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1、10申请公布号CN104178562A43申请公布日20141203CN104178562A21申请号201410213413822申请日20140520201310189964020130521CNC12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人生物梅里埃股份公司地址法国马赛埃托勒72发明人孟夏徐清华叶迅刘芳吴非74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡54发明名称一种大肠癌预后试剂盒57摘要本发明公开了一种大肠癌预后试剂盒，它包括检测如下5个基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的相关试剂BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SE。
2、QIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。本发明还公开了检测上述5种基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的试剂在制备大肠癌预后试剂中的用途。本发明试剂盒可以对大肠癌患者进行准确预后，临床应用前景良好。66本国优先权数据51INTCL权利要求书4页说明书14页序列表32页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书14页序列表32页附图2页10申请公布号CN104178562。
3、ACN104178562A1/4页21一种大肠癌预后试剂盒，其特征在于它包括检测如下5个基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的相关试剂BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。2根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是MRNA的量的试剂。3根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为检测与所述MRNA互补的CD。
4、NA的量的试剂。4根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为检测与所述CDNA互补的CRNA的量的试剂。5根据权利要求24任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为探针。6根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。7根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。8检测如下5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达水平的相关试剂在制备大肠癌预后试剂盒中的用途BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQ。
5、IDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。9根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是MRNA的量的试剂。10根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述试剂为检测与所述MRNA互补的CDNA的量的试剂。11根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述试剂为检测与所述CDNA互补的CRNA的量的试剂。12根据权利要求911任意一项所述用途，其特征在于所述试剂为探针。13根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。14根据权利要求13所述的用途，其特征在于。
6、所述试剂为抗体或者亲和性蛋白。15一种检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的方法，包括1测定受试者血样的基因组中任意一个或者任意多个基因转录的RNA的水平，所述基因组包括如下基因BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示；2检测受试者血样中的基因表达。16根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1是测定基因组中5个基因转录的RNA的水平。17根据权。
7、利要求15所述的方法，其特征在于所述样本是大肠癌患者的血液样本。18根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1使用至少一个寡核苷酸。权利要求书CN104178562A2/4页319根据权利要求18所述的方法，其特征在于其中，一个寡核苷酸仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交。20根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述步骤1包括如下步骤A、扩增所述基因转录的RNA，得扩增产物；B、使用至少一个引物检测步骤A所得扩增产物的量。21根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述步骤1包括如下步骤、用至少一个探针与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交，。
8、得杂交产物；、检测步骤所得杂交产物的量。22根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1包括扩增所述基因转录的RNA的方法。23根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1包括检测所述基因转录的RNA互补的CDNA的量的方法。24根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1至少使用一个探针。25根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述步骤1至少使用一个引物。26一种寡核苷酸，它仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交，所述属于一个基因组的基因由如下基因组成BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、。
9、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。27根据权利要求26所述的寡核苷酸，其特征在于其选自SEQIDNO2534所示的核苷酸序列。28一种检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的试剂盒，其特征在于包括5个基因的5种表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述5个基因如下所示BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCA。
10、N3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。29根据权利要求28所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体是寡核苷酸，特别是探针和/或引物。30根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体选自SEQIDNO2534所示的核苷酸序列的集合。31根据权利要求30所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体包含抗体和/或亲和性蛋白。32通过血液样本预测大肠癌患者的发展情况的方法，其特征在于它包括如下步骤A取血液样本，检测如下5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的量BST1，如SEQIDNO1所示；MGST。
11、1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。B将步骤A检测到的基因的表达产物的量输入支持向量机模型，计算预后指数；C根据步骤B计算得到的结果，判断大肠癌患者的预后。权利要求书CN104178562A3/4页433根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述步骤A是检测5个基因中每个基因的表达产物的量。34根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述步骤A中，检测至少一个基因的表达产物的量是将所述基因的表。
12、达产物与该表达产物的特异配偶体接触。35根据权利要求32所述的方法，其特征在于步骤A中，检测基因的表达产物的量，所述基因的核酸序列选自SEQIDNO124所示序列集合。36根据权利要求32所述的方法，其特征在于步骤A所述表达产物包括至少一个RNA转录物或者一个多肽。37根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述表达产物包括至少一个MRNA。38根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述RNA转录物通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和定量。39根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述RNA转录物在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与RNA转录物。
13、杂交。40根据权利要求39所述的与所述RNA转录物的CDNA在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与CDNA杂交。41根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述多肽的检测是通过将多肽与至少一个特异配体接触来检测的，特别是与抗体或者亲和性蛋白接触。42根据权利要求41所述的方法，其特征在于所述多肽与至少两个特异配体接触，特别是与两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白接触。43一种通过血液样本预测大肠癌患者的发展情况的试剂盒，其特征在于包括5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述5个基。
14、因如下所示BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。所述特异配偶体与基因的表达产物特异结合；所述5个基因的核酸序列选自SEQIDNO124所示序列的集合。44根据权利要求43所述的试剂盒，其特征在于包括5个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。45根据权利要求43所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。46跟据权利要求45所述的试剂盒，。
15、其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。47跟据权利要求46所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。48根据权利要求43所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。49根据权利要求48所述的试剂盒，其特征在于所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白。权利要求书CN104178562A4/4页550核酸序列如SEQIDNO124所示的5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的特异配偶体在制备大肠癌预后试剂中的用途。51根据权利要求50所述的用途，其特。
16、征在于所述特异配偶体是5个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。52根据权利要求50所述的用途，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。53根据权利要求52所述的用途，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。54根据权利要求53所述的用途，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。55根据权利要求50所述的用途，其特征在于所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。56根据权利要求55所述的用途，其特征在于所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体或者一个亲和性蛋白。权利要求书CN104178562A1。
17、/14页6一种大肠癌预后试剂盒技术领域0001本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种大肠癌预后试剂盒。背景技术0002大肠癌，是最常见的恶性肿瘤之一，其在美国人肿瘤发病率中排名第五，在中国人肿瘤发病率中排名第四，是欧洲人第三大致死肿瘤疾病。大肠癌的血液和淋巴结转移严重影响了大肠癌的预后，是导致患者死亡的重要原因，全世界大肠癌的发生率每年以2的速度上升，急需一种有效预测大肠癌发展过程及结果的手段。发明内容0003为了解决上述问题，本发明提供了一种大肠癌预后试剂盒。0004本发明大肠癌预后试剂盒，它包括检测如下5个基因中的任意一个或者多个基因的表达水平的相关试剂BST1，如SEQIDNO1所示；MGS。
18、T1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。0005其中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是MRNA的量的试剂。0006其中，所述试剂为检测与所述MRNA互补的CDNA的量的试剂。0007其中，所述试剂为检测与所述CDNA互补的CRNA的量的试剂。0008其中，所述试剂为探针。0009其中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。0010其中，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。0。
19、011检测如下5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达水平的相关试剂在制备大肠癌预后试剂中的用途BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。0012其中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是MRNA的量的试剂。0013其中，所述试剂为检测与所述MRNA互补的CDNA的量的试剂。0014其中，所述试剂为检测与所述CDNA互补的CRNA的量的试剂。0015。
20、其中，所述试剂为探针。0016其中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。0017其中，所述试剂为抗体或者亲和性蛋白。0018本发明检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的方法，包括1测定受试者血样的基因组中任意一个或者任意多个基因转录的RNA的水平，所述基因组包括如下基因BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。说明书CN104178562A2/。
21、14页700192检测受试者血样中的基因表达。0020优选地，所述步骤1是测定基因组中5个基因转录的RNA的水平。0021其中，所述样本是大肠癌患者的血液样本。0022其中，所述步骤1使用至少一个寡核苷酸。0023其中，一个寡核苷酸仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交。0024其中，所述步骤1包括如下步骤0025A、扩增所述基因转录的RNA，得扩增产物；0026B、使用至少一个引物检测步骤A所得扩增产物的量。0027其中，所述步骤1包括如下步骤0028、用至少一个探针与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交，得杂交产物；0029、检测步骤所得杂交产物。
22、的量。0030其中，所述步骤1包括扩增所述基因转录的RNA的方法。0031其中，所述步骤1包括检测所述基因转录的RNA互补的CDNA的量的方法。0032其中，所述步骤1至少使用一个探针。0033其中，所述步骤1至少使用一个引物。0034本发明寡核苷酸，它仅与一个基因转录的RNA杂交，和/或可以与所述基因转录的RNA互补的CDNA杂交，所述属于一个基因组的基因由如下基因组成BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21。
23、或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。0035所述的寡核苷酸选自SEQIDNO2534所示的核苷酸序列。0036本发明检测人体样本，特别是人血液样本中基因表达的试剂盒，包括5个基因的5种表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述5个基因如下所示BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示。0037其中，所述特异配偶体是寡核苷酸。
24、，特别是探针和/或引物。0038其中，所述特异配偶体选自SEQIDNO2534所示的核苷酸序列的集合。0039其中，所述特异配偶体包含抗体和/或亲和性蛋白。0040本发明通过血液样本预测大肠癌患者的发展情况的方法，它包括如下步骤0041A取血液样本，检测如下5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的量BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示；0042B。
25、将步骤A检测到的基因的表达产物的量输入支持向量机模型，计算预后指数；C根据步骤B计算得到的结果，判断大肠癌患者的预后0043若样本的预后指数大于0，其被归类为高风险病例；若样本的预后指数小于0，其被归类为低风险病例。优选地，所述步骤A是检测5个基因中每个基因的表达产物的量。说明书CN104178562A3/14页80044其中，所述步骤A中，检测至少一个基因的表达产物的量是将所述基因的表达产物与该表达产物的特异配偶体接触。0045其中，步骤A中，检测基因的表达产物的量，所述基因的核酸序列选自SEQIDNO124所示序列集合。0046其中，步骤A所述表达产物包括至少一个RNA转录物或者一个多肽。。
26、0047其中，所述表达产物包括至少一个MRNA。0048其中，所述RNA转录物通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和定量。0049其中，所述RNA转录物在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与RNA转录物杂交。0050其中，与所述RNA转录物的CDNA在预设条件下与至少一个探针和/或至少一个引物接触，在预设条件下，所述探针和/或引物可以与CDNA杂交。0051其中，所述多肽的检测是通过将多肽与至少一个特异配体接触来检测的，特别是与抗体或者亲和性蛋白接触。0052其中，所述多肽与至少两个特异配体接触，特别是与两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个。
27、亲和性蛋白接触。0053本发明通过血液样本体外筛查人大肠癌患病风险的试剂盒，包括5个基因中任意一个或者任意多个基因的表达产物的特异配偶体，每个配偶体与每个基因特定配合，所述5个基因如下所示BST1，如SEQIDNO1所示；MGST1，如SEQIDNO2、3、4、5、6、7、8、9或者10所示；HP，如SEQIDNO11或者12所示；RCAN3，如SEQIDNO13、14、15、16、17、18、19、20、21或者22所示；SRA1，如SEQIDNO23或者24所示；0054所述特异配偶体与基因的表达产物特异结合；0055所述5个基因的核酸序列选自SEQIDNO124所示序列的集合。0056优。
28、选地，包括5个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。0057其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。0058其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。0059其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。0060其中，所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。0061其中，所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白。0062本发明核酸序列如SEQIDNO124所示的5个基因的表达产物的特异配偶体在制备体外筛查大肠癌患病风险的试剂中的用途，所述特异配偶体与5个基因的表达产物特异结合。0063优选地，所述特。
29、异配偶体是5个基因中每个基因的表达产物的特异配偶体。0064其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针。0065其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和至少一个引物。0066其中，所述特异配偶体包括至少一个杂交探针和两个引物。0067其中，所述特异配偶体包括至少一个特异配体，特别是抗体或者亲和蛋白。0068其中，所述特异配偶体包括至少两个特异配体，特别是两个抗体、两个亲和性蛋白或者一个抗体和一个亲和性蛋白。说明书CN104178562A4/14页90069本发明基因表达水平的检测可以通过检测RNA转录物来实现。0070术语“RNA转录物”是指总RNA，即编码或者非编码RNA，包括直接来自于外周。
30、血样本中，也包括间接来自于细胞裂解后的血液样本中的RNA。细胞裂解的方法可以采用申请号WO99/05338的专利申请公开的磁性和机械裂解方法，或者采用申请号WO99/53340的专利申请公开的磁裂解方法，或者采用申请号WO99/15321的专利申请公开的机械裂解方法，当然，也可以采用本领域公知的方法，如，热裂解、高渗透压裂解或者使用胍盐等裂解液的化学裂解方法。细胞裂解后，还需要将核酸从裂解步骤产生的其他细胞组成物中分离出来，通常来讲，离心即可纯化核酸。总RNA包含TRNA，MRNA和RRNA，其中，MRNA包括目标基因转录的MRNA，也包括来自于其他非目标基因的MRNA。0071本发明中，RN。
31、A转录物可以通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和量化。比如，将RNA转录物与探针或者引物杂交。0072术语“杂交是指在适当条件下，两个核酸片段通过稳定且特异的氢键结合，形成双螺旋复合物的过程。所述氢键存在于互补的腺嘌呤A和胸腺嘧啶T或者尿嘧啶U之间，简称AT键，或者存在于互补的鸟嘌呤G和胞嘧啶C之间，简称GC键。0073两段核酸片段的杂交可能是完全的即形成完全互补的核苷酸片段或者序列，杂交过程中形成双螺旋复合物仅包含AT键和GC键；也可能是局部的即形成充分互补的核苷酸片段或者序列，杂交过程中形成双螺旋复合物包含AT键和GC键，使得其可以形成双螺旋结构，也包含未绑定到双螺旋复合物上的碱基。007。
32、4两段核酸片段的杂交程度取决于杂交的反应条件，特别是严格程度。所述严格程度是指两个核酸片段的碱基组成函数，也指两个核酸片段的错配程度。严格程度取决于反应条件，比如，杂交溶液中，离子的浓度和种类，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。这些条件是常规条件，本领域技术人员能确定合适的条件。通常来讲，根据待杂交核酸片段的长度，杂交温度在2070之间，优选在3565之间，生理盐水的浓度在051M之间。0075术语“扩增引物”，是指包含5100个核苷酸的核酸片段，优选地，包含能起始酶促反应比如，酶促扩增反应的1530个核苷酸。0076术语“酶促扩增反应”是指通过在至少一种酶的作用下产生核酸片段多拷贝的过程。。
33、所述扩增反应是本领域公知常识，且在如下技术中被提及美国专利NO4,683,195、美国专利NO4,683,202和美国专利NO4,800,159中描述的PCR多聚酶链式反应,申请号为EP0201184的专利申请中公开的LCR连接酶链式反应，申请号为WO90/01069的专利申请中公开的RCR修复链式反应，申请号为WO90/06995的专利申请中记载的3SR自主序列复制，申请号为WO91/02818的专利申请中记载的NASBA依赖核酸序列的扩增技术，美国专利NO5,399,491中记载的TMA转录介导的扩增。0077当酶促扩增反应为PCR时，扩增一个目标基因至少需要2个目标基因特异性的引物，保证。
34、扩增产物与目标基因特异性一致。如，扩增产物可以为目标基因MRNA逆转录制备的互补DNACDNA，或者，与该CDNA互补RNACRNA。当酶促扩增反应是反转录酶介导的PCR，即为RTPCR。0078术语“杂交探针”是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，比如，包含5100个核苷酸，其能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合说明书CN104178562A5/14页10物。在本发明中，所述目标基因的表达产物包含目标基因MRNA，所述目标表达产物的扩增产物包括与目标产物MRNA互补DNACDNA或者与CDNA互补的CRNA。杂交探针上还包括用于检测的标志物。0079术语“检测”。
35、是指计数方式等直接检测法和使用标志物方式等间接检测方法。目前，有很多用于核酸检测的方法比如，KRICKAETAL,CLINICALCHEMISTRY,1999,NO454,P453458ORKELLERGHETAL,DNAPROBES,2NDED,STOCKTONPRESS,1993,SECTIONS5AND6,P173249记载的方法。0080术语“标志物”是指可以产生能被检测的信号的示踪剂。示踪剂列表包括产生能被侦测到的信号的酶，比如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶，葡萄糖6磷酸或者脱氢酶，通过比色法，荧光或发光法检测；发色团，如荧光，发光，染料化合物；电子密度基团，通过电子显微镜。
36、或凭借其导电性等电学性能、由安培法、伏安法或者阻抗测量的方法检测；基团，通过光学方法，比如，衍射，表面等离子体共振，或接触角变化，或原子力光谱隧道效应等物理方法检测；放射性分子，比如32P,35S或者125I。0081上述杂交探针是一种检测探针。检测探针被标志物标记的探针，如，TYAGIKRAMERNATUREBIOTECH,1996,14303308所述，检测探针具体是指“分子信标”检测探针。“分子信标”具有茎环形结构，包括一个荧光基团和一个淬灭基团，当“分子信标”特异的环序列与其互补的目标基因的结合将会导致茎展开，并在适当的波长的激发过程中发射荧光。检测探针具体还包括“报告探针”，如NAN。
37、OSTRINGTMS技术所示，其包括一个“颜色编码的条形码”。0082检测探针包括荧光团和淬灭剂，如，6羧基荧光素或者6羧基X罗丹明，3末端有淬灭剂4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯。0083为了检测杂交反应，需要对目标序列进行标记，可以是直接标记，具体是在目标序列内部加入标志物，也可以是间接标记，即使用检测探针。具体是在杂交之前，实施包括标记和/或剪切目标序列的步骤，比如，在酶促扩增反应中使用被标记了的脱氧核糖核三磷酸。咪唑或者氯化锰可以达到剪切的作用。目标序列也可以在扩增步骤之后再标记，比如，通过申请号WO91/19812的专利申请文件中记载的三明治杂交技术杂交一个检测探针。另外一种优选的方法是申。
38、请号FR2780059的专利申请文件中记载的标记核酸序列的方法。0084上述杂交探针也是一种“捕获”探针。“捕获”探针可以通过任何适合的方法，直接地或者间接地固定在固体基质上，比如，通过共价键结合或者吸附。所述固体基质，可以是合成材料，也可以是化学修饰或者非化学修饰的天然材料，具体可以是多糖，如，基于纤维素的材料、葡聚糖、共聚物和聚合物，基于纤维素的材料包含纸、纤维素衍生物，纤维素衍生物包括醋酸纤维素、硝酸纤维素；可以是苯乙烯型单、棉等天然纤维或者等合成纤维；可以是无机材料，如，二氧化硅、石英、玻璃或者陶瓷；还可以是乳胶、磁性粒子、金属衍生工具、凝胶等。固体基质可以是微量滴定板，可以是申请号W。
39、OA94/12670的专利申请文件中的固定膜，也可以是颗粒。针对每个目标基因，也可以在基质上固定不同捕获探针，具体地，一个能够固定大量探针的基因芯片作为基质即可以实现。“基因芯片”是指很微小但固定了许多捕获探针的固体基质，捕获探针固定在预定位置上。0085基因芯片，或者说DNA芯片的概念可以追溯到20世纪90年代初。它基于多学科技术，结合了微电子技术，核酸化学，图像分析和信息技术。它的工作原理是分子生物的基础说明书CN104178562A106/14页11杂交现象，即，两个DNA或者RNA序列的互补配对。基因芯片的方法基于固定在固体基质上的捕获探针，直接或者间接荧光素标记的目标核酸片段的样本可。
40、以与该探针相互作用。捕获探针特异的固定在基质或者芯片上，每个杂交均可以给出一条与目标基因相关的特定信息。特定信息的集合使得计量一个或者多个目标基因的表达水平成为可能。为了分析目标基因的表达水平，需要准备包含大量探针的基质，这些探针与所有或者部分转录为MRNA的目标基因相关。其中，“低密度基质”是指包含的探针低于50个的基质，“中等密度基质”是指包含的探针数量为5010000的基质，“高密度基质”是指包含超过10000个探针的基质。0086目标基因的CRNA或者CDNA与特定的捕获探针杂交后，清洗芯片或者基质，被标记的CDNA或者CRNA与捕获探针的复合物可以通过绑定了荧光标签的高亲和力配体显示。
41、出来。并通过信息技术作出分析荧光，得出结果。进行分子诊断时，不得不提AFFYMETRIX公司制备的DNA芯片“ACCESSINGGENETICINFORMATIONWITHHIGHDENSITYDNAARRAYS“,MCHEEETAL,SCIENCE,1996,274,610614“LIGHTGENERATEDLIGONUCLEOTIDEARRAYSFORRAPIDDNASEQUENCEANALYSIS“,ACAVIANIPEASEETAL,PROCNATLACADSCIUSA,1994,91,50225026，在该技术中，捕获探针往往很小，含有25个左右的核苷酸。其他一些生物芯片分别在如下文。
42、献中公开GRAMSAY,NATUREBIOTECHNOLOGY,1998,NO16,P4044；FGINOT,HUMANMUTATION,1997,NO10,P110；JCHENGETAL,MOLECULARDIAGNOSIS,1996,NO13,P183200；TLIVACHEETAL,NUCLEICACIDSRESEARCH,1994,NO2215,P29152921JCHENGETAL,NATUREBIOTECHNOLOGY,1998,NO16,P541546，或者在美国专利NO4,981,783、美国专利NO5,700,637、美国专利NO5,445,934、美国专利NO5,744,3。
43、05和美国专利NO5,807,522中。固体基质的主要特征是保守捕获探针与目标核酸片段的杂交，但产生的背景噪音却很小。0087捕获探针固定在基质上的方式主要有三种00881、将预先合成的探针布放于玻片载体上。通过微量、缩微或喷墨装置，这种探针可以被直接附着到芯片上。这个技术允许附着的探针具有一系列大小不等的碱基，从几个碱基510个，到较大尺寸的60个碱基印刷，再到几百个碱基微印刷。0089所述印刷与打印机的方式相似，是基于小球体流体以4000转/S的速度推进。所述微印刷包括将含有几十到几百个碱基的长探针附着到玻璃载片表面上。这些探针通常来自于数据库，是扩增和纯化的产物。DNA可以处在小于4CM。
44、2大小的面积范围内，制备得到微阵列芯片，微阵列可以携带大约1万个识别区域的斑点。使用直径为051MM的尼龙膜，携带扩增的产物通常是PCR扩增的，称为巨阵列，其最大密度为25斑点/CM2。许多实验室采用该技术。本发明中，微印刷技术是包含生物芯片的，如申请号WOA00/71750或者FR00/14896的专利申请文件所示，一定体积的样品可以沉积在微量滴定板的底部，或者依照如申请号FR00/14691的专利申请文件，一定数目的其他液滴能够沉积在微量滴定板或者裴氏培养皿底部。00902、第二种在基质和芯片上附着芯片方法是原位杂交。这种技术在芯片表面直接产生短探针。该技术基于原位寡核苷酸合成详见申请号W。
45、O89/10977和申请号WO90/03382的专利申请文件和寡核苷酸合成程序。它包括一个移动的反应室，在该反应室中，寡核苷酸衍生反应可以沿着玻璃表面进行。说明书CN104178562A117/14页1200913、第三种技术叫做光刻，即AFFYMETRIX公司开发的专门用于基因芯片的程序。它也是一种原位杂交技术，来自于微处理器技术。具体地，芯片表面被附着物活化，附着物是能够被光活化的不稳定化学基团。这些基团一旦被活化就可以与寡核苷酸序列的3末端反应。通过在芯片表面用预定形状掩膜掩盖的方式可以选择性的活化和激活芯片区域，在该掩盖区域，可以结合四种核苷酸一个或者其他。不同掩膜的成功使用使得保护/。
46、反应可以交替循环，因而可以在大小约几十平方微米的斑点产生寡核苷酸探针。该方式可以在几平方厘米的表面区域产生成百上千的斑点。光刻的优点可以通过4倍N循环产生NMERS的芯片。0092杂交检测目标基因表达还可以使用如下方法1同上述方法步骤1，提取全血的总RNA，逆转录得到该生物材料MRNAS的CDNAS。使用T7聚合酶，在启动子的作用下，使CDNA的互补RNA发生聚合，得到以DNA为模版的互补RNACRNA。得到包含目标基因特异性CRNAS与非目标基因特异性的CRNAS的混合物。2将CRNAS与固定了目标基因特异性的捕获探针的基质混合，目标基因特异性的捕获探针将与目标基因特异性的CRNAS发生杂交。
47、反应，而与非目标基因特异性的CRNAS不发生杂交反应。通过在基质上同时固定不同的捕获探针一个探针与一个目标基因对应，可以同时检测不同目标基因的表达水平。在杂交反应之前也可以先对目标基因特异性的CRNAS按照前述方法进行标记和/或剪切。3检测杂交反应的结果。检测是通过将基质与带有标签的检测探针混合后，检测标签发出的信号实现的，所述基质上带有目标基因特异性的捕获探针，该探针可以与目标基因特异性的CRNAS杂交。若之前已经对目标基因特异性的CRNAS进行标记，则直接检测即可。当基质上有大量探针时，CRNA的优势尤其明显。0093本发明基因表达水平的检测可以通过检测多肽来实现。具体是将多肽与至少一种特。
48、定配体相结合。前述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂。0094优选地，所述试剂为抗体或者亲和性蛋白。在本发明优选实施例中，是将表达的多肽与至少两个特定配体结合。本发明特定配体可以是抗体或者名叫“NANOFITINTM”的亲和蛋白。0095所述“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和重组抗体，它们的制备方法是本领域公知常识。0096基因表达数据具有数据量大、维数高、样本小、非线性的特点。对基因表达数据分析的重要任务之一是对样品进行判别分类,即根据已知的基因表达数据建立判别模型,对未知样本进行分类,这对疾病的诊断具有非常重要的意义。传统的统计分类方法如线性判别、LOGISTIC判别等有。
49、很大的局限性,由于这些方法本质上是线性的,难以适合复杂的情况,同时基因表达数据分析中变量基因的个数远大于样本的例数,无法进行有效的计算。0097支持向量机SUPPORTVECTORMACHINE,SVM是近年来在统计学习理论的基础上发展起来的一种新型机器学习方法。它采用了结构风险最小化原则,能较好的解决小样本学习的问题,尤其是针对维数高、样本小、非线性的基因表达数据,支持向量机表现出了很好的性能。GUYON首次将其应用于白血病基因表达数据的研究，获得成功IGUYON,MACHINELEARNING,2002,NO46,P389422；J。近年来，国内学者的研究也证实了支持向量机算法优越的性能ZZHU,JOURNALOFCLINICALONCOLOGY,2009,NO7,P10911099；说明书CN104178562A128/14页13YXU,CLINCIALCANCERRESEARCH,2013,NO19,P30393045。0098本发明试剂盒可以有效预测大肠癌患者的发展情况，并且操作简单，仅需血液检查，患者依从性高，为临床大肠癌患者的治疗提供了可靠的依据，具有良好的应用前景。0099显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修。