阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103305544 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103305544 A *CN103305544A* (21)申请号 201310282654.3 (22)申请日 2013.07.05 CGMCC No.7639 2013.05.24 C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 19/26(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/045(2006.01) (71)申请人 浙江海正药业股份有限公司 地址 318000 浙江省台州市椒江区外沙路 46 号 (72)发明人 黄。

2、隽 李美红 余贞 (74)专利代理机构 北京邦信阳专利商标代理有 限公司 11012 代理人 黄泽雄 陈悦军 (54) 发明名称 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种阿卡波糖工程菌、 制备该工 程菌的方法及该工程菌的应用。本发明的阿卡波 糖工程菌是通过接合转移的方法导入同源重组片 段将游动放线菌的treY基因灭活而获得。 所述阿 卡波糖工程菌发酵后， 产生的阿卡波糖 C 组分杂 质含量明显降低。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 8 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 。

3、权利要求书1页 说明书8页 序列表8页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103305544 A CN 103305544 A *CN103305544A* 1/1 页 2 1. 一种制备阿卡波糖工程菌的方法， 所述方法是将生产阿卡波糖的游动放线菌中的 treY 基因灭活 ； 所述灭活是通过将 DNA 片段 M 导入到游动放线菌中， 使 DNA 片段 M 与游 动放线菌的 treY 基因发生同源重组而完成 ； 所述同源重组是通过将游动放线菌的菌丝与 导入所述 DNA 片段 M 的重组菌共同培养进行接合转移而完成 ； 优选地， 所述游动放线菌是 Actinoplanes sp.SN223/29。

4、 ； 进一步优选地， 所述游动放线菌是游动放线菌 8-22 ； 所述 DNA 片段 M， 自 5 端到 3 端分别为同源臂 T1、 DNA 片段 N 和同源臂 T2 ； 所述同源 臂 T1 和同源臂 T2 能够与 treY 基因发生同源重组， 灭活 treY 基因 ； 所述片段 N 为连接片 段。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述DNA片段M中， 所述同源臂T1与treY 基因的上游序列同源重组 ； 优选地， 所述同源臂 T1 包括 treY 基因编码序列的 5 端 785bp 核苷酸 ； 所述同源臂T2与treY基因的下游序列同源重组 ； 优选地， 所述同源臂T2包括tre。

5、Y 基因编码序列的 3 端 930bp 核苷酸 ； 所述片段 N 为包含限制性核酸内切酶识别序列的片 段 ； 优选地， 所述片段 N 包含 BamHI 酶识别序列。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述DNA片段M的序列如SEQ ID NO:3所 示。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述导入 DNA 片段 M 的重组菌是将所述 DNA 片段 M 克隆至 pUAmT14 质粒的多克隆酶切位点而得到重组质粒 pAT-tre12， 再将重组质 粒 pAT-tre12 转化至大肠杆菌 ET12567(pUZ8002) 中所得到的重组菌。 5. 根据权利要求 1-4 。

6、任一项所述的方法， 其特征在于， 在将重组菌与游动放线菌共同 培养进行接合转移之前， 将所述游动放线菌以 37水浴 20 分钟。 6. 根据权利要求 1-5 任一项所述的方法制备的阿卡波糖工程菌， 其特征在于， 所述工 程菌中 treY 基因失活 ； 优选地， 所述阿卡波糖工程菌是游动放线菌 tre12-2#。 7. 根据权利要求 6 所述的阿卡波糖工程菌在制备阿卡波糖中的应用。 8. 一种制备阿卡波糖的方法， 其特征在于， 所述方法使用权利要求 6 所述的阿卡波糖 工程菌。 9.DNA 片段 M， 其特征在于， 所述片段 M 自 5 端到 3 端分别为同源臂 T1、 DNA 片段 N 和 同。

7、源臂 T2 ； 所述同源臂 T1 与 treY 基因的上游序列同源重组， 优选地， 所述同源臂 T1 包括 treY 基因编码序列的 5 端 785bp 核苷酸 ； 所述同源臂 T2 与 treY 基因的下游序列同源重 组， 优选地， 所述同源臂 T2 包括 treY 基因编码序列的 3 端 930bp 核苷酸 ； 所述片段 N 为连 接片段， 包含限制性核酸内切酶识别序列， 优选地， 所述片段N包含BamHI酶识别序列 ； 优选 地， 所述 DNA 片段 M 的序列如 SEQ ID NO:3 所示。 10. 包含权利要求 9 所述的 DNA 片段 M 的质粒或重组菌， 优选地， 所述质粒是 。

8、pAT-tre12 ； 优选地， 所述重组菌是将质粒pAT-tre12转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中 所得到的重组菌。 权 利 要 求 书 CN 103305544 A 2 1/8 页 3 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种利用基因工程方法构建的阿卡波糖工程菌， 更具体地， 涉及一种 降低了 C 组分杂质的阿卡波糖工程菌、 制备该工程菌的方法以及该工程菌的应用。 背景技术 0002 据统计， 目前我国糖尿病患者人数已达 9240 万人， 其中男性 5020 万人， 女性 4220 万人。发病人数超过印度， 成为世界糖尿病人最多的国家， 发病率。

9、 （9.7%） 仅次于美国 （11%） 。此外， 还有约 1.5 亿人为糖尿病前期， 每年治疗费用就达到 1740 亿元。 0003 游动放线菌 （Actinoplanes sp.） 产生的降糖药阿卡波糖是 II 型糖尿病的首选 治疗药物， 国内年销售额已近 20 亿元。目前阿卡波糖在生产上主要存在杂质组分问题， 严 重影响产品质量 ； 其中最为突出的是 C 组分杂质 （Yvonne Rockser,Udo F.Wehmeier.The gac-gene cluster for the production of acarbose from Streptomyces glaucescens G。

10、LA.O-Identification,isolation and characterization.Journal of Biotechnology， 第 140 卷， 第 1-2 期， 2009 年 3 月 10 日， 114-123 页） 。一般情况下， 产品中对 C 组分杂质含 量的要求是在 0.1% 以下， 杂质含量不达标的产品不能进入销售渠道。然而现有的由游动放 线菌发酵工程生产的阿卡波糖中， C 组分杂质含量普遍在 2.5% 以上。为保证产品质量， 需 要进行后续提纯步骤， 导致工艺复杂， 生产成本提高。 0004 目前使用较多的是通过控制发酵过程来控制杂质组分的含量， 但是该方。

11、法不稳 定。 0005 根据文献报导 （ppl Microbiol Biotechnol(2008)80:767-778） ， 产生阿卡波糖 C 组分杂质有两条途径 ： 一是阿卡波糖经过 treY 基因编码的麦芽寡糖基海藻糖合酶催化反 应直接得到 C 组分杂质 ； 二是由 treS 基因编码的海藻糖酶合成海藻糖， 再进入合成途径得 到 C 组分杂质。因此， 通过基因重组的方法控制 C 组分杂质也是一种途径。 0006 利用接合转移方法进行转化的技术在链霉菌和其它一些放线菌中已广泛应用， 但 在游动放线菌中鲜有报道， 而且传统的接合转移方法对游动放线菌的转化效率极低， 不适 合进行基因重组。例如。

12、， 现有技术中， 采用 50热击 10 分钟对大肠杆菌和放线菌进行接合 转移 （Practical Streptomyces Genetics,2000,Tobias Kieser等） ， 但该温度和时间对游 动放线菌和大肠杆菌的接合转移不适用。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种阿卡波糖工程菌， 使发酵产生的阿卡波糖 C 组分杂质显 著下降。 0008 在第一个方面， 本发明提供一种制备阿卡波糖工程菌的方法， 所述方法是将生产 阿卡波糖的游动放线菌中的 treY 基因灭活， 所述 treY 基因的编码序列如 SEQ ID NO:1 所 示 ； 所述灭活是通过将DNA片段M导入到游动放。

13、线菌中， 使DNA片段M与游动放线菌的treY 基因发生同源重组而完成 ； 所述同源重组是通过将游动放线菌的菌丝与导入所述 DNA 片段 说 明 书 CN 103305544 A 3 2/8 页 4 M 的重组菌共同培养进行接合转移而完成 ； 0009 所述 DNA 片段 M， 自 5 端到 3 端分别为同源臂 T1、 DNA 片段 N 和同源臂 T2 ； 所述 同源臂 T1 和同源臂 T2 能够与 treY 基因发生同源重组， 灭活 treY 基因 ； 所述片段 N 为连接 片段。 0010 优选地， 所述同源臂 T1 与 treY 基因的上游序列同源重组 ； 进一步优选地， 所述同 源臂 。

14、T1 包括 treY 基因编码序列的 5 端 785bp 核苷酸。 0011 优选地， 所述同源臂 T2 与 treY 基因的下游序列同源重组 ； 进一步优选地， 所述同 源臂 T2 包括 treY 基因编码序列的 3 端 930bp 核苷酸。 0012 优选地， 所述片段 N 为包含限制性核酸内切酶识别序列的片段 ； 进一步优选地， 所 述片段 N 包含 BamHI 酶识别序列。 0013 同源重组的原理是本领域技术人员已知的。所述 DNA 片段 M 分别在同源臂 T1 和 同源臂 T2 包括 treY 基因编码序列的 5 端和 3 端序列， 但缺失 treY 基因中间一部分编码 序列。当 。

15、T1、 T2 与出发游动放线菌的 treY 基因的上下游发生同源重组， 所述 DNA 片段 M 将 被重组至游动放线菌的基因组中 ； 因其缺失 treY 基因的部分序列， 无法表达正常产物或不 表达， 从而使构建的游动放线菌中的 treY 基因灭活。本领域技术人员可以理解， 当 treY 基 因的 5 端和 3 端分别被扩增后， 需要将二者连接起来以形成完整的 DNA 片段。通常情况 下， 本领域技术人员将使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段。 限制性内切酶的选择、 包含限制性内切酶识别序列的引物设计、 PCR 扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领 域技术人员根据所使用的质粒、 菌株和实验。

16、条件可以选择和判断的。 0014 所述 treY 基因的编码序列如 SEQ ID NO:1 所示， 其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 0015 在一种优选的实施方式中， 所述片段 M 的序列如 SEQ ID NO:3 所示。 0016 本发明中使用的游动放线菌可以是任何能够生产阿卡波糖的游动放线菌。优选 地， 所述游动放线菌是Actinoplanes sp.SN223/29。 在一种具体的实施方式中， 所述游动放 线菌是游动放线菌Actinoplanes sp.8-22， 所述游动放线菌Actinoplanes sp.8-22是保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物。

17、中心 （CGMCC） （北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号） 的编号为 CGMCC No.7639 的游动放线菌， 保藏日期为 2013 年 5 月 24 日。所述游动 放线菌 8-22 不产孢， 气生菌丝生长紧致， 颜色由橙色至棕黄色， 产色素。 0017 本发明方法通过构建包含 DNA 片段 M 的质粒和重组菌， 利用重组菌与出发游动放 线菌同源重组而完成。本领域技术人员可以根据实验条件而选择合适的原始质粒和菌株， 构建出合适的包含 DNA 片段 M 的质粒和重组菌。 0018 优选地， 所述导入 DNA 片段 M 的重组菌是将所述 DNA 片段 M 克隆至 pUAmT14 质粒 的。

18、多克隆酶切位点而得到重组质粒 pAT-tre12， 再将重组质粒 pAT-tre12 转化至大肠杆菌 ET12567(pUZ8002) 中所得到的重组菌。 0019 在一种优选的实施方式中， 所述方法包括以下步骤 ： 构建包含DNA片段M的重组质 粒， 制备重组菌， 将重组菌与游动放线菌共同培养进行接合转移， 使 DNA 片段 M 与游动放线 菌的 treY 基因发生同源重组， 筛选 treY 基因缺失失活的交换株。 0020 优选地， 所述方法中， 在将重组菌与游动放线菌共同培养进行接合转移之前， 将所 述游动放线菌以 37水浴 20 分钟。 说 明 书 CN 103305544 A 4 3。

19、/8 页 5 0021 上述优选的处理游动放线菌的条件可以用于本发明的任一种制备阿卡波糖工程 菌的方法中。 0022 在第二个方面， 本发明提供一种阿卡波糖工程菌， 所述工程菌由本发明的方法制 备而成， 所述工程菌中 treY 基因失活。优选地， 所述工程菌是游动放线菌 tre12-2#， 所述 游动放线菌 tre12-2# 是游动放线菌 8-22 的 treY 基因与序列为 SEQ ID NO:3 的 DNA 片段 M 发生同源重组后产生的 treY 基因失活的游动放线菌。 0023 在第三个方面， 本发明提供所述阿卡波糖工程菌在制备阿卡波糖中的应用。 0024 在第四个方面， 本发明提供一。

20、种制备阿卡波糖的方法， 所述方法使用本发明的阿 卡波糖工程菌， 尤其是游动放线菌 tre12-2#， 进行发酵。 0025 在第五个方面， 本发明提供DNA片段M、 包含所述DNA片段M的重组质粒或重组菌。 所述 DNA 片段 M、 重组质粒和重组菌如本申请第一个方面所述。 0026 本发明的阿卡波糖工程菌发酵的阿卡波糖中 C 组分杂质含量明显降低， 由出发菌 株的0.18%降到0.06%以下， 而阿卡波糖的发酵单位没有受到影响。 利用本发明的阿卡波糖 工程菌发酵的阿卡波糖中杂质组分含量低， 产品质量可以得到保证， 不需要进行后续提纯， 减少工艺步骤， 降低生产成本。 附图说明 0027 图 。

21、1 是用于 treY 基因双交换的重组质粒 pAT-tre12 构建过程示意图 ； 0028 图 2 是游动放线菌自杀型质粒 pUAmT14 的结构及酶切位点示意图 ； 0029 图3是构建的质粒pUAmT14的酶切电泳检测图 ； 其中M是DNA Ladder， 泳道1-3分 别是以 Bgl I、 Hinc 和 Xba I 酶切质粒 pUAmT14 后的电泳图 ； 0030 图 4 是重组质粒 pAT-tre1 的结构及酶切位点示意图 ； 0031 图 5 是重组质粒 pAT-tre12 的结构及酶切位点示意图 ； 0032 图 6 是构建的重组质粒 pAT-tre1、 pAT-tre12 的。

22、酶切电泳检测图 ； 其中， 泳道 1-6 分别是构建的 6 个 pAT-tre12 质粒以 Pst 酶切后的电泳图， 泳道 7 是 pAT-tre1 质粒以 Pst 酶切后的电泳图， M 是 DNA Ladder（Fermentas#SM0333） ； 0033 图 7 是 treY 基因双交换原理及酶切位点示意图 ； 0034 图 8 是 treY 基因缺失重组子 PCR 筛选的电泳图 ； 其中 1 7 泳道是待检测菌株 tre12-1# tre12-7# ； 8、 10 是具有安普霉素抗性的对照 （单交换） ； 9 是出发菌株 8-22（负 对照） ； 11 是质粒 pAT-tre12（正。

23、对照） ； M 是 DNA ladder（Fermentas， #SM0333） ； 0035 图 9 是对照菌 8-22 的发酵产物阿卡波糖以及 C 组分杂质的 HPLC 图谱。 0036 图 10 是 tre12-2# 工程菌的发酵产物阿卡波糖以及 C 组分杂质的 HPLC 图谱。 具体实施方式 0037 下面将结合具体实施例和附图说明本发明， 但本发明的内容不限于此。如没有特 殊说明， 下面实施例中所使用的试剂均是常规化学试剂商店可购得的 ； 所使用的方法及其 参数都是本领域技术人员根据现有技术或公知常识可以完成的。 0038 本发明的制备和筛选阿卡波糖工程菌的方法可以概括为以下步骤 ：。

24、 0039 1、 利用 PCR， 以游动放线菌的基因组为模板， 分别扩增 treY 基因上游的 3057bp 片 说 明 书 CN 103305544 A 5 4/8 页 6 段 （其中包括 treY 基因的编码序列 5 端 785bp） ， 两端分别加入 EcoRI 和 BamHI 酶切位点 ； 以及下游 2885bp 片段 （其中包括 treY 基因的编码序列 3 端 930bp） ， 两端分别加入 BamHI 和 Hind III 酶切位点。将这两个片段依次插入到放线菌自杀型质粒 pUAmT14 的相应酶切 位点， 得到用于灭活treY基因的重组质粒pAT-tre12。 该质粒的treY。

25、基因因为缺失了内部 的 553 个碱基而失去原有的生物活性。 0040 2、 将重组质粒pAT-tre12转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(中科院上海生理生 态研究所覃重军老师提供 ) 后， 通过接合转移的方法转化到阿卡波糖产生菌游动放线菌。 0041 3、 筛选 treY 基因缺失失活的双交换株， 进行摇瓶发酵试验。 0042 结果表明， 阿卡波糖 C 组分杂质的含量由出发菌株的 0.18% 降到 0.06% 以下， 而阿 卡波糖的发酵单位没有受到影响。 0043 实施例 1 ： 用于敲除 treY 基因的重组质粒 pAT-tre12 的构建 （构建过程示意图如 图 1 所示）。

26、 0044 a) 放线菌自杀型质粒 pUAmT14 的构建 ： 克隆载体 pUC19（Fermentas）以 Dra I(TaKaRa)和Ssp I(TaKaRa)双酶切 ； 质粒pIJ773(中科院上海生理生态研究所覃重军老师 提供） 以 Xba I(TaKaRa) 和 BstB I(TaKaRa) 双酶切， 并以 BLK 试剂盒 (TaKaRa) 补平末端。 将上述两个片段连接， 得到放线菌自杀型质粒pUAmT14。 质粒pIJ773在文献Gust B,Kieser T and Chater K,F.technology:PCR-targeting system in Streptomyc。

27、es coelicolor.John Innes Centre.2002 中有详细说明。质粒 pUAmT14 的结构及酶切位点如 图 2 所示。利用 Bgl I、 Hinc 和 Xba I 酶切质粒 pUAmT14 以鉴定构建的质粒是否正确， 质 粒酶切电泳图如图 3 所示。 0045 b)游动放线菌基因组的分离 ： 取游动放线菌8-22冻存管菌液200l接种于30ml TSB 培养基 （Bacto TM Tryptic Soy Broth.BD 公司， 货号 211825） ， 28， 220rpm 培养 48hr 后， 于50ml离心管中， 4000rpm离心10分钟， 去上清， 沉淀用3。

28、0ml蔗糖-Tris缓冲液 （10.3% 蔗糖， 10mM Tris-HCl， pH8.0） 洗涤 2 遍后， 以 5ml 蔗糖 -Tris 缓冲液悬浮。加入 100mg/ml 溶菌酶溶液 20l， 37水浴 2hr。加入 10%SDS 溶液 500l， 温和颠倒直至基本澄清。加 酚 - 氯仿 - 异戊醇 （25:24:1， pH8.0） 溶液 5ml， 温和颠倒数次后， 4000rpm 离心 10 分钟。取 上层溶液 4ml， 加酚 - 氯仿 - 异戊醇 （25:24:1， pH8.0） 溶液 4ml， 温和颠倒数次后 4000rpm 离 心 10 分钟。取上层溶液 3ml， 加入 3mol。

29、/L 的 HAc/NaAc 缓冲液 （pH5.3） 300l， 异丙醇 3ml， 温和颠倒数次后， 将结团的沉淀用吸头挑到 1.5ml 离心管中。沉淀用 70% 乙醇洗涤 2 遍后， 室温干燥。加入 500l Tris-HCl（pH8.0） 溶解， 得到游动放线菌 8-22 的总 DNA。 0046 c)treY 基因上游片段的扩增和克隆 ： 引物为 ： 0047 treU1 ： atcgaattcCGTAAGGGGATAAATTAGCGCC（SEQ ID NO:4） ； 0048 treD1 ： atcggatcctATCTTCTCGATCACCAGCCAGG（SEQ ID NO:5） 。 。

30、0049 按以下配比配制反应液 ： 0050 说 明 书 CN 103305544 A 6 5/8 页 7 0051 （PrimeSTAR 试剂盒， TaKaRa） 0052 进行 PCR 反应， 程序为 ： 0053 95 5 分钟， 0054 (98 10 秒、 55 30 秒、 72 3 分钟 )25 个循环， 0055 72 5 分钟， 0056 16 1 分钟。 0057 PCR 产物以 PCR 产物回收试剂盒 （上海华舜生物技术有限公司） 回收后， 以 EcoRI 和 BamHI 双酶切， 回收产物与以 EcoRI 和 BamHI 双酶切的载体 pUAmT14 连接， 得到重组质粒。

31、 pAT-tre1。 0058 d)treY 下游片段的扩增和克隆， 引物为 ： 0059 treU2 ： atcggatccACCGACGAGTTCCACGAGTGCT（SEQ ID NO:6） ； 0060 treD2 ： atcaagcttGACCGCAGTCGCGAGTTGTCAT（SEQ ID NO:7） 。 0061 按以下配比配制反应液 ： 0062 0063 进行 PCR 反应， 程序为 ： 0064 95 5 分钟， 0065 (98 10 秒、 55 30 秒、 72 3 分钟 )25 个循环， 0066 72 5 分钟， 0067 16 1 分钟。 0068 PCR 产物。

32、以 PCR 产物回收试剂盒 （上海华舜生物技术有限公司） 回收后， 以 BamHI 和 Hind III 双酶切， 回收产物与以 BamHI 和 Hind III 双酶切的质粒 pAT-tre1 连接， 得到 重组质粒 pAT-tre12。 说 明 书 CN 103305544 A 7 6/8 页 8 0069 质粒 pAT-tre1、 pAT-tre12 的结构及酶切位点分别如图 4、 5 所示。利用 PstI 酶切 构建的质粒以检测质粒是否正确。质粒 pAT-tre1、 pAT-tre12 的酶切电泳图如图 6 所示。 0070 进一步通过测序检验pAT-tre12质粒中引物treU1和t。

33、reD2之间的序列， 其中从序 列 CGTAAGGGGATAAATTAGCGCC（引物 treU1 部分序列） 开始至序列 ATGACAACTCGCGACTGCGGTC （引物 treD2 的反向互补序列的部分序列） 之间的序列即为 SEQ ID NO:3 所示的连接片段 M 的序列。 0071 实施例2 ： 将treY基因缺失的重组质粒pAT-tre12转化到宿主菌游动放线菌8-22 0072 a) 将重组质粒 pAT-tre12 转化到大肠杆菌 ET12567(pUZ8002) ： 取 1l 重组质粒 pAT-tre12 加入到 100l 大肠杆菌 ET12567(pUZ8002) 感受态。

34、细胞 （以 CaCl2法制备） 中， 冰 上放置 30 分钟后， 42热击 90 秒， 再迅速放到冰上冷却 1 分钟， 加入 900l LB 培养， 37 水浴 50 分钟。取 100l 涂布于含 25g/ml 氯霉素 （Cm） 、 50g/ml 卡那霉素 （Km） 、 50g/ ml 安普霉素 （Am） 的固体 LB 培养上， 37培养过夜， 长出转化子， 挑选其中一个转化子并鉴 定已转入质粒 pAT-tre12， 命名为 ET12567(pUZ8002,pAT-tre12)。 0073 b) 大肠杆菌 ET12567(pUZ8002,pAT-tre12) 的培养 ： 挑一个转化子单菌落于 。

35、3ml 含 25g/ml Cm、 50g/ml Km 和 50g/ml Am 的液体 LB 培养基中， 37， 250rpm 培养过 夜， 菌液 300l 接种于 30ml 含 Cm、 Km、 Am 的液体 LB 培养基中， 37， 250rpm 培养 4-6h， 至 OD600 为 0.4-0.6 之间。收集菌液， 离心后， 以 LB 培养基洗涤 2 遍， 最后以 3ml LB 培养基悬 浮， 备用。 0074 c)宿主菌8-22菌液的准备 ： 从平板上刮下游动放线菌8-22的菌丝， 在30mlTSB培 养基中， 28培养24-40h， 至菌液变成黑色。 取3ml菌液转接于30ml TSB培。

36、养基中， 28培 养 6h。取 500l 菌液， 离心去上清后， 以 500l2YT 培养基悬浮， 37水浴 20min， 自然 冷却， 备用。 0075 d) 接合转移 ： 取 500l b) 的菌液加入到 500l c) 的菌液中， 离心去掉 800l 上清。以剩余的上清悬浮菌体， 并涂布于 MS 培养基。28培养 16-20h 后， 以含有 625g Am 和 500g 萘啶酮酸 （Nal） 的 1ml 无菌水覆盖， 28培养 4-8d， 长出转化子。 0076 双交换过程的原理图如图 7 所示。 0077 实施例 3 ： treY 基因缺失的游动放线菌工程菌的筛选培养 0078 a)挑。

37、一个转化子， 在含有25g/ml Am和25g/ml Nal的YMS培养基上划线， 28 培养 4-6d。将生长的菌落在不含抗生素的 YMS 培养基上 28连续培养 2 代后， 再在不含抗 生素的 YMS 培养基上划线分离单菌落， 28培养 4-6d。 0079 b)用牙签将a)得到的单菌落分别于含和不含25g/ml Am的YMS培养基上点种， 28培养 4-6d。挑选在含 25g/ml Am 的 YMS 培养基上不生长而在不含 Am 的 YMS 培养基 上生长的菌落， 在不含抗生素的 YMS 培养基上进行放大培养。 0080 实施例 4 ： treY 基因缺失的游动放线菌工程菌的鉴定 008。

38、1 利用 PCR 方法对放大培养的菌株进行筛选， 所用的引物为 ： 0082 treY1 ： TTCTACGACATCGACTGGGAGC（SEQ ID NO:8） ； 0083 treY2 ： GTAGATCCGGTCGACCATCTCC（SEQ ID NO:9） 。 0084 按以下配比配制反应液 ： 0085 说 明 书 CN 103305544 A 8 7/8 页 9 0086 15l/ 管分装， 分别用牙签挑取实施例 3-b) 所筛选的菌落为模板进行 PCR 反应， 并以 0.2l8-22 总 DNA 和重组质粒 pAT-tre12 分别为负对照和正对照。PCR 反应程序为 ： 00。

39、87 95 10 分钟， 0088 (94 30 秒、 55 30 秒、 72 1 分钟 )30 个循环， 0089 72 5 分钟， 0090 16 1 分钟。 0091 PCR 产物大小为 1347bp 的是回复突变， 即其基因型与出发菌株 8-22 相同 ； PCR 产 物大小为 801bp 的是 treY 基因缺失的游动放线菌工程菌。图 8 是 PCR 筛选的电泳图。选 择第2#菌， 命名为tre12-2#， 对该菌株进行测序鉴定， 测序结果如SEQ ID NO:10所示。 PCR 电泳结果与测序结果说明该菌株即是本发明预期的菌株。 0092 实施例 5 ： treY 基因缺失的游动放。

40、线菌工程菌 tre12-2# 的发酵检验 0093 将treY基因缺失的游动放线菌工程菌tre12-2#在YMS培养基上28培养3-4天 后， 将面积为 1cm2左右菌落挖到 30ml 种子培养基 （黄豆饼粉 3.0%， 玉米淀粉 1.0%， 葡萄糖 1.0%， 甘油 2.0%， CaCO30.20%， pH 自然） 中， 28， 220rpm 培养 24-30hr， 以 2ml 的接种量转 接到发酵培养基 （葡萄糖 3.0%， 麦芽糖 5.0%， 黄豆饼粉 1.2%， K2HPO40.10%， CaCl2H2O0.35%， FeCl30.05%， CaCO30.3%， 谷氨酸钠 0.1%） 。

41、， 28， 220rpm 培养 7-8d。取发酵液 5ml 过滤后， 取 1ml滤液， 加入4ml无水甲醇， 浸泡过夜后， 过滤。 取滤液以HPLC检验阿卡波糖及C组分杂质 的含量。 HPLC方法为 ： 氨基柱， 流动相为KH2PO40.87g、 K2HPO40.46g、 乙腈2550ml、 H2O1450ml。 波长 210nm， 流速 1ml/ 分钟。以同样的方法检测出发菌株 8-22 的发酵产物以进行对比。 0094 检测结果在图 9、 图 10 和表 1、 表 2 中示出， 其中表 1 和表 2 分别是图 9 和图 10 的 峰表 （检测器 A 通道 1/210nm 检测值） 。 00。

42、95 表 1 ： 对照菌 8-22 的发酵产物阿卡波糖以及 C 组分杂质的 HPLC 图谱的峰表 0096 峰 # 保留时间面积高度面积 %高度 % 129.23313425022942.9765.271 233.311799169821.7712.258 334.249101172720.2240.626 *436.95742797093981294.85691.499 说 明 书 CN 103305544 A 9 8/8 页 10 *545.29578241500.1730.346 总计 451181743511100.000100.000 0097 峰 *4 代表阿卡波糖， 峰 *5 代。

43、表 C 组分杂质。 0098 表 2 ： tre12-2# 工程菌的发酵产物阿卡波糖及 C 组分杂质的 HPLC 图谱的峰表 0099 峰 # 保留时间面积高度面积 %高度 % 129.15411363020451.9393.637 233.17810197912111.7402.154 334.554174323700.2970.659 *436.80356246325260495.97393.545 *545.137297130.0510.006 总计 586064556234100.000100.000 0100 峰 *4 代表阿卡波糖， 峰 *5 代表 C 组分杂质。 0101 如图 。

44、9 和 10 所示， 阿卡波糖和 C 组分杂质的保留时间分别为 37 分钟和 45 分 钟左右 ； 进一步由表 1 和表 2 可知， tre12-2# 工程菌发酵液样品中的阿卡波糖峰面积 大于对照菌株 8-22 的阿卡波糖峰面积。结果表明， 与出发菌株 8-22 相比， treY 基因缺 失的游动放线菌工程菌 tre12-2# 的 C 组分杂质含量从 0.18%（C 组分杂质 ： 阿卡波糖 =7824:4278709=0.18%） 降至 0.053%（C 组分杂质 ： 阿卡波糖 =2971:5624632=0.053%） ， 而阿 卡波糖的含量则略有提高。 说 明 书 CN 103305544。

45、 A 10 1/8 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103305544 A 11 2/8 页 12 0003 序 列 表 CN 103305544 A 12 3/8 页 13 0004 序 列 表 CN 103305544 A 13 4/8 页 14 0005 序 列 表 CN 103305544 A 14 5/8 页 15 0006 序 列 表 CN 103305544 A 15 6/8 页 16 0007 序 列 表 CN 103305544 A 16 7/8 页 17 0008 序 列 表 CN 103305544 A 17 8/8 页 18 序 列 表 CN 103305544 A 18 1/5 页 19 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103305544 A 19 2/5 页 20 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103305544 A 20 3/5 页 21 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103305544 A 21 4/5 页 22 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103305544 A 22 5/5 页 23 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103305544 A 23 。