结合剂。
示例性IL-1介导的障碍包括：
类风湿关节炎和相关关节炎。受体结合剂可用于治疗患有类风湿关节炎或处于发生所述疾病的风险中的受试者。类风湿关节炎(RA)是影响关节的滑膜并且破坏关节软骨的慢性全身性自身免疫炎性疾病。RA的发病机理是T淋巴细胞依赖性的，并且可包括称为类风湿因子的自身抗体的产生。类风湿因子与抗原的复合物可形成并且积累在关节液和血液中，从而诱发淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞至滑膜的浸润。关节通常以对称模式受影响，但关节外疾病也可发生，例如引发肺纤维化、脉管炎和皮肤溃疡或表现为嗜性粒细胞减少症、血小板减少症和碑肿大的费尔提氏综合征。患者还可显示受影响的关节区域中的类风湿性小结、心包炎、肋膜炎、冠状动脉炎和具有肺纤维化的间质性肺炎。IL-1Ra的形式表明适度至严重活动的RA。参见，例如，Cohen,S.等人Arthritis&Rheumatism46,614-24(2002)；Fleischmann,R.M.等人Arthritis&Rheumatism48,927-34(2003)；Nuki,G.,等人Arthritis& Rheumatism46,2838-46(2002)；Schiff,M.H.等人Arthritis&Rheumatism50,1752-60(2004)。
活动RA的症状包括疲劳、缺乏食欲、低热、肌肉和关节疼痛以及僵硬。肌肉和关节僵硬通常在早晨和间歇期后最明显。在潮红过程中，通常作为滑膜炎的结果关节通常变红、肿胀、疼痛和触痛。用于评估RA和RA的症状的标准包括类风湿关节炎严重度标准(RASS；Bardwell等人,(2002)Rheumatology41(1):38-45),SF-36Arthritis Specific HealthIndex(ASHI；Ware等人,(1999)Med.Care.37(5Suppl):MS40-50),ArthritisImpact Measurement Scales或Arthritis Impact Measurement Scales2(AIMS或AIMS2；Meenan等人(1992)Arthritis Rheum.35(1):1-10)；the Stanford HealthAssessment Questionnaire(HAQ),HAQII或modified HAQ(参见，例如，Pincus等人(1983)Arthritis Rheum.26(11):1346-53)。
可给患有RA或处于发生RA的风险中的受试者施用本文中描述的受体结合剂以延迟前述体征和症状的一个或多个的发作和/或改善。受试者可具有适度至严重的活动RA。受试者可以是TNF抑制疗法(例如，利用(依那西普)、(阿达木单抗)或(英夫利昔单抗)的疗法)的非反应者；受试者可以先前已施用了TNF抑制剂；或受试者还可继续接受TNF抑制剂(并且反应或不反应)。
还可给受试者施用氨甲蝶呤。可给受试者施用一种或多种其它DMARDS(疾病修饰抗类风湿药)、皮质类固醇和/或非类固醇抗炎剂。可与受体结合剂共同施用的其它药物包括CD28的抑制剂(例如，CTLA4-Ig)、RANKL、IFNg、IL-6、IL-8和IL-17的抑制剂。抑制剂包括针对这类介质、对于这样的介质是特异性的可溶性受体的抗体和/或针对这样的介质的受体的抗体。
幼年型慢性关节炎。可将受体结合剂用于治疗例如21、18、17、16、15或14岁以下的受试者的幼年型慢性关节炎。幼年型慢性关节炎在几个方面与RA相似。受试者可以是类风湿因子阳性的。受试者可具有疾病的少关节、多关节或全身性形式。关节炎可引起关节强直和生长阻滞，还可导致慢性前葡萄膜炎和全身性淀粉样变性。受体结合剂可用于延迟一个或多个这样的症状的发作或改善所述症状。
受体结合剂可用于治疗幼年特发性关节炎，包括全身型幼年类风湿性关节炎(SO-JIA)。受试者可具有失败的先前皮质类固醇治疗或需要等于或超过0.3mg/kg的日剂量的皮质类固醇治疗。参见例如，Quartier等人(2011)AnnRheum Dis.70(5):747-54。
其它类风湿障碍。本文中描述的受体结合剂还可用于治疗其它类风湿障碍，包括硬皮病、系统性红斑狼疮、痛风、骨关节炎、风湿性多肌痛、牛皮癣关节炎和慢性莱姆关节炎、随意肌和其它肌肉的炎症，包括皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎和淋巴管平滑肌瘤、化脓性关节炎综合征、儿科肉芽肿性关节炎(PGA)/Blau综合征以及本文中论述的其它类风湿性障碍。
受体结合剂可用于治疗代谢类风湿障碍，例如，与高尿酸血症相关的障碍，例如痛风，包括慢性急性痛风和其它结晶介导的关节病。试剂可用于治疗药物诱导的与痛风相关的潮红，包括例如由黄嘌呤氧化酶抑制剂、尿酸氧化酶或排尿酸剂诱导的潮红。在痛风中，尿酸的结晶可激活炎性体并且触发IL-1β的释放。
脊椎关节病。受体结合剂可用于治疗脊椎关节病，所述疾病包括障碍例如强直性脊柱炎、莱特尔综合征、与炎性肠病相关的关节炎、与银屑病相关的脊柱炎、幼年脊柱关节病和未分化脊柱关节病。脊柱关节病通常与HLA-B27基因相关。受试者可以不存在类风湿因子并且可显示具有或不具有脊柱炎和炎性不对称关节的骶髂关节炎(sacroileitis)。受试者还可具有眼睛炎症(参见下文)。
硬皮病。受体结合剂可用于治疗硬皮病或系统性硬化症。硬皮病特征在于可以是局部的或全身性的皮肤的硬化。微脉管系统中血管损伤和内皮细胞损伤也可存在。受试者可在皮肤损伤中显示单核细胞浸润并且具有抗核抗体。显示发病机理的其它器官可包括：可具有平滑肌萎缩和纤维化(从而导致异常蠕动/运动)的胃肠道；可具有同心内皮下血管内膜增生(影响小弓状动脉和小叶间动脉使得肾皮质血流量减少)以及可引起蛋白尿、氮血症和高血压的肾；可牵涉萎缩、间质纤维化、炎症、肺、间质性肺炎和间质纤维化的骨骼肌；和可显示例如收缩带坏死和结瘢/纤维化的心脏。可给患有硬皮病或处于发生所述疾病的风险中的受试者施用本文中描述的受体结合剂以改善前述体征和症状的一个或多个。
斯耶格伦氏综合征。受体结合剂可用于治疗斯耶格伦氏综合征。斯耶格伦氏综合征的特征在于免疫介导的炎症和随后泪腺和唾液腺的功能性破坏。疾病可与炎性结缔组织疾病相关或伴随所述疾病。疾病与针对Ro和La抗原(这两者是小的RNA-蛋白质复合物)的自身抗体产生相关。损伤可导致干燥性角结膜炎、口腔干燥症和其它表现或联系，包括胆汁性肝硬化、周围感觉神经病以及可触知的紫癜。与斯耶格伦氏相关的眼障碍的治疗也描述于下文中。
甲状腺障碍。受体结合剂可用于治疗甲状腺障碍。示例性甲状腺障碍包括格雷夫斯氏病、淋巴细胞性甲状腺炎、青少年淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，并且是针对甲状腺抗原的自身免疫反应(产生与存在于甲状腺中并且通常对于甲状腺是特异性的蛋白质的反应的抗体)的结果。实验模型是可获得的，包括自发模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)和通过用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物产生的诱导型模型。
糖尿病和代谢障碍。受体结合剂可用于治疗糖尿病障碍例如幼年型糖尿病(包括自身免疫型糖尿病和糖尿病的胰岛素依赖类型)和成年型糖尿病(包括非胰岛素依赖性和肥胖介导的糖尿病)、I型糖尿病和II型糖尿病。例如，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病与由自身抗体和自身反应性T细胞引起的胰岛细胞的自身免疫破坏相关。此外，减小IL-1β活性可改善葡萄糖控制和β细胞功能，从而可用于治疗II型糖尿病。参见例如，Owyang等人Endocrinology.2010；151(6):2515-27。例如，在一些实施方案中，可给没有施用胰岛素的受试者(例如受试者不是胰岛素依赖的)施用本文中描述的受体结合剂。例如，受试者可以是前期糖尿病患者。受试者可具有葡萄糖耐受性受损或空腹葡萄糖受损。受试者可以是肥胖症患者或具有高于23、25、30、35或40kg/m²的人体质量指数。受试者可以是抗胰岛素的，和/或特征在于高血糖症或超高胰岛素血症。受试者可处于进展至II型糖尿病的风险中。也参见Larsen,等人(2007)NEJM356:1517-26和Larsen,等人(2009)。Diabetes Care32:1663-8。在一些实施方案中，受试者具有大于6.1、6.5、7或8mmol/L的空腹血糖。在一些实施方案中，受试者具有大于5.5、5.7、6、6.4、7、7.5或8%的A1C水平。
在一些实施方案中，还给受试者施用刺激胰岛素分泌的胰岛素促泌素例如磺酰脲(例如，氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋酸己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)和/或氯茴苯酸类(例如，瑞格列奈、那格列胺)。还可给受试者施用双缩胍(例如，二甲双胍)。可施用受体结合剂以减少胰岛素β细胞的损失和/或对其的损害。
在一些实施方案中，受试者对于位于基因IL1RN的5’附近的rs4251961的C等位基因是杂合的或纯合的。
利用受体结合剂的治疗包括改善或防止与糖尿病相关的继发性病况的恶化，例如糖尿病患者的糖尿病视网膜病变、肾移植排斥、肥胖介导的胰岛素抗性和肾功能衰竭，所述病况与蛋白尿和高血压相关。
胃肠道障碍。本文中描述的受体结合剂可用于治疗炎性胃肠道障碍，包括例如腹部疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、特发性胃肌轻瘫胰腺炎，包括慢性胰腺炎、急性胰腺炎、炎性肠病和溃疡，包括胃溃疡和十二指肠溃疡。
肺障碍。受体结合剂可用于治疗由IL-1介导的肺病。可治疗的示例性肺病包括慢性阻塞性肺疾病(例如肺气肿和慢性支气管炎)、肺泡蛋白沉着症、博来霉素诱导的肺病和纤维化、肺纤维化，包括特发性肺纤维化和辐射诱发的肺纤维化、肺结节病、囊性纤维化、胶原在肺中的积累、ARDS、支气管肺发育不良(BPD)、慢性阻塞性肺疾病和早产儿的慢性纤维化肺疾病。此外，本文中描述的受体结合剂可用于治疗职业性肺部疾病，包括石棉肺、煤工尘肺、矽肺或与对灰尘的长期暴露相关的相似病况。炎性和纤维化肺疾病(包括嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎)可包括可使用受体结合剂治疗的失调性免疫-炎症反应。
结节病是特征在于上皮样肉芽肿存在于身体中几乎任何组织的病因未明的病况；肺的牵涉是最常见的。发病机理包括活化巨噬细胞和淋巴细胞在疾病部位的持续存在，随后局部和全身性活性产物(由这些细胞类型释放的)的释放引起的慢性后遗症。
心血管障碍。本文中描述的受体结合剂可用于治疗心血管障碍或损伤，例如主动脉瘤、急性冠状动脉综合征、动脉炎、血管闭塞(包括脑动脉闭塞)、冠状动脉架桥手术的并发症、局部缺血/再灌注损伤、心脏病(包括动脉粥样硬化性心脏病)、心肌炎(包括慢性自身免疫性心肌炎和病毒性心肌炎)、心力衰竭(包括慢性心力衰竭、充血性心力衰竭)、心肌梗塞、心脏手术后或颈动 脉气囊血管成形术后再狭窄和/或动脉粥样硬化、无症状性心肌缺血、左心室泵功能障碍、左心室辅助设备的植入后并发症、雷诺氏现象、血栓性静脉炎、脉管炎(包括川崎氏脉管炎)、静脉闭塞性病、巨细胞动脉炎、韦格纳氏肉芽肿和许兰-亨诺紫癜。还可例如预防性地提供受体结合剂来减小这样的心血管障碍的风险。在一些实施方案中，给患者施用受体结合剂以治疗动脉粥样硬化或减小其风险。
IL-1介导的信号转导可被急性心肌梗塞活化，并且可起始梗塞周围的心肌细胞的凋亡细胞死亡，从而扩大梗塞区域的尺寸。可施用本文中描述的受体结合剂以减小因心肌梗塞引起的损伤。例如，可给处于发生心肌梗塞的风险中的受试者或经历心脏梗塞，特别地急性心肌梗塞(例如，在最近2、4、6、12、24或48小时内)的受试者施用受体结合剂。可将试剂与包括例如肝素和阿司匹林的其它试剂组合施用。
受体结合剂还可用于治疗中风、蛛网膜下腔出血、头损伤或脑损伤，和/或与心血管障碍相关的炎症。例如，升高的水平的IL-1β牵涉与中风和脑损伤相关的神经炎症(Rothwell,N.J.,等人,TINS23(12)：618-625,2000)。可施用受体结合剂以减少这样的炎症和与缺血和/或缺氧相关的其它炎症。此外，还可以预防性提供受体结合剂来例如减小这样的障碍和/或与这样的障碍相关的炎症的风险。例如，可给处于发生中风、缺血事件、其它心血管事件或出血事件(例如蛛网膜下腔出血)的风险中的受试者，或已经历中风、缺血事件、其它心血管事件或出血事件(例如蛛网膜下腔出血)(例如，在最近2、4、6、12、24或48小时内)的受试者施用受体结合剂。
泌尿生殖器和肾障碍。泌尿生殖系统的障碍还可用本文中描述的本文中描述的受体结合剂来治疗。这样的障碍包括肾小球肾炎，包括自身免疫性肾小球肾炎、因对毒素的暴露而引起的肾小球肾炎或继发于溶血链球菌(streptococci)或其它感染剂的感染的肾小球肾炎。免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤(作为自体反应抗体或抗肾抗原的T细胞的产生的结果直接地，或作为与其它非肾抗原反应的抗体和/或免疫复合物在肾中的沉积的结果间接地)的结果。因此导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病还可诱发免疫介导的肾病作为间接后遗症。直接和间接免疫机制都导致炎症反应，所述炎症反应产 生/诱导肾组织的损伤发生，使得器官功能受损并且在一些情况下进展至肾功能衰竭。体液和细胞免疫机制都可参与损伤的发病机理。
受体结合剂还可用于治疗尿毒症综合征及其临床并发症(例如，肾衰竭、贫血和肥厚型心肌病)，包括与对环境毒素暴露、药物或其它病原的暴露相关的尿毒症综合征。还可治疗从胆囊壁的炎症产生的并发症，所述并发症导致吸收功能的改变。包括在这样的并发症中的是胆石症(胆石)和胆总管结石(choliedocholithiasis)(胆管结石)以及胆石症和胆总管结石的复发。可治疗的其它病况是血液透析并发症：前列腺病况，包括良性前列腺肥大、非细菌性前列腺炎和慢性前列腺炎；和血液透析并发症。受体结合剂还可用于治疗慢性疼痛病况，例如慢性骨盆痛，包括慢性前列腺炎/骨盆痛综合征和疱疹后疼痛。
血液学和肿瘤学障碍。本文中描述的受体结合剂可用于治疗不同形式的癌症，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、EB病毒阳性鼻咽癌、神经胶质瘤、结肠癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、颈和卵巢癌、肺癌(SCLC和NSCLC)，包括癌症相关恶病质、疲劳、无力、恶病质和血钙过多的副肿瘤性综合征。参见，例如，Voronov等人(2003)PNAS100:2645-2650。实体瘤，包括肉瘤、骨肉瘤和癌例如腺癌(例如，乳腺癌)和鳞状细胞癌也是可治疗的。关于IL-1β在某些肿瘤中的作用，参见，例如，Krelin等人(2007)Cancer Res.67:1062-1071。其它癌症包括食道癌、胃癌、胆囊膀胱癌、白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、髓样白血病、慢性或急性成淋巴细胞性白血病和多毛细胞白血病。具有侵袭转移潜能的其它恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤，可用受体结合剂治疗。参见，例如，Lust等人(2009)Mayo Clin Proc84(2):114-122。
受体结合剂还可用于治疗贫血和血液学失调，包括慢性特发性中性粒细胞减少症、慢性病性贫血、再生障碍性贫血，包括范科尼再生障碍性贫血；特发性血小板减少性紫癜(ITP)；血栓性血小板减少性紫癜、脊髓发育不良综合征(包括难治性贫血、难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞、未成熟细胞过多的难治性贫血、转化型原始细胞增多的难治性贫血)；骨髓纤维化/髓样化生；和镰刀状细胞血管阻塞危象。
自身免疫性溶血性贫血、免疫全血细胞减少症和发作性睡眠性血经蛋白尿可因抗体(所述抗体与在红细胞(和在一些情况下也在其它红细胞包括血小 板)的表面上表达的抗原反应)的产生而引起，并且是通过补体介导的裂解和/或ADCC/Fc-受体-介导的机制除去这些抗体包被的细胞的结果。在自身免疫性血小板减少症(包括血小板减少性紫癜)以及免疫介导性血小板减少症(在其它临床背景中)中，血小板破坏/去除作为抗体或补体连接至血小板，随后通过补体裂解、ADCC或FC-受体介导的机制除去的结果发生。
还可给患有各种淋巴组织增殖性障碍或处于发生所述障碍的风险中的受试者施用受体结合剂，所述淋巴组织增殖性障碍包括自身免疫性淋巴组织增生性综合征(ALPS)、慢性淋巴母细胞白血病、多毛细胞白血病、慢性淋巴性白血病、外周T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、EB病毒阳性T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、何杰金氏病、弥散性进行性淋巴瘤、急性淋巴性白血病、Tγ淋巴增生病、皮肤B细胞淋巴瘤、皮肤T淋巴细胞瘤(即，蕈样肉芽肿)和塞扎里综合征。
肝脏障碍。本文中公开的受体结合剂还用于治疗肝的病况例如肝炎，包括急性酒精性肝炎、急性药物诱导的或病毒性肝炎、甲型、乙型和丙型肝炎、硬化性胆管炎、肝血窦上皮细胞和因未知病因引起的肝的炎症。
听力障碍。受体结合剂还可用于治疗牵涉听力丧失和与异常IL-1表达相关的障碍。这样的障碍包括被认为由自身免疫过程产生的耳蜗神经相关听力丧失，例如自身免疫性听力丧失、美尼尔氏综合征和胆脂瘤、通常与听力丧失相关的中耳障碍。
骨障碍。骨和关节的非关节炎障碍也可用本文中描述的受体结合剂来治疗。这包括骨或关节的炎性障碍、导致骨损失的破骨细胞障碍，例如但不限于骨质疏松症，包括闭经后骨质疏松、骨关节炎、导致牙松动或损失的牙周炎以及关节置换术后假体松脱(通常与对磨损碎片的炎症反应相关)，例如，矫形外科植入物骨质溶解。
淀粉样蛋白障碍。此外，本文中描述的受体结合剂可用于治疗原发性淀粉样变性和继发性淀汾样变性，所述变性的特征在于各种病况，包括阿尔茨海默病、继发性反应性淀粉样变性；唐氏综合征；和透析相关淀粉样变性。此外，受体结合剂可用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病和帕金森氏病。这些疾病还可包括聚集体和淀粉样蛋白的形成，这可促发炎症反应。
神经性障碍。受体结合剂还可用于治疗中枢和周围神经系统的神经炎症和脱髓鞘疾病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘性多神经病或格林-巴利综 合征；和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。这些障碍据信具有自身免疫基础，并且作为引起的直接对少突神经胶质细胞或对髓磷脂的损害的结果导致神经脱髓鞘。在多发性硬化中，疾病诱发牵涉T淋巴细胞。多发性硬化具有复发缓解过程或慢性进展过程。损伤包括主要地T淋巴细胞介导的小神经胶质细胞和浸润巨噬细胞的浸润；CD4⁺T淋巴细胞是伤口处的主要细胞类型。少突胶质细胞细胞死亡和随后脱髓鞘的机制还不清楚，但可以是T淋巴细胞驱动的。
肌病。受体结合剂可用于治疗与炎症和自身免疫相关的肌病。特发性炎性肌病包括皮肌炎、多肌炎和其它肌炎是导致肌无力的病因未知的慢性肌肉炎症的障碍。肌肉损伤/炎症通常是对称的和进行性的。自身抗体与大多数形式相关。这些肌炎特异性自身抗体是针对参与蛋白质合成的组分、蛋白质和RNA的，并且抑制其功能。
血管炎障碍。本文中描述的受体结合剂可用于治疗血管炎障碍，例如系统性血管炎。系统性血管炎包括其中原发病灶是炎症和随后对血管的损伤的疾病，所述血管的损伤导致由受影响的血管供养的组织局部缺血/坏死/退化，以及在一些情况下导致最终的终末器官功能障碍。血管炎还可作为其它免疫炎症介导的疾病例如类风湿关节炎、系统性硬化病等(特别地在与免疫复合物形成相关的疾病中)的继发性损伤或后遗症发生。
原发性系统性脉管炎类群中的疾病包括：系统性坏死性血管炎：结节性多发性动脉炎、变应性脉管炎和肉芽肿病、多血管炎；韦格纳氏肉芽肿；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞动脉炎。混杂血管炎包括：皮肤粘膜淋巴结节综合征(MLNS或川崎氏病)、分离的CNS血管炎、贝切特病、闭塞性血栓性脉管炎(伯格氏病)和引起皮肤坏死的血管炎。这些血管炎障碍的致病机理据信主要归因于免疫球蛋白复合物在血管壁中的沉着和随后通过ADCC、补体活化或两者进行的炎症反应的诱导。
CAPS。受体结合剂可用于治疗CAPS障碍即CIAS1相关周期综合征。CAPS包括3个遗传综合征：早发型多系统炎性疾病(NOMID)、Muckle-Wells综合征(MWS)和家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)。(Hoffman等人2001Naure29:301-305；Feldmann等人2002Am J Hum Genet71:198-203；Aksentijevich等人2002Arthritis Rheum46:3340-3348)。CAPS以散发性或家族性模式以常染色体显性方式遗传。CIAS1编码NALP3，一种“炎性体”的蛋 白质组分，调节胱天蛋白酶1的活性的亚细胞酶复合物。CIAS1的突变导致增加的IL-1和许多病理学后果的产生(Aksentijevich等人2002同上)。IL-1强劲地诱导急性期反应物在肝中产生，例如C-反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
CAPS障碍共有共同的临床特性并且呈现为连续的临床严重度。NOMID是最严重的失能，MWS比之略轻一些，FCAS是最不严重的。CAPS障碍具有严重的重叠特性，并且个体可具有独特的一系列体征和症状。所有这些病况的共同特性包括发热、荨麻疹样疹、关节炎或关节痛、肌痛、全身乏力和结膜炎。
在NOMID中，慢性无菌性脑膜炎可导致智力低下，并且这些患者还可遭受毁损面容和在骨骺和髌骨处使骨生长过度而导致失能。这些患者还可因视神经萎缩(因颅内压升高而导致的)而遭受失明。MWS和NOMID通常与严重的炎症相关，所述炎症可包括听觉系统、脑膜和关节。这些患者可每日患有高热以及在分布和强度上频繁变化的慢性皮疹。患者可患听力丧失或耳聋。频繁观察到结膜炎和视乳头水肿。淀粉样变性可发展并且因慢性炎症和急性期反应物(特别地SM)的过度产生而导致肾衰竭。可给患有NOMID、MWS或FCAS或经诊断具有与NOMID、MWS或FCAS相关的基因型的受试者施用受体结合剂。此外，可给患有TRAPS(TNF受体相关周期综合征)的受试者施用受体结合剂。
皮肤病学障碍。受体结合剂可用于治疗皮肤病学障碍例如炎性皮肤病学障碍或自身免疫或免疫介导的皮肤病。示例性障碍是银屑病。其它自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎是由自身抗体介导的，其发生是T淋巴细胞依赖性的。银屑病是T细胞介导的炎性疾病。损伤包括T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞和一些嗜中性粒细胞的浸润。
可治疗的皮肤或粘膜的其它障碍包括皮肤棘层松解病，包括Darier病、毛囊角化病和寻常天疱疮。其它另外的障碍包括：痤疮、红斑痤疮、斑秃、口疮性口炎、大疱性类天疱疮、烧伤、湿疹、红斑，包括多形红斑和大疱性多形红斑(Stevens-Johnson综合征)、炎性皮肤病、扁平苔癣、线性IgA大疱性病(儿童的慢性大疱性皮病)、皮肤弹性的损失、粘膜表面溃疡，包括胃溃疡、嗜中性染色皮炎(斯威特氏综合征)、皮肌炎、毛发红糠疹、银屑病、坏 疽性脓皮病、多中心网状组织细胞增多症和中毒性表皮坏死松解症。可利用受体结合剂治疗的其它皮肤相关障碍包括疱疹样皮炎(杜林氏病)、特应性皮炎、接触性皮炎和荨麻疹(包括慢性特发性荨麻疹)。
变应性障碍。受体结合剂可用于治疗变应性障碍例如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应、变应性结膜炎(也参见下文)和荨麻疹。这些疾病通常由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或两者介导。
哮喘是牵涉呼吸系统的慢性病况，在所述呼吸系统中气道偶尔通常响应一种或多种触发剂而收缩，开始发炎，并且衬以过量的粘膜。发作可通过这样的情况如对环境刺激物(或变应原)例如冷空气、暖空气、湿空气、锻炼或用力、情绪应激和病毒性疾病的暴露触发。气道变窄引起症状例如哮鸣、呼吸短促、胸部紧迫感和咳嗽。受体结合剂可用于治疗哮喘，并且可经配制用于局部或经肺递送，以进行这样的治疗，或可进行胃肠外递送。
移植。可给将要经历、正在经历移植或正从移植恢复的受试者施用受体结合剂。移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)是T淋巴细胞依赖性的；T淋巴细胞功能的抑制起着改善作用。角膜移植可与可通过利用受体结合剂的治疗改善的新生血管形成相关。受体结合剂还可用于治疗由实质器官移植例如心脏、肝、皮肤、肾、肺(肺移植气道闭塞)或其它移植物(包括骨髓移植物)引起的并发症。
感染性疾病。本文中描述的受体结合剂用于治疗原生动物病，包括疟疾和血吸虫病以及治疗麻风结节性红斑；细菌或病毒性脑膜炎；结核病，包括肺结核；和继发于细菌或病毒感染(包括流感和传染性单核细胞增多症)的肺炎。
也可用受体结合剂治疗的是遗传周期性发热综合征，包括家族性地中海热、超免疫球蛋白D和周期性发热综合征以及TNF-受体相关周期性综合征(TRAPS)，和成人斯蒂尔病、施尼茨勒综合征和纤维化肺泡炎。
在一些实施方案中，给受试者施用受体结合剂来减小IL-6在受试者中的活性或表达。例如，受试者可具有与IL-6相关或至少部分地由IL-6介导的障碍。
眼障碍和经眼递送。本文中描述的受体结合剂可用于治疗眼障碍，包括影响眼睛表面的眼障碍、炎性眼障碍和至少部分由自身免疫反应介导的眼障碍。
在一些实施方案中，眼障碍是影响眼睛表面的干眼障碍。障碍包括也称 为干燥性角结膜炎、干性角膜炎、肖格伦氏综合征、干眼病、泪膜障碍、减少的泪产生、泪水缺乏症和睑板腺功能不良的病况。干眼可包括与斯耶格伦氏综合征(SS)，例如，与干燥性角结膜炎相关的斯耶格伦氏综合征相关的形式，而且还包括不这样相关的形式，例如与干燥性角结膜炎相关的非斯耶格伦氏综合征相关的形式。患者可以具有或可以不具有全身性自身免疫性障碍的其它表现。IL-1牵涉干眼障碍的发病机理。参见，例如，Enriquez deSalamanca等人(2010),Mol.Vis.16:862-873。
具有干眼综合征的受试者可显示干眼的炎症，并且可经历发痒、刺痛、灼烧或压觉、刺激、疼痛和发红。干眼可与过多流泪和相反地不充足的泪产生相关。可给这样的受试者施用受体结合剂来改善或防止一个或多个这样的症状的发作或恶化。受体结合剂还可用于减轻经历这样的疼痛的受试者的疼痛，例如眼痛(例如因神经炎症引起的)。
在一些实施方案中，眼障碍是与全身性自身免疫性障碍(例如斯耶格伦氏综合征和类风湿关节炎)相关的或与与IL-1或另一种IL-1细胞因子家族成员相关的障碍相关的眼障碍。患者可具有或可以不具有全身性自身免疫性障碍或全身性自身免疫障碍的其它表现。
受体结合剂还可用于治疗影响眼的表面例如眼角膜的其它障碍。这样的障碍包括角膜眼表面炎性病况、角膜新生血管化、角膜炎，包括外周溃疡性角膜炎和微生物角膜炎。受体结合剂可用于治疗正在经历角膜伤口愈合的受试者(例如，具有角膜创伤的受试者)。可给将接受、正在经历牵涉眼的手术例如角膜移植/角膜移植术、人工角膜手术、板层移植、选择性内皮移植或从所述手术恢复的受试者施用受体结合剂。参见，例如，Dana(2007)Trans AmOphthalmol Soc105：330-43；Dekaris等人(1999)Curr Eye Res19(5)：456-9；和Dana等人(1997)Transplantation63:1501-7。受体结合剂可用于治疗影响结膜的障碍，包括结膜瘢痕障碍和结膜炎。受体结合剂可用于治疗其它障碍例如类天疱疮综合征和Stevens-Johnson综合征。可给受试者施用本文中描述的受体结合剂来调节眼中或眼周围的新生血管形成。参见，例如，Dana(2007)Trans Am Ophthalmol Soc105：330-43。
可给具有影响眼的变态反应的受试者，例如正在经历严重变应性(特应性)眼疾病例如变应性结膜炎的受试者施用受体结合剂。例如，可局部施用受体结合剂。也参见，例如，Keane-Myers AM等人(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci,40(12)：3041-6。
可给具有影响眼的自身免疫性障碍的受试者施用受体结合剂。示例性自身免疫性眼障碍包括交感性眼炎、Vogt-Koyanagi Harada(VKH)综合征、散射状视网膜脉络膜病变、眼瘢痕性类天疱疮、富克斯氏虹膜睫状体炎和葡萄膜炎的各种形式。可给受试者施用受体结合剂来治疗任何前述障碍。
可给患有糖尿病视网膜病变或处于发生所述疾病的风险中的受试者施用受体结合剂。参见，例如，Demircan等人(2006)Eye20:1366-1369和Doganay等人(2006)Eye,16:163-170。
葡萄膜炎包括急性和慢性形式，包括虹膜、睫状体和脉络膜的一种或多种的炎症。慢性形式可与全身性自身免疫性疾病例如白塞氏综合征、强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、莱特尔氏综合征和炎性肠病相关。在前葡萄膜炎中，炎症主要在虹膜中(也称为虹膜炎)。前葡萄膜炎可影响患有全身性自身免疫性疾病的受试者，而且还影响不具有全身性自身免疫疾病的受试者。中间葡萄膜炎包括前部玻璃体、周边视网膜和睫状体的炎症，通常具有极小前部或脉络膜视网膜炎症。扁平部睫状体炎(Pan planitis)由虹膜与脉络膜之间的睫状环的炎症引起。后葡萄膜炎牵涉葡萄膜和主要地脉络膜，也称为脉络膜炎。后葡萄膜炎可与全身性感染或自身免疫疾病相关。其可持续数月和甚至数年。可给受试者施用受体结合剂来治疗葡萄膜炎的上述形式的任一种。也参见，例如，Tsai等人(2009)Mol Vis15:1542-1552和Trittibach P等人(2008)Gene Ther.15(22)：1478-88。
在一些实施方案中，受体结合剂用于治疗患有年龄相关性黄斑变性(AMD)或处于发生所述疾病的风险中的受试者。可将受体结合剂局部用于眼，将其注射(例如，玻璃体内)或全身性提供。参见，例如，Olson等人(2009)Ocul Immunol Inflamm17(3):195-200。
本文中描述的受体结合剂可通过任何模式施用来治疗眼病。可通过胃肠外模式递送试剂。或者或此外，可将试剂直接递送至眼或眼的附近。例如，可局部或眼内施用蛋白质，例如，如下文中描述的。
用于眼递送的制剂和方法。可递送包含受体结合剂的眼用制剂以用于局部施用，例如用于以液滴或药膏的形式施用或用于植入例如眼前房或结膜囊。可使用滴眼管递送液滴。当配制用于眼递送时，受体结合剂可以以0.0001-0.1%、0.001-5%，例如，0.005-0.5%、0.05–0.5%、0.01-5%、0.1-2%或1%-5% 的浓度存在。通常地，将眼用制剂直接施用于眼，包括局部施用至眼脸或滴入眼球与眼脸之间的空间(cul-de-sac)。眼用制剂可被设计来与泪液容易地混合并且在角膜和结膜的表面上扩散。借助于常用施用技术，将大部分药物沉积在下穹窿中。毛细作用、扩散力和瞬目反射驱动药物掺入其从之渗入并且通过角膜的角膜前膜。
眼用制剂还可包括一种或多种其它试剂例如抗炎类固醇例如利美索龙、氯替泼诺、甲羟松和氢化可的松或非类固醇抗炎药。例如，类固醇可以以0.001至1%的浓度存在。在一些实施方案中，不存在类固醇。例如，受体结合剂是制剂中的唯一活性剂。
制剂还可包含下列组分的一种或多种：表面活性剂、张度剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂和粘性构建剂。张度剂可用于将组合物的张度调整至例如天然泪的张度。例如，可添加氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钙、葡萄糖和/或甘露醇以获得适当的张度，例如生理张度。可以以足以提供约150-450mOsm或250-350mOsm的重量摩尔渗透压浓度的量添加张度剂。
制剂还可包含适合用于眼递送的缓冲液。缓冲液可包含一种或多种缓冲组分(例如，磷酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)来应对pH的变化(特别地在贮存条件下)。例如，缓冲剂可被选择来提供在pH5.5-7.5、6.0-7.5或例如6.5-7.5的范围内的目标pH。
制剂可包含含水或磷脂载体。特别地为了治疗干眼障碍，制剂可包含试剂来提供短期缓解，例如润滑眼和帮助泪形成的化合物。例如，磷脂载体(其包含一种或多种磷脂)可用于提供短期缓解。用作人工泪液载体的人工泪液组合物的实例包括商业产品例如Tears Naturale^TM(Alcon Labs,Inc.,TXUSA)。例如，每ml制剂可包含：1mg葡聚糖、70和3mg羟丙基甲基纤维素和任选地防腐剂如(聚季胺盐-1)0.001%(m/v)。磷脂载体制剂的实例包括US4,804,539、US4,883,658、US5,075,104、US5,278,151和US5,578,586中公开的磷脂载体制剂。
制剂还可包含用作润滑剂或湿润剂的其它化合物。这些化合物包括粘性剂例如：单体多元醇例如甘油、丙二醇、乙二醇；多聚体多元醇例如聚乙二醇、纤维素家族的各种聚合物；羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素(“HPC”)、葡聚糖例如葡聚糖70；水溶性蛋白质例如明胶；和乙烯基聚合物例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮和卡波姆例如 卡波姆934P、卡波姆941；卡波姆940、卡波姆974P。其它实例包括多糖，例如透明质酸及其盐和硫酸软骨素及其盐，以及丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，制剂具有1至400cP的粘度。
可将制剂包装在具有伴随滴管或一组一次性使用的滴管的瓶子中以用于单剂量或多剂使用。制剂可包含一种或多种防腐剂，例如以在使用过程中防止微生物和真菌污染，和/或一种或多种去垢剂例如以溶解蛋白质。示例性防腐剂包括：苯扎氯铵、三氯叔丁醇、苄十二烷基二甲基铵溴化物、尼泊金甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙基醇、依地酸二钠、山梨酸和聚季铵盐-1，并且可以以0.001至1.0%w/v的浓度包含在制剂中。还可能提供包含受体结合剂的灭菌且不含防腐剂的制剂。示例性去垢剂包括Triton X-100、Elugent、Tween-20和Tween-80，并且可以以0.001至1.0%w/v的浓度包含在制剂中。还可能提供不含去垢剂的制剂。制剂可被制备来用于单次使用应用。
眼用包装可用于提供眼用制剂与眼的延伸的接触。棉拭子用制剂来进行饱和，随后将其插入上或下穹窿。受体结合剂还可通过离子透入法来施用。该方法使溶液保持与角膜在具有电极的洗眼杯中接触。药物的扩散通过电位差来实现。
受体结合剂还可通过注射，例如结膜下注射来施用。可将制剂注射在结膜下面，从而促进通过简单扩散穿过巩膜并进入眼中。还可将制剂注射在结膜下面和眼的更前部分的眼球筋膜下面，以将试剂递送至睫状体、脉络膜和视网膜。还可通过球后注射施用制剂。
对于干眼和其它表面障碍，可使用例如下列方法的一种或多种来评价受试者：眼表面疾病指数(OSDI)、角膜和结膜染色以及希尔默测试(Schirmertest)。可使用本领域已知的其它方法。
眼表面疾病指数(OSDI)是12项问卷法，其提供与眼表面炎性障碍包括DES一致的眼刺激的症状以及它们对视觉相关功能的影响的快速评估。参见例如，Ocul Immunol Inflamm.2007Sep-Oct；15(5):389-93。将OSDI问卷法的12项按0至4的等级进行分级。评分基于反应得出，以按0至100的等级提供OSDI评分，更高的评分代表更大的失能。相对于基线的负变化表示视觉相关功能和眼炎性障碍的改善。
角膜和结膜染色：角膜染色是上皮疾病或眼表面上皮屏障的破裂(通常对于眼表面炎性障碍例如干眼中看到的)的测量。角膜染色可以甚至在无临 床明显干眼的情况下存在，如果存在显著的眼脸疾病例如后眼脸炎的话。角膜染色与许多(尽管并非全部)患者的眼睛不适相关；通常地，角膜染色与OSDI中的高评分相关，如上文中所述的。对于角膜荧光染色，将盐水湿润的荧光素测试条或1%荧光素钠溶液用于对泪膜进行染色。随后利用黄色屏障滤光片(#12Wratten)和钴蓝色照明，使用裂隙灯评价检查整个角膜。按照Oxford方案对染色进行分级。结膜染色同样地是上皮疾病或眼表面上皮屏障的断裂的测量。使用丽丝胺绿，在裂隙灯下进行结膜染色。将盐水湿润的测试条或1%丽丝胺绿溶液用于对泪膜进行染色，随后评价睑间结膜染色超过30秒但少于2分钟。通过使用中等强度的白光，使用Oxford方案仅对鼻的睑间区域和短暂结膜染色进行分级。
希尔默测试：在麻醉存在和不存在的情况下，通过将窄滤纸条(Whatman#41滤纸的5x35mm测试条)置于下cul-de-sac中来进行希尔默测试。在光线昏暗的房间中进行该测试。患者轻轻地闭上他的/她的眼直至5分钟流逝，并且移开测试条。因为在泪前沿离开眼后，其将继续前行数毫米，因此在精确地5分钟时用圆珠笔标记泪前沿。通过以毫米表示的长度测量泪水的产量，滤纸条在5分钟的过程中湿润。在不麻醉的情况下对于希尔默测试10mm或更短的结果以及在麻醉的情况下对于希尔默测试5mm或更短的结果被认为是不正常的。相较于基线的正改变表明本文中描述的眼炎性障碍的一个或多个症状的改善。
用于肺递送的制剂和方法。可配制受体结合剂以用于肺递送的吸入或其它模式，例如以将试剂施用至呼吸道例如上呼吸道和下呼吸道的组织。可用于将试剂局部递送至肺气道的3个常用系统包括干粉吸入器(DPI)、定量雾化吸入器(MDI)和喷雾器。MDI可用于以溶解形式或以分散体的形式递送受体结合剂。通常地，MDI包含氟利昂或在激活装置后将雾化的药剂迫入呼吸道的其它相对蒸气压的喷射剂。相反地，DPI通常依赖于患者吸气努力来将药剂以干粉形式引入肺。喷雾器形成通过将能量赋予液体溶液来吸入的药剂气溶胶。试剂可以以冻干形式(例如，在室温)贮存以及在吸入前于溶液中重建。在液体通气或使用含氟化合物介质的肺灌洗过程中进行药物的直接肺递送也是可能的递送模式。这些和其它方法可用于递送受体结合剂。例如，可以以至少为约0.02、0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、20、40或50mg/喷出或更多的剂量单位形式递送试剂。
受体结合剂可通过使用适当的喷射剂例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、dielilorotetrafluoroctliane、二氧化碳或其它适当气体，以气雾喷雾呈送的形式方便地从加压袋或喷雾器递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来测定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒可被配制来包含受体结合剂与适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉剂混合物，如果颗粒是配制的颗粒的话。除了配制或未配制的受体结合剂以外，还可将其它材料例如100%DPPC或其它表面活性剂混合在一起来促进配制的或未配制的受体结合剂的递送和扩散。还可改变粒度来控制递送朝向下呼吸道还是朝向上呼吸道。例如，1-5微米或10-50微米的尺寸范围内的颗粒可分别用于下呼吸道和上呼吸道。
递送增强剂例如表面活性剂可用于进一步增强肺递送。表面活性剂通常是具有亲水和亲脂部分的化合物，其通过与两种非混溶相之间的界面相互作用来促进药物的吸收。表面活性剂因几个原因例如颗粒聚集的减少和巨噬细胞吞噬作用的减少而用于干燥颗粒。表面活性剂在本领域是公知的，包括磷酸甘油脂例如磷脂酰胆碱、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-；月桂基乙醚；棕榈酸；油酸；三油酸山梨坦(Span85)；甘胆酸盐；枯草菌脂肽；泊洛沙姆；山梨糖醇酐脂肪酸酯；三油酸山梨坦；泰洛沙泊和磷脂。
本文中还表征了特异性识别本文中描述的嵌合细胞因子结构域的抗体，例如相对于任何亲代细胞因子结构域优先结合嵌合结构域的这类抗体。例如，特异性抗体可结合包括来自第一亲代细胞因子的区段与第二亲代细胞因子之间的接合处的表位。
核酸递送。可递送编码受体结合剂并且可表达其的核酸来将受体结合剂提供给受试者。例如，可将编码受体结合剂的核酸序列置于转录控制序列的控制之下和置于用于基因递送的核酸载体例如病毒载体中。示例性病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒或腺病毒相关病毒载体。载体可以以质粒或线性分子例如线性双链DNA的形式存在。递送的核酸可被设计来整合进入靶细胞的基因组，例如，整合进入靶细胞的基因组。或者，可这样设计递送的核酸，以便在递送后，其自主地存在于细胞中。
可对转录控制序列进行工程化以提供瞬时或组成型表达。瞬时控制可包括通过外源试剂例如通过使用响应外源试剂(例如，类固醇激素或FK506)或环境信号的转录因子的转录反应元件调节的控制。
可以例如通过检测由基因编码的蛋白质(例如，使用抗体)或通过检测mRNA(例如使用PCR或Northern杂交)来评价在递送的核酸上提供的基因的表达。通常这样工程化递送的核酸，以使转录和翻译调控性DNA相对于受体结合剂的编码序列适当地定位，以便可起始转录，并且从所得的信使翻译该蛋白质。核酸可包括来自哺乳动物细胞(特别地人)转录和翻译调控性核酸序列。这样的序列包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活物序列。
此外，表达载体可包括额外的元件。例如，为了整合表达载体，表达载体可包含至少一个或两个与宿主细胞基因组同源的序列，例如侧翼连接表达构建体。可通过选择适当的同源序列包含在载体中来将整合载体导向宿主细胞中的特定基因座。用于整合载体的构建体在本领域是公知的。
示例性腺病毒载体包括人腺病毒载体的修饰形式例如Ad2或Ad5，其中病毒体内复制所必需的基因元件已被除去。例如，可除去E1区域，还可进一步修饰基因组以接受编码受体结合剂的表达盒。
示例性逆转录病毒载体包括LNL6、LXSN、LNCX和慢病毒载体。具体的慢病毒载体由Pawliuk等人(2001)Science294:2368和Imren等人(2002)PNAS99:14380进行了描述，包括但不限于人免疫缺陷病毒(例如，HIV-1、HIV-2)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和马感染性贫血病毒(EIAV)。构建这些载体，通过例如将必需基因(例如，gag和pol)分离至分开的载体上和通过使逆转录病毒变成复制缺陷型来使这些载体变得安全。随后利用标准技术，通过使用辅助病毒或包装细胞系将复制缺陷型逆转录病毒包装在病毒体中。用于产生重组逆转录病毒和用于利用这样的病毒体外或体内感染细胞的方案可见于Current Protocolsin Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人(编著)Greene PublishingAssociates,(1989),Sections9.10-9.14和其它标准实验室手册。逆转录病毒载体，除了用于表达受体结合剂的序列以外，还可包含左(5')逆转录病毒LTR；逆转录病毒输出元件，任选地逆反应元件(RRE)；启动子和基因座控制区域(LCR)或其它转录隔离序列和右(3')逆转录LTR。逆转录载体还可包含中枢聚 嘌呤区(cPPT)或DNA翼(DNA flap)来增加病毒滴度和转导效率。
可将包含编码受体结合剂的序列的核酸例如离体或体内递送至任何适当的靶细胞。示例性靶细胞包括滑膜细胞、造血细胞、表皮细胞等。可将核酸递送至与眼相关的靶细胞例如角膜上皮细胞。递送可包括角膜上皮的清创术或刮术，以暴露上皮的基底层。随后添加用于递送的核酸。在另一个实施方案中，将核酸递送至角膜内皮细胞、角膜周围下面的小梁网的细胞、眼脉络膜层的细胞、视网膜、巩膜或睫状体的细胞、视网膜或眼脉管系统的细胞或玻璃体的细胞或晶状体例如晶状体上皮的细胞。
递送法包括例如逆转录病毒感染、腺病毒感染、利用质粒的转化、利用包含外源核酸的脂质体的转化、微粒轰击核酸递送(例如，将核酸加载至金或其它金属颗粒上并且射入或注射入细胞)、腺病毒相关病毒感染和EB病毒感染。可通过任何方法包括针注射、皮下注射器、电穿孔或基因枪来递送进入细胞或组织。
用于基因递送的其它方法可见于例如Kay,M.A.(1997)Chest111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)Liver19:265-74；Oka,K.等人(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；和Lee,H.C.等人(2000)Nature408:483-8。
示例性第二试剂。可将本文中描述的受体结合剂与第二试剂一起施用。可共施用或例如使用不同的方案单独施用两种试剂。示例性第二试剂包括抗炎剂。
在一个实施方案中，第二试剂是IL-17拮抗剂(包括所有IL-17家族成员的拮抗剂，例如，IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17E的拮抗剂)。示例性IL-17拮抗剂包括：结合IL-17(包括IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17E)并且拮抗IL-17介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；结合一种或多种IL-17的受体例如IL-17RA和IL-17RC并且拮抗IL-17介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)； 结合包含IL-17和至少一个受体亚单位的复合物例如IL-17和Il-17RA或IL-17、IL-17RA和IL-17RC并且拮抗IL-17介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；和包含IL-17RA和IL-17RC的可溶性胞外结构域的一个或多个并且拮抗IL-17介导的信号转导的试剂例如可溶性受体。
在另一个实施方案中，第二试剂是IL-12拮抗剂。示例性IL-12拮抗剂包括：结合IL-12(包括p35和p40)并且拮抗IL-12介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；结合IL-12的受体的一个或多个例如IL-12Rβ1或IL-12Rβ2并且拮抗IL-12介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；结合包含p35、p40和至少一个受体亚单位例如IL-12Rβ1或IL-12Rβ2的复合物并且拮抗IL-12介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；和包含IL-12Rβ1或IL-12Rβ2的可溶性胞外结构域的一个或多个并且拮抗IL-12介导的信号转导的试剂例如可溶性受体。
在另一个实施方案中，第二试剂是IL-23拮抗剂。示例性IL-23拮抗剂包括：结合IL-23(包括p19和p40)并且拮抗IL-23介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；结合IL-23的一个或多个受体例如IL-12Rb1或IL-23R并且拮抗IL-23介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；结合包含p19、p40和至少一个受体亚单位例如IL-12Rb1或IL-23R的复合物并且拮抗IL-23介导的信号转导的试剂(例如抗体和其它结合蛋白)；和包含IL-12Rb1或IL-23R的可溶性胞外结构域的一个或多个并且拮抗IL-23介导的信号转导的试剂例如可溶性受体。
针对IL-23的示例性抗体已被描述。参见例如，Beyer等人,J.Mol.Biol.(2008),doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001。
动物模型。可在人疾病例如人自身免疫和/或人炎性疾病的动物模型中评价受体结合剂。试剂可具有对于动物中的对应靶蛋白的特异性。
类风湿关节炎模型。可在类风湿关节炎的动物模型例如胶原诱发的关节炎(CIA)模型中评价受体结合剂。参见，例如，McIndoe等人,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2210-2214；Issekutz,A.C.等人,Immunology(1996)88:569；和Current Protocols in Immunology,Unit15.5,Coligan等人(编著),John Wiley&Sons,Inc.。通过用天然II型胶原免疫大鼠/小鼠的易感品系来产生模型。将胶原在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化并且皮内注射(100mg胶原:100mg CFA/小鼠)注射在尾的基部。用0.05ml的蒸馏水/CFA乳剂皮内注射对照小鼠。初 始免疫后21天提供不完全佐剂中的胶原的加强注射。疾病因胶原免疫后诱导的自身免疫反应而引起。
使用定义的等级对关节的关节炎、炎症、血管翳、软骨破坏和骨质吸收进行评分。例如可如下对关节炎的严重度评分：0=无可见关节炎效应；1=一个趾或关节的水肿和红斑；2=2个关节的水肿和红斑；3=超过2个关节的水肿和红斑；4=整个爪和趾的严重关节炎，伴随踝关节的僵硬和肢体的变形。将每一个肢体的的评分求和，记录为每一个个体动物的关节炎指数(AI)。还可将其它评分方案用于这些和其它标准。
多发性硬化。实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的有用鼠模型。可在EAE模型中评价受体结合剂。EAE是T细胞介导的自身免疫性障碍，其特征在于T细胞和单核细胞炎症以及随后中枢神经系统的轴突的脱髓鞘作用。(参见，例如，Bolton,C.,1995,Multiple Sclerosis,143)。示例性方案可见于Current Protocols in Immunology,单元15.1和15.2；Coligan等人(编著),John Wiley&Sons,Inc。还可获得髓磷脂疾病的模型，其中少突神经胶质细胞或许旺细胞被移植入中枢神经系统，例如，如在Duncan等人,1997,Molec.Med.Today,554-561中描述的。
同种异体移植。可以例如使用鼠尾-皮肤移植，在同种移植皮片排异反应的动物模型中评价受体结合剂。同种移植皮片排异反应由T细胞、辅助T细胞和杀伤细胞-效应T细胞介导。参见，例如，Current Protocols inImmunology,单元4.4；Coligan等人(编著),1995,John Wiley&Sons,Inc。还可使用其它移植排斥模型。参见，例如，Tinubu等人,1994,J.Immunol.,4330-4338。
IBD和结肠炎模型。炎性肠病的示例性模型是使用高CD4+CD45Rb细胞转移至SCID小鼠。参见，例如，Hirano等人,J Pharmacol Sci.2009Jun；110(2):169-81和使用IL-10缺陷型转基因小鼠。参见，例如，Inaba等人,Inflamm Bowel Dis.,DOI：10.1002/ibd.21253(2010)。另一个示例性结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)来诱导急性结肠炎。例如，可通过随意施用5%(wt/vol)的饮用水中的DSS(分子质量30–40kDa；ICN Biomedicals,Aurora,OH)来诱导小鼠的结肠炎。由该处理引起的症状是血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和具有嗜中性粒细胞浸润的粘膜溃疡形成。DSS诱发的结肠炎的组织学特征在于炎症细胞至粘膜固有层的浸润，具有淋巴样组织增生、局灶性隐 窝损害和上皮溃疡形成。这些变化被认为因DSS对上皮的毒性效应以及因固有层细胞的吞噬作用和TNF-α及IFN-γ的产生而发生。参见，例如，Hassan等人PLoS One.2010Jan25；5(1):e8868。
干眼病模型。可使用本领域已知的方法在干眼病的小鼠模型中评价受体结合剂。例如，可通过皮下注射东莨菪碱，随后将小鼠置于人工气候室来诱发小鼠的干眼。以具体实例为例，可通过在人工气候室中连续暴露于干燥环境来诱发正常健康的6至10周龄雌性C57BL/6小鼠具有干眼。人工气候室具有小于30%(通常约19%)的低相对湿度、高气流(15升/分钟)和恒温(约22℃)。置于人工气候室中的小鼠也用东莨菪碱进行处理以抑制眼泪分泌。持续释放东莨菪碱经皮吸收贴剂可获自Novartis(Summit,N.J.)。每隔48小时将1/4的贴剂用于小鼠的脱毛中尾。人工气候室与东莨菪碱的组合在相对短的时间(约2-4天)内产生严重干眼。可如Barbino等人,Invest.Ophthal.Vis.Sci.,46：2766-2711(2005)中所述制备人工气候室，使得能够控制气流、湿度和温度。
可以例如通过进行下列测试来监测小鼠的干眼体征：a)测量泪水产生的棉线测试，所述泪水产生在干眼患者中通常减少；b)角膜荧光染色，其为角膜表面损伤的标志；和一般眼科检查。
棉线测试：可用利用酚红(Zone-Quick,Lacrimedics,Eastsound,Wash.)浸透的棉线测试测量眼泪产生。在放大荧光下，用珠宝商镊夹住线，将其置于右眼的结膜穹的外眦中进行30或60秒。使用血细胞计数器的标度在显微镜下读取以mm表示的泪距。
角膜荧光染色：可通过用微量移液管将1.0μl的5%荧光素施用于眼的下结膜囊内来评价角膜荧光染色。在荧光素滴注后3分钟，利用裂隙灯活组织显微镜，使用钴蓝色光检查角膜。对于5个其中角膜表面已分裂的区域的每一个区域，使用0-3的标准化国立眼科研究所(NEI)分级系统以隐蔽方式记录点状染色。
可使用其它适当的方法，例如参见实施例8(在下文中)。
诊断和其它用途。本文中描述的受体结合剂可用于检测表达这样的受体的样品或细胞中的IL-1R1。例如，可用作为标记物或产生信号的部分例如酶、放射性标记物、表位或荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)直接或间接标记试剂。可将试剂与样品或细胞接触以测定受体是否存在于样品中或细胞上，例如，使 用标准免疫印迹、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光能量转移、Western印迹和其它诊断及检测技术。
受体结合剂还可被标记以用于体内检测和给受试者施用。可以例如通过NMR或其它体层摄影方法给受试者摄像。例如，可用放射性标记物例如¹³¹I、¹¹¹In、¹²³I、^99mTc、³²P、¹²⁵I、³H、¹⁴C和¹⁸⁸Rh、荧光标记物例如荧光素和罗丹明、核磁共振活性标记物、可通过正电子发射体层摄影术(“PET”)扫描仪检测的正电子发射同位素、化学发光剂例如萤光素和酶促标记例如过氧化物酶或磷酸酶标记结合剂。可用造影剂例如顺磁剂和磁性铁或超顺磁性造影剂(其主要改变T2反应)标记试剂。
受体结合剂还可用于纯化表达其所结合的受体的细胞。例如，可将受体结合剂偶联至固定的支持物(例如，磁珠或柱子基质)，将其与可表达受体的细胞接触。支持物可以例如用生理缓冲液洗涤，可从所述支持物回收细胞。
受体结合剂还可用于纯化其所结合的受体的可溶性形式。例如，可将包含可溶性受本的样品与固定的受体结合剂接触，随后，例如在洗涤后，可从固定的试剂回收它。
下列非限定性实施例进一步举例说明本文中描述的本发明的实施方案。
实施例
实施例1.将编码具有表4(下文中)中所列的氨基酸序列的蛋白质的核酸构建于包含T7启动子和氨苄青霉素(pET31系列)或卡那霉素抗性基因(pET28系列)(EMD Chemicals,Gibbstown NJ,USA)的pET载体中，并且进行表达。可用于表达的编码序列的实例提供于表5中。
表4

编码上述蛋白质的示例性核酸列于表5中。在一些实施方案中，核酸序列还在下面所列的第一个核苷酸之前包含ATG。在一些实施方案中，核酸序列还在下面所列的最后一个核苷酸之后包含终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)。
表5

蛋白质可包括一系列来自下文中举例说明的IL-1β和IL-1Ra的不同残基。在这些实例P01、P02、P03、P04和P05当中，细胞因子结构域可具有48-70%的来自IL-1β的残基和55-78%的来自IL-1Ra的残基。(因为许多氨基酸残基在两种蛋白质之间是保守的，因此与IL-1β和与IL-1Ra的百分比同一性之和可大于100%)。
表6
IL-1β残基IL-1RA残基总的残基%IL-1β%IL-1RAP061306215285.540.8P071138015373.952.3P051088515370.655.6P041048915368.058.2P03949915361.464.7P028510815355.670.6P017411915348.477.8
实施例2.通过在LB液体培养基中，在37℃利用1mM IPTG诱导3小时，在大肠杆菌细胞BL21(DES)株或BLR(DE3)中表达包含六组氨酸标签的蛋白质。在20-50mM Tris,0.5M NaCl,2.5mM EDTA,0.1%Triton X-100,pH8.0中裂解细胞。针对1.25x PBS(包含0.1%聚山梨醇80)透析裂解物，随后将其通过0.8/0.2μm滤器进行无菌过滤，随后使用HisTrap预装柱(GEHealthcare,Piscataway NJ,USA)将其经历IMAC层析。将柱在50mM磷酸盐,500mM NaCl,pH7.1中进行平衡，加载，用相同的缓冲液洗涤。用25mM咪唑对其进行预洗脱，在相同的缓冲液中用125mM咪唑进行洗脱。将洗脱的蛋白质针对1.25x PBS,0.1%聚山梨醇80,pH7.4进行充分透析。
将蛋白质加载在20mM磷酸钠,0.5M NaCl10mM咪唑,pH7.4缓冲液中。用200mM咪唑,20mM磷酸钠,0.5M NaCl pH7.4缓冲液对其进行洗脱。将洗脱的蛋白质针对PBS,0.1%聚山梨醇80,pH7.4进行充分透析，使用Amicon(10K)过滤器将其浓缩，于4°或-80℃贮存。
通过离子交换层析纯化缺乏六组氨酸标签的蛋白质。通过离子交换层析纯化P05蛋白。在盐不存在的情况下(电导率约1mS/cm)将来自表达细胞的裂解物施用至具有低pH(约pH5.5)的GigaCapS^TM柱(Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia,PA,USA)。随后利用pH梯度(缓冲液A=10mM醋酸,pH5.5；缓冲液B=20mM Tris pH8)洗脱柱子。随后用5ml的H₂O和5ml的20mMTris pH8稀释5ml包含洗脱的蛋白质的级分，随后将其用于Capto^TM Q树脂(GE Healthcare,Piscataway NJ,USA)，利用0mM至250mM的20mM Tris pH8.0中的NaCl梯度进行洗脱。将洗脱的蛋白质针对1.25X PBS0.1%80或不存在的1.25X PBS进行充分透析，随后贮存。参见图6。使用类似的方法纯化P03和P04蛋白。
还将表达P05的细胞在具有非动物大豆胨的(#T7660)的Teknova^TMTerrific液体培养基(补充有10g/L葡萄糖、10mM MgSO₄、微量元素(1mg/mlTeknova^TM1000X微量元素,#T1001)和Sartorius2L Biostat^TMA+中的抗生素)中生长并且，在OD35-40时用1mM IPTG诱导约6小时。将细胞在37℃和30%的溶解氧，pH7.0下生长，以200-800rpm搅拌，以2L/min的速度喷射氧。当葡萄糖被耗尽(如通过pH增加检测到的)时，给细胞喂饲9g葡萄糖/L/hr。当pH下降时(诱导后约2.5hr)，将喂饲减少至6g葡萄糖/L/hr。
收集细胞，于裂解缓冲液(20mM Tris,10mM EDTA,0.1%Triton,pH8.0；20mM Tris,10mM EDTA,0.1%Triton,pH7.0；50mM MOPS,10mMEDTA,0.1%Triton,pH6.5；或50mM MOPS,10mM EDTA,0.1%Triton,pH6.0)中进行裂解。将裂解物加载至具有pH5.3和3mS/cm(35mg产物/ml柱子树脂)的XS阳离子交换介质(Life Technologies Corp.,Carlsbad CAUSA)上。
在示例性方法中，使用包含100mM MOPS25mM NaCl pH7.0的缓冲液，通过至pH7.0的阶梯洗脱P05蛋白。弃去第一洗脱峰，收集第二洗脱峰，将其混合，其包含P05蛋白。早期混合物相对于des-Ala种类富集了完整P05蛋白。随后将该洗脱的材料流过CaptoQ^TM阴离子交换树脂。收集包含完整P05蛋白的流通液。
在另一个示例性方法中，用100mM MOPS20mM NaCl pH6.0洗涤介质。使用包含100mM MOPS50-58mM NaCl pH6.0的缓冲液，通过至pH6.0的阶梯洗脱P05蛋白。将第一洗脱峰与随后的峰分离，所述第一洗脱峰包含完整的P05蛋白。随后将该洗脱的材料流过CaptoQ^TM阴离子交换树脂。收集包含完整P05蛋白的流通液。
实施例3.在基于细胞的测定中评价包含蛋白质的蛋白质或上清液的IL-1活性。HEK-Blue^TMIL-1β反应性细胞用于监测IL-1β活性(可获自InvivoGen Inc.,San Diego CA,USA)。这些细胞包含在融合至5个NF-kB和5个AP-1结合位点的IFN-β最小启动子的控制下的SEAP报告基因。细胞表面上IL-1受体的IL-1β衔接导致NF-kB活化和SEAP产生。可以例如使用QUANTI-Blue^TM(InvivoGen Inc.,San Diego CA,USA)和分光光度计测量分析来检测来SEAP报告。从培养至70-80%汇合的细胞制备HEK-Blue IL-1β细胞悬浮液。将悬浮细胞于新鲜生长培养基(DMEM,4.5g/l葡萄糖,2mM L-谷氨酰胺,10%(v/v)热灭活的胎牛血清(在56℃进行30min),50U/ml青霉素,50mg/ml链霉素,100mg/ml NormocinT)中调整至～330,000个细胞/ml。
将试剂：10ml的20ng/ml的IL-1β,uml的目标试剂和30ml的细胞培养基添加至平底96孔细胞培养板的孔中至50ml的终体积。平行地制备阳性和阴性对照。随后将150ml HEK-Blue IL-1β细胞悬浮液(～50,000个细胞)添加至每一个孔，将板在37℃于5%CO2组织培养箱中培养过夜。通常地，终IL-1β浓度(于200ml终体积中)为0.1ng/ml。第二天(12-15小时后)评价IL-1β活性。在定量之前，按照制造商的说明书制备QUANTI-Blue^TM试剂。制备平底96孔测定板，其中将150ml的QUANTI-Blue^TM溶液添加至每一个孔中。将50ml的来自96孔组织培养板的孔的条件培养基添加至测定板的每一个孔中。将板在37℃温育约15-20分钟。随后使用分光光度计在620-655nm测量SEAP水平。
结果。如图7A中所示，在该测定中，P06蛋白表现为IL-1RI激动剂，P07蛋白表现为部分激动剂，P01蛋白不能激动。事实上，当在IL-1β存在的情况下测定时，P01蛋白表现为拮抗剂。图7B显示通过使用上述HEKBlue^TM细胞测定，P01在一系列IL-1β蛋白浓度上对IL-1β活性的拮抗。拮抗随增加P01的量增加而增强(x-轴反映包含P01的上清液的微升)。
蛋白质P01、P02、P03、P04和P05各自拮抗IL-1β活性。例如，参见图8A和8B。P05的IC50小于约5ng/ml。在该测定中测试P05的激动IL-1RI的能力，即使在最高测试浓度1mg/ml下也未观察到P05具有任何可检测的激动活性。P01、P02、P03、P04和P05还抑制IL-1β诱导的MG-63细胞(响应IL-1β的人骨肉瘤细胞系)的IL-6表达。在干眼病的鼠模型中，观察到六组氨酸标记的P05具有生物活性。关于未标记的P05，也参见下面的实施例8。
实施例4.使用表面等离子体共振术，利用Reichert SR7000DC Dual ChannelSPR系统评价蛋白质对可溶性重组人IL-1RI(对应于IL-1RI的胞外结构域)的结合性质。在具有0.005％Tween20的磷酸缓冲盐溶液中评价结合。观察到IL-1β具有8-9nM的K_D和2-3×10^-3s^-1的解离常数(K_d)，在另一个实验中，约2nM的K_D，1.3-1.5×10⁶M^-1s^-1的缔合常数和约2.9-3.0×10^-3s^-1的解离常数(K_d)。参见图9A。P01蛋白以与IL-1β相似的缔合动力学结合，但在结合实验的解离相(约180秒)中不解离。因此，P01以比IL-1β在相似条件下显示的亲和力更大的亲和力结合IL-1RI。
观察到IL-1Ra的结合具有约0.33nM的K_D，约2×10⁵M^-1s^-1的缔合常数(K_a)和约6.6×10^-5s^-1的解离常数(K_d)。参见图9B。观察到嵌合细胞因子结构域P01、P02、P03、P04和P05具有在约12-1700pM的范围内的K_D，从约3×10⁴M^-1s^-1变化至3×10⁶M^-1s^-1的缔合常数(K_a)和从约2×10^-5变化至1×10^-3s^-1的解离常数(K_d)。参见例如图9C和9D和下面的表7。
表7
蛋白质k_a(M^-1s^-1)K_d(s^-1)K_D(pM)IL-1β1.47×10⁶M^-1s^-12.95×10^-3s^-12010IL-1Ra2.01×10⁵M^-1s^-16.58×10^-5s^-1326P014.93×l0⁴M^-1s^-12.32×10^-5s^-1470P023.39×10⁴M^-1s^-12.16×10^-5s^-1636P034.1×10⁶M^-1s^-11.2×10^-3s^-1290P043.00×10⁴M^-1s^-15.14×10^-4s^-11714P053.47×10⁵M^-1s^-14.15×10^-5s^-112P064.8×10⁶M^-1s^-11.7×10^-3s^-1410P071.58×10⁴M^-1s^-11.46×10^-3s^-192553
实施例5
其它示例性嵌合IL-1家族蛋白还包括下列蛋白：
P08 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQ ID NO：32
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P09 APVRSQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQ ID NO：33
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P10 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESND SEQID NO：34
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P11 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESND SEQ ID NO：35
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P12 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQ ID NO：36
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFTMQFVSS
P13 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQ ID NO：37
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
P14 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESND SEQ ID NO：38
KIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN
NKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
下面的多肽是包含至少2个来自IL-1α的区段和至少2个来自IL-1Ra的区段的嵌合结构域。
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKF SEQID NO：39
DMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNL
LFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYILENQA
实施例6
可通过使用接头序列和为每一个末端的选择新位置将分子的N末端连接至C末端来构建环状排列的IL-1嵌合结构域。对于具有来源于IL-1β的末端的蛋白质，接头长度可为5至10个，例如约7个氨基酸。新末端的优选位置在背离受体的环，例如β6-β7环(例如，对应于SEQ ID NO：1的71-80的氨基酸)或β7-β8环(例如，对应于SEQ ID NO：1的84-99的氨基酸)中。
这样的环状排列的IL-1嵌合结构域的实例包括：
DKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKD(SEQID NO：40)；和
NYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPK(SEQ ID NO：41)
实施例7.在磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH7.4中以0.5mg／ml的浓度制备蛋白质P03、P04、P05、mIL-1Ra(甲硫氨酰IL-1Ra)和IL-1β。将蛋白质以1∶500的原液浓度的稀释度与SYPRO橙染料(InVitrogen，CA)组合，随后将其经历差示扫描荧光测定法。参见，例如，He等人(2010)J.Pharm.Sciences，991707-1720。随着温度以每分钟1℃的速度从25℃升高至95℃，使用Agilent Mx3005QPCR仪监测荧光测量。解链温度(Tm)值从荧光跃迁的第一衍生物最大值推导而来。观察到蛋白P03、P04和P05具有高于50℃和高至59℃的解折叠发生，和高于59、60、62和64℃的Tm。结果示于下面的表8和图10A&10B中：
表8

P04具有比mIL-1Ra和IL-1β高约4℃的Tm，并且显示比mIL-1Ra高约3℃和比IL-1β高约10℃的解折叠发生。P03和P05具有比mIL-1Ra和IL-1β高约9℃的T_m，并且显示比mIL-1Ra高约11℃和比IL-1β高约18℃的解折叠发生。
实施例8.在1.25x PBS中制备纯化的P05(缺乏六组氨酸标签)，在干眼病的鼠模型中进行测试。在该模型中，在第0天对来自Jackson实验室的的6至10周龄雌性C57BL／6小鼠(在具有≥30％相对湿度、水凝胶食品补充剂和enVirodry环境丰度的动物保温室中适应1至2周)的荧光染色进行预筛选。对于荧光染色，将以10mg／mL于WFI H₂O中稀释的新制备的荧光素以0.4μL 给每只眼施用。施用后约8-13分钟，使用Olympus荧光解剖显微镜对眼进行评分。对于5个其中角膜表面已分裂(评分范围0-15/眼)的区域的每一个区域，使用0-3的标准化国立眼科研究所(NEI)分级系统记录点状染色。通过使用教导桥，两个隐蔽评分同时评价小鼠以为每一只眼提供单个集体评分。
第1天将每只眼具有≤7的评分(其中15为最大评分)的小鼠置于干眼室(20%±2%的湿度和～21L/min/笼的恒定气流)，将其在实验过程中维持在该室中(除检查外)。在第3天，再次给小鼠评分，将其随机化至处理组(8至10只小鼠/组)中。将小鼠随机化，以便具有4至5只小鼠的每一个笼具有大致相同的平均疾病评分。始于第3天和在随机化后，以3μL/眼BID频率在滴眼剂中给小鼠局部施用P05或媒介物(1.25X PBS)。在第7、9和11天检查小鼠并且如上所述对小鼠的角膜荧光染色进行评分。在实验过程中，对于处理组评分是在盲测的情况下进行的。
图11A是在下列每日两次的处理下来自两个相同实验的小鼠的第0、3、7、9和11天的平均角膜染色评分±SEM的条线图：无处理、媒介物(1.25XPBS)和10mg/ml(1%)P05。10mg/ml P05显著减少实验的第7、9和11天的角膜染色。对于低至0.1mg/ml P05的剂量，亦观察到通过角膜染色的减少评价的效率。重组IL-1Ra也在动物模型中适度地减少角膜染色。
如图11B中显示的，基于与相同媒介物中的10mg/ml鼠血清白蛋白的比较，10mg/ml P05的效应是特异性。对于10mg/ml鼠血清白蛋白(MSA)相对于媒介物未看到效应，10mg/ml P05的效应相对于10mg/ml鼠血清白蛋白在统计上是显著的。如图11C中显示的，还将10mg/ml P05与0.05%的眼用乳剂()中的环孢素相比较。尽管P05减少角膜染色，但在约1周的每日2次给药后，对于0.05%的环孢素眼用乳剂未观察到效应。
实施例9.捕获步骤已被开发来纯化通过在BLR(DE3)大肠杆菌细胞中发酵产生的P05。通过统计设计在1mL柱子上进行的实验方法(DOE)来确定洗脱条件。在中等规模(10mL柱子)上进行最优化的条件。
通过在由20mM Tris，pH7.0和添加的10mM EDTA组成的裂解缓冲液中进行微流化来提取产物。将澄清的裂解物调整至pH5.3和3mS/cm的电导率。以2min的停留时间将条件裂解物加载至XS(强阳离子交换树脂)上，至25-30mg P05/mL柱的容量。用平衡缓冲液洗涤柱子以除去未结合 的种类。将在pH6.0和3mS/cm下进行的第二洗涤用于除去一组杂质。在pH6.0和6.6mS/cm下洗脱产物。在pH6.0和12.4mS/cm下洗脱产物相关种类。用高盐缓冲液和NaOH清洁柱子。
P05是具有6.58的理论pI的17kDa蛋白质。des-ALA种类的理论pI为6.8。甲二磺酰化种类的理论pI为6.3，乙酰化种类的理论pI值小于6.3。这三种亚型和P05蛋白可通过分析性弱阳离子交换层析来容易地分离。des-ALA种类可能是在大肠杆菌中发现的氨肽酶P活性的产物。亚型可通过质谱法、肽谱和HPLC法来鉴定。
层析材料。XS基于具有标称50um粒度的交联的聚(苯乙烯-二乙烯苯)珠粒。层析基质具有磺丙基表面化学药品，并且被设计来在结合过程中耐受升高的水平的盐。以散装泥浆的形式获得XS(CN4404339,Life Technologies)材料，将其填充入具有1mL的终柱体积(床高5cm)的5×50mm Tricorn柱(CN28-4064-09,GE Healthcare)或填充入10×150mm Tricorn柱(CN28-4064-16,GE Healthcare)(填充至10.5mL的终体积(床高13.4cm))。
缓冲液。按容量利用MilliQ水制备所有缓冲液。为了达到期望的pH，添加10N HCl或1M NaOH(从10M NaOH的原液制备的)以滴定缓冲液。在制备后，将所有缓冲液通过0.2mm PES瓶顶过滤器来进行过滤。在室温(～20-25℃)下进行所有pH和电导率的测量。
XS缓冲液：CEX平衡缓冲液–通过每升缓冲液添加0.57mL的冰醋酸和2.44g NaCl制备的具有21mM NaCl的10mM醋酸(HoAC)。终pH为5.3并且终电导率为3mS/cm。
CEX洗涤缓冲液–通过每升缓冲液添加19.5g的MOPS游离酸、1.5g的MOPS钠盐和1.28g NaCl制备的具有22mM NaCl的100mM MOPS。终pH为5.7-6.6(按需要)并且终电导率为3mS/cm。
CEX洗脱缓冲液–通过每升缓冲液添加19.5g的MOPS游离酸、1.5g的MOPS钠盐和6.93g NaCl制备的具有118mM NaCl的100mM MOPS。终pH为5.7-6.6(按需要)并且终电导率为12.4mS/cm。
CEX剥离缓冲液–通过每升缓冲液添加0.57mL的冰醋酸和175gNaCl制备的具有3M NaCl的10mM醋酸。终pH为5.3并且终电导率为188mS/cm。
裂解物制剂。使用200mM的pH4.5的醋酸(通过混合11.5mL的冰醋 酸/L的缓冲液制备的)调整裂解物的pH。使用1M NaOH将溶液滴定至终pH4.5。使用该溶液以避免因浓酸或强酸的低pH引起的局部沉淀。
用于这些实验的加载材料是来自2L分批补料生物反应器运行的提取物。使用20mM的pH7.0的Tris和添加的10mM EDTA从细胞沉淀提取产物。利用MilliQ水(通常地1:1-1.5的稀释度)将新鲜提取物稀释至为3mS/cm的电导率。将稀释的提取物在41mL等分中于-20℃冷冻。为了制备负载制剂，在室温下解冻等分，使用pH4.5的200mM醋酸将其滴定至pH5.3。当在滴定后需要时，通过添加MilliQ水进行电导率的小调整。最后，使用CEX平衡缓冲剂将负载制剂稀释2.5倍至～1.7g/L的浓度。将负载制剂通过0.8/0.2um滤器进行无菌过滤。在制备的同一天使用条件负载制剂。
宿主细胞蛋白质的测定。利用对于大肠杆菌表达系统是特异性的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(CN F410,Cygnus Technologies)测定宿主细胞蛋白质(HCP)水平。完全一样地进行与试剂盒一起提供的方案。使用样品稀释剂(CN I028,Cygnus Technologies)以最小的10倍稀释度稀释待测定HCP水平的样品。通常以2个稀释度运行样品，对于每一个稀释度以一式二份将其涂板。HCP的水平以百万分率(ppm)或ng-HCP/mg-产物来表示。
SDS-PAGE分析。对于利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的纯度分析，使用1mm×10孔、1mm×12孔或1mm×15孔NuPAGE4-12%BisTris凝胶(分别地CN NP0322Box和NP0323Box,Invitrogen)。电泳缓冲液为从20×浓度(CN NP0002,Invitrogen)制备的1×MES SDS电泳缓冲液。Novex sharp预染的蛋白质标准(CN57318,Invitrogen)用作分子量指示器。通过用MilliQ水稀释至30mL的终体积制备用于分析的样品，将10mL的4×十二烷基硫酸锂(LDS)(CN NP0008,Invitrogen)添加至为1×的终浓度。通过涡旋5秒混合样品。基于从A280/A320测量计算的蛋白质浓度，加载每孔3μg的靶。
wCEX。使用DionexWCX-104x250mm柱(产品编号054993)，使用10mM醋酸钠pH5.5(缓冲液A)和10mM醋酸钠pH5.5,250mMNaCl(缓冲液B)的流动相溶液以1.2mL/min的流速通过弱阳离子交换层析(wCEX)评价P05。在20分钟内进行从10%B至25%B的梯度。运行10分钟后，乙酰化种类最早洗脱出来。甲二磺酰化种类第二洗脱出来，随后在梯度的更后部分，完整P05在des-Ala种类之前约1.5至2.5分钟洗脱出来。
阳离子交换捕获层析。在AKTA Explorer100层析系统上进行层析。填充10mLXS柱。将材料以40mg P05/ml加载或可以以25-30mgP05/ml加载。层析法概述于表9中。在加载和洗脱步骤过程中使停留时间恒定地保持在2分钟。制备模拟洗脱混合物，测定产物回收、HCP水平和完整蛋白质的百分比。利用pH6.0的30%和35%的%B在10mL柱子上完成总共2个运行。
表9

洗涤#2导致主要由杂质组成的峰。利用30%和35%的B的洗脱#1导致超过95%的纯度的产物(通过SDS-PAGE分析)。洗涤#2的盐浓度可少量增加以除去洗脱峰上的肩。也参见图13至16。终产物混合物回收率大于50%，des-Ala种类的回收率小于10%，并且洗脱物中HCP的浓度小于600ppmHCP。
在2L培养制剂中，将250mLXS柱用于培养物层析，使用50mLPorosHQ阴离子柱，将220mL CHA(羟基磷灰石柱)用于进一步除去杂质。
在100L培养制剂中，将6.25L PorosXS柱用于捕获层析，将1L PorosHQ柱用于阴离子层析，将30L CHA羟基磷灰石柱用于进一步除去杂质。需要3个循环来处理整个100L的发酵罐。
在1000L培养制剂中，可将具有约50L至约80L，例如约60L或约70L 的体积的PorosXS柱用于捕获层析；可将具有约5L至约20L，例如约10L或约15L的体积的PorosHQ柱用于阴离子交换层析，将具有约250L至约500L，例如约300L或约400L的体积的的CHA羟基磷灰石柱用于进一步除去杂质。任选地，更小的柱子可用于以几个批次处理大发酵罐。
实施例10.纯化P04，在20℃于25%PEG1500、0.1M PCB(pH4.0)中生长衍射高质量晶体。蛋白质在空间群P212121中结晶，常见晶胞尺度为：a=44.5，b=46.4，c=64.8。晶体衍射成高分辨率，在先进光子源，光束线LS-CAT21ID-F(Chicago IL,USA)上收集扩展至的数据集组。使用整合来自PDB结构1ITB和1IRA的已知IL-1β和IL-1Ra结构的相关部分的模型，通过分子置换来解析P04的X射线结构(Vigers等人,(1997)Nature386：190-194和Schreuder等人,(1997)Nature386：194-200)。最终的模型被优化成17.6%/20.4%的R_work/R_free并且包含一个P04分子(140个残基)和98个水分子(表10)。P04个残基1-2、48-49和85-93在电子密度上是不可视的并且将在最终模型中消失。
表10


刮弧中的数字对应于最高分辨率壳
R_merge=∑_hkl[∑_i│I_i-<I>│/∑_iI_i]
R_work=∑_hkl F_obs│-│F_calc/∑_hkl│F_obs│，其中F_obs和F_calc被观察到，并且是计算的结构因子
从未用于优化的一个亚组的反射(5%)计算R_free。
P04晶体结构具有与通过建模预测的折叠相似的折叠。该结构的视图示于图1中。两个结构的重迭示于图12A中。对于IL-1β和IL-1Ra区段，相对于各自亲代分子上的相同残基，主链碳的RMSD为和P04具有至少一个独特的盐桥和两个独特的氢键，所述氢键参与来源于IL-1β的残基与来源于IL-1Ra的对应残基之间的相互作用：(i)Glu39-Lys64(来自IL-1RA的Glu39；来自IL-1β的Lys64)，如图12B中显示的，(ii)Arg9-Gln149(来自IL-1RA的Arg9；来自IL-1β的Gln149)，如图12C中显示的，和(iii)Ser152-Lys40(来自IL-1RA的Ser152；来自IL-1β的Lys50)，如图12C中显示的。这些独特的相互作用可解释P04的增加的热稳定性，因为这些相互作用在IL-1β和IL-1Ra结构中是不存的。参与这些相互作用的残基也存在于P03和P05(同样地具有增加的热稳定性的蛋白质)中。
实施例11.为了进一步纯化从细胞培养物产生的蛋白质，例如以帮助分离出产物相关种类，例如des-ALA、乙酰化和甲二磺酰化种类，例如，甲二磺酰化完整蛋白质，可使用额外的纯化步骤。这样的纯化步骤可以例如使用陶瓷羟基磷灰石柱(CHA)，将宿主细胞蛋白质(HCP)水平降至低于50ppm。CHA I型是基于电荷和/或钙离子协调分离生物分子的多峰层析介质。从Bio-RadLaboratories(CN732-4322)获得具有5mL的柱体积和40um的粒度的预装柱。
缓冲液制备。利用MilliQ水按体积制备所有缓冲液。所有缓冲液组分与提供商和目录信息概述于表11中。为了达到期望的pH，将10N HCl或1NNaOH(从10N NaOH的原液制备的)用于滴定缓冲液。制备后，将所有缓冲液通过0.2um PES瓶顶过滤器单位来进行过滤。在室温(～20-25℃)下进行所 有pH和电导率测量。
表11.缓冲液组分信息.

CHA缓冲液制备
CHA平衡和洗涤缓冲液–通过每升缓冲液添加1.18g的磷酸二氢钾、0.21g的磷酸氢二钾和0.79g NaCl来制备具有13.5mM NaCl的10mM磷酸钾。终pH为6.5并且终电导率为2.5mS/cm。
CHA洗脱缓冲液–通过每升缓冲液添加14.1g的磷酸二氢钾、9.8g的磷酸氢二钾来制备160mM磷酸钾。终pH为6.5并且终电导率为～18mS/cm.
CHA测试条/条件缓冲液–通过每升缓冲液添加19.2g的磷酸二氢钾和45.1g的磷酸氢二钾来制备400mM磷酸钾。终pH为6.8并且终电导率为～52mS/cm。
进料流制备。使用超滤(10,000kDa Hydrosart membrane,Sartorius-Stedim)将AEX流通液浓缩5倍。对这些实验不进行渗滤。浓缩后，使用10%醋酸(通过用MilliQ水将冰醋酸稀释10倍制备的)调整pH。使用MilliQ水调整电导率。
进料流制备。从在2L分批补料生物反应器实验中发酵的大肠杆菌提取这些实验的负载制剂材料。使用20mM的pH7.0的Tris(具有0.1%TritonX)和添加的10mM EDTA进行提取。利用MilliQ水(通常地1-1.5倍的稀释度)将新鲜提取物稀释至为3mS/cm的电导率，将其滴定至pH5.3以用于通过CEX进行纯化。将稀释的提取物通过0.8/0.2um2XLG滤器(CN5441307G4--OO,Sartorius-Stedim)进行无菌过滤。将裂解物加载至XS柱上，收集约12CV的洗脱物。使用2M Tris碱将洗脱物滴定至pH7.5，使用MilliQ水将其稀释至5mS/cm，随后加载至HQ柱上。将50mM Tris, 2M NaCl pH7.5缓冲液用于HQ柱层析。如上所述将HQ流通液混合物浓缩5倍，随后调整至pH6.5和2.5mS/cm。
通过A280/A320测量蛋白质浓度。通过使用分光光度计(NanoDrop2000,Thermo Scientific)，扣除320nm处的基线来测量280nm处的吸光度。通过下列公式计算浓度：
C=(A280-A320)&epsiv;l]]>
其中C是以mg/mL表示的浓度，A280和A320分别是280和320nm处的吸光度，e是蛋白质的消光系数(1AU-mL-mg^-1-cm^-1)，l是路径长度。在不进行稀释的情况下，2mL的等分经测量是纯净的。
宿主细胞蛋白质的测定。利用对于对于大肠杆菌表达系统是特异性的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(CN F410,Cygnus Technologies)测定宿主细胞蛋白质(HCP)水平。完全一样地进行与试剂盒一起提供方案。使用样品稀释剂(CN I028,Cygnus Technologies)稀释待测定HCP水平的样品。由于纯化的样品中HCP的水平较低，因此CHA洗脱物经测定是纯净的。通常在单个稀释度上测定样品，对于每一稀释度以一式两份将样品涂板。针对特定样品的常见稀释度概述于表12中。HCP的水平以百万分率(ppm)或ng-HCP/mg-P05表示。
表12.用于HCP ELISA的常用稀释度.

弱阳离子交换层析(wCEX)。使用设置至5℃的温度受控自动注射室和利用在280nm收集的数据的PDA检测器，在Agilent1260HPLC或BioInert系统上进行分析性wCEX分析。流动相A是pH5.5的10mM醋酸钠。流动相B是pH5.5的添加有250mM NaCl的10mM醋酸钠。将约10-50μg的产物注射至Dionex ProPac WCX-10柱(CN054993,Dionex Corporation)上。以1.2mL/min的速度运行柱子。完整的P05在约16min洗脱出来。des-ALA种类在约18min分钟洗脱出来，甲二磺酰化种类在约14min洗脱出来，acP05在约9min洗脱出来。
大小排阻层析(SEC)。使用设置至5℃的温度受控自动注射室和利用在214nm和280nm收集的数据的PDA检测器，在Agilent1200Bio-inert HPLC系统上进行分析性SEC分析。流动相是从10×PBS原液(CN BP3994,Fisher)的稀释制备的1×PBS。将约10-50μg的产物注射至Zenix SEC-150(CN213150-7820,Sepax)上。以1mL/min的速度运行柱子。P05单体在约5.2min洗脱出来。更高等级的分子量种类在3.7-4.9min洗脱出来。
CHA柱的当前运行条件。注意：由于用于发展的较小的柱体积(5mL)和相对大的层析系统体积，可能在按比例放大过程中必需调整体积。CHA柱的当前运行条件概述于表13中。以2min的停留时间(2.5mL/min)和在室温下进行所有步骤。靶向15mg-P05/mL-柱的加载。在2CV级分中收集洗脱峰，在制备最终的洗脱混合物之前通过A280/A320、wCEX、SEC和HCPELISA测定所述洗脱峰。
表13.用于CHA的层析方法。

陶瓷羟基磷灰石(CHA)层析的概述。CHA层析的概述提供于表14中。使用PorosXS(一种耐受盐的强阳离子交换树脂)通过阳离子交换层析捕获产物。对PorosXS洗脱物进行条件化，以流通模式将其加至PorosHQ上。将产物收集在通过柱子的级分中。可通过超滤/渗滤或稀释/滴定将流通级分调整 至pH6.5和2.5mS/cm。随后将产物流加载至CHA柱上，利用来自10-90%B的20CV梯度进行洗脱。在梯度洗脱过程中，收集级分，通过wCEX进行分析，以在最终混合之前测定杂质和产物相关种类的水平。进一步发展将包括结合能力及其对分辨率的影响，以及负载制剂中产物相关种类的升高的水平对分辨率的影响的研究。还可评价更大规模的CHA柱(～150mL)以确保可扩缩性。
表14.CHA层析的概述

实施例12.如下进行100L运行，从而表达和纯化P05。
(A)按照实施例9在100L生物反应器中进行的发酵导致4.45g/L x103.2L=459.2g的P05蛋白产生。
(B)通过XS阳离子交换柱[Poros XS19.9cm床x20cmID(6.25L)]进行的3个循环，随后进行的洗脱导致下列P05的捕获：
第一循环：97.8L x1.41g/L=137.9g
第二循环：105L x1.28g/L=134.4g
第三循环：102L x1.42g/L=144.8g
总计P05负载制剂=417.1g(90.8%)
XS+洗脱混合物的3个循环：187.5L x1.82g/L=341.2g P05
XS%P05回收率=(341.2/417.1)x100=81.8%
(C)通过HQ阴离子交换柱[Poros HQ13.0cm床x10cmID(1.02L)]进行的2个循环；随后进行HQ Flowthrough和HQ的两个额外循环导致下列P05的捕获:
第一循环：210L x0.725g/L=152.5g
第二循环：200L x0.725g/L=145.0g；总的P05负载制剂=297.5g
HQ Flowthrough
第一循环：210L x0.713g/L=149.7g
第二循环：200L x0.71g/L=142.0g；总的P05负载制剂=291.7g
HQ%P05回收率=(291.7/297.5)x100=98.1%
(D)羟基磷灰石(CHA)柱[羟基磷灰石1型40μm19.2cm床x44.6cmID(30.0L)]负载制剂和洗脱导致下列P05的捕获:
负载制剂1：460L x0.33g/L=151.8g
负载制剂2：420L x0.32g/L=134.4g；总的P05负载制剂=286.2g
洗脱混合物：285L x0.95g/L=270.75g
羟基磷灰石%P05回收率=(270.75/286.2)x100=94.6%
(E)洗脱的P05的超滤/渗滤导致下列P05的捕获:
负载制剂285L x0.95g/L=270.75g
渗余物：3.96L x65.3g/L=258.6g%回收率=(258.6/270.75)x100=95.5%
超滤/渗滤缓冲液是pH为6.5的10mM磷酸钠和5%山梨醇。
(F)使用10%Lutrol的缓冲液；和10mM磷酸钠、5%山梨醇以及0.1%Lutrol，pH6.5进行递送。
终产物混合回收率大于70%，洗脱物中des-Ala种类少于10%，HCP少于50ppm。
实施例13.
P05的分批补料发酵法。在具有Biostat A+控制器和1.6L工作体积的Sartorius2L Univessel生物反应器中进行分批补料培养。将生物反应器在121℃高压灭菌60分钟，高压灭菌后使用无菌瓶和管道焊接器添加分批培养基。
分批培养基由具有非动物大豆胨(Teknova)的Terrific液体培养基(补充有10g/L葡萄糖和2mM硫酸镁)组成。使用0.2μm PES膜过滤器将该溶液过滤。通过在生物安全柜中将成等分的无菌浓缩原液添加至过滤的Terrific液体培养基来获得补充剂的终浓度：0.08g/L止泡剂204(Sigma)、0.1mMEDTA(Caliber)、50mg/L硫酸卡那霉素(Teknova)和1mL/L微量元素溶液(1000X微量元素,Teknova)。微量元素溶液包含50mM氯化铁、20mM氯化钙、10mM氯化锰、10mM氯化锌、2mM氯化钴、2mM氯化铜、2mM氯化镍、2mM钼酸钠、2mM亚硒酸钠和2mM硼酸。
在37℃和pH7.0±0.05下进行分批补料培养。使用上限85%的磷酸(Amresco)和下限28%的氢氧化铵(Ricca)调整pH。利用止泡剂204溶液(Sigma)控制泡沫。将气流和初始搅拌速率分别设置在1.25v/v/m和200rpm。使用达800rpm的高落搅拌和富氧鼓风以30%的饱和度控制溶解氧张力。
一旦初始葡萄糖水平(10g/L)被耗尽并且观察到pH和溶解氧的的快速增加，开始进料。进料培养基由具有非动物大豆胨(Teknova)的Terrific液体培养基(补充有400g/L葡萄糖(Sigma)和30mM硫酸镁(Sigma))组成。初始进料速度为约0.6mL/min。(9g葡萄糖/L/小时)。诱导培养物后4小时，将进料速度降至约0.4mL/min(6g葡萄糖/L/小时)以避免葡萄糖积累。
一旦达到为35–40的OD₆₀₀，通过注射器用1mM异丙基B-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG,Applied Biosystems)诱导培养物。在6小时的诱导后，收获培养物。
每小时对培养物采样以测定下列参数：离线pH(Orion4Star pH计,Thermo Scientific)、OD₆₀₀(Ultrospec2100Pro,Amersham Biosciences)、葡萄糖和乳酸盐浓度(YSI7100,YSI Life Sciences)、产物浓度(浓度使用SDS-PAGE凝胶的光密度测定法),10mL样品(用于分析性wCEX)和1mL样品(用于细胞湿重和干重量)。对于细胞湿重和干重样品，将1mL的培养物在预称重的微量离心管中以14,000g旋转2分钟以进行沉淀(MiniSpin Plus centrifuge,Eppendorf)。弃去上清液，将沉淀在1mL1.25X磷酸缓冲盐溶液(PBS,Calbiochem)中洗涤2次。随后将沉淀和管称重，测定细胞湿重。随后将管在65℃干燥至少48小时。再次对沉淀和管称重，测定细胞干重。
在摇瓶实验中生长和表达表达不同IL-1β/IL-1Ra杂交体的细菌菌株。对于最优化生长条件，所有5个菌株都显示相似的生产率。在基于细胞的活性测定中，P05以12pM的对IL-1R1受体的Kd显示最大活性，比仅次于其的杂交分子强一个数量级(参见表15)。虽然P01和P02分子也显示良好的活性，但发现它们是不溶性的并且在提取后存在于包涵体中。P03至P05产物存在于可溶性级分中。由于这3种杂交分子的增强的生产容易性，集中对P03至P05进行初始稳定性研究。
表15：不同杂交分子的活性和稳定性的比较
杂交分子Kd(pM)Tm(℃)P01470P02640P0329065P04170060P051265IL-1β200056IL-1Ra330
使用定量PCR仪(Agilent)通过差示扫描荧光测定法测定这3种可溶性杂交分子的解链温度，将其示于表15中。所有3种杂交分子具有高于IL-1Ra的解链温度，但P03和P04具有65℃的最高解链温度。
通过发酵法的发展进行的产物相关种类的减少。为了测定碳源对P05蛋白质量的影响，进行一式两份2L分批补料实验。在每一个实验中，一个反应器包含10g/L的基础培养基中的葡萄糖和400g/L的上述进料培养中的葡萄糖，并且一个反应器包含10g/L的基础培养基中的甘油(Fisher Scientific)和400g/L的进料培养基中的甘油。虽然两个反应器之间的细胞生长的差异不显著(参见表16)，但含甘油的发酵物产生比含葡萄糖的发酵物更少的P05(5.4g/L，而非7.0g/L)。使用甘油产生的材料包含更大百分比的乙酰化种类(14.7%的总蛋白质，而非对照反应器中的8.9%)，以及更大百分比的des-Ala种类(17.3%的总蛋白质，而非对照反应器中的13.4%)。由于还观察到含甘油发酵物使用增加的氧气的事实，因此假设这些培养物中产物的增加的乙酰化可由缺氧或一些其它应激条件引起。从而确认葡萄糖为用于P05发酵的优良碳源。
高温、微碱性环境(pH7.5–9)和Mn²⁺(作为催化剂)的存在全都增加氨肽酶-P的酶促活性。进行几个实验来研究使用对于氨肽酶-P活性不太有利的培养条件的益处。在32℃进行摇瓶实验，但观察到相较于对照培养瓶生产率的显著减小。该特征，除了技术转移和按比例放大中增加的处理时间和添加的复杂性以外，还使得该方法能够改善不期望的P05蛋白质质量。
通过发酵法的发展进行的产物相关种类的减少。为了测定培养pH对P05蛋白质质量的影响，在pH6.8±0.05进行2L分批补料发酵。虽然des-Ala种类的百分比在控制在pH6.8的发酵物中更低(6.9%的总蛋白质，而非对照反应器中 的13.4%)，但在更低pH的细胞生长和生产率在对照发酵物显著更低(参见表16)。大于40%的生产率的损失使得该方法能够改善不期望的P05蛋白质量。
收获、提取和澄清。收获后，将培养物分成5个相等的300–320mL的体积，以6000g(具有GS-3转子的Sorvall RC5C Plus离心机,Dupont)在4℃旋转20分钟。如果不立即提取，则将冷冻的沉淀于-80℃冷冻。为了提取产物，将沉淀重悬浮于由20mM Tris碱(Fisher)、0.1%Triton X-100(Fisher)和10mMEDTA(Caliber)，pH7.0组成的裂解缓冲液。随后将细胞沉淀以18,000psi通过微射流机(M-110P microfluidizer,Microfluidics)3次。随后将溶液在4℃以6000g离心20分钟。如果不立即澄清，则将提取物于-20℃冷冻。
表16：通过不同2L分批补料发酵产生的材料的生长、生产率和蛋白质质量数据

具体地配制不包含氯化锰的微量元素溶液(1000X微量元素–MnCl₂,Teknova)。在2L分批补料发酵中评价该溶液的使用。如在利用更低pH的实验中看到的，通过除去氯化锰来负面地影响细胞生长和生产率(参见表16)。虽然des-Ala种类的百分比下降(4.8%的总蛋白质，而非对照反应器中的13.4%)，但乙酰化和甲二磺酰化种类的百分比分别增加超过1%和5%。为了减小所有基于金属的酶促活性，研究在基础培养基中使用EDTA的情况。进行研究在基础培养基中使用0–0.8mM EDTA的摇瓶实验。增加EDTA的基线浓度对生长没有负面影响。终OD₆₀₀值增加。观察到生产率略微减小，但完整产生种类的相对百分比显著增加(参见表17)。例如，0.4mM EDTA至基 础培养基的添加使des-Ala种类的相对百分比从6.3%降至2.5%。
表17：通过包含不同浓度的EDTA的摇瓶产生的材料的生长、生产率和蛋白质质量数据.
EDTA浓度终OD₆₀₀生产率完整%Des-Ala%0mM11.30.78g/L93.7%6.3%0.05mM11.70.73g/L96.2%3.8%0.2mM12.40.71g/L97.1%2.9%0.4mM12.50.71g/L97.5%2.5%0.8mM12.70.71g/L97.1%2.9%
基于这些小规模实验，在2L分批补料发酵中测试0.1mM、0.2mM和0.4mM的EDTA浓度。如在摇瓶研究中看到的，含EDTA发酵物生长至略微更高的终OD₆₀₀值(参见表16)。生产率得以维持或略微提高。含0.1mMEDTA的培养物例如生长至150的终OD₆₀₀，29g/L的细胞干重和产生8g/L的P05(分别相较于对照培养物的140OD₆₀₀,28g/L,和7g/L)。虽然产生的des-Ala种类的百分比随EDTA的浓度增加而下降，但乙酰化种类的百分比增加。甲二磺酰化种类的百分比在所有含EDTA的发酵物也更大(6.0–6.1%，相较于对照培养物的2.6%)。0.1mM EDTA的条件被确定为减少不期望的产物相关种类的最有效的发酵策略。虽然乙酰化和甲二磺酰化种类的百分比大于对照培养物中的所述百分比，但0.1mM EDTA至基础培养基的添加有效地减少des-Ala种类，而对生长和按比例放大考虑几乎无影响，同时增加总体生产率。
发酵法的按比例放大。将内部开发的分批补料发酵法技术转移至CMO(FujiFilm Diosynth Biotechnologies,Billingham,UK)。在具有DCU2控制器和3L工作体积的5L B.Braun Biostat ED生物反应器中进行技术转移分批补料发酵。随后将内部GMP-适应的Terrific液体培养基和微量元素溶液用于将来的发酵，发现其在性能上等同于研究培养基制剂。在具有DCU-3控制器，使用100L的工作体积的100L B.Braun D生物反应器中进行终100L级的方法。
在进行柱层析后从2L和100L反应物进行的蛋白质回收分别描述于实施例14和15中。层析步骤包括使用捕获P05蛋白的PorosXS阳离子交换柱、阴离子交换柱和进一步从P05制剂纯化杂质的陶瓷羟基磷灰石(CHA)柱。
对于PorosXS捕获步骤，通过将来自100L发酵物的负载大肠杆菌裂解物的pH/电导率调整至pH5.3，随后以15,000xg离心30分钟来进行负载制剂的制备。离心后，在30英寸0.8/0.45μm过滤器上，随后在30英寸0.45/0.2μm过滤器上分批过滤过程流。其它方法开发努力已研究了负载制剂制备过程中在5.3-5.9的pH范围内的调整。当加载至40mg-蛋白质/mL-树脂时，捕获柱的产物容量未受影响。P05的乙酰化和甲二磺酰化形式的减少随负载制剂的pH增加而增大。des-Ala的析出随着pH增加而减少，但仍然在可接受的水平上。
如下开发用于陶瓷羟基磷灰石(CHA)柱的洗脱条件。洗脱条件包括20CV梯度，使得必需在随后下游过程中处理大体积，即超滤和渗滤。调查各种参数以在产物回收、低洗脱体积和产物种类的析出方面最优化CHA柱的洗脱。改进的梯度/步骤组合被开发来减少CHA I型柱的洗脱体积。简而言之，进行从10mM磷酸盐至32-64mM磷酸盐的5CV梯度，随后进行至160mM磷酸盐的阶梯。在5CV梯度过程中，富集洗脱级分的P05的甲二磺酰化和des-Ala形式。按照期望的产物特征谱(即<1%的甲二磺酰化，<4%的des-ALA)富集在至160mM磷酸盐的阶梯过程中获得的洗脱混合物的P05。进行完全因子试验来描述该过程的运行窗口。研究6.2至6.8的pH值和上文中指出的5CV梯度过程的磷酸盐浓度的范围。在产物相关种类减少、过程相关杂质减少(HCP)和产物回收方面在该窗口内观察到强劲的运行。将该窗口内的最佳条件按比例变成12mL柱来显示～2倍的按比例放大。此外，在最佳条件下研究利用升高的水平的P05的des-ALA和甲二磺酰化形式的攻击负载制剂。洗脱特征谱表现相似。
实施例14.如上文中实施例13中所述，进行2个2L培养反应以表达和纯化P05。
结果如下
(A)按照实施例13的2L生物反应器中的发酵导致以下列百分比存在的蛋白质的收获:

(B)通过XS阳离子交换柱[235mL的体积]，随后通过洗脱从收获的蛋白质捕获P05，这导致以下列百分比存在的蛋白质收集：

(C)通过HQ阴离子交换柱[50mL的体积]处理来自PorosXS收集的蛋白质，这产生以下列百分比存在的蛋白质：

注意：阴离子交换柱的主要目的是除去DNA、内毒素和HCP(宿主细胞蛋白质)。
(D)通过羟基磷灰石(CHA)柱[羟基磷灰石1型，体积220mL]处理来自Poros HQ收集的蛋白质，这产生以下列浓度存在的蛋白质：


(E)将来自CHA柱的蛋白质经历超滤/渗滤，这产生以下列浓度存在的蛋白质：

注意：超滤/渗滤步骤的主要目的是交换缓冲液和浓缩蛋白质：
第一运行 第二运行
在步骤(A)至(E)后
总的P05回收率: 60% 63%
实施例15.
如上文中实施例13中所述进行2个100L的运行以表达和纯化P05。在R&D(研究和开发)条件下进行第一运行，和在GMP(质生产规范)条件下进行第二运行。
结果如下
(A)按照实施例13的100L生物反应器中的发酵导致以如下百分比存在的蛋白质的收获：:

(B)通过XS阳离子交换柱[6.25L的体积]，随后通过洗脱从收获的蛋白质捕获P05，这导致以下列百分比存在的蛋白质收集：：


(C)通过HQ阴离子交换柱[1L的体积]处理来自PorosXS收集的蛋白质，这产生以下列百分比存在的蛋白质：

(D)通过羟基磷灰石(CHA)柱[羟基磷灰石1型，体积30L)处理来自PorosHQ收集的蛋白质，这产生以下列百分比存在的蛋白质混合物：

(E)将来自CHA柱的蛋白质经历超滤/渗滤，这产生以下列百分比存在的蛋白质：

注意：超滤/渗滤步骤的主要目的是交换缓冲液和浓缩蛋白质。
第一运行 第二运行
在步骤(A)至(E)后
总的P05回收率: 65% 54%
其它实施方案在下列权利要求的范围内。