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1、(10)申请公布号 CN 103436600 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436600 A *CN103436600A* (21)申请号 201310164452.9 (22)申请日 2013.04.19 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211 号 (72)发明人 康波 姜冬梅 白林 马容 何珲 邹明峰 (54) 发明名称 一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快 速检测其表达规律的方法 (57) 摘要 一种快速获取鹅 OAZ1 基因全长 。
2、CDS 序列及 快速检测其表达规律的方法， 包括以下步骤 ： 提 取鹅卵巢组织中的总RNA， 然后将总RNA反转录为 cDNA ； 分别以鸟类 OAZ1 和 -actin 基因的保守 区作为模板， 设计 OAZ1 基因的全长 CDS 序列引物 (OAZ1-L)， 快速检测OAZ1基因表达规律的OAZ1和 -actin荧光定量特异性引物 ； 通过RT-PCR扩增 反应， PCR 产物的回收纯化， DH5 感受态细胞的 制备， 目的基因的连接、 连接产物的转化， 阳性菌 落的筛选， 菌液测序获取全长 OAZ1 基因全长 CDS 序列， 并测序鉴定所设计的荧光定量引物能特异 性的扩增 OAZ1 和 。
3、-actin 基因 ； 然后再利用荧 光定量 PCR 进一步鉴定， 鉴定结果表明所建立的 方法能快速、 准确地检测鹅机体中 OAZ1 基因的表 达规律。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103436600 A CN 103436600 A *CN103436600A* 1/1 页 2 1. 一种快速获取鹅 OAZ1 基因全长 CDS 序列及快速检测其表达规律的方法包括以下步 骤 ： 1) 取鹅卵巢组织中的总 RNA， 并将其反转录。
4、为 cDNA ； 2) 设计 OAZ1-L 基因的引物， 长度为 874bp ； Forward ： TGCGGGGTGTTCAAGATGT Reverse ： GAGGGAGAGGACCTGCAAAC 设计 OAZ1-S 基因的引物， 长度为 141bp ； Forward ： ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT Reverse ： GCTGCCCTCATCTTTCTAATACGG 设计 -actin 基因的引物， 长度为 222bp ； Forward ： GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG Reverse ： GCGAAGCTTGGCCATCTCC。
5、TGCTCGAAGT 3) 通过 RT-PCR 扩增反应、 PCR 产物的回收纯化、 DH5 感受态细胞的制备、 目的基因的 连接、 连接产物的转化、 阳性菌落的筛选、 菌液测序获取全长 OAZ1 序列。 4)应用实时荧光定量PCR技术构建OAZ1和-actin荧光定量PCR引物的标准曲线和 溶解曲线， 进一步鉴定所设计的 OAZ1 和 -actin 荧光定量引物的特异性和准确性。 2. 一种如权利要求 1 所述的快速获取鹅 OAZ1 基因全长 CDS 序列及快速检测其表达规 律的方法， 其特征在于 ： 设计了采用常规的 RT-PCR 方法进行一次性克隆即可快速获得 OAZ1 基因全长 CDS。
6、 序列的基因特异性引物。 3.一种采用权利要求1所述方法快速、 直观并准确的测定OAZ1基因在不同组织和不同 发育时期的表达规律。 权 利 要 求 书 CN 103436600 A 2 1/3 页 3 一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达 规律的方法 技术领域 0001 本发明涉及一个鹅 OAZ1 相关基因及其编码蛋白的应用， 特别涉及一种快速获取 鹅 OAZ1 基因全长 CDS 序列及快速检测其表达规律的方法。 背景技术 0002 多胺是活细胞的必需组分， 可以参与 DNA 复制， 翻译， 转录和细胞凋亡等多种生理 活动。细胞内缺乏多胺将抑制细胞的生长， 而多胺水平过高则。
7、会导致癌症的发生。鸟氨酸 脱羧酶 (Ornithine Decarboxylase， ODC) 是多胺合成的限速酶， 在维持细胞多胺稳态的过 程中发挥重要作用。鸟氨酸脱羧酶抗酶 (Ornithine Decarboxylase Antizyme， OAZ) 是由 OAZ基因通过特殊的阅读框移码机制翻译的蛋白质。 目前已研究证实的OAZ基因家族的4个 成员中OAZ1(Ornithine Decarboxylase Antizyme1， OAZ1)是调节ODC活性的重要成员， 可 介导ODC被26S蛋白酶体降解并且能抑制多胺的转运， 负性调控细胞内多胺水平， 从而使细 胞内多胺浓度维持相对稳定。O。
8、AZ1 还能通过介导 Cyclin D1 和 Cyclin E1 降解， 抑制细胞 周期。 研究证实， 在各种癌细胞中多胺水平均显著高于正常水平， 细胞的多胺含量与多胺的 合成、 分解和运输相关， 合理的调节这些途径可以抑制肿瘤细胞的生长。而研究表明， OAZ1 可通过结合ODC并介导其降解来调节ODC活性， 进而调节细胞内多胺水平， 抑制肿瘤细胞生 长。近年来研究表明， OAZ1 还可参与动物繁殖功能的调节。籽鹅卵巢组织中的 OAZ1 的表达 量显著高于产蛋前期， 提示 OAZ1 能通过抑制多胺的生物合成来使卵泡发育处于静止状态。 而我们前期研究表明产蛋期四川白鹅小黄卵泡中 OAZ1 基因的。
9、表达量显著高于 F1 级卵泡， 提示 OAZ1 在卵泡发育过程中发挥重要作用。综上， OAZ1 是参与调节细胞内多胺代谢的关 键酶， 阐明OAZ1基因的结构和功能， 建立起OAZ1基因表达规律的快速检测方法具有重要理 论意义和实际意义。 0003 分段克隆 ： 将目的基因分成几段来克隆， 然后将所有分段的片段进行拼接， 最终获 得完整的目的片段。 在进行分段克隆时需要设计多对引物， 且每对引物必须有重叠， 在将所 有片段克隆出来后还需进行一次 PCR 反应检测所获取的片段是否为目的片段。 0004 快速扩增 cDNA 末端技术 ： RACE 技术是基于 PCR 技术基础之上， 分别在 cDNA。
10、 序列 的 3 末端和 5 末端设计特定引物， 然后进行克隆， 从而获得 cDNA 全长序列的方法。 0005 但是分段克隆和 RACE 技术都需要做许多次的 PCR 和克隆工作， 操作过程繁琐， 工 作量大， 耗时长， 且成本高。采用半定量反转录 - 聚合酶链式反应进行定量检测时， 其技术 原理为 PCR 反应的终点法， 因此只能在 PCR 反应结束时， 获得目的基因片段的拷贝数， 不能 了解定量过程中的准确变化， 期间由于电泳操作的影响， 会出现较大误差， 不能十分准确的 检测目的基因表达量。分段克隆和 RACE 技术都需要做许多次的 PCR 和克隆工作， 操作过程 繁琐， 工作量大， 耗。
11、时长， 且成本高。 0006 半定量反转录 - 聚合酶链式反应 ： 首先将 mRNA 反转录成 cDNA， 再进行 PCR 扩增， 取等量的 PCR 产物在同一块琼脂糖凝胶上电泳检测， 然后采用生物信息学分析软件来比较 说 明 书 CN 103436600 A 3 2/3 页 4 电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值， 最后计算目的基因表达量 ( 或拷贝数 ) 的 定量检测技术。 0007 采用半定量反转录 - 聚合酶链式反应进行定量检测时， 其技术原理为 PCR 反应的 终点法， 因此只能在 PCR 反应结束时， 获得目的基因片段的拷贝数， 不能了解定量过程中的 准确变化， 期间由于电泳。
12、操作的影响， 会出现较大误差， 不能十分准确的检测目的基因表达 量。 发明内容 0008 本发明设计全长 OAZ1 基因的引物， 通过 RT-PCR 扩增直接可以获取全长 OAZ1 序 列， 一次PCR和克隆过程就可以获得OAZ1的全长CDS区序列。 相较于分段克隆和RACE技术， 本方法大大的提高了试验的简便性， 节省了试验时间， 也很大程度上的降低了试验成本。 0009 半定量法只能通过最终产物的电泳图来判断是否表达， 表达量的高低， 相当于终 点法， 这其中还有很多人为影响因素， 特别是在进行凝胶电泳的时候加样量是否准确。 而本 发明采取 SYBR-Green 染料法进行 QRT-PCR。
13、 检测， 设计特异性强的荧光定量 PCR 引物。在 PCR 反应过程中， 可对整个扩增过程进行实时监测， 连续地分析与扩增产物相关的荧光信号 的变化， 采用我们设计的方法 ( 方案 ) 可以直观并准确的测定 OAZ1 基因在不同组织和不同 发育时期的表达规律。 0010 本发明技术方案带来的有益效果 ： 0011 本发明设计了全长 OAZ1 基因的引物， 应用普通的 RT-PCR 技术即可获取全长的 OAZ1 序列， 一次性克隆 OAZ1 的全长 CDS 序列。相较于以前的分段克隆和 RACE 技术， 该方法 能快速的获取 OAZ1 基因的全长 CDS 序列， 大大的节省了试验时间和试验成本，。
14、 也避免了分 段克隆可能出现的拼接不成功的情况， 提高了试验的准确性。另外， 本发明设计了 OAZ1 的 短片段荧光定量 PCR 检测所需的特异性强、 PCR 反应效率高的引物序列， 该引物序列适合应 用 SYBR-Green 染料进行快速检测不同组织和不同发育时期 OAZ1 基因 mRNA 表达规律的研 究。在实时定量 PCR 检测过程中， 可对整个反应扩增过程进行实时监测， 连续地分析与扩增 产物相关的荧光信号的变化。因此， 该项发明技术为鹅 OAZ1 基因的结构和功能研究提供了 一个快速获取OAZ1基因全长CDS序列的方法， 并建立了一套快速、 准确、 省时省力的研究鹅 OAZ1 基因 。
15、mRAN 表达规律的方法。 附图说明 0012 附图 1OAZ1 全长 CDS 序列 PCR 扩增电泳图 0013 附图 2OAZ1 开放阅读框及其氨基酸序列图 0014 附图 3 短片段 OAZ1 和 -actin 基因 PCR 扩增电泳图 0015 附图 4-actin 荧光定量标准曲线 0016 附图 5-actin 荧光定量溶解曲线 0017 附图 6OAZ1 荧光定量标准曲线 0018 附图 7OAZ1 荧光定量溶解曲线 具体实施方式 说 明 书 CN 103436600 A 4 3/3 页 5 0019 下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。 0020 实施案例 1. 0021 。
16、一种快速获取鹅 OAZ1 基因全长 CDS 序列及快速检测其表达规律的方法包括以下 步骤 ： 0022 1. 取鹅卵巢组织中的总 RNA， 并将其反转录为 cDNA ； 0023 2. 设计 OAZ1-L 基因的引物， 长度为 874bp ； 0024 Forward ： TGCGGGGTGTTCAAGATGT 0025 Reverse ： GAGGGAGAGGACCTGCAAAC 0026 设计 OAZ1-S 基因的引物， 长度为 141bp ； 0027 Forward ： ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT 0028 Reverse ： GCTGCCCTCATCTTTCTA。
17、ATACGG 0029 设计 -actin 基因的引物， 长度为 222bp ； 0030 Forward ： GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG 0031 Reverse ： GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT 0032 3. 通过 RT-PCR 扩增反应、 PCR 产物的回收纯化、 DH5 感受态细胞的制备、 目的基 因的连接、 连接产物的转化、 阳性菌落的筛选、 菌液测序获取全长 OAZ1 序列。 0033 4.应用实时荧光定量PCR技术构建OAZ1和-actin荧光定量PCR引物的标准曲 线和溶解曲线， 进一步鉴定所设计的 OAZ1 和 -actin 荧光定量引物的特异性和准确性。 说 明 书 CN 103436600 A 5 1/5 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103436600 A 6 2/5 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 103436600 A 7 3/5 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103436600 A 8 4/5 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103436600 A 9 5/5 页 10 图 7 说 明 书 附 图 CN 103436600 A 10 。