一种疫苗组合物及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104248758 A (43)申请公布日 2014.12.31 CN 104248758 A (21)申请号 201310556460.8 (22)申请日 2013.11.08 A61K 39/295(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (71)申请人 普莱柯生物工程股份有限公司 地址 471000 河南省洛阳市高新区凌波路 5 号 (72)发明人 张许科 孙进忠 田克恭 (74)专利代理机构 北京华夏正合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11017 代理人 。

2、韩登营 (54) 发明名称 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种疫苗组合物， 该疫苗组合 物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和免疫量的 猪链球菌病病毒抗原。本发明还提供了制备该疫 苗组合物的方法， 通过该方法制备的疫苗组合物 副作用小， 不含内毒素， 具有较好的免疫安全性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 (10)申请公布号 CN 104248758 A CN 104248758 A 1/1 页 2 1. 一种疫苗组合物， 所述疫苗组合物包括免疫量。

3、的猪伪狂犬病病毒抗原和免疫量的猪 链球菌病细菌抗原。 2. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其中， 所述猪伪狂犬病病毒抗原为灭活的猪伪 狂犬病全病毒抗原、 改良的活的猪伪狂犬病全病毒抗原、 含有猪伪狂犬病的免疫原性氨基 酸序列的重组病毒、 或含有猪伪狂犬病的免疫原性氨基酸序列的多肽 ； 以及 所述猪链球菌病细菌抗原为灭活的猪链球菌病全菌抗原、 改良的活的猪链球菌病全菌 抗原、 含有猪链球菌病的免疫原性氨基酸序列的重组菌株、 或含有猪链球菌病的免疫原性 氨基酸序列的多肽。 3. 根据权利要求 2 所述的疫苗组合物， 其中， 所述猪伪狂犬病病毒抗原为猪伪狂犬病 病毒基因缺失 SA215 株、。

4、 Ea 株、 WKQ-001 株或猪伪狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、 Bartha-K61 株、 Bucharest 株、 BUK 株、 H 株和 C 株中的一种或任意几种的组合 ； 以及 所述猪链球菌病细菌抗原为灭活的猪链球菌血清 2 型SC 株全菌抗原、 猪链球菌 2 型分 离株 HA9801 全菌抗原以及马链球菌兽医亚种 ATCC35246 全菌抗原的一种或任意几种的组 合。 4. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 疫 苗 组 合 物， 其 中， 所 述 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 抗 原 为 1.0106.0TCID50/ml， 所述猪链球菌病细菌抗原为 1109CFU/m。

5、L。 5. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其中， 所述疫苗组合物中猪伪狂犬病病毒抗原 部分进一步包含冻干保护剂 ； 所述疫苗组合物猪链球菌病病菌抗原部分进一步包括佐剂。 6. 根据权利要求 5 所述的疫苗组合物， 其中， 所述冻干保护剂包括脱脂牛奶、 明胶、 海 藻糖、 牛血清白蛋白、 聚乙烯吡咯烷酮、 山梨醇、 谷氨酸钠、 Vc 中的一种或几种 ； 所述佐剂包 括铝盐佐剂、 Montanide IMS 佐剂、 Montanide GEL 佐剂、 蜂胶、 免疫刺激复合物、 双向佐剂 206、 水包油性佐剂、 细胞因子类佐剂、 核酸及其衍生物类佐剂、 卵磷脂类佐剂。 7. 一种制备权利要。

6、求 1 所述疫苗组合物的方法， 所述方法包括 ： 1） 培养增殖猪伪狂犬病病毒， 加入冻干保护剂 ； 2） 培养增殖猪链球菌病细菌， 灭活， 加入佐剂 ； 3） 使用所述灭活的猪链球菌病病毒复原所述猪伪狂犬病病毒。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中， 所述方法 2） 步骤中在所述灭活步骤完成后进一 步包括浓缩步骤， 所述浓缩步骤包括采用切向流超滤法、 离心法、 中孔纤维超滤法、 石棉以 及活性碳吸附法、 凝胶层析法、 铝胶吸附沉淀法。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 所述切向流超滤法所用超滤膜的截留分子量为 500KD 1000KD。 10. 权利要求 1 6 任一项所。

7、述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒和猪 链球菌病病菌相关疾病中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104248758 A 2 1/10 页 3 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗组合物， 以及该疫苗组合物的制备方法和应用。 背景技术 0002 猪伪狂犬病 (Pseudorabies， PR) 是多种动物共患的传染病， 引起家畜和野生动物 急性致死性的传染病， 以发热、 奇痒和脑脊髓炎为主要症状， 猪是其自然易感宿主， 主要引 起妊娠母猪流产、 死胎和木乃伊胎， 仔猪感染主要是神经症状， 成年猪则以隐性感染为主。 0003 猪伪狂犬病是一种由伪狂犬。

8、病毒引起的高死亡率的急性传染病。 猪伪狂犬病病毒 (PRV) 属于疱疹病毒科 (Herpesvirdae)、 2 疱疹病毒亚科 (Alpherpesvirinae)。目前仅 发现一种血清型的 PRV。该病最早发现于美国， 后由匈牙利学者 Aujeszky 首次分离出该病 毒， 因而又称奥耶斯基病 (Aujeszkys Disease)。目前该病分布于全世界 50 多个国家和地 区， 对养猪业的发展构成了严重的威胁， 已引起世界各国的高度关注。 该病在我国的发生已 较严重， 是现在危害我国规模养猪业最严重的疫病之一。猪伪狂犬病的发生往往继发或混 合感染一种或几种某些病毒性， 细菌性， 寄生虫性疾。

9、病。 这种混合感染的诊断与防治都十分 困难。 猪伪狂犬病病毒可侵害各种日龄阶段的猪， 病毒可在康复猪的嗅球、 三叉神经节和其 他神经组织中潜伏， 在猪受到体内外因素的刺激时， 体内的病毒活化后通过排毒和传播， 引 起妊娠母猪流产、 死胎或木乃伊胎， 即使具有较高的母源抗体水平的哺乳仔猪在受到野毒 感染时， 也会出现神经症状， 如麻痹， 最后因衰竭而死亡， 而不易致死的， 也会表现出体温升 高、 食欲下降等临床症状， 且耐过病后常出现生长阻滞。 猪伪狂犬病野毒更可能诱导或加剧 呼吸道症状， 也可能与断奶后的腹泻有关， 并且还可降低猪的机体对其他疫苗如猪瘟疫苗 的体液免疫应答能力， 抑制抗体水平的。

10、升高。猪伪狂犬病病毒的持续性感染和潜在的免疫 抑制， 对于猪的疾病防治工作带来了很大的困难。目前， 进行疫苗接种是预防、 控制甚至消 灭伪狂犬病最主要的措施之一。 国内外已研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、 灭活疫苗、 基 因缺失弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗， 而病毒载体重组疫苗和基因疫苗尚处于实验室研究 阶段。 基因缺失疫苗已在生产中发挥着重要的作用， 尤其在美国和欧洲一些发达国家的PRV 根除计划中功不可没。 0004 当前伪狂犬疫苗的种类有 ： 一 ： 灭活苗。优点是安全， 不会散毒 ； 缺点是免疫效果 不是很好。 二 ： 自然缺失弱毒活疫苗， 弱毒活疫苗是将分离到的野毒株经非猪源细胞反复传。

11、 代， 或适应鸡胚， 或加入致突变剂在高于一般的培养温度条件下， 在细胞上反复传代而获得 的疫苗。目前使用较多的是 Bartha、 Buk 毒株。优点是弱毒苗具有良好的免疫原性， 而且价 格低廉， 至今仍在伪狂犬病的防控中起着重要作用。缺点是未经充分致弱的弱毒苗的毒力 可能会返强而导致疾病的流行 ； 弱毒疫苗可建立潜伏感染， 并有可能散毒。三， 基因工程疫 苗 ： 包括基因工程缺失弱毒活疫苗、 亚单位疫苗、 核酸疫苗、 重组病毒疫苗。 （一） 1. 基因工 程缺失弱毒活疫苗优点 ： 都缺失了目的基因的几百甚至几千个碱基， 缺失区域明确， 所以它 们返祖的可能性极小。2. 基因工程缺失弱毒活疫苗。

12、缺点 ： 基因缺失疫苗能否引起潜伏感染 或被激活为感染性病毒令人担忧。 （二） 亚单位疫苗 ： 是利用 PRV 保护性抗原基因， 在原核或 说 明 书 CN 104248758 A 3 2/10 页 4 真核系统中表达所获得的产物制成的疫苗。 1.亚单位疫苗的优点:不含有核酸物质因此比 较安全， 接种后不会产生持续感染或潜伏感染。 产生的免疫应答可以与野毒感染相区分， 有 利于疫病的控制和消灭。2. 亚单位疫苗的缺点 : 生产成本高， 免疫原性不及弱毒疫苗及灭 活疫苗， 应用受到限制。 （三） 核酸疫苗 ： 核酸疫苗是指将编码外源蛋白质的核酸表达载体注 射入机体， 以激发机体产生针对外源蛋白质。

13、特异性的免疫应答。1. 核酸疫苗的优点 : 能克 服伪狂犬病病毒的潜伏感染， 安全性高， 免疫期长， 而且能激发细胞免疫。2. 核酸疫苗的缺 点 : 虽然核酸疫苗的免疫能产生较高的抗体水平， 但对强毒攻击的保护力不理想。 （四） 重 组疫苗。重组疫苗的优点 ： 载体病毒较稳定， 免疫原性持久， 删除毒力基因的活载体疫苗能 诱发体液免疫和细胞免疫， 避免了灭活苗免疫的缺点， 接种方便安全。重组疫苗的缺点 ： 有 些载体对人或动物具有潜在致病性， 对人或动物具有潜在的威胁。 另外， 重复使用会使动物 对载体病毒产生免疫反应。 0005 猪链球菌病 (Swine streptococosis) 是由。

14、链球菌属中致病性链球菌所致的一种 传染病。链球菌的抗原构造比较复杂， 有核蛋白抗原 (P 抗原 )， 无群型的特异性 ； C 抗原， 具 有群特异性 ； 表面抗原， 具有型特异性。根据 C 抗原的不同， 用兰氏 (Lance field) 血清学 分类， 可将链球菌分成 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 等 20 个血清群。根据细菌的荚膜多糖抗原 (CPS) 特性的不同， D 群又可分为 35 个血清型， 即 1 型 34 型和 1/2 型 ( 同时含有 1 型和 2 型抗 原的菌株 )。目前， 以 C 群兽疫链球菌病和 D 群中的 2 型链球菌病影响最严重， 危害最大。 C群兽疫链球菌。

15、(Streptococcus zooepidemicus)现名马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus)， 在自然界中分布很广， 一直是我国猪链球菌病的重要病原。 猪 链球菌病也是一种人畜共患的急性、 热性传染病， 表现为急性出血性败血症、 心内膜炎、 脑 膜炎、 关节炎、 哺乳仔猪下痢和孕猪流产等， 在特定诱因作用下， 发病猪死亡率可达 80， 严 重影响养猪业的发展。猪链球菌病在我国华南、 西南、 华东、 江西及江苏等地曾大面积爆发 流行过， 发病率和死亡率都较高， 造成了严重的经济损失， 主要血清型为兰氏 C 群， 其次为 兰氏 D 群。

16、、 E 群。近年来， 在猪链球菌众多血清型中， 猪链球菌 2 型 (R 群 ) 是猪的最主要病 原， 致病性最强， 从表征健康的猪扁桃体内分离的所有猪链球菌中， 2 型多达 50.6， 而且 可感染特定人群发病， 并可致死亡， 危害严重， 其中 1998 年江苏部分地区爆发的猪链球菌， 造成 25 人感染， 14 人死亡 ； 2005 年四川部分地区爆发 2 型疫情， 造成 205 人感染， 37 人死 亡。 0006 近年来， 随着集约化养猪业的发展， 猪链球菌病的发生在中国一直呈上升趋势， 除 猪链球菌 2 型外， C 群兽疫链球菌仍是最主要的病原之一， 引起的损失巨大， 更为严重的是 现。

17、有的疫苗不能提供有效的免疫保护， 因此对该病的有效防控开展研究是当务之急。 0007 对猪链球菌病的防治包括药物预防与治疗， 免疫接种等。但是， 近年来， 由于抗生 素的滥用， 不仅使治疗成本提高， 耽误了有效治疗的最佳时机， 而且产生了大量耐药菌， 抗 生素也失去应有的作用， 疾病难以控制 ； 其次猪链球菌的耐药率较高， 而敏感率又普遍偏 低， 不同地区分离株耐药性也不一致， 表现出多重耐药性 ； 再就是链球菌的血清型较多， 其 间的交叉免疫保护作用也不确定， 再加上猪链球菌具有较强的地域性， 即使同一地区的不 同菌株也有明显的差异， 因而彻底根除本病难度较大。 0008 免疫接种是猪链球菌。

18、病和猪伪狂犬病防制的重要措施， 但目前市场上仅有猪链球 菌病疫苗和猪伪狂犬病疫苗单苗， 为了有效预防猪链球菌病和猪伪狂犬病的发生， 需单独 说 明 书 CN 104248758 A 4 3/10 页 5 免疫上述两种疫苗。单独免疫猪链球菌病疫苗和猪伪狂犬病活疫苗存在繁琐、 费时、 费力、 增加成本等问题， 且容易造成漏种， 直接影响免疫效果。 发明内容 0009 本发明提供了预防和治疗猪伪狂犬病与猪链球病的疫苗组合物， 以解决现有技术 没有猪伪狂犬病， 猪链球菌病二联苗的问题， 同时还解决了现有技术没有猪伪狂犬病， 猪链 球菌病二联苗的使用方法与免疫程序。 0010 本发明的主要目的在于提供一。

19、种疫苗组合物， 所述疫苗组合物包括免疫量的猪伪 狂犬病病毒抗原和免疫量的猪链球菌病细菌抗原。 0011 优选地， 所述猪伪狂犬病病毒抗原为灭活的猪伪狂犬病全病毒抗原、 改良的活的 猪伪狂犬病全病毒抗原、 含有猪伪狂犬病的免疫原性氨基酸序列的重组病毒、 或含有猪伪 狂犬病的免疫原性氨基酸序列的多肽 ； 以及所述猪链球菌病细菌抗原为灭活的猪链球菌病 全菌抗原、 改良的活的猪链球菌病全菌抗原、 含有猪链球菌病的免疫原性氨基酸序列的重 组菌株、 或含有猪链球菌病的免疫原性氨基酸序列的多肽。 0012 优选地， 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗中， 所述的猪链球菌病抗 原为猪链球菌病疫苗、 。

20、改良 / 嵌合的猪链球菌病疫苗、 至少含有猪链球菌病的免疫原性氨 基酸序列的重组菌株， 至少含有猪链球菌病的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分的一种或 任意几种的组合。 0013 优选地， 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗中， 所述的猪伪狂犬病病 毒抗原为猪伪狂犬活病毒、 改良 / 嵌合的猪伪狂犬活病毒， 至少含有猪伪狂犬病病毒的免 疫原性氨基酸序列的重组病毒、 猪伪狂犬病病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几 种的组合。 0014 更优选地， 所述猪伪狂犬病病毒抗原为猪伪狂犬病病毒基因缺失 SA215 株、 Ea 株、 WKQ-001 株或猪伪狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、 。

21、Bartha-K61 株、 Bucharest 株、 BUK 株、 H 株和 C 株中的一种或任意几种的组合 ； 以及所述猪链球菌病细菌抗原为灭活的猪链球菌 血清 2 型 SC 株全菌抗原， 猪链球菌 2 型分离株 HA9801 全菌抗原以及马链球菌兽医亚种 ATCC35246 全菌抗原一种或任意几种的组合。 0015 优选地， 所述的猪伪狂犬病病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失 SA215 株 （CCTCC， 保藏编号 V200002）公开于中国专利 CN101186902A、 Ea 株 （CGMCC， 保藏编号 N0.0907） 、 WKQ-001 株 （CCTCC， 保藏号 V200511）。

22、 或伪狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、 Bartha-K61 株 （保 藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏日期 ： 2011年7月21日， 保 藏号 ： CGMCC N0.5076） 专利公开号 CN102727884A。 、 Bucharest 株、 BUK 株、 H 株 （GCMCC， 保藏 号为 No.5013） 和 C 株 (CCTCC， 保藏编号 V201114) 的一种或任意几种的组合 ; 以及所述猪 链球菌病细菌抗原为灭活的猪链球菌血清2型SC株全菌抗原、 猪链球菌2型分离株HA9801 全菌抗原 （保藏编号 ： CGMCC N0.1446） 以。

23、及马链球菌兽医亚种 ATCC35246 全菌抗原 （保藏编 号 ： CGMCC N0.1446） 一种或任意几种的组合。 0016 上述各种菌株均可商业上获得。 0017 更优选地， 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗中， 所述的猪链球菌病 抗原为猪链球菌血清 2 型 SC 株 (Streptococcus suis Serotype2， Strain SC ； 保藏于中 说 明 书 CN 104248758 A 5 4/10 页 6 国典型培养物保藏中心， 简称为 CCTCC ； 保藏日期 ： 2011 年 10 月 12 日， 保藏号 ： CCTCC NO ： M2011351，。

24、 公开于专利申请 CN103157100A)。 0018 优选地， 所述猪伪狂犬病病毒抗原为 1.0106.0TCID50/ml， 所述猪链球菌病细菌 抗原为 1109CFU/mL。 0019 优选地， 本发明所述的猪链球菌、 猪伪狂犬病二联疫苗中， 所述的猪链球菌病抗原 为猪链球菌2型SC株， 所述猪链球菌2型SC株灭活抗原浓缩-重悬稀释液灭活前活菌数不 少于1109CFU/mL ； 所述的猪伪狂犬病病毒抗原为猪伪狂犬病病毒基因缺失株 （SA215株） ， 含量为 5.0105.0TCID50/ 头份， 优选地为 1.0106.0TCID50/ 头份。 0020 优选地， 所述疫苗组合物中猪。

25、伪狂犬病病毒抗原部分进一步包含冻干保护剂 ； 所 述疫苗组合物中猪链球菌病病菌抗原部分进一步包括佐剂。 0021 更优选地， 所述冻干保护剂包括脱脂牛奶、 明胶、 海藻糖、 牛血清白蛋白、 聚乙烯吡 咯烷酮、 山梨醇、 谷氨酸钠、 Vc 中的一种或几种 ； 所述佐剂包括铝盐佐剂、 Montanide IMS 佐 剂、 Montanide GEL 佐剂、 蜂胶、 免疫刺激复合物、 双向佐剂 206、 水包油性佐剂、 细胞因子类 佐剂、 核酸及其衍生物类佐剂、 卵磷脂类佐剂。 0022 所述佐剂为兽医学可接受的水性佐剂， 包括铝盐系列佐剂、 Montanide IMS 系列佐 剂或 Montani。

26、de GEL 系列佐剂， 蜂胶， 免疫刺激复合物， 双向佐剂 206， 水包油性系列佐剂， 细胞因子类佐剂， 核酸及其衍生物类佐剂， 卵磷脂类佐剂等。 0023 本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法， 所述方法包括 ： 1） 培养增殖猪伪狂犬病病毒， 加入冻干保护剂 ； 2） 培养增殖猪链球菌病细菌， 灭活， 加入佐剂 ； 3） 使用所述灭活的猪链球菌病病毒复原所述猪伪狂犬病病毒。 0024 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中， 还包括加入冻干 保护剂的步骤。 0025 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中， 猪链球菌病灭活 苗可以采用。

27、甲醛、 - 丙内酯 (BPL)、 缩水甘油醛 (GDA) 等其他灭活方法。 0026 本发明的另一目的在于提供上述猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法， 包括以下步骤 ： 分别培养猪链球菌病菌液和猪伪狂犬病病毒液， 获得猪链球菌病菌液和猪 伪狂犬病病毒液， 将猪链球菌病菌液和猪伪狂犬病病毒液按一定比例配制， 如使得猪链球 菌病菌液的含量为1109CFU/mL， 猪伪狂犬病病毒液的含量为1.0106.0TCID50/头份， 制备 成二联疫苗。 0027 优选地， 所述方法 2） 步骤中在所述灭活步骤完成后进一步包括浓缩步骤， 所述浓 缩步骤包括采用切向流超滤法、 离心法、 中孔纤维超滤法、。

28、 石棉以及活性碳吸附法、 凝胶层 析法、 铝胶吸附沉淀法。 0028 更优选地， 所述切向流超滤法所用超滤膜的截留分子量为 500KD 1000KD。 0029 本发明所述的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中， 还包括浓缩的步 骤。猪链球菌病抗原灭活液， 采用切向流超滤系统进行浓缩， 并同时除去毒素和杂蛋白， 所 用超滤膜的截留分子量为 500KD 1000KD。还可以采用其他分离技术进行浓缩， 并同时除 去毒素和杂蛋白。 所属其他技术包括 ： 离心法、 中孔纤维超滤法、 石棉以及活性碳吸附法、 凝 胶层析法、 铝胶吸附沉淀法等。 0030 本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在。

29、制备预防和治疗猪伪狂犬病病 说 明 书 CN 104248758 A 6 5/10 页 7 毒和猪链球菌病病菌相关疾病中的应用。 0031 由上可以看出， 本发明的二联疫苗提供了在治疗和预防猪链球菌病和猪伪狂犬病 的疫苗中应用。 0032 本发明的疫苗组合物副作用小， 不含内毒素， 具有较好的免疫安全性。 具体实施方式 0033 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换， 但这些修改和替。

30、换均落入本发明的保护范围内。 0034 本发明具体实施方式以猪链球菌病 2 型 SC 株， 猪伪狂犬病病毒 SA215 株说明本发 明。 0035 实施例 1 制备含猪链球菌病 2 型 SC 株， 猪伪狂犬病 （SA215 株） 的疫苗复合物 0036 1 猪链球菌灭活苗、 猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗二联疫苗的制备 0037 1.1 生产用菌种的制备 0038 猪链球菌病菌种的制备 ： 猪链球菌 2 型 SC 株冻干菌种， 划线接种于 Clumbia 羊血 平板上， 于 37条件下， 培养 18 24h 作为一级种子。选取符合要求猪链球菌 2 型 SC 株的 一级种子， 接种于含有 15ml/。

31、L 犊牛血清的改良马丁肉汤培养基中， 于 37条件下， 静置培 养 12 16h， 经羊血平板纯粹检验合格后作为二级种子即为生产用毒株。 0039 猪伪狂犬病病毒基因缺失株 （SA215 株） 的制备 ： 将猪伪狂犬病病毒基因缺失株 （SA215株， 为TK/gE/gI三基因缺失， 公开于中国专利CN101186902， 该毒株以保藏编 号 V200002 保藏于 CCTCC） 用病毒稀释液 （无血清的 DMEM 培养基） 作适当稀释， 按感染复数 （M.O.I） 为 0.1 接种于 ST 细胞 （购自 CCTCC， 编号 GDC0060） 培养， 37吸附 30min， 加入含 3%（v/v。

32、） 犊牛血清的 DMEM 细胞维持液， 37培养 2 4 日， 冻融 2 3 次， 收获病毒， 病毒 效价 108.5TCID50/ml。 0040 1.2 菌液病毒液的制备 0041 猪链球菌液的制备 ： 在猪链球菌培养基(市售改良马丁肉汤 ： 蛋白胨5.0g/L、 硫酸 镁 0.5g/L、 葡萄糖 20.0g/L、 酵母粉 2.0g/L、 磷酸氢二钾 1.0g/L) 中， 加入 1.5的犊牛血 清、 5的葡萄糖配制成制苗培养基， 将猪链球菌 2 型 SC 株生产用毒株按 5的量加进制苗 培养基中， 混合均匀后进行培养。 培养条件为 ： 温度为37， 搅拌转速为200rmp， DO为80 0。

33、， pH 值 7.4 6.5， 培养时间为 18h。当培养液的浓度 OD600达到 2.5 以上、 DO 值降至 0 后 又开始上升、 pH 值降低至 6.0 以下时停止培养， 收获抗原液。 0042 猪伪狂犬病病毒基因缺失株 （SA215 株） 的制备 ： 用转瓶细胞培养法， 将长满单层 的 ST 细胞， 倒去细胞培养液， 将毒种液按 M.O.I=0.1 的接种量接种于 ST 细胞上， 轻轻旋转 细胞瓶 2 周， 37吸附 30min， 加入细胞维持液， 置 37旋转 （10 12 转 / 小时） 培养。每 日观察 1 2 次， 细胞生长良好， 37培养 2 4 日收获细胞和细胞液， 冻融 。

34、3 次， 置 -20 以下保存。 0043 1.3 菌液病毒液的处理 0044 猪链球菌菌液的处理 ： 采用其他分离技术进行浓缩， 并同时除去毒素和杂蛋白。 所 说 明 书 CN 104248758 A 7 6/10 页 8 属其他技术包括 ： 离心法、 中空纤维超滤法、 石棉及活性碳吸附法、 凝胶层析法、 铝胶吸附沉 淀法等。 0045 猪伪狂犬病病毒基因缺失株病毒液的处理 ： 将病毒液用滤布 （孔径 1.2m 与 4.5m） 过滤， 除去细胞碎片。 0046 1.4 含量测定 0047 1.4.1 猪链球菌菌液的活菌数的测定 ： 猪链球菌用血琼脂平板进行活菌计数 （CFU） ， 以确定培养。

35、的菌数。 0048 1.4.2 猪伪狂犬病病毒基因缺失株 （SA215 株） 病毒含量测定 0049 将收获的病毒液做 10 倍系列稀释， 取 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-95 个稀释度， 分别接 种 ST 细胞单层的 96 孔细胞培养板上， 每个稀释度接种 8 个孔， 同时设立阴性不接毒对照， 放入 5%CO2温箱中 37培养 48 72h， 观察细胞病变 （CPE） ， 根据 Reed-Muench 法计算病毒 TCID50， 结果为病毒的含量 108.5TCID50/ml。 0050 1.5 猪链球菌病灭活疫苗的制备 0051 1.5.1.1 猪链球菌病 2 型。

36、 SC 株灭活苗的制备 0052 将检验合格的猪链球菌2型SC株抗原液按加入终浓度为0.2(V/V)甲醛溶液以 及终浓度为 0.01% 硫柳汞溶液， 37振荡灭活 24h。灭活后取样接种于羊血琼脂平板， 以确 认是否完全灭活。 0053 1.5.1.2 灭活检验 ： 取上述已灭活的菌液 5mL 接种于 100mL 含 1.5犊牛血清、 0.2的葡萄糖的链球菌培养基中 37培养 24 小时， 再移植于上述 100mL 培养基中 37培 养 24 小时。取灭活菌液 0.5mL 接种于血琼脂平皿上， 37培养 24 小时。两种方法培养后， 均应无菌生长。 0054 1.5.1.3 灭活抗原液进行安全。

37、性检验 0055 取已灭活的菌液静脉注射 18 22g 的 Balb/c 小鼠 5 只， 每只 0.2mL， 三天内 5/5 健活， 方为灭活彻底。 0056 1.5.1.4 灭活抗原液浓缩 0057 灭活抗原液用美国 Millipore 公司的 Pellicon 切向流超滤系统浓缩， 弃去上清， 制得其灭活抗原浓缩液。 0058 1.5.1.5 猪链球菌病灭活疫苗的配制 0059 用生理盐水重悬稀释上述灭活抗原浓缩液， 参照菌落计数结果， 将猪链球菌 2 型 SC 株的抗原浓缩液稀释至浓度为 1109CFU/mL。向上述已灭活并安检合格的菌液中加入 终浓度为 15 25% 氢氧化铝混合后乳化。

38、， 待液体成均一的混悬液即可。取样检验， 安检合 格后， 分装 20mL/ 瓶， -4保存备用。 0060 1.5.2 猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗 （SA215 株） 的制备 0061 1.5.2.1 冻干保护剂配方 ： 用水溶性明胶 0.5 1.5%、 牛血清白蛋白 0.8 2.5%、 海藻糖 5 10%、 聚乙烯吡咯烷酮 5 6%、 山梨醇 1.5 3%、 谷氨酸钠 1 3%、 Vc0.02 0.05%。 0062 1.5.2.2 配苗方法 ： 猪伪狂犬病病毒 （病毒含量为 1.0106.0TCID50/ 头份） 按 1:1 （V/V） 比例加入冻干保护剂， 充分摇均， 定量分装， 分装后。

39、迅速进行冷冻真空干燥后即得疫 苗成品即猪伪狂犬病抗原。分装成 20 头份 / 瓶， -4保存备用。 说 明 书 CN 104248758 A 8 7/10 页 9 0063 2. 猪链球菌和猪伪狂犬病免疫复合物的制备 0064 2.1 猪链球菌病 2 型 SC 株灭活苗、 猪伪狂犬病病毒耐热保护剂活疫苗 （SA215 株） 二联疫苗配制 0065 用猪链球菌液 （灭活前菌液含量为 1109CFU/mL） 灭活抗原液 20mL 把猪伪狂犬病 病毒 （病毒含量为 1.0106.0TCID50/ 头份） 冻干制品 （20 头份 / 瓶） 稀释成 1 头份使用即规 格是 20 头份 / 瓶， -4保存。

40、备用。 0066 2.2 猪链球菌和猪伪狂犬病免疫复合物的无菌检验 0067 取上述复合物， 按照 中华人民共和国兽药典 附录进行无菌检验， 无菌生长。 0068 3. 猪链球菌和猪伪狂犬病免疫复合物的使用方法 （免疫程序） 0069 （1） 按瓶签注明的头份， 肌肉注射使用。 0070 （2） 仔猪每次接种 1mL（1 头份） 。 0071 （3） 仔猪在产后 1 个月左右首免， 免疫后 1 个月再次免疫。母猪在产前 45 天左右 免疫。 0072 实施例 2 猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗安全性试验 0073 1.Balb/c 小鼠 ： 静脉注射 18 22g 的 Balb/c 小鼠 1。

41、0 只， 每只 0.4mL， 14 日内无 局部反应且全部健活。 0074 2.仔猪 ： 疫苗肌肉注射30日龄健康易感猪5头， 4mL， 14日内无局部反应且全部健 活。 0075 表 1 疫苗对 Balb/C 小鼠安全性试验结果 0076 0077 表 2 疫苗对仔猪安全性试验结果 0078 0079 说 明 书 CN 104248758 A 9 8/10 页 10 0080 从上述结果可知 ： 0081 Balb/C 小鼠安全性试验 ： 链球菌单苗免疫后无局部反应全部正常 ； 猪伪狂犬单苗 免疫后， 除1只有精神抑郁， 死亡外， 其余正常 ； 二联苗免疫后观察14日， 无局部反应且全部 键。

42、活。 0082 仔猪的安全试验 ： 链球菌单苗免疫后无局部反应全部正常 ； 猪伪狂犬单苗免疫 后， 除1只有体温升高， 食欲下降外， 其余正常 ； 二联苗免疫后观察14日， 无局部反应且全部 键活。 0083 注 ： 临床反应包括小鼠注射部位有无肿胀， 仔猪精神、 饮食、 体温是否正常。 0084 实施例 3 猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗效力检验 0085 1. 材料 0086 猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗， 选用实施例 1 中的疫苗制品 ； 猪链球菌病疫 苗， 选用实施例 1 中的猪链球菌病抗原， 其病毒含量与二联疫苗中的猪链球菌病抗原含量 相同， 为 1109CFU/mL。猪伪狂犬。

43、活疫苗， 选用实施例 1 中的猪伪狂犬病病毒抗原， 其病毒 含量与二联活疫苗中的猪伪狂犬病病毒抗原含量相同， 为 1.0106.0TCID50/ 头份。 0087 2. 动物试验设计 0088 选 28 35 日龄仔猪 30 头， 分为 3 组， 10 头 / 组。第 1 组 ： 5 头分别颈部肌肉注射 二联疫苗 1ml， 其余 5 头注射菌液培养基做对照， 免疫 28 天后， 以 5LD50的 HA9801（保藏编 号 ： CGMCC N0.1446， 参考专利 CN101745105A） 强毒株进行攻击 ； 第 2 组 ： 5 头分别颈部肌肉 注射二联疫苗 1ml， 其余 5 头注射 DM。

44、EM 做对照， 免疫 28 天后， 以 107.0TCID50/ 头份猪伪狂犬 病病毒强毒株 （Fa 株） 进行攻毒试验 ； 第 3 组 ： 5 头分别颈部肌肉注射二联疫苗 1ml， 其余 5 头注射 PBS 做对照， 免疫 28 天后， 以 5LD50的 HA9801 强毒株和 107.0TCID50/ 头份猪伪狂犬病 病毒强毒株 （Fa株） 进行攻毒试验 ； 连续观察14日， 测量仔猪体温、 观察仔猪临床症状 （直肠 温度变化， 是否有跛行， 呼吸是否正常， 有无神经症状） 和记录仔猪死亡情况。 0089 3. 试验结果 0090 表 3 二联疫苗效力检验试验结果 0091 说 明 书 C。

45、N 104248758 A 10 9/10 页 11 0092 即从上述结果可知 ： 1 组 ： 猪链球菌病强毒攻击后， 免疫组无临床症状， 对照组出 现跛行、 食欲减退甚至废绝， 呼吸急促并伴有抽搐、 滑水样运动等神经症状， 5 头猪全部发病 其中4头死亡 ； 2组 ： 猪伪狂犬强毒攻击后免疫组有个别有体温升高， 食欲减退， 但三天后恢 复正常， 对照组出现体温升高， 食欲减退甚至废绝， 转圈、 犬坐、 滑水样运动等神经症状， 5 头 猪全部发病其中3头死亡 ； 3组 ： 猪链球菌病强毒和猪伪狂犬强毒同时攻击后免疫组有个别 体温升高， 食欲减退， 但很快恢复正常 ； 对照组 ： 全部出现体温。

46、升高， 食欲减退， 转圈跛行， 关节红肿等神经症状， 5 头猪全部死亡。 0093 本发明的猪链球菌病、 猪伪狂犬病二联疫苗中对仔猪的链球菌的保护率是 100%， 不仅对猪伪狂犬病病毒的免疫效力得到了显著地增强， 而且在猪伪狂犬病病毒的强毒攻毒 情况下， 表现出更佳的免疫效力。 0094 注 ： 0095 猪伪狂犬病发病标准 0096 1精神、 食欲下降至少 3 天， 体温 40.5至少 2 天 ； 0097 2 出现咳嗽、 喘气、 呼吸急促、 打喷嚏等呼吸道症状 ； 或者转圈、 撞墙， 肌肉震颤、 犬 坐、 泳状姿势等神经症状。 0098 猪链球菌病的发病标准 0099 1直肠温度 40.5。

47、至少 2 天 ； 说 明 书 CN 104248758 A 11 10/10 页 12 0100 2出现共济失调， 肌肉颤抖， 后肢瘫痪至卧地不起， 泳状姿势等神经症状 ； 0101 3跛行， 关节红肿。 0102 本发明预防猪链球菌病和猪伪狂犬病的二联疫苗， 制备方法简单， 免疫方便快捷， 与现有技术中的分次免疫， 至少需要打 2 针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相 比， 降低了免疫成本， 节约了免疫程序， 更加经济可靠。 而且， 制备的二联疫苗与单苗免疫仔 猪的安全性和效力比较显示， 本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗， 且安全性更佳， 避免了 多次接种免疫出现的不良反应。 0103 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104248758 A 12 。