一种真菌总蛋白的提取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103319566 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103319566 A *CN103319566A* (21)申请号 201310258614.5 (22)申请日 2013.06.26 C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253 号 (72)发明人 张琦 胡彬彬 何仕武 魏云林 林连兵 季秀玲 (54) 发明名称 一种真菌总蛋白的提取方法 (57) 摘要 本发明提供了一种真菌总蛋白的提取方法， 本发明采用简单易行的方法， 克服了真菌细胞壁 厚而坚韧， 胞内蛋白释放困难。

2、的特点， 成功提取到 质量较高的真菌蛋白质组。 提取液成分简单， 其中 提取液包含78M尿素、 22.5M硫脲、 12mMEDTA （乙二胺四乙酸） 、 10mMTris-HCL（三羟甲基氨基甲 烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物， 提 取液包含24%CHAPS （3-3-(胆酰氨丙基)二甲 氨基丙磺酸内盐） 、 0.5%SDS(十二烷基硫酸钠)、 24%DTT（二硫苏糖醇） ， 本方法简便快速， 对设备 要求不高， 并且总蛋白的提取过程可以在三个小 时内完成提取过程， 可以获得大量的总蛋白用于 蛋白质组分析， 具有较大的实际应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求。

3、书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103319566 A CN 103319566 A *CN103319566A* 1/1 页 2 1. 一种真菌总蛋白的提取方法， 包括以下步骤 ： （1） 将培养好的真菌菌体进行抽滤收集， 用 PBS 缓冲液洗涤后再收集菌体， 或先离心收 集菌体， 然后用 PBS 洗涤菌体， 再离心收集菌体 ； （2） 将收集到的菌体置于液氮预冷的研钵中， 用液氮充分研磨， 将菌体研磨为粉末状 ； （3） 按每 800l 提取液中加入研磨后菌。

4、体粉末 100-150mg 的比例， 将研磨后菌体粉 末置于提取液中， 充分混匀后置于冰上孵育 30-60min， 孵育期间每隔 5-7min 混匀一次， 其中提取液是指含有78M尿素、 22.5M硫脲、 12mM乙二胺四乙酸、 10mM Tris-HCL、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物的溶液 ； （4） 按每 800l 提取液添加 200l 的提取液的比例在步骤 （3） 孵育后的溶液中 加入提取液， 颠倒混匀后再置于冰上孵育 20-30min， 孵育期间每隔 3-5min 混匀一次， 其 中提取液为含有 24% 3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐、 0.5% 十二烷基硫酸 钠、。

5、 24% 二硫苏糖醇的溶液 ； （5） 将步骤 （4） 处理后的液体置于离心管中于低温高速冷冻机中离心处理 ； （6） 取上清弃沉淀， 上清即为提取到的真菌总蛋白 ； （7） 将提取到的总蛋白分装， 置于冰箱中冷冻保存或进行下一步的实验。 2.根据权利要求1所述真菌总蛋白的提取方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中使用的PBS是 指预冷的 1PBS， pH 为 7.4， 洗涤次数为 2-3 次。 3. 根据权利要求 1 所述真菌总蛋白的提取方法， 其特征在于 ： 离心收集菌体是指在 4、 6000-10000rmp 离心 10-15min。 4.根据权利要求1所述真菌总蛋白的提取方法， 其特。

6、征在于 ： 步骤 （5） 中离心处理是在 4、 13000rmp 的条件下离心 15min。 5. 根据权利要求 1-5 所述真菌总蛋白的提取方法， 其特征在于 ： 真菌为丝状真菌或酵 母。 权 利 要 求 书 CN 103319566 A 2 1/7 页 3 一种真菌总蛋白的提取方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白质组学研究领域中总蛋白的提取方法， 特别是涉及一种高效、 快 速的真菌总蛋白的提取方法。 背景技术 0002 真菌 （Fungus） 在生物学分类上属于藻菌植物中真菌超纲， 具真核细胞型的微生 物。随着人类对真菌的研究的深入， 真菌已经与人类的生活息息相关。真菌在自然界分布 广。

7、泛， 绝大多数对人有利， 如酿酒 、 制酱， 发酵饲料， 农田增肥， 制造抗生素， 生产蘑菇， 食品 加工及提供中草药药源 （如灵芝、 茯苓、 冬虫夏草等， 都是真菌的产物或本身或利用真菌的 作用所制备的） 。但是也有对人类致病的真菌， 分为浅部真菌和深部真菌， 此外有些真菌寄 生于粮食、 饲料、 食品中， 能产生毒素引起中毒性真菌病。 0003 双向电泳技术是 O Farrell s、 Klose 和 Scheele 等于 1975 发明的， 其第一先通 过等电聚焦， 使蛋白因等电点的不同而分离 ； 第二通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 使蛋白 质亚基按分子量大小进行分离 ； 通过等电点。

8、和分子量的两次分离， 混合物中的蛋白质在二 维平面上分开， 从而得到蛋白质等电点和分子量的信息。双向凝胶电泳既是一种高分辨率 的蛋白质分离技术， 又是一种蛋白质的收集技术， 因而成为蛋白质组学研究的核心技术。 而 蛋白质组研究中， 能否有效的从复杂样品中提取出目的蛋白是进行质谱分析成功与否的关 键。 0004 现在人们对真菌的研究越来越多， 使真菌产品走进了千家万户， 为人们的生活健 康做出了巨大的贡献。 目前人们对于真菌的研究大多集中在一些具有应用价值或者对人类 具有致病效果的真菌上， 大多方法也是针对某一或某一类菌株上， 缺乏一种通用方法。 对于 真菌的蛋白质组学研究目前也处于一个起步阶段。

9、， 因此急需一种通用方法来指导人们对真 菌蛋白组学研究的开展， 从而使其更好的服务于人类。 此外， 该法还可应用于有关真菌蛋白 相关研究的其它实验操作中。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种蛋白质组学研究领域中真菌总蛋白的提取方法， 该方法 高效快速。 0006 本发明提供的真菌总蛋白的提取方法， 包括以下几个步骤 ： （1） 将培养好的菌体进行抽滤收集， 用 PBS（磷酸盐缓冲液） 洗涤后再收集菌体， 或采用 离心先收集菌体， 然后用 PBS 洗涤菌体， 再离心收集菌体 ； （2） 将收集到的适量菌体置于液氮预冷的研钵中， 用液氮充分研磨， 将菌体研磨为粉末 状 ； （3） 按每 8。

10、00l 提取液中加入研磨后菌体粉末 100-150mg 的比例， 将研磨后菌体 粉末置于提取液中， 充分混匀后置于冰上孵育 30-60min， 孵育期间每隔 5-7min 混匀一 次， 其中提取液是指含有 78M 尿素、 22.5M 硫脲、 12mM EDTA（乙二胺四乙酸） 、 10mM 说 明 书 CN 103319566 A 3 2/7 页 4 Tris-HCL（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物 （100X） 的溶液 ； 为 了保证蛋白不被降解， 称量菌体时需先将提取液置于离心管中， 加入菌体粉末后要迅速混 匀， 再置于冰上， 并间隔颠倒混匀一次 。

11、； （4）按每 800l 提取液添加 200l 的提取液的比例在步骤 （3）孵育后的溶 液中加入提取液， 颠倒混匀后置于冰上孵育 20-30min， 孵育期间每隔 3-5min 混匀一 次， 其中提取液为含有 24%CHAPS（3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐） 、 0.5%24%SDS( 十二烷基硫酸钠 )、 24%DTT（二硫苏糖醇） 的混合溶液 ； （5） 将提取后液体置于离心管中于低温高速冷冻机中离心处理 ； （6） 取上清弃沉淀， 上清及为提取到的总蛋白 ； （7） 将提取到的总蛋白分装， 置于冰箱中冷冻保存或进行下一步的实验。 0007 本发明方法中步骤 （1） 中。

12、使用的 PBS 是指预冷的 1PBS， pH 为 7.4， 洗涤次数为 2-3 次。 0008 本发明方法中离心收集菌体是指在 4、 6000-10000rmp 离心 10-15min。 0009 本发明方法中步骤 （5） 中离心时采用 4、 13000rmp 离心 15min， 离心后的上清用 移液器小心转入新的离心管中， 若吸到沉淀可再次离心除去沉淀。 0010 本发明方法中步骤 （8） 中将提取到的蛋白分装为若干份， 以每份可以做一次实验 为宜， 避免反复冻融对蛋白的损害。 0011 上述百分比浓度均为质量体积比浓度 （w/v， g/ml） ， 离心速度以转速表示。 0012 本发明方法。

13、适合从真菌中提取总蛋白， 无论是丝状真菌还是酵母都有很好的效 果， 该方法简便快捷， 用常规的实验室器材与试剂就可以提取到大量的真菌总蛋白， 具有较 大的实际应用价值。 附图说明 0013 图 1 为五种方法提取深黄被孢霉总蛋白的 SDS-PAGE 检测示意图， 图中 ： 泳道 1 为 方法 1 提取的总蛋白 ； 泳道 2 为方法 2 提取的总蛋白 ； 泳道 3 为方法 3 提取的总蛋白 ； 泳道 4 为方法 4 提取的总蛋白 ； 泳道 5 为方法 5 提取的总蛋白 ； M 为蛋白 Marker ； 图2为方法2与本发明方法的对比图谱， 图中 ： 1是方法2提取的总蛋白 ； 2是本发明方 法提。

14、取的总蛋白 ； M 为蛋白 Marker ； 图 3 为用本发明的方法提取六种种真菌的总蛋白图谱， 图中 ： M 为蛋白 Marker， 1 为深 黄被孢霉的总蛋白、 2 为酿酒酵母的总蛋白、 3 为尖孢镰刀菌的总蛋白、 4 为木霉的总蛋白、 5 为青霉的总蛋白、 8 为黑曲霉的总蛋白 ； 图 4 为本发明方法提取的深黄被孢霉蛋白的双向电泳图谱。 具体实施方式 0014 下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明保护范围不局限于 所述内容， 实施例中试剂如无特殊说明为市售常规试剂或按常规方法制得的试剂。 0015 本实施例中使用的试剂如下 ： 蛋白酶抑制剂混合物溶液 （100X）。

15、 购于上海生工生物公司， 蛋白分子量标准 （Thermo Fisher） ， 二硫苏糖醇 DTT（Amresco） ， 尿素 (Amersham)， 硫脲 (Amersham)， CHAPS(Usb)， 说 明 书 CN 103319566 A 4 3/7 页 5 Tris-base（Amresco） ， HCl（广州化学试剂厂） ， 丙烯酰胺 （Amresco） ， 甲叉双丙烯酰胺 （Sigma） ， EDTA （Sigma） ， 干胶条 drystrip （24cm， pH4-7）（GE） ， 其余为国产分析纯试剂 ； 双向 电泳尿素水化液、 SDS 平衡液、 琼脂糖密封液等双向电泳溶液均。

16、参考 GE 公司 双向电泳原理 和方法 配制 ； 1PBS 缓冲液按如下浓度配制 ： KCl 0.2g/L， NaCl 8.0g/ L， KH2PO4 0.27g/ L， Na2PO4 1.42g/L， pH7.4。 0016 实施例 1 ： 五种方法和本发明方法提取深黄被孢霉总蛋白效果的单向比较实验 经过查找资料， 选出五种方法提取深黄被孢霉的总蛋白， 用 SDS-PAGE 来比较提取方法 效果的优劣， 具体的方法包括以下步骤 ： 1、 菌体的培养 挑取斜面上深黄被孢霉的孢子于 PDA 液体培养基中， 在 28、 150rmp 条件下培养 72h ； 2、 五种方法提取深黄被孢霉的总蛋白， 。

17、五种方法如下所述 ： 方法 1 ： 将培养好的菌体用抽滤收集菌体， 用超纯水洗涤 3 次， 再过滤收集， 收集到的 一部分菌体在液氮中进行充分研磨， 取 100mg 研磨后的菌丝粉末放入 1ml 裂解液 （20 mM Tris-HCl pH 7.4， 150 mM NaCl， 1%（w/v， g/ml） NP-40， 0.5%（w/v， g/ml） 脱氧胆酸钠， 0.1% （w/v， g/ml） SDS， 1 蛋白酶抑制剂混合物） 中， 迅速充分混合， 冰上孵育 1h， 期间每隔 5min 颠倒混匀 ； 将上述离心管放入离心管中离心 （4、 24000g、 30min） ， 将上清转入新的预冷。

18、的 离心管中进行后续的实验。 0017 方法 2 ： 离心收集菌体， 超纯水洗涤 （3000r/min， 离心 19min） 3 次 ； 用 2ml 离心管 称取菌体， 按照每 200mg 菌体加 100ul 提取液 （7.5M 尿素， 2.5M 硫脲， 1.5mM EDTA， 10mM Tris， 20mM PMSF， 2mg/L Dnase， 5mg/L Rnase） ； 室温作用 15-20min ； 在上述液体中加入 300mg 酸洗玻璃珠 （直径约 0.5mm） ， 在离心管中用玻璃棒充分研磨约 10min 后， 在涡旋振荡 器上涡旋震荡 10min（1800r/min） ； 加提取。

19、液 （2% CHAPS， 1%DTT） 25ul， 涡旋 30s6 次， 期 间间隔 1min 置于冰上 ； 10000r/min 离心 10min， 弃沉淀取上清。 0018 方法 3 ： 将培养好的菌体抽滤收集， 用超纯水洗涤 2-3 次 ； 将收集的一部分菌体置 于液氮中充分研磨 ； 用预冷的 1.5ml 离心管称取 100mg 菌丝粉末， 加入 1ml 裂解液 （50mM Tris-Hcl， 1mM EDTA， 50mM NaCl， 0.1% Triston X-100， 1mM DTT， 1mM PMSF， pH8.0） 重悬 菌体 ； 4冰浴 30min， 期间每隔 5min 混匀。

20、一次 ； 利用超声波细胞破碎仪在冰浴中破碎菌体 （750W， 超声 6s， 间隔 1s， 超声 20 次） ； 用高速冷冻离心机 （12000r/min） 离心 20min， 弃沉淀 取上清。 0019 方法 4 ： 将收集的菌体超滤收集， 用超纯水洗涤 3 次 ； 将收集的一部分菌体置于 液氮中研磨 3-5 次， 使其成为细粉末 ； 加入 300mg 的蜗牛酶和 1mol/L DTT 50ul， 再加入 25mmol/L 磷酸钾缓冲液 （ph7.9， PBS） 至 20ml， 涡旋混匀， 37水浴 3h。4离心 （9300g， 5min） ， 弃去上清， 重复 2 次， 洗净蜗牛酶 ； 在沉。

21、淀中加入裂解液 （8M 尿素， 200mM 碳酸 钠） 400ul， 吹打混匀， 冰上孵育 30min， 剧烈震荡 20min ； 样品混匀液于 4离心 （15700g， 20min） ， 取上清 300ul 于 -70保存。 0020 方法 5 ： 将收集的菌体超滤收集， 用超纯水洗涤 2-3 次 ； 取 1g 菌体于液氮中研磨 5 次 ； 取粉末于 1.5ml 离心管中， 加入预冷的 10%TCA- 丙酮溶液 （含 20mM DTT） ， 混匀后 -20 放置过夜以沉淀蛋白 ； 于 4离心 （13400g） 25min， 弃上清， 向沉淀中再加入预冷的丙酮溶 液 （含 20mM DTT） 。

22、1ml 洗涤， 4离心 （13400g） 25min， 弃上清， 重复 2 次 ； 将沉淀室温风干， 说 明 书 CN 103319566 A 5 4/7 页 6 待残留的丙酮挥尽， 沉淀干燥成细粉。 向沉淀中加入含有尿素、 硫脲的双向电泳样品裂解液 400ul， 室温浸提 2h， 期间多次用无菌枪头吹吸， 使溶液与沉淀充分接触 ； 样品溶液 4离心 （13400g） 20min。取上清 （约 300ul） 于 -70保存。 0021 3、 对方法 1-5 提取到的深黄被孢霉的总蛋白进行 SDS-PAGE 单向电泳检测 对步骤2中方法1-5提取到的总蛋白按常规方法进行SDS-PAGE检测， 结。

23、果如图1所示， 从图中可以看出方法 4 和方法 5 所提取到的蛋白质浓度较大， 但是方法 4 提取到的有些蛋 白质存在降解， 蛋白质条带不清晰， 方法 5 对于一些低丰度的蛋白质提取效果比较差， 而且 分子量大的蛋白条带少， 虽然方法 2 提取到的蛋白质浓度相对较低， 但是其提取到的蛋白 质条带多、 分布均匀， 还能够提取到一些低丰度的蛋白质。 0022 表 1 ： 五种方法提取的总蛋白浓度结果 4、 采用本发明的方法进行深黄被孢霉总蛋白的提取， 包括以下几个步骤 ： 1)将培养好的菌体进行抽滤收集， 用pH为7.4的预冷的1PBS洗涤3次， 再抽滤收集 菌体 ； 2) 将收集到的菌体置于用液。

24、氮预冷的研钵中， 用液氮充分研磨 5 次， 将菌体研磨为细 小的粉末状 ； 3) 取 100mg 研磨后的菌体置于预冷的 1.5ml 的离心管中， 加入 800ul 提取液 （7.5M 尿素、 2.5M 硫脲、 1.5mM EDTA（乙二胺四乙酸） 、 10mM Tris-HCL（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul蛋白酶抑制剂混合物， 充分混匀后置于冰上孵育60min， 期间每隔5min颠倒混 匀一次 ； 4) 在步骤 3） 孵育后的的溶液中加入 200ul 提取液 （2% （w/v， g/ml） CHAPS （3-3-( 胆 酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐） 、 0.5。

25、%（w/v， g/ml） SDS( 十二烷基硫酸钠 )、 2%（w/v， g/ml） DTT（二硫苏糖醇） ） ， 颠倒混匀后置于冰上孵育 30min， 期间每隔 5min 颠倒混匀一次 ； 5) 将提取后液体置于离心管中于低温高速冷冻机中离心处理， 离心时采用 13000rmp、 4离心 15min， 离心后的上清用移液器小心转入新的离心管中 ； 6) 取上清弃沉淀， 上清及为提取到的总蛋白 ； 7) 将提取到的总蛋白分装， 置于冰箱中冷冻保存或进行下一步的实验。 0023 5、 将本发明方法提取的总蛋白进行 SDS-PAGE 单向电泳检测 从电泳图谱 （图 2） 可以看出本方法提取到的总蛋。

26、白质浓度有明显的提高， 低丰度蛋白 条带浓度明显增加， 而且浓度高并不引起蛋白质降解， 对蛋白的破坏作用相对较小， 提取质 量显著提高。 0024 表 2 ： 五种方法和本发明方法提取蛋白浓度的比较 说 明 书 CN 103319566 A 6 5/7 页 7 实施例 2 ： 不同提取条件下采用本发明方法对深黄被孢霉进行总蛋白提取的实验 （1） 提取方法同实施例 1， 不同在于 ： 提取液为 7.5M 尿素、 2.5M 硫脲、 1.5mM EDTA、 10mM Tris-HCL（pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物， 孵育时间为 50min， 每隔 6min 混匀一 次 ； 提取液为。

27、 2%CHAPS、 0.5%SDS、 2%DTT， 孵育 25min， 孵育期间每隔 4min 混匀一次 ； （2） 提取方法同实施例 1， 不同在于 ： 提取液为 7M 尿素、 2M 硫脲、 1mM EDTA （乙二胺四 乙酸） 、 10mM Tris-HCL （三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物， 孵育 时间为 40min， 每隔 7min 混匀一次 ； 提取液为 2%CHAPS （3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐） 、 0.5%SDS( 十二烷基硫酸钠 )、 2%DTT （二硫苏糖醇） ， 孵育 20min， 孵育期间每隔 3min 。

28、混匀一次 ； （3） 提取方法同实施例 1， 不同在于 ： 提取液为 8M 尿素、 2.5M 硫脲、 2mM EDTA （乙二胺 四乙酸） 、 10mM Tris-HCL （三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物， 孵 育时间为 30min， 每隔 5min 混匀一次 ； 提取液为 4%CHAPS（3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨 基 丙磺酸内盐） 、 0.5%SDS( 十二烷基硫酸钠 )、 4%DTT（二硫苏糖醇） ； （4）提取方法同实施例 1， 不同在于 ： 先 4、 7000rmp 离心 12min 收集菌体， 然后用 1PBS 洗涤菌体 2 次， 。

29、再离心收集菌体， 提取液为 7.5M 尿素、 2 M 硫脲、 1.5mM EDTA（乙 二胺四乙酸） 、 10mM Tris-HCL（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合 物， 提取液为 3%CHAPS（3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐） 、 0.5%SDS( 十二烷 基硫酸钠 )、 3%DTT（二硫苏糖醇） ； （5） 提取方法同实施例 1， 不同在于 ： 先 4、 10000rmp 离心 10min 收集菌体， 然后用 1PBS 洗涤菌体 2 次， 再离心收集菌体， 提取液为 7M 尿素、 2.5M 硫脲、 1.5mM EDTA（乙二 胺四。

30、乙酸） 、 10mM Tris-HCL （三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、 pH7.4） 、 10ul 蛋白酶抑制剂混合物， 提取液为 4%CHAPS （3-3-( 胆酰氨丙基 ) 二甲氨基 丙磺酸内盐） 、 0.5%SDS( 十二烷基硫 酸钠 )、 3%DTT（二硫苏糖醇） 。 0025 表 3 ： 不同条件下提取总蛋白浓度的比较 从表中可以看出， 在本发明方法在不同条件下对深黄被孢霉总蛋白的都有不错的效 果。 0026 实施例 3 ： 不同菌体粉末添加量对提取效果的比较 说 明 书 CN 103319566 A 7 6/7 页 8 按实施例1中本发明的方法分别添加100mg、 110mg、 120。

31、mg、 130mg、 130mg、 150mg的菌体 粉末进行总蛋白浓度的比较， 结果见表 4。 0027 表 4 ： 不同菌体粉末添加量对提取效果的比较 从表中可以看出， 菌体粉末添加量并不能明显提高总蛋白浓度。 0028 实施例 4 ： 采用本发明的方法提取六种真菌的总蛋白 现用本发明的方法提取六种真菌的总蛋白， 方法同实施例 1 中提取方法， 菌种包括常 见的深黄被孢霉、 酿酒酵母、 尖孢镰刀菌、 木霉、 青霉以及黑曲霉， 然后对其提取的效果进行 SDS-PAGE 单向检测， 检测结果如图 3 所示， 从图中可以看出， 本发明的方法对这六种真菌都 有很好的提取效果， 说明本方法能适用于丝。

32、状真菌和单细胞酵母。提取六种真菌的总蛋白 浓度见表 5。 0029 表 5 ： 用本发明的方法提取到的六种真菌总蛋白含量比较 实施例 5 ： 选用提取到的深黄被孢霉总蛋白进行双向电泳检测 前处理 ： 将提取到的总蛋白进行透析处理， 以除去盐离子对双向电泳的影响， 透析时采 用分子截留量为 3500 的透析袋， 透析缓冲液为 50mM、 pH7.4 的 Tris 缓冲液， 前两次每隔 2h 更换一次透析液， 第三次过夜透析， 其全过程置于 4进行 ； 透析后总蛋白的浓度降低， 但 是经过 SDS-PAGE 检测， 但是从图谱可以看出， 透析前后蛋白质的条带一致， 没有明显变化， 说明透析处理对蛋。

33、白质的影响较小， 可以采用透析处理。 0030 操作步骤 ： 取 120mg 透析后的总蛋白加水化液至 450ul， 用移液器均与置于水化 盘中的胶槽内， 将胶 （24cm， pH4-7） 面朝下置于胶槽内， 室温水化 16h ； 水化结束后将胶条 转移至聚焦盘中， 采用 Ettan IPGphor 进行第一向等电聚焦， 聚焦的条件为 ： S1 stp 300V 0:30Hr， S2 stp 700V 0:30Hr， S3 stp 1500V 1:30Hr， S4 grd 9000V 3:00Hr， S5 stp 9000V 5:00Hr， 整个聚焦过程所用总电压 ： 64KVh ； 胶条的上。

34、限电流为 50uA/ 胶条， 聚焦温度 为20。 聚焦结束后置于装有SDS平衡缓冲液的平衡管中平衡处理， 平衡两次， 每次15min， 第一次加入1%的DTT， 第二次加入2.5%的IAA ； 平衡结束后置于电泳缓冲液中浸润一下， 然 后置于凝胶上， 用 0.5% 的琼脂糖密封液密封， 转移至 ETTAN DALTsix 系统中进行第二向的 电泳， 控制温度为 15， 其条件为 S1 2W/gel、 45min， S2 17W/gel， 直到溴酚蓝跑到底 ； 电泳 说 明 书 CN 103319566 A 8 7/7 页 9 结束后， 将凝胶置于染色盘中进行硝酸银染色 ； 将染色后的凝胶进行扫。

35、描， 扫描前先把扫描 仪擦干净， 在玻璃上喷上一些水， 再将凝胶转移到扫描仪上， 保证每张胶扫描的方向相同， 扫描模式为 256 灰阶透视扫描， 分辨率为 200dpi。 0031 图 4 为深黄被孢霉总蛋白的双向电泳图谱， 从 2D 电泳图可以看出， 本发明方法提 取到的总蛋白经过透析处理后， 适合于 2D 电泳的分析， 得到的蛋白质点相对较多， 经软件 检测约有 1983 个蛋白质点， 适合进行蛋白质组学的研究， 因此本方法能适用于其它真菌的 双向电泳分析， 应用前景广阔。本发明的方法采用传统的液氮研磨破壁方法， 不仅成本低 而且操作简便 ； 尿素和硫脲的加入可以打断蛋白质分子内和分子间的。

36、各种化学键， 使多肽 伸展， 增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度， 减少了疏水相互作用硫脲可以辅助尿 素对蛋白质的性， 同时可增加膜蛋白的溶解度， 使制备样品包含更完整的蛋白质组 ； DTT 的 可以保护蛋白质自由的巯基不被氧化， 从而避免蛋白质的聚焦和变性， 同时尿素可以辅助 DTT 进行二硫键的还原 ； CHAPA 可以增溶膜蛋白， 保护蛋白质的天然状态， 解除蛋白 - 蛋白 之间的相互作用 ； SDS 作为变性剂助溶剂， 在蛋白提取过程中是一个重要溶剂， 可以破坏分 子内和分子间的氢键以破坏蛋白质的二、 三级结果， 从而增加蛋白质的溶解度 ; 蛋白酶抑 制剂混合物可以抑制多种蛋白酶的活性， 可以很好的保持蛋白的完整性， 效果优于单独使 用PMSF。 本发明的提取方法简便快速， 采用常用廉价试剂并对设备要求不高， 除具有操作简 单、 成本低、 节约时间等优点外， 而且可以用于多种真菌， 为一种真菌总蛋白的广谱提取方 法， 具有较大的实际应用价值， 将会推动真菌蛋白质组学的发展。 说 明 书 CN 103319566 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103319566 A 10 2/2 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103319566 A 11 。