单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法.pdf

《单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法.pdf（18页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103443274 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103443274 A *CN103443274A* (21)申请号 201280014783.8 (22)申请日 2012.03.30 2011-080369 2011.03.31 JP C12N 15/09(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 积水医疗株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 与谷卓也 清远英司 牛泽幸司 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 翟赟琪 (54) 发明名称 单核苷酸多态性检测用的试样核酸、 。

2、单核苷 酸多态性检测试样制备用的 PCR 引物以及用于离 子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样 的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及用于迅速并且简便的单核苷酸多 态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样 核酸、 单核苷酸多态性检测试样制备用的 PCR 引 物以及用于离子交换色谱分析的单核苷酸多态性 检测用试样的制备方法。本发明为一种单核苷酸 多态性检测用的试样核酸， 其具有下述(a)(c) 的特性， (a)总链长为200bp以下 ； (b)在5 末端、 3 末端中的任意一个末端具有与模板 DNA 不完全 互补的序列 ( 标识序列 ) ； (c) 与用于比较单核苷 酸多态性的有无的试样。

3、核酸的链长差为 10bp 以 下。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.09.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2012/058701 2012.03.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/133834 JA 2012.10.04 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103443274 A CN 103443274 A *CN103443274A* 。

4、1/1 页 2 1. 一种单核苷酸多态性检测用的试样核酸， 其具有下述 (a) (c) 的特性， (a) 总链长为 200bp 以下 ； (b) 在 5 末端、 3 末端中的任意一个末端具有与模板 DNA 不完全互补的序列， 该序列 为标识序列 ； (c) 与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为 10bp 以下。 2. 根据权利要求 1 所述的试样核酸， 其中， (d) 标识序列的链长为 10bp 以下。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的试样核酸， 其用于离子交换色谱法分析。 4. 一种单核苷酸多态性检测试样制备用的 PCR 引物， 其具有下述 (a) (c) 的特性， (a)。

5、 在用于 AS-PCR 法的情况下， 复制总链长 200bp 以下的扩增产物 ； (b) 在 5 末端具有与模板 DNA 不完全互补的序列， 该序列为标识序列 ； (c) 标识序列的链长为 10bp 以下。 5. 一种用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法， 其特征在 于， 使用权利要求 4 所述的 PCR 引物。 权 利 要 求 书 CN 103443274 A 2 1/11 页 3 单核苷酸多态性检测用的试样核酸、 单核苷酸多态性检测 试样制备用的 PCR 引物以及用于离子交换色谱法分析的单 核苷酸多态性检测用试样的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及用于迅速并且简。

6、便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性 检测用的试样核酸。另外， 本发明涉及单核苷酸多态性检测试样制备用的 PCR 引物以及用 于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。 背景技术 0002 近年来， 开发了分析已经明确与各种疾病或药的副作用相关的单核苷酸多态性 (SNP ； Single Nucleotide Polymorphism) 的技术， 在这些开发中， 简便并且在短时间内精 度良好地检测单核苷酸多态性成为重要的要素。 0003 作为分析单核苷酸多态性的方法， 已知有 RFLP 法 ( 限制性片段长度多态性， Restriction Fragmet Length。

7、 Polymorphism)。RFLP 法为如下方法 ： 在存在识别 PCR( 聚 合酶链反应， Polymerase Chain React ion) 扩增产物中的基因变异部的限制酶的情况下， 在共有序列部位设定引物， 使在其内侧即 PCR 扩增产物内具有多态性， 并进行扩增， 用限制 酶切断所得到的 PCR 扩增产物， 根据该片段的长度判定多态性的有无。但是， 由于使用限制 酶， 因此， 存在分析成本提高、 或分析整体的时间延长等课题。 另外， 由于通过电泳检测链长 差别， 因此， 也存在作业变烦杂、 或分析整体的时间延长等课题。 0004 另一方面， 在生物化学领域或医学领域等中， 在核。

8、酸、 蛋白质、 多糖类这样的生物 体高分子的分析中， 作为能够简便并且在短时间内精度良好地检测的方法， 利用离子交换 色谱法。使用离子交换色谱法时， 缓和对于利用电泳的测定而言必须的烦杂的作业。非专 利文献1中公开了通过高效液相色谱法分离核酸相关化合物的方法。 但是， 在非专利文献1 中公开的方法中， 存在难以充分地分离单核苷酸多态性这样的具有接近的链长差的核酸的 问题。 0005 现有技术文献 0006 专利文献 0007 专利文献 1 ： 日本特开 2005-027518 号公报 0008 专利文献 2 ： 日本特开 2006-075126 号公报 0009 非专利文献 0010 非专利文。

9、献 1 ：“高速液体一基礎 実験 ( 用于生命科学的高效液相色谱法基础与实验 )” 、 广川书店、 p.323(1988) 0011 非专利文献 2 ： Nature、 324、 p.163-166、 (1986) 发明内容 0012 发明要解决的问题 0013 本发明的目的在于， 提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核 说 明 书 CN 103443274 A 3 2/11 页 4 苷酸多态性检测用的试样核酸。 另外， 本发明的目的在于， 提供单核苷酸多态性检测试样制 备用的 PCR 引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。 0014 用于解决问题的。

10、方法 0015 本发明为具有下述 (a) (c) 的特性的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。 0016 (a) 总链长 200bp 以下 ； 0017 (b) 在 5 末端、 3 末端中的任意一个末端具有与模板 DNA 不完全互补的序列 ( 标 识序列 ) ； 0018 (c) 与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为 10bp 以下。 0019 以下， 详细说明本发明。 0020 本发明人发现， 通过使用具有特定的特性的试样核酸， 能够迅速并且简便地检测 单核苷酸多态性， 从而完成了本发明。 0021 AS-PCR( 等位基因特异性 PCR， Allele Specific-PCR) 。

11、法是检测利用序列特异性 的扩增反应的基因多态性 ( 特别是单核苷酸多态性 ) 的方法。具体而言， 使想要检测的单 核苷酸多态性的碱基序列成为引物的 3 末端， 进行 PCR。在目标核酸的序列与引物完全互 补的情况下， 通过 DNA 聚合酶引起延长反应。另一方面， 在目标核酸的序列与引物不完全互 补的情况下， 阻碍 DNA 聚合酶的延长反应。这样， 是使用在 3 末端具有单核苷酸多态性的 野生型或变异型的碱基序列的 2 种引物， 基于扩增反应的结果， 进行单核苷酸多态性的判 定的方法。作为 AS-PCR 法， 可以使用非专利文献 2 中公开的方法。 0022 本发明中的 AS-PCR， 所使用的。

12、引物具有以下的特征。 0023 (1)正向引物使用变异型用、 野生型用的2种， 变异型用在3 末端具有单核苷酸多 态性的碱基序列， 野生型用在 3 末端 ( 相当于单核苷酸多态性部位 ) 具有野生型的碱基序 列。 0024 (2)上述2种正向引物中的一种引物在5 末端具有与目标核酸的碱基序列不完全 互补的序列 ( 以下有时称为 “标识序列” )。 0025 (3) 上述标识序列的链长为 10bp 以下。 0026 (4) 上述 2 种正向引物以扩增产物的链长达到 200bp 以下的方式进行设计。 0027 (5) 反向引物使用在变异型用、 野生型用中共同的引物。 0028 (6) 上述反向引物。

13、， 在通过变异型用正向引物复制在 5 末端具有标识序列的 PCR 扩增产物的情况下， 能够在 PCR 扩增的第 2 次循环以后复制在 3 末端具有标识序列的扩增 产物。 0029 在上述的引物中， 示意地说明变异型用引物具有标识序列的情况下的 PCR 扩增反 应的特征。 0030 (A)PCR扩增的第1次循环的特征如下。 变异型用、 野生型用的2种引物对于变异型 的模板 DNA、 野生型的模板 DNA 而言分别退火后， 分别进行延长反应， 分别复制变异型 DNA、 野生型 DNA。此时， 被复制的变异型 DNA 相对于被复制的野生型 DNA， 仅标识序列的链长部 分总链长长。 0031 (B)。

14、PCR 扩增的第 2 次循环以后的特征如下。反向引物在变异型 DNA 的复制产物 ( 在 5 末端具有标识序列 ) 以及野生型 DNA 的复制产物分别退火后， 进行延长反应， 分别复 制变异型 DNA、 野生型 DNA。此时， 通过反向引物复制的变异型 DNA， 也相对于被复制的野生 说 明 书 CN 103443274 A 4 3/11 页 5 型 DNA， 仅标识序列的链长部分总链长长。 0032 这样得到的仅标识序列部分总链长不同的 2 种 PCR 扩增产物， 通过后述的离子交 换色谱法进行分离分析。 0033 上述示意的说明中， 以 2 种 PCR 扩增产物能够通过离子交换色谱法进行分。

15、离分析 作为限度， 可以在变异型用引物、 野生型用引物二者上附加标识序列， 除了通常使用的引物 应该具备的特性之外， 不限于标识序列， 这对于本领域技术人员而言能够容易地理解。 0034 需要说明的是， 正向引物、 反向引物的用词以本发明的技术领域中的通常的含义 进行使用， 正向引物使用在变异型用、 野生型用中共同的引物， 反向引物中变异型用的在 5 末端附加标识序列这样的形态当然也包括在本发明的范围内。 0035 以往， 在引物上付加与本发明同样的标识序列的情况下， 以非特异反应的避免 ( 专利文献 1)、 利用标识探针的检测 ( 专利文献 2) 为目的， 没有作为离子交换色谱法用的 试样、。

16、 特别是单核苷酸多态性的检测用试样的例子。 0036 如上所述， 本发明中， 提供单核苷酸多态性检测用的试样核酸、 单核苷酸多态性检 测试样制备用的 PCR 引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的 制备方法。 0037 本发明的单核苷酸多态性的检测方法中， 使用离子交换色谱。 0038 用于离子交换色谱法的洗脱液， 优选含有由下述式 (1) 所示的胍衍生的胍盐。 0039 0040 作为胍盐， 例如可以列举 ： 胍盐酸盐、 胍硫酸盐、 胍硝酸盐、 胍碳酸盐、 胍磷酸酯、 胍 硫氰酸盐、 胍氨基磺酸盐、 氨基胍盐酸盐、 氨基胍碳酸氢盐等。其中， 优选使用胍盐酸盐、 胍 硫酸盐。

17、。 0041 洗脱液中的胍盐的分析时的浓度， 根据检测对象物质适当调节即可， 但优选为 2000mmol L 以下。具体而言， 可以列举 ： 使胍盐的浓度在 0 2000mmol L 的范围内进 行梯度溶出的方法。 因此， 分析开始时的胍盐的浓度无需为0mmolL， 另外， 分析结束时的 胍盐的盐浓度也无需为 2000mmol L。 0042 梯度溶出的方法可以为低压梯度法也可以为高压梯度法， 但优选在进行利用高压 梯度法的精密的浓度调节的同时使其溶出的方法。 0043 胍盐可以单独添加到洗脱液中， 也可以与其他盐组合添加。作为能够与胍盐组合 使用的盐， 可以列举例如 ： 由氯化钠、 氯化钾、。

18、 溴化钠、 溴化钾等卤化物和碱金属构成的盐， 由氯化钙、 溴化钙、 氯化镁、 溴化镁等卤化物和碱土金属构成的盐， 高氯酸钠、 高氯酸钾、 硫 酸钠、 硫酸钾、 硫酸铵、 硝酸钠、 硝酸钾等无机酸盐等。另外， 也可以使用乙酸钠、 乙酸钾、 琥 珀酸钠、 琥珀酸钾等有机酸盐。 0044 作为用于洗脱液的缓冲液， 可以使用公知的缓冲液类和有机溶剂类， 具体而言， 可 以列举例如 ： Tris-HCl 缓冲液、 由 Tris 和 EDTA 构成的 TE 缓冲液、 由 Tri s 和乙酸和 EDTA 说 明 书 CN 103443274 A 5 4/11 页 6 构成的 TAE 缓冲液、 由 Tri s。

19、 和硼酸和 ED TA 构成的 TBA 缓冲液等。 0045 洗脱液的 pH 没有特别限定， 只要是通过阴离子交换能够分离核酸链的范围即可。 0046 作为用于离子交换色谱法的填充剂， 优选为在基材粒子的至少表面上引入阳离子 性基团的填充剂， 更优选为在基材粒子的至少表面上具有强阳离子性基团和弱阴离子性基 团的填充剂。 0047 本说明书中，“强阳离子性基团” 是指在 pH 为 1 至 14 的宽范围内进行解离的阳离 子性基团。即， 强阳离子性基团不受水溶液的 pH 的影响而能够保持解离了的 ( 阳离子化 的 ) 状态。 0048 作为强阳离子性基团， 可以列举 ： 季铵基。具体而言， 例如可。

20、以列举 ： 三甲基铵基、 三乙基铵基、 二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。 0049 另外， 作为强阳离子性基团的抗衡离子， 例如可以列举 ： 氯化物离子、 溴化物离子、 碘化物离子等卤化物离子。 0050 强阳离子性基团量没有特别限定， 填充剂的每单位干燥重量的优选的下限为 1eq g， 优选的上限为 500eq g。强阳离子性基团量低于 1eq g 时， 有时填充剂 的保持力减弱， 分离性能变差。强阳离子性基团量超过 500eq g 时， 填充剂的保持力变 得过强， 不能使检测对象物质容易地溶出， 有时产生分析时间延长等问题。 0051 本说明书中，“弱阴离子性基团” 是指 pKa 为 3 以。

21、上的阴离子性基团。即， 上述弱 阴离子性基团受水溶液的 pH 的影响， 解离状态发生变化。pH 高于 3 时， 羧基的质子发生解 离， 具有负的电荷的比例增加。相反， pH 低于 3 时， 结合了羧基的质子的非解离状态的比例 增加。 0052 作为上述弱阴离子性基团， 例如可以列举羧基、 磷酸基等。其中， 优选为羧基。 0053 作为在基材粒子的至少表面上引入羧基的方法， 可以使用例如 ： 将具有羧基的单 体进行共聚的方法、 将单体中的酯部水解的方法、 通过臭氧水处理形成羧基的方法、 通过臭 氧气体形成羧基的方法、 通过等离子体处理形成羧基的方法、 使具有羧基的硅烷偶联剂反 应的方法、 使具有。

22、环氧基的单体共聚、 通过环氧基的开环形成羧基的方法等公知的方法。 其 中， 在基材粒子具有疏水性的结构部分、 特别是具有碳 - 碳双键的情况下， 优选使用通过臭 氧水处理形成羧基的方法。 0054 对通过臭氧水处理形成羧基的方法进行说明。 0055 臭氧与双键的反应性高， 与双键反应了的臭氧， 形成作为中间体的臭氧化物， 然 后， 形成羧基等。 0056 臭氧水是指臭氧气体在水中溶解而成的。 0057 通过使用臭氧水， 仅通过使粒子分散在臭氧水中， 就能够使粒子表面简便地氧化。 其结果， 基材粒子中的疏水性的结构部分被氧化， 形成羧基、 羟基、 醛基、 酮基等亲水性基 团。 0058 臭氧具有。

23、强力的氧化作用， 通过使用臭氧水进行处理， 通过使用臭氧气体进行处 理， 均能够使粒子表面均匀地氧化， 更均匀地形成羧基， 因此优选。 0059 臭氧水中的溶解臭氧的浓度没有特别限定， 优选的下限为20ppm。 溶解臭氧的浓度 低于 20ppm 时， 形成羧基需要长时间， 或羧基的形成变得不充分， 无法充分地抑制检测对象 物质的非特异吸附等。溶解臭氧的浓度的更优选的下限为 50ppm。 说 明 书 CN 103443274 A 6 5/11 页 7 0060 关于臭氧水， 如例如日本特开 2001-330969 号公报等所记载， 可以通过将原料水 和臭氧气体隔着仅透过气体、 阻止液体透过的臭氧。

24、气体透过膜使其接触的方法等进行制 备。 0061 在碱性条件下， 在基材粒子的表面上引入的羧基处于基本解离的状态， 在与核酸 碱基中的少许阳离子之间产生弱阳离子交换相互作用。 0062 另外认为， 通过臭氧水进行处理， 由此， 除了羧基之外， 还形成羟基、 醛基、 酮基等 亲水性基团， 通过这些亲水性基团的存在， 在填充剂的表面与核酸之间起作用的疏水性相 互作用减弱。 0063 因此， 使用在至少表面上具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的填充剂的情况 下， 除了作为主要的相互作用的在填充剂表面与核酸之间发挥的阴离子交换相互作用之 外， 如上所述， 发挥弱的阳离子交换相互作用， 或疏水性相互作用。

25、变弱， 由此， 分离性能提 高。 0064 在基材粒子的至少表面上引入的弱阴离子性基团量， 只要是强阳离子性基团量以 下， 则没有特别限定。 0065 作为基材粒子， 可以使用例如使用聚合性单体等而得到的合成高分子微粒、 二氧 化硅系等无机微粒等， 优选包括 ： 由有机合成高分子构成的疏水性交联聚合物粒子、 和由在 该疏水性交联聚合物粒子的表面具有共聚的离子交换基团的亲水性聚合物构成的层。 0066 疏水性交联聚合物可以为如下聚合物中的任意一种， 即 ： 将 1 种疏水性交联性单 体进行均聚而得到的疏水性交联聚合物、 将 2 种以上疏水性交联性单体进行共聚而得到的 疏水性交联聚合物、 将至少 。

26、1 种疏水性交联性单体与至少 1 种疏水性非交联性单体进行共 聚而得到的疏水性交联聚合物。 0067 作为疏水性交联性单体， 只要是在单体1分子中具有2个以上乙烯基的单体， 则没 有特别限定， 例如可以列举 ： 乙二醇二 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 聚乙二醇二 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 丙 二醇二 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 聚丙二醇二 ( 甲基 ) 丙烯酸酯等二 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 四羟甲基 甲烷三 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 三羟甲基丙烷三 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 四羟甲基甲烷四 ( 甲基 ) 丙 烯酸酯等三 ( 甲基 ) 丙烯酸酯或四 ( 甲基 ) 丙烯酸酯、 二乙烯基苯、 二乙烯基甲。

27、苯、 二乙烯 基二甲苯、 二乙烯基萘等芳香族类化合物等。 0068 需要说明的是， 本说明书中，“( 甲基 ) 丙烯酰基” 是指 “丙烯酰基或甲基丙烯酰 基” ，“( 甲基 ) 丙烯酸酯” 是指 “丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯” 。 0069 作为疏水性非交联性单体， 只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单 体， 则没有特别限定， 例如可以列举 ： ( 甲基 ) 丙烯酸甲酯、 ( 甲基 ) 丙烯酸乙酯、 ( 甲基 ) 丙 烯酸丙酯、 ( 甲基 ) 丙烯酸异丙酯、 ( 甲基 ) 丙烯酸丁酯、 ( 甲基 ) 丙烯酸叔丁酯等 ( 甲基 ) 丙烯酸酯， 苯乙烯， 甲基苯乙烯等苯乙烯类单体等。 007。

28、0 疏水性交联聚合物由疏水性交联性单体与疏水性非交联性单体的共聚构成的情 况下， 疏水性交联聚合物中的来自疏水性交联性单体的链段的含有比例的优选的下限为 10 重量， 更优选的下限为 20 重量。 0071 具有离子交换基团的亲水性聚合物由具有离子交换基团的亲水性单体构成， 可以 包含来自具有 1 种以上离子交换基团的亲水性单体的链段。即， 作为制造具有离子交换基 团的亲水性聚合物的方法， 可以列举 ： 使具有离子交换基团的亲水性单体均聚的方法、 使具 说 明 书 CN 103443274 A 7 6/11 页 8 有离子交换基团的亲水性单体与不具有离子交换基团的亲水性单体共聚的方法等。 00。

29、72 作为具有离子交换基团的亲水性单体， 优选为具有强阳离子性基团的亲水性单 体， 更优选为具有季铵基的亲水性单体。具体而言， 例如可以列举 ： 甲基丙烯酸乙基三甲基 铵氯化物、 甲基丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、 甲基丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、 丙烯酸 乙基三甲基铵氯化物、 丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、 丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、 丙烯 酰胺乙基三甲基铵氯化物、 丙烯酰胺乙基三乙基铵氯化物、 丙烯酰胺乙基二甲基乙基铵氯 化物等。 0073 填充剂的平均粒径没有特别限定， 优选的下限为 0.1m， 优选的上限为 20m。填 充剂的平均粒径低于 0.1m 时， 色谱柱的内压增高， 有时引起分离。

30、不良。填充剂的平均粒 径超过 20m 时， 色谱柱内的死体积变得过大， 有时引起分离不良。 0074 需要说明的是， 本说明书中， 平均粒径表示体积平均粒径， 可以使用粒度分布测定 装置 (AccuSizer780 Particle Sizing Systems 公司制 ) 进行测定。 0075 在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中， 通过 AS-PCR 法扩增的产物的大小优 选为 200bp 以下。通过 AS-PCR 法扩增的产物的大小超过 200bp 时， 有时 PCR 的扩增时间和 离子交换色谱法中的分析时间延长， 或不能得到充分的分离性能。通过 AS-PCR 法扩增的产 物的大小更优选。

31、为 100bp 以下。 0076 在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中， 通过 AS-PCR 法扩增的野生型与变异 型的产物的大小之差 ( 链长差 ) 优选为 10bp 以下。以被扩增的野生型与变异型的产物的 大小之差超过 10bp 的方式设计 AS 引物， 有时通过非特异扩增反应等不能得到期望的扩增 产物。 0077 发明效果 0078 根据本发明， 能够提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷 酸多态性检测用的试样核酸。 另外， 根据本发明， 能够提供单核苷酸多态性检测试样制备用 的 PCR 引物以及用于离子交换色谱分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。 附图说明 007。

32、9 图1是实施例1中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp 和变异型 79bp 而得到的色谱图。 0080 图 2 是在实施例 1 中使用阴离子交换色谱柱 2 分离检测 UGT1A1*6 区域的野生型 76bp 和变异型 79bp 而得到的色谱图。 0081 图 3 是在参考例 1 中使用阴离子交换色谱柱 1 分离检测 UGT1A1*6 区域的野生型 271bp 和变异型 274bp 而得到的色谱图。 0082 图 4 是在参考例 1 中使用阴离子交换色谱柱 2 分离检测 UGT1A1*6 区域的野生型 271bp 和变异型 274bp 而得到的色谱图。 0083 。

33、图 5 是在参考例 2 中使用阴离子交换色谱柱 2 分离检测 UGT1A1*6 区域的野生型 76bp 和变异型 79bp 而得到的色谱图。 具体实施方式 0084 以下， 列举实施例， 对本发明更详细地进行说明， 但本发明不仅限定于这些实施 说 明 书 CN 103443274 A 8 7/11 页 9 例。 0085 ( 阴离子交换色谱柱的准备 ) 0086 ( 阴离子交换色谱柱 1) 0087 在带搅拌机的反应器中， 在 3 重量聚乙烯醇 ( 日本合成化学公司制 ) 水溶液 2000mL 中添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯 ( 新中村化学工业公司制 )300g、 三乙二醇二甲基 丙烯酸酯(新中。

34、村化学工业公司制)100g、 以及过氧化苯甲酰(化学公司制)1.0g的 混合物。搅拌的同时进行加热， 在氮气气氛下， 80下聚合 1 小时。接着， 作为具有强阳离 子性的离子交换基团 ( 季铵基 ) 的单体， 将甲基丙烯酸乙基三甲基铵氯化物 ( 和光纯药工 业公司制 )100g 在离子交换水中溶解， 进一步将所得到的溶液添加到上述反应器中。接着， 搅拌的同时， 在氮气气氛下， 80下聚合 2 小时， 得到聚合物组合物。将所得到的聚合物组 合物用水以及丙酮清洗， 由此， 得到在基材粒子的表面上具有季铵基的亲水性的被覆聚合 物粒子。 0088 将所得到的被覆聚合物粒子 10g 在溶解臭氧浓度 10。

35、0ppm 的臭氧水 300mL 中浸渍， 搅拌 30 分钟。搅拌结束后， 使用离心分离机 ( 日立制作所公司制、“Himac CR20G” ) 进行离 心分离， 除去上清液。重复该操作 2 次， 对被覆聚合物粒子实施臭氧水处理， 得到季铵基和 羧基共存的离子交换色谱法用填充剂。 0089 需要说明的是， 关于臭氧水， 使用在具有内径15em长度20em的圆柱形的外套内 包含收纳有由全氟烷氧基树脂构成的内径 0.5mm 厚度 0.04mm 长度 350cm 的中空管状 的臭氧气体透过膜 400 根的臭氧溶解模块的臭氧水制造系统 ( 积水化学工业公司制 ) 进行 制备。 0090 关于所得到的离子。

36、交换色谱法用填充剂， 使用粒度分布计 (Particle Sizing Systems 公司制、“Accusizer780” ) 进行测定， 结果平均粒径为 10m。 0091 使用所得到的离子交换色谱法用填充剂， 准备以下的色谱柱 ( 阴离子交换色谱柱 1)。 0092 色谱柱尺寸 ： 内径 4.6mm20mm 0093 离子交换基团 ： 季铵基 0094 ( 阴离子交换色谱柱 2) 0095 作为市售的色谱柱， 准备以下的色谱柱。 0096 品名 ： TSK-gel DNA-STAT( 东曹公司制 ) 0097 色谱柱尺寸 ： 内径 4.6mm 长度 100mm 0098 离子交换基团 ：。

37、 季铵基 0099 ( 实施例 1) 0100 实施例 1 中， 进行 UGT1A1*6 区域的野生型 76bp 和变异型 79bp 的分离检测。 0101 (AS-PCR 扩增 ) 0102 通过以下所示的 AS-PCR 条件得到野生型和变异型的扩增产物。 0103 (1) 试药 0104 AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen 公司制、 Lot.760816) 0105 10AccuPrime PCR 缓冲液 I 说 明 书 CN 103443274 A 9 8/11 页 10 0106 AccuPrime Taq DNA。

38、 Polymerase High Fidel ity(5U L) 0107 UGT1A1*6 引物 (0peron Biotechnologies 公司制 ) 0108 正向 ( 野生型 )(10pmol L) ： 5 -(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3 ( 序列号 1) 0109 正向 ( 变异型 )(10pmol L) ： 5 -(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3” ( 序列 号 2) 0110 反向 (10pmol L) ： 5 -(cacatcc tccc t t tggaatggca)-3” ( 序歹号 3) 无核 酸酶的水 ( 非 。

39、DEPC 处理过的 )(Ambi on 公司制、 Lot.0803015) 0111 UGT1A1 基因野生型序列插入质粒 (1106拷贝 L) 0112 UGT1A1 基因变异型序列插入质粒 (1106拷贝 L) 0113 (2) 制备 0114 在 5L 的 10AccuPrime PCR 缓冲液 I、 1L 的正向引物、 1L 的反向引物中以 总量达到 49L 的方式用无核酸酶的水调节而成的溶液中， 添加 1L 的 UGT1A1 基因序列 插入质粒， 得到反应溶液。 0115 (3) 反应 0116 使用 C1000( 一公司制 )， 进行 PCR 反应。温度循环 如下所示。 0117 。

40、在94、 30秒下使模板热改性， 将94下15秒、 62下15秒、 68下30秒的扩增 循环进行循环 40 次， 最后， 在 68保温 5 分钟。4下保存直到样品使用。 0118 在 AS-PCR 扩增后， 用电泳 (Advance 公司制、“Mupid-ex” ) 确认在 80bp 附近来自 扩增产物的带。 扩增产物的大小使用20bp DNA Ladder标记物(宝生物公司制)进行确认。 0119 (HPLC 分析 ) 0120 使用准备的阴离子交换色谱柱， 在以下的条件下分离检测 AS-PCR 扩增产物。 0121 系统 ： LC-20A 系列 ( 岛津制作所公司制 ) 0122 洗脱液 。

41、： 洗脱液 A25mmol L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) 0123 洗脱液 B25mmol L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5)+1mol L 胍盐酸盐 0124 分析时间 ： 使用阴离子交换色谱柱 1 时的分析时间为 10 分钟 0125 使用阴离子交换色谱柱 2 时的分析时间为 20 分钟 0126 溶出法 ： 通过以下所示的梯度条件， 使洗脱液 B 的混合比率直线增加。 0127 使用阴离子交换色谱柱 1 时的条件 0128 0 分钟 ( 洗脱液 B40 ) 10 分钟 ( 洗脱液 B50 ) 0129 使用阴离子交换色谱柱 2 时的条件 0130 0 分钟 ( 。

42、洗脱液 B70 ) 20 分钟 ( 洗脱液 B90 ) 0131 检体 ： UGT1A1*6 区域的野生型 76bp 0132 UGT1A1*6 区域的变异型 79bp 0133 流速 ： 0.5mL 分钟 ( 使用阴离子交换色谱柱 1 时 ) 0134 1.0mL 分钟 ( 使用阴离子交换色谱柱 2 时 ) 0135 检测波长 ： 260nm 0136 试剂注入量 ： 10L 0137 ( 参考例 1) 说 明 书 CN 103443274 A 10 9/11 页 11 0138 参考例 1 中， 进行 UGT1A1*6 区域的野生型 271bp 和变异型 274bp 的分离检测。 0139。

43、 (AS-PCR 扩增 ) 0140 通过以下所示的 AS-PCR 条件， 得到野生型与变异型的扩增产物。 0141 (1) 试药 0142 AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen 公司制、 Lot.760816)10AccuPrime PCR 缓冲液 I 0143 AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidel ity(5U L) 0144 UGT1A1*6 引物 (0peron Biotechnologies 公司制 ) 0145 正向 ( 野生型 )(10pmol L) ： 5 -(cgc。

44、ctcgttgtacatcagagcgg)-3 ( 序列号 1) 0146 正向 ( 变异型 )(10pmol L) ： 5 -(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3” ( 序列 号 2) 0147 反向 (10pmol L) ： 5 -(gaaagggtccgtcagcatgac)-3” ( 序歹号 4) 0148 无核酸酶的水 ( 非 DEPC 处理过的 )(Ambion 公司制、 Lot.0803015) 0149 UGT1A1 基因野生型序列插入质粒 (1106拷贝 L) 0150 UGT1A1 基因变异型序列插入质粒 (1106拷贝 L) 0151 (2) 制。

45、备 0152 在 5L 的 10AccuPrime PCR 缓冲液 I、 1L 的正向引物、 1L 的反向引物中以 总量达到 49L 的方式用无核酸酶的水进行调节后的溶液中， 添加 1L 的 UGT1A1 基因序 列插入质粒， 得到反应溶液。 0153 (3) 反应 0154 使用 C1000( 一公司制 )， 进行 PCR 反应。温度循环 如下所示。 0155 在94、 30秒下使模板热改性， 将94下15秒、 62下15秒、 68下30秒的扩增 循环进行循环 40 次， 最后， 在 68保温 5 分钟。4下保存直到样品使用。 0156 在 AS-PCR 扩增后， 用电泳 (Advance 。

46、公司制、“Mupid-ex” ) 确认在 270bp 附近 (200bp 与 300bp 之间 ) 来自扩增产物的带。扩增产物的大小使用 20bp DNA Ladder 标记物 ( 宝生物公司制 ) 进行确认。 0157 (HPLC 分析 ) 0158 使用准备的阴离子交换色谱柱， 在以下的条件下分离检测 AS-PCR 扩增产物。 0159 系统 ： LC-20A 系列 ( 岛津制作所公司制 ) 0160 洗脱液 ： 洗脱液 A25mmol L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) 0161 洗脱液 B25mmol L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5)+1mol L 胍盐酸盐 01。

47、62 分析时间 ： 使用阴离子交换色谱柱 1 时的分析时间为 10 分钟 0163 使用阴离子交换色谱柱 2 时的分析时间为 20 分钟 0164 溶出法 ： 通过以下所示的梯度条件， 使洗脱液 B 的混合比率直线增加。 0165 使用阴离子交换色谱柱 1 时的条件 0166 0 分钟 ( 洗脱液 B60 ) 10 分钟 ( 洗脱液 B80 ) 0167 使用阴离子交换色谱柱 2 时的条件 0168 0 分钟 ( 洗脱液 B80 ) 20 分钟 ( 洗脱液 B100 ) 说 明 书 CN 103443274 A 11 10/11 页 12 0169 检体 ： UGT1A1*6 区域的野生型 2。

48、71bp 0170 UGT1A1*6 区域的变异型 274bp 0171 流速 ： 0.5mL 分钟 ( 使用阴离子交换色谱柱 1 时 ) 0172 1.0mL 分钟 ( 使用阴离子交换色谱柱 2 时 ) 0173 检测波长 ： 260nm 0174 试剂注入量 ： 10L 0175 ( 比较例 1) 0176 比较例 1 中， 尝试进行 UGT1A1*6 区域的野生型 76bp 和变异型 96bp 的分离检测。 0177 (1) 试药 0178 AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidel ity(Inv i torgen 公司制、 Lot.760816)10AccuPrime PCR 缓冲液 I 0179 A。