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1、(10)申请公布号 CN 103319570 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103319570 A *CN103319570A* (21)申请号 201310210329.6 (22)申请日 2013.05.30 C07K 7/08(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 深圳翰宇药业股份有限公司 地址 518057 广东省深圳市南山区高新技术 工业园中区翰宇生物医药园办公大楼 四层 (72)发明人 宓鹏程 刘建 马亚平 袁建成 (74)专利代理机构 北京北翔知识产权代理有限 公司 11285 代理人 。
2、张广育 姜建成 (54) 发明名称 一种比伐卢定的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种通过顺序偶联制备比伐卢 定的方法， 其中 Gly 的投料比显著高于其他相应 氨基酸的投料比， 具体地， Gly的投料比为4-8倍。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103319570 A CN 103319570 A *CN103319570A* 1/1 页 2 1. 一种比伐卢定的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 选择合适的固相载体 ； 2) 制得 Fmoc-。
3、Leu- 固相载体 ； 3) 脱除 Fmoc 保护后以 1-3 倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联， 从而依次完成 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 的偶联 ； 4) 脱除 Fmoc 保护后以 4-8 倍的投料比加入 Fmoc-Gly-OH 进行偶联， 重复偶联 4 次 ； 5。
4、) 脱除 Fmoc 保护后以 1-3 倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联， 从而依次完成 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 得到比伐卢定树 脂 ； 6) 用裂解试剂将比伐卢定从比伐卢定树脂上裂解下来， 得到粗肽 ； 7) 所述粗肽经过纯化， 转盐， 最终得到精制比伐卢定。 2. 权利要求 1 的方法， 其中步骤 1) 中所述的固相载体为 Wang 树脂。 3. 权利要求 1 或 2 的方法， 其中步骤 4) 中 Fmoc-Gly-OH 的偶联体系选自 DIC/HOBt、 HATU/HOAt/DIPEA、 。
5、PyBOP/HOBt/DIPEA 中的一种。 4. 权利要求 1-3 任一项的方法， 其中步骤 4) 中 Fmoc-Gly-OH 的偶联反应时间为 10min-30min。 5. 权利要求 1-3 任一项的方法， 其中步骤 6) 中所述的裂解试剂为 TFA、 TIS 和 H2O 的 混合物。 6. 权利要求 5 的方法， 其中 TFA TIS H2O 92 4 4(V V)。 7. 权利要求 1-3 任一项的方法， 其中步骤 7) 中所述的纯化为反相高效液相色谱纯化。 8. 权利要求 7 的方法， 其中所述反相高效液相色谱的色谱柱为反相 C18 柱。 9. 权利要求 1-3 任一项的方法， 其。
6、中步骤 7) 中所述的转盐是转成三氟乙酸盐形式。 权 利 要 求 书 CN 103319570 A 2 1/8 页 3 一种比伐卢定的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种肽制备方法， 尤其地涉及一种比伐卢定的制备方法。 背景技术 0002 比伐卢定 (Bivalirudin) 是一种应用于临床的凝血酶抑制剂， 早期的临床研究表 明比伐卢定抗凝治疗效果确切， 且出血事件的发生率较低， 和传统的肝素抗凝治疗相比使 用更为安全。 比伐卢定可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴离子输出位点而 直接抑制凝血酶的作用。 0003 比伐卢定 (Bivalirudin， 又名 Angiomax)。
7、 是人工合成抗凝药物， 其抗凝成分为水 蛭素衍生物 C 端 20 个氨基酸残基的肽。结构序列为 D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gl y-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。 比伐卢定属于强有力的凝血 酶直接抑制剂， 是近年来临床应用较广的药物。 0004 关于比伐卢定的制备方法， 国内外已有大量报道。 主要有固相依次偶联方法。 由于 比伐卢定结构中含有一个 -Gly-Gly-Gly-Gly 片段， 因此在固相依次偶联 -Gly 过程中， Gly 自身特性使得极易在主峰前后产生 Bivalirudin。
8、-Gly 和 Bivalirudin+Gly 的杂质， 这两个 杂质在后续分离时很难去除。中国专利 201110170669 和中国专利 201110144317 均采用了 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH作为反应原料来解决上述Gly杂质的问题。 但是， 上述专利方法 需要自制， 步骤繁琐， 不利于工业化生产。 发明内容 0005 为了解决以上缺点， 本发明旨在找到合适的偶联条件， 能够在顺序偶联的基础上， 有效的控制 Gly 杂质的产生， 以利于工业化生产。固相合成时， 氨基酸偶联一般采用 2h 甚 至更长的反应时间以确保偶联的完全。本发明意外的发现， 在合成 -Gly-Gly。
9、-Gly-Gly 肽链 时， 通过提高氨基酸 (Fmoc-Gly-OH) 投料比例， 并缩短反应时间， 能够有效解决 BIV 合成中 Gly 杂质的问题。 0006 本发明的第一方面提供一种比伐卢定的制备方法， 包括以下步骤 ： 0007 1) 选择合适的固相载体 ； 0008 2) 制得 Fmoc-Leu- 固相载体 ； 0009 3) 脱除 Fmoc 保护后以 1-3 倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联， 从而依次完成 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-。
10、Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 的偶联 ； 0010 4) 脱除 Fmoc 保护后以 4-8 倍的投料比加入 Fmoc-Gly-OH 进行偶联， 重复偶联 4 次 ； 0011 5) 脱除 Fmoc 保护后以 1-3 倍的投料比加入相应氨基酸进行偶联， 从而次完成 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 得到比伐卢定肽树 说 明 书 CN 103319570 。
11、A 3 2/8 页 4 脂 ； 0012 6) 用裂解试剂将比伐卢定从肽树脂上裂解下来， 得到粗肽 ； 0013 7) 所述粗肽经过纯化， 转盐， 最终得到精制比伐卢定。 0014 在一些实施方案中， 步骤 1) 中所述的固相载体为 Wang 树脂。 0015 在另一些实施方案中， 步骤 4) 中 Fmoc-Gly-OH 的偶联体系选自 DIC/HOBt、 HATU/HOAt/DIPEA、 PyBOP/HOBt/DIPEA 中的一种。在一个优选的实施方案中， 步骤 4) 中 Fmoc-Gly-OH 的偶联反应时间为 10min-30min。 0016 在又一些实施方案中， 步骤 6) 中所述的。
12、裂解试剂为 TFA、 TIS 个 H2O 的混合物。在 一个优选的实施方案中， TFA TIS H2O 92 4 4(V V)。 0017 在再一些实施方案中， 步骤 7) 中所述的纯化为反相高效液相色谱纯化。在一个优 选的实施方案中， 所述反相高效液相色谱的色谱柱为反相 C18 柱。在另一个优选的实施方 案中， 步骤 7) 中所述的转盐是转成三氟乙酸盐形式。 具体实施方式 0018 缩写及含义 0019 缩写含义 Fmoc9- 芴甲氧羰基 Boc叔丁氧羰基 tBu叔丁基 OtBu叔丁氧基 Pbf2， 2， 4， 6， 7- 五甲基苯并呋喃 -5- 磺酰基 Trt三苯甲基 DCM二氯甲烷 DB。
13、LK20六氢吡啶 /DMF 溶液 DIPEAN， N- 二异丙基乙胺 TIS三异丙基硅烷 DMFN， N- 二甲基甲酰胺 DMAP4- 二甲氨基吡啶 HPLC高效液相色谱法 TFA三氟乙酸 说 明 书 CN 103319570 A 4 3/8 页 5 0020 术语解释 0021 替代度 ： 单位重量树脂上含有活性基团的量。在本文中， 替代度的单位是 mmol/g。 以实施例四为例， 树脂重量为 239.5g， 其替代度为 0.501， 因此活性基团的量为 120mmol。 0022 投料比 ： 反应原料与活性基团的比例。 0023 多肽合成仪 ： 下文所述的多肽合成仪购自海南建邦制药有限公司。
14、， 型号为 JBP-20。 0024 茚三酮法 ： 下文所述的茚三酮法为固相常规检测方法， 可参见 Fmoc Solid phase peptide synthesis Oxford university press。 0025 下面通过以下实施例详细说明本发明。 0026 实施例一 ： 替代度为 0.4mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang 树脂的制备 0027 称取替代度为 1.0mmol/g 的 Wang 树脂 ( 购自南开合成科技有限公司， 货号 HCW01-1-2)120g( 活性基团 120mmol)， 加入多肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树 脂 。
15、30 分钟后， 取 84.8gFmoc-Leu-OH、 38.9g HOBt、 36.3g DIC、 2.93g DMAP 溶于 250ml 体积 比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h。反应结束后用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗 2 次。然后加入 189.8g 吡啶和 245.04g 酸酐混合液封闭树脂 6h。再用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗涤 2 次后， 用甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Leu-Wang 树脂， 检测替代度为 0.406mmol/g。 0028 实施例二 ： 替代度为 0.6mmol/g 的 Fmoc-Leu-W。
16、ang 树脂的制备 0029 称取替代度为 1.0mmol/g 的 Wang 树脂 ( 购自南开合成科技有限公司， 货号 HCW01-1-2)120g( 活性基团 120mmol)， 加入多肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树 脂 30 分钟后， 取 118.7gFmoc-Leu-OH、 54.5g HOBt、 50.8g DIC、 4.1g DMAP 溶于 250ml 体积 比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h。反应结束后用 DMF 洗 涤 4 次， DCM 洗 2 次。然后加入 189.8g 吡啶和 245.04g 乙。
17、酸酐混合液封闭树脂 6h。再用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗涤 2 次后， 用甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Leu-Wang 树脂， 检测替代度为 0.617mmol/g。 0030 实施例三 ： 替代度为 0.5mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang 树脂的制备 0031 称取替代度为 1.0mmol/g 的 Wang 树脂 ( 购自南开合成， 货号 HCW01-1-2)120g( 活 性基团120mmol)， 加入多肽合成仪中， 用DMF洗涤2次， 用DMF溶胀树脂30分钟后， 取101.7g Fmoc-Leu-OH、 46.7gHOBt、 43.6g DIC、 3.5g D。
18、MAP 溶于 250ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h。反应结束后用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗 2 次。然 后加入 189.8g 吡啶和 245.04g 乙酸酐混合液封闭树脂 6h。再用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗涤 2 次后， 用甲醇收缩抽干， 得到 Fmoc-Leu-Wang 树脂， 检测替代度为 0.501mmol/g。 0032 实施例四 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 一 ) 0033 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合成仪中， 用。
19、 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保 护， 然 后 用 DMF 洗 涤 4 次， DCM 洗 2 次。 然 后 将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶 于 500ml 体 积 比 为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂 无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗 说 明。
20、 书 CN 103319570 A 5 4/8 页 6 涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护 ( 加入 700ml DBLK， 然后用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗 2 次 ) 和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段的顺 序，依 次 完 成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmo。
21、c-Asn(Trt)-OH 的偶联。 0034 再将 142.7g Fmoc-Gly-OH(480mmol)， 77.8g HOBt(576mmol)， 90.0g DIC(576mmol) 溶于 700ml DMF 溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 30min。用 DMF 溶液洗涤 树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 480mmol) 偶联的 步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0035 最后将 81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)，。
22、 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护 和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 。
23、1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定树脂。 0036 实施例五 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 二 ) 0037 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保 护， 然 后 用 DMF 洗 涤 4 次， DCM 洗 2 次。 然 后 将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶 于。
24、 450ml 体 积 比 为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂 无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗 涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺 序，依 次 完 成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp。
25、(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 的偶联。 0038 再将 178.4g Fmoc-Gly-OH(600mmol)， 97.3g HOBt(720mmol)， 112.6g DIC(720mmol) 溶于 700ml DMF 溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 20min。用 DMF 溶液洗涤 树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 600mmol) 偶联的 步骤， 按照片段的序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0039 最后将 。
26、81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护 和加入 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、。
27、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定树脂。 0040 实施例六 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 三 ) 说 明 书 CN 103319570 A 6 5/8 页 7 0041 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保护， 然后用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗 2 次。然后将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(24。
28、0mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 450ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反 应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复 上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段 的顺序， 依次完成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、。
29、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH 的偶联。 0042 再将 214.1g Fmoc-Gly-OH(720mmol)， 116.7g HOBt(864mmol)， 135.1g DIC(864mmol) 溶于 700ml DMF 溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 10min。用 DMF 溶液洗涤 树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸偶联 ( 以相同的 mmol 量， 即 720mmol) 。
30、的 步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0043 最后将 81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护 和加入氨基酸 ( 以相同。
31、的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定树脂。 0044 实施例七 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 四 ) 0045 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保护， 然后用 DMF 洗涤 4 次，。
32、 DCM 洗 2 次。然后将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 450ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反 应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复 上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段 的顺序， 依次完成 Fmoc-Glu(。
33、OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH。 0046 再将 285.4g Fmoc-Gly-OH(960mmol)， 438.0g HATU(960mmol)， 156.8g HOAt(1152mmol) 溶于 700ml DMF 溶液， 滴加入 333.8mlDIPEA(1920mmol)， 将反应液加入 多肽合成仪中， 室温反应 1。
34、0min。用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护 和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 960mmol) 偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0047 最后将 81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 说 明 书 CN 103319570 A 7 6/8 页 8 温反应 2h( 反应。
35、终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和 加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定 树脂。 0048 实施例八 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 五 ) 0049 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合。
36、成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保 护， 然 后 用 DMF 洗 涤 4 次， DCM 洗 2 次。 然 后 将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶 于 450ml 体 积 比 为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂 无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶。
37、液洗 涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺 序，依 次 完 成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH。 0050 再将 249.7g Fmoc-Gly-OH(840mmol)， 437.1g PyBOP(840mmol)， 136.2g HOBt(1008mmol)。
38、 溶于 700ml DMF 溶液， 滴加入 292.1mlDIPEA(1680mmol)， 将反应液加入多 肽合成仪中， 室温反应20min。 用DMF溶液洗涤树脂6次。 重复上述脱除Fmoc保护和加入相 应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0051 最后将 81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 温反应 。
39、2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和 加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定 树脂。 0052 实施例九 ： 比伐卢定肽树脂的制备 ( 六 ) 0053 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 。
40、加入多 肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保 护， 然 后 用 DMF 洗 涤 4 次， DCM 洗 2 次。 然 后 将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶 于 450ml 体 积 比 为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂 无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用。
41、 DMF 溶液洗 涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺 序，依 次 完 成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH。 说 明 书 CN 103319570 A 8 7/8 页 9 0054 再将 214.1g Fmoc-Gly-OH(720mmol)， 374.7g 。
42、PyBOP(720mmol)， 116.7g HOBt(864mmol) 溶于 700ml DMF 溶液， 滴加入 250.4ml DIPEA(1440mmol)， 将反应液加入多 肽合成仪中， 室温反应15min。 用DMF溶液洗涤树脂6次。 重复上述脱除Fmoc保护和加入相 应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Gly-OH 的偶联。 0055 最后将 81.0g Fmoc-Pro-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 700ml 体积比为 1。
43、 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室 温反应 2h( 反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表 示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复上述脱除 Fmoc 保护和 加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照片段的顺序， 依次完成 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定 树脂。 0056 实施例十 ： 比伐卢定粗肽的制备 0057 将实施例四至实施例九得到的肽树脂置于圆底。
44、烧瓶中， 以 10ml/g 树脂的量加入 裂解试剂 (TFA TIS 水 92 4 4(V/V)， 室温搅拌 2h。反应物用砂芯漏斗过滤， 收 集滤液， 树脂再用少量 TFA 洗涤 3 次， 合并滤液后减压浓缩。以 100ml/g 肽树脂的量加入冰 冻的无水乙醚进行沉淀， 用无水乙醚洗涤 3 次， 真空干燥得到白色粉末固体， 即比伐卢定粗 肽。粗肽的 HPLC 纯度为 77.8 -83.6， -Gly 杂质 0.2， +Gly 杂质 0.2 ( 见下表 )。 0058 对比例一 ： 现有技术比伐卢定树脂及粗肽的制备 0059 以下采用 200910051311.X 中记载的顺序多肽固相合成方法。
45、进行比伐卢定树脂及 粗肽的制备。 0060 称取实施例三制备的 Fmoc-Leu-wang 树脂 239.5g( 活性基团 120mmol)， 加入多 肽合成仪中， 用 DMF 洗涤 2 次， 用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后， 用 700ml DBLK 脱除 Fmoc 保护， 然后用 DMF 洗涤 4 次， DCM 洗 2 次。然后将 110.3g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(240mmol)， 38.9g HOBt(288mmol)， 45.0g DIC(288mmol) 溶于 450ml 体积比为 1 1 的 DCM 和 DMF 混合溶液， 加入多肽合成仪中， 室温反应 2h( 。
46、反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反 应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 1h)， 用 DMF 溶液洗涤树脂 6 次。重复 上述脱除 Fmoc 保护和加入氨基酸 ( 以相同的 mmol 量， 即 240mmol) 偶联的步骤， 按照片段 的顺序， 依次完成 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(。
47、Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联， 反应结束后用 1100ml 甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 得到比伐卢定 树脂。然后由制得的肽树脂按照与实施例十所述相同的方法制备比伐卢定粗肽， 然后通过 HPLC 检测。 0061 HPLC 检测结果如下 ： 0062 HPLC 检测结果纯度-Gly 杂质+Gly 杂质 实施例四80.760.120.07 说 明 书 CN 103319570 A 9 8/8 页 10 实施例五77.800.190.09 实施例六80.630.160.06 实施例七8。
48、2.210.150.05 实施例八83.600.130.07 实施例九82.630.160.06 对比例一74.392.335.66 0063 0064 从上述结果可以看出， 通过本发明方法制得的比伐卢定粗肽中的 -Gly 和 +Gly 杂 质含量较现有技术方法明显减少。 0065 实施例十二比伐卢定精肽三氟醋酸盐的制备 0066 称取 200g 按照实施例九所述制得的比伐卢定粗肽用 25乙腈 +25 DMSO+50 水的混合溶剂 5000mL 溶解后， 采用 Waters2545RP-HPLC 系统， 波长 214nm， 色谱柱为 50250mm 反相 C8 柱， 柱温为 50， 常规 0.1 TFA/ 乙腈流动相纯化， 收集目的峰馏分， 得 到纯度大于 98.5精肽。将精肽溶液采用 Waters2545RP-HPLC 系统， 色谱柱为 50250mm 反相C8柱， 0.1三氟醋酸/乙腈流动相转盐， 收集目的峰馏分， 旋蒸浓缩， 冻干得到比伐卢 定三氟乙酸盐精肽 79.8g， HPLC 纯度 99.53， 纯化收率 81.4， 总收率 35.9。而按照对 比例一所述制得的比伐卢定粗肽采用与上述相同的方法精制， HPLC 纯度明显降低， 且收率 在 10以下。 说 明 书 CN 103319570 A 10 。