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1、10申请公布号CN104164474A43申请公布日20141126CN104164474A21申请号201310182694022申请日20130517C12Q1/68200601G01N21/6420060171申请人刘代新地址215101江苏省苏州市吴中区木渎镇金枫南路198号同济大学苏州研究院2号楼4楼72发明人刘代新何胜祥54发明名称一种检测尿液中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒57摘要本发明涉及了一种用于检测尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PGR法及其诊断试剂盒。该方法指首先跨内含子设计PCA3和PSA的特异性的引物和TAQMAN荧光。
2、探针，2个探针使用不同的荧光染料进行标记，可以在同一反应液中进行扩增和检测，然后利用含PCA3和PSA特异性扩增片段的体外转录RNA定量标准品制作标准曲线，对尿液样本中PCA3和PSAMRNA分别进行定量，最后通过对比PCA3基因和PSA基因表达量，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。该诊断试剂盒包括PCA3/PSAPCR反应液、PCA3/PSARNA阳性对照、阴性对照、4种已知浓度的PCA3/PSARNA定量标准品。本发明为临床利用尿液样本进行前列腺癌早期筛查提供了一种新的方法。51INTCL权利要求书1页说明书5页19。
3、中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104164474ACN104164474A1/1页21一种用于检测尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法，其特征在于为避免PCA3和PSA基因组DNA的干扰，首先跨内含子设计PCA3和PSA的特异性的引物和TAQMAN荧光探针，2个探针使用不同的荧光染料进行标记，可以在同一反应液中进行扩增和检测，同时加入内参检测引物和探针对样本处理和PCR扩增进行全程监控。然后利用含PCA3和PSA特异性扩增片段的体外转录RNA定量标准品制作标准曲线，对尿液样本中PCA3和PSAMRNA分别进行定量。最。
4、后通过对比PCA3基因和PSA基因表达量，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。2如权利1所述，PCA3MRNA检测所用的引物和探针为上游引物PCA3F序列为5GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA3；下游引物PCA3R序列为5GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA3；荧光探针PCA3P序列为5TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA3，5端标记FAM荧光报告基团，3端标记BHQ1荧光淬灭基团。3如权利1所述，PSAMRNA检测所用的引物和探针为上游引物PSAF序列为5GTCTGCGGCGGTGTTCT。
5、G3；下游引物PSAR序列为5GCTGTGGCTGACCTGAAATACC3；荧光探针PSAP序列为5CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC3，5端标记HEX荧光报告基团，3端标记BHQ1荧光淬灭基团。4如权利1所述，内参基因检测所用的引物和探针为上游引物ICF序列为5TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT3；下游引物ICR序列为5TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA3；荧光探针ICP序列为5ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC3，5端标记ROX荧光报告基团，3端标记BHQ2荧光淬灭基团。5如权利1所述，PCA3标准品中含的特异性扩增片段为GAGAAGCTG。
6、GCATCAGAAAAACAGAGGGGAGATTTGTGTGGCTGCAGCCGAGGGAGACCAGGAAGATCTGCATGGTGGGAAGGACCTGATGATACAGAGGTGAGAAATAAGAAAGGCTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCACACATCTGCTGAAATGGAGATAATTAACATCACTAGAAACAGCAAGATGACAATATAATGTCTAAGTAGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAATC。6如权利1所述，PSA标准品中含的特异性扩增片段为GGGCAGTCTGCGGCGGTGT。
7、TCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCC。7一种PCA3和PSAMRNA核酸荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括PCA3/PSAPCR反应液、PCA3/PSARNA阳性对照、阴性对照、4种已知浓度的PCA3/PSARNA定量标准品。8如权利7所述，PCA3/PSAPCR反应液各成分的终浓度为1X的反转录PCR缓冲液、4MM的MGCL2、04MM的DNTP、2U的TAQDNA。
8、聚合酶、2U的AMV逆转录酶、200NM的PCA3F、200NM的PCA3R、150NM的PCA3P、200NM的PSAF、200NM的PSAR、200NM的PSAP、100NM的ICF、100NM的ICR和100NM的ICP。权利要求书CN104164474A1/5页3一种检测尿液中PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒技术领域0001本发明涉及生物医药及体外诊断试剂领域，具体涉及检测尿液样本中前列腺癌组织表达基因PCA3基因和PSA基因表达量的荧光定量PCR法及其诊断试剂盒。背景技术0002前列腺癌PROSTATECARCINOMA，PCA是男性常见的恶性肿瘤之一，。
9、除少数病例外；其生长大多比较缓慢，潜伏期较长，有些甚至终生不被发现。许多患者早期没有任何主观不适，等出现临床症状时已至疾病晚期，从而错过了最佳治疗时机。临床上探寻前列腺癌的早期诊断方法，一直是研究的热点。因此，开发早期诊断前列腺癌的试剂盒有重要的临床价值。目前血清前列腺特异性抗原PSA是临床应用最广泛的前列腺肿瘤标记物，PSA敏感度高，但特异度较低，由此导致临床前列腺穿刺活检阴性几率较高，以及多次前列腺重复穿刺活检、过度诊断和过度医疗等问题。因此人们不断寻找敏感性高，特异性强的检测项目。0003PCA3PROSTATECANCERANTIGEN3是1999年BUSSEMAKERS等应用差异显示。
10、分析方法，通过比较前列腺癌组织和正常前列腺组织的MRNA表达谱时发现的一种前列腺癌特异性基因。PCA3基因位于9号染色体长臂2区1带到2带，全长25000BP，含有4个外显子和3个内含子，具有很高的组织特异性和癌特异性，在癌变的前列腺细胞中表达量很高，具有较高的敏感性和特异性，是最新发现的前列腺癌早期诊断筛查和对治疗后的患者进行有效的监测的标记物。HESSELS等应用RTPCR法证实，PCA3基因高度表达于前列腺癌组织，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中仅有少数表达或不表达，在其他肿瘤组织及器官中无表达，现已成为一种较有应用前景的前列腺癌标记物，它较之单一检测PSA水平筛查前列腺癌具有更高的效。
11、能。0004各种研究认为PCA3基因序列中含有高密度的终止密码子，因而PCA3表达非编码的MRNA，而不产生相应的蛋白质。因此，目前检测PCA3的主要方法都是检测PCA3MRNA。研究还发现PCA组中PCA3MRNA和PSAMRNA含量显著高于前列腺增生组，PCA3MRNA和PSAMRNA可作为PCA诊断的良好标志。PSAMRNA诊断PCA的敏感度高于PCA3MRNA，但特异度较之低，可能是由于PSAMRNA在肿瘤细胞中的表达量高于PCA3MRNA，而PCA3MRNA高度特异性地表达于PCA细胞。因此，若将PCA3MRNA和PSAMRNA联合检测，则可相互弥补PCA3MRNA敏感度低和PSAM。
12、RNA特异性低的不足，从而大大提高对早期PCA的诊断效能。临床评估证明PCA3在前列腺癌的诊断过程中能与PSA检测结合，有效排除前列腺体积、炎症等干扰因素，显著提高前列腺癌的早期诊断价值。PCA3分数PCA3MRNA表达量/PSAMRNA表达量。慢性前列腺炎、前列腺体积、PSA水平对PCA3分数没有影响。在世界多个地区、国家的人群多样本研究中表明，PCA3分数可以有效预测穿刺阳性活检率。0005目前有3种针对PCA3的诊断技术，第一种是以荧光定量PCR技术定量检测PCA3MRNA的表达；第二种是UPM3技术，是由BOSTWICK实验室发展的基于核苷酸序列扩增的检验方法；第三种是GENPROBE。
13、公司以APTIMA技术为基础开发分子诊断试剂盒，为目前唯一说明书CN104164474A2/5页4的商业化试剂盒。国内外各种研究表明，利用荧光定量RTPCR建立的PCA3评分方法，方法简便、特异且重复性好，为临床应用提供了一种新方法。0006本发明应用TAQMAN荧光探针技术定量检测尿液样本中PCA3基因和PSA基因的MRNA的表达，然后通过对比两种基因的表达，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。发明内容0007本发明的目的提供一种可以同时对尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量定量检测体外诊断试剂盒。0008本发明的另。
14、一目的在于建立一种对尿液样本中PCA3基因和PSA基因表达量荧光定量PCR检测方法，通过对比PCA3基因和PSA基因表达量，建立PCA3评分标准，PCA3分数可以协助临床医生判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。0009所述的PCA3/PSAMRNA荧光定量PCR检测试剂盒包括PCA3/PSAPCR反应液、PCA3/PSARNA阳性对照、阴性对照、4种已知浓度的PCA3/PSARNA定量标准品。0010所述的PCA3/PSAPCR反应液包括反转录PCR缓冲液、MGCL2、DNTP、AMV逆转录酶、TAQDNA聚合酶、PCA3基因上游引物PCA3F、PCA3基因下游引物PCA。
15、3R、PCA3基因荧光探针PCA3PPSA基因上游引物PSAF、PSA基因下游引物PSAR、PSA基因荧光探针PSAP、内参基因上游引物ICF、内参基因下游引物ICR和内参基因荧光探针ICP。0011所述PCA3/PSAPCR反应液各成分的终浓度为1X的反转录PCR缓冲液、4MM的MGCL2、04MM的DNTP、2U的TAQDNA聚合酶、2U的AMV逆转录酶、200NM的PCA3F、200NM的PCA3R、150NM的PCA3P、200NM的PSAF、200NM的PSAR、200NM的PSAP、100NM的ICF、100NM的ICR和100NM的ICP。0012所述的PCA3F序列为00135。
16、GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA3；0014所述的PCA3R序列为00155GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA3；0016所述的PCA3P序列为00175TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA3；0018所述的PSAF序列为00195GTCTGCGGCGGTGTTCTG3；0020所述的PSAR序列为00215GCTGTGGCTGACCTGAAATACC3；0022所述的PSAP序列为00235CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC3；0024所述的ICF序列为00255TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT3；0026所述的ICR序列为0027。
17、5TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA3；说明书CN104164474A3/5页50028所述的ICP序列为00295ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC3；0030其中PCA3P的5端标记FAM荧光报告基团，3端标记BHQ1荧光淬灭基团；PSAP的5端标记HEX荧光报告基团，3端标记BHQ1荧光淬灭基团；ICP的5端标记ROX荧光报告基团，3端标记BHQ2荧光淬灭基团。0031所述的PCA3/PSARNA阳性对照为含靶序列的PCA3体外转录的RNA与含靶序列的PSA体外转录的RNA的等比例混合物。0032所述的阴性对照为DEPC处理水。0033所述的4种已知浓度的PCA。
18、3/PSARNA定量标准品为含靶序列的PCA3体外转录的RNA与含靶序列的PSA体外转录的RNA的等比例混合物，浓度从高到底依次为107拷贝/ML、106拷贝/ML、105拷贝/ML和104拷贝/ML。0034本发明中试剂盒的原理为首先为避免PCA3和PSA基因组DNA的干扰，跨内含子设计PCA3和PSA的特异性的引物和TAQMAN荧光探针，2个探针使用不同的荧光染料进行标记，可以在同一反应液中进行扩增和检测。TAQMAN技术是由美国PERKINELMERPE公司研制的一种实时PCR技术，它在一条20多BP的寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团R和淬灭基团Q，在PCR反应中设立标准品模板系。
19、列和阴性对照，根据FRET原理，探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当PCR扩增时，TAQ酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，并计算出RN值、RN值、CT值和阈值。CT值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的CT值，就可以确定样品的起初模板量。根据不用的荧光标记，仪器可以识别不同的荧光信号，达到分开检测的目的，常用的荧光基团是FAM、JOE、HEX和ROX。
20、。在整个扩增中有2个酶起到重要作用，AMV反转录酶负责把MRNA反转录为CDNA，TAQ酶负责PCR扩增。跨内含子设计的引物可以避免基因组DNA的干扰，荧光探针可以使2种产物在一个反应管中同时检测到。通过自制的标准品制作标准曲线，分别对PCA3MRNA和PSAMRNA进行定量，然后就可以得到PCA3分数PCA3分数PCA3MRNA表达量/PSAMRNA表达量，根据PCA3分数临床医生可以判断患者得前列腺癌的可能性，有效预测前列腺穿刺阳性活检率。具体实施方式0035下列实施是旨在举例说明，而不是限制本发明。0036实施例1本发明试剂盒的使用方法00371产品名称PCA3/PSAMRNA定量检测试。
21、剂盒PCR荧光探针法00382预期用途用于男性尿液样本中PCA3和PSAMRNA的表达量进行定量检测，通过计算PCA3和PSAMRNA的比值，确定PCA3分数，为前列腺癌的早期诊断提供依据，为预测前列腺活检阳性率提供参考。00393试剂盒组成成分2管PCA3/PSAPCR反应液11ML/管、1管PCA3/PSARNA阳性对照200UL/管、1管阴性对照300UL/管、1管PCA3/PSARNA定量标准品1200UL/管、1管PCA3/PSARNA定量标准品2200UL/管、1管PCA3/PSARNA定量标准品3200UL/说明书CN104164474A4/5页6管、1管PCA3/PSARNA定。
22、量标准品4200UL/管和1份产品说明书。00404样本的采集、保存和运输004141样本采集取当日第一次晨尿，不少于50ML。004242样本的保存和运输保存于48，48H内检测。样本长距离运输采用泡沫盒加冰袋，3H内送达实验室。00435样本处理取15ML尿液，使用商品化的总RNA提取试剂盒抽提RNA。00446试剂准备若样本数为N，准备N6个PCR管，每管分装45UL的PCA3/PSAPCR反应液，其中6指1份阳性对照、1份阴性对照和4份定量标准品。00457加样向分装的PCR反应液中依次分别加入5UL的阴性对照、抽提的RNA样本、阳性对照和定量标准品。00468上机使用ABI7500。。
23、004781样品设置根据样本类型设置样本编号、阴性对照、阳性对照和定量标准品包括其浓度值。004882荧光通道选择每个样品选择FAM、ROX和JOE3个通道。参比荧光PASSIVEREFERENCE设置为NONE。004983反应条件设定0050005184反应体积设定50L。005285保存文件，运行程序。00539结果分析0054ABI7500荧光PCR仪将BASELINE设为315根据实际情况，BASELINECYCLER可在一定范围内变化，荧光阈值THRESHOLD设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线无规则的噪音线的最高点，且CT值显示为UNDET。FAM荧光通道检测的PCA3M。
24、RNA，JOE荧光通道检测PSAMRNA，ROX检测的是内参基因人的珠蛋白基因MRNA。使用仪器配套软件自动分析结果，同时自动生成PCA3和PSAMRNA定量标准曲线，得出阳性样本中PCA3和PSAMRNA的表达量。通过对比两种基因的表达量，得到PCA3评分，根据说明书提供的或者医生科室自建的参考值范围判断患者得前列腺癌的可能性，预测前列腺穿刺阳性活检率。005510质量控制说明书CN104164474A5/5页70056101阴性对照无明显S型扩增曲线，且CT显示为UNDET。0057102阳性对照FAM和JOE通道均有典型的S型阳性扩增曲线，且CT值32。0058103上述两个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。说明书CN104164474A。