说明书1-甲基-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽、其合成、纳米结构、抗血栓作用和应用
技术领域
本发明涉及通式I代表的1-甲基-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽(式中AA为Ser, Val或Phe), 涉及它们的制备方法, 涉及它们的纳米结构, 涉及它们对凝血酶诱导的血小板聚集的高度选择性, 涉及它们的强抗血栓活性以及作为抗血栓剂的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
在全球范围内, 血栓性疾病的发病率和死亡率都居首位。通常, 血管损伤处所发生的止血作用称为生理性凝血, 血管壁未受损伤发生的止血过程称为血栓形成。血栓形成与凝血系统有关。根据反应起始点的凝血因子和复合物形成的途径, 凝血系统可分为内源性和外源性两种凝血系统。
内源性凝血系统的凝血酶原复合物的形成完全依赖于血浆中的凝血因子。具体凝血过程是, 血浆中的凝血因子XII与受损伤的血管壁内的胶原或基膜接触,被激活成XIIa, 然后催化因子XI成为Xia。XIa继而催化因子IX成为IXa。因子IXa, 因子VIII, Ca2+和血小板磷脂等共同催化因子X成Xa。 Xa与因子V, Ca2+和血小板磷脂形成“凝血酶原激活物”。
外源性凝血系统是指组织受外伤时,释放出因子III,发动的凝血过程。因子III是一种脂蛋白,它与血浆因子VIII和Ca2+形成复合物, 该复合物可催化因子X成Xa。Xa与因子V在血小板磷脂和Ca2+参与下形成“凝血酶原激活物”。
凝血酶原没有活性, 在Ca2+与凝血酶原激活物的作用下转变为凝血酶。凝血酶除了能催化纤维蛋白形成外, 还能够促进血小板磷脂的释放以及增强因子VIII与因子V的活性, 加速血凝过程。
纤维蛋白原是一种二聚体蛋白质,在血浆中呈溶解状态。凝血酶将其水解为单体,然后各单体之间以氢键作用,聚合在一起成为多聚体。此多聚体不稳定, 在Ca2+的参与下, 因子a催化多聚体中的单体, 使之相互反应形成共价键。这样的纤维蛋白多聚体才是稳定的,并呈不溶解状态。它们相互连接, 以蛋白质细丝纵横交错织成网状, 将各种血细胞, 尤其是GP IIb/IIIa血小板表面糖蛋白受体活化的血小板, 网罗其中形成血块。GP IIb/IIIa血小板表面糖蛋白受体活化时与纤维蛋白原a链及纤维蛋白原g链的RGDS，RGDV和RGDF序列结合的关键位点外化, 加速血凝过程。
这些知识说明, 抑制凝血酶是防止血栓的最根本的手段。在长期的研究中, 发明人逐渐认识到结构式II代表的(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸对凝血酶有一定的选择性抑制作用。在长期的研究中, 发明人逐渐认识到在II的3位羧基偶联RGD肽形成通式I代表的1-甲基-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽(式中AA为Ser, Val或Phe) 对凝血酶有高度的选择性抑制作用。这种核心创新和关键技术的进步必然使本发明的化合物的抗血栓有效剂量大幅度下降。于是, 发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供通式I代表的三种新型1-甲基-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 特征在于其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe。
本发明的第二个内容是提供制备三种新型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 特征在于其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe, 的方法, 该方法由以下步骤构成:
(1) 在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下采用液相法制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl 和Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
(2) 在氯化氢-乙酸乙酯溶液中将Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl 和Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Phe-OBzl脱除Boc, 生成HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl 和HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Phe-OBzl;
(3) 在稀硫酸中, 室温下, L-Trp与乙醛反应12 h直接生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸,并以无色固体的形态从反应液中沉淀析出;
(4) 将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的2位N用Boc保护生成(1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸;
(5) 在DCC)和HOBt)存在下将(1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的3-羧基与HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, HCl·Arg(NO2)-Gly- Asp(OBzl)-Val-OBzl 或HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Phe-OBzl偶联生成(1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-OBzl, (1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)- Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl, (1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
(6) 在氯化氢-乙酸乙酯溶液中将(1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, (1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl和(1S,3S)-1-甲基-2-Boc-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱除Boc, 生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly- Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, (1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl和(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl;
(7) 在三氟乙酸中, 在三氟甲磺酸存在下将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly- Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl, (1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl和(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl脱保护基生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser, (1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val和(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Phe。
本发明的第三个内容是描述通式I代表的三种新型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe, 在水溶液中生成的纳米球, 特征在于在10-11 M时(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser生成的纳米球的直径为23 - 95 nm,(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val生成的纳米球的直径为20 - 62 nm, (1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Phe生成的纳米球的直径为50 - 82 nm。
本发明的第四个内容是描述通式I代表的三种新型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe, 的抗血小板聚集活性, 特征在于高度选择性地抗凝血酶诱导的血小板聚集活性。
本发明的第五个内容是描述通式I代表的三种新型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe, 的抗血栓活性, 特征在于有效剂量低达0.001 nmol/kg。
本发明的第六个内容是阐明通式I代表的三种新型(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰RGD肽, 其咔啉的1位碳和3位碳都是S构型, 其肽链中的AA为Ser, Val或Phe, 在制备抗血栓剂中的应用。
缩略语
THF 四氢呋喃
DCC 二环己基酰亚胺
DCU 二环己基脲
HOBt N-羟基苯并三唑
NMM N-甲基吗啉
附图说明
图1 4a-c的合成路线图。
图2 浓度为10-11 M的4a-c的透射电子显微镜照片, 左为4a的纳米球, 中为4b的纳米球, 右为4c的纳米球。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
将6.0 g (18.79 mmol) Boc-Arg(NO2) 溶解于200 ml干燥的THF, 加入2.79 g (20.67 mmol) HOBt, 搅拌使溶解。冰浴和搅拌下向该溶液中滴加4.64 g (22.55 mmol) DCC和 50 ml干燥THF的溶液。冰浴和搅拌下反应30分钟, 加入6.67 g (19.74 mmol)Tos·Gly-OBzl, 并滴加9 ml NMM调节反应液的pH至9, 室温搅拌反应12 h, TLC显示Boc-Arg(NO2)消失。滤除DCU, 减压浓缩去THF, 残留物加5 ml乙酸乙酯溶解, 再次滤除DCU。残留物再加320 ml乙酸乙酯溶解, 溶液依次使用饱NaHCO3洗三次, 饱和NaCl洗三次, 5% KHSO4洗三次, 饱和NaCl洗三次, 5% NaHCO3洗三次, 饱和NaCl洗三次。将乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4, 滤液减压浓缩, 得到8.0 g (91%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 467 [M + H]+。
实施例2 制备Boc-Arg(NO2)-Gly
将 6.0 g (12.85 mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶解于20 ml甲醇, 冰浴和搅拌下加30 ml NaOH (2N) 水溶液调pH 14, 搅拌1小时, TLC显示Boc-R(NO2)-Gly- OBzl消失。用2N 盐酸调反应液pH至2, 减压浓缩, 残留物用20 ml蒸馏水稀释, 用乙酸乙酯萃取, 每次150 ml, 萃取三次。合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗三次, 乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥过夜。过滤除, 滤液减压浓缩, 得到4.85 g(100%)标题化合物，为无色油状产物。ESI/MS 377 [M + H]+。
实施例 3制备Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将2.3 g (7.12 mmol) Boc-Asp-(OBzl) 溶解于150 ml干燥的THF, 加入1.06 g (7.83 mmol) HOBt, 搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加1.76 g (8.54 mmol) DCC与50 ml干燥THF的溶液, 反应30分钟。冰浴和搅拌下将2.40 g (7.48 mmol) HCl·Ser(Bzl)-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加4 ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12 h，TLC显示Boc-Asp-(OBzl)消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180 ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5% KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5% NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤, 减压浓缩, 得3.86 g (92%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 591 [M + H]+。
实施例 4制备HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
将 3.65 g (6.18 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于30 ml 氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N), 冰浴下搅拌1小时, TLC显示Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl消失。反应液减压浓缩, 残留物加5 ml乙酸乙酯溶解, 减压浓缩, 得到的无色固体再用5 ml乙酸乙酯溶解, 减压浓缩。得到的无色固体用5 ml乙醚溶解, 减压浓缩, 得到的无色固体再用5 ml乙醚溶解, 减压浓缩,得3.3 g (100%)标题化合物。为无色粉末。ESI/MS 491 [M + H]+。
实施例 5制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
使用实施例1的操作, 从3.17 g (8.43 mmol) Boc-Arg-(NO2)-Gly和3.65 g (6.94 mmol) HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl得4.6 g (80%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 849 [M + H]+。
实施例 6制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
使用实施例4的操作, 从3.5 g (4.12 mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-OBzl得到3.3 g (101.9%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 749 [M + H]+。
实施例 7制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
使用实施例1的操作, 从2.01 g (6.20 mmol) Boc-Asp-(OBzl)和2.47 g (6.11 mmol) Tos·Val-OBzl得到3.20 g (100%)标题化合物, 为淡黄色油状产物。ESI/MS 513 [M + H]+。
实施例8 制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
使用实施例4的操作, 从5.13 g (10.0 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到4.5 g (100%), 为无色固体。ESI/MS 413 [M + H]+。
实施例9 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
使用实施例1的操作, 从 2.55 g (6.79 mmol) Boc-Arg-(NO2)-Gly和2.90 g (6.46 mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到3.8 g (76%)标题化合物, 为无色油状物。ESI/MS 771 [M + H]+。
实施例10制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按照实施例4的方法, 从3.2 g (4.15 mmol) Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Val-OBzl制得3.0 g (99%) 标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 671 [M + H]+。
实施例 11制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
使用实施例1的操作, 从2.2 g (6.81 mmol) Boc-Asp-(OBzl)和3.06 g (7.15 mmol) Tos·Phe-OBzl得到3.70 g (97%)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 561 [M + H]+。
实施例 12 制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
使用实施例1的操作, 从2.17 g (5.78 mmol) Boc-Arg-(NO2)-Gly和3.01 g (6.07 mmol) HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到3.9 g (84%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 819 [M + H]+。
实施例13制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
按照实施例4的方法, 从3.5 g (4.27 mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Phe-OBzl得到3.3 g (100%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 719 [M + H]+。
实施例14制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)
搅拌下向400 ml蒸馏水中滴加入1 ml 98%的浓硫酸, 搅拌均匀后分三次加入10.0 g (50 mmol) L-Trp, 搅拌五分钟L-Trp溶解, 滴加入10 ml乙醛溶液(40%), 室温反应12 h后,有无色固体沉淀析出, 滴加3 ml 浓氨水调反应溶液pH至7, 静置1 h, 抽滤, 得10.03 g (87%)标题化合物, 为无色固体。Mp 287 - 289 oC. ESI/MS 231 [M+H]+. [α]D25 = -273.97 (c = 0.275, H2O/CH3OH). IR (KBr) 3101-2405, 2962, 2905, 1703, 1624, 1595, 1506, 1453, 1376, 1072, 904 cm-1. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 11.92 (s, 1 H), 10.97 (s, 1 H), 9.17 (s, 1 H), 7.45 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.10 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.01 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 4.22 (q, J = 4.8 Hz, 1 H), 3.66 (dd, J = 10.5 Hz, J = 5.0 Hz, 1 H), 3.14 (dd, J = 10.5 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 2.85 (ddd, J = 10.5 Hz, J = 5.0 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 1.38 (d, J = 5.0 Hz, 3 H)。
实施例14制备 (1S,3S)-N-Boc-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸
冰浴和搅拌下向2.3 g (10 mmol)(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与50 ml DMF的悬浮液中加2.62 g (12 mmol) (Boc)2O与40 ml DMF的溶液, 滴加三乙胺调节反应液pH至10, 撤去冰浴, 室温反应48 h, 反应液由浑浊液变为澄清透明溶液, 原料消失。减压浓缩, 得到的淡黄色油状物用乙酸乙酯溶解, 用5% KHSO4水溶液洗三次, 饱和NaCl水溶液洗三次, 乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥,过滤, 滤液减压浓缩,得到的淡淡黄色油状物用氯仿重结晶, 得到3.0 g (91%)标题化合物, 为无色固体。ESI/MS 330 [M + H]+。
实施例15制备Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly- Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl (3a)
使用实施例1的操作, 从0.363 g(1.10 mmol) (1S,3S)-Boc-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与0.942 g (1.20 mmol) HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-OBzl得到0.90 g (77%)标题化合物, 为无色固体。 Mp 104 - 105 oC. [α]D25 = 9.69 (c = 0.7, CH3OH).ESI/MS 1083 [M + Na]+. IR (KBr) 3319, 3062, 3034, 2974, 2933, 1739, 1676, 1525, 1454, 1394, 1367, 1311, 1263, 1163, 1105, 1029, 912, 854, 742, 698, 597, 457 cm-1. 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) δ/ppm= 10.82 (s, 1H), 8.49 (d, J = 7.25 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.98 - 7.84 (m, 2H), 7.52 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.41-7.26 (m, 17H), 7.04 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.14-5.06 (m, 6H), 4.81 (m, 1H), 4.59 (m, 1H), 4.52-4.43 (m, 2H), 4.28 (m, 1H), 3.80-3.72 (m, 4H), 3.68-3.64 (m, 2H), 3.35 (s, 2H), 3.18 (m, 1H) , 3.10 (m, 1H), 2.78 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 1.63-1.62 (m, 2H), 1.49 (m, 12H). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) δ/ppm= 171.85, 171.01, 170.22, 170.17, 169.02, 159.79, 150.08, 138.30, 136.64, 136.25, 128.84, 128.81, 128.68, 128.44, 128.35, 128.15, 127.98, 126.64, 124.35, 121.29, 118.85, 118.24, 111.39, 80.78, 72.76, 69.50, 66.60, 66.19, 53.13, 52.51, 49.50, 49.07, 42.21, 36.87, 30.13, 28.48, 24.89, 20.84。
实施例16制备Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly- Asp-(OBzl)-Val-OBzl (3b)
使用实施例1的操作, 从0.41 g (1.24 mmol) (1S,3S)-Boc-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与0.967 g (1.37 mmol) HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到0.72 g (59%)标题化合物, 为无色固体。Mp 113 - 114 oC. [α]D25 = 4.91 (c = 0.45, CH3OH). ESI/MS 983 [M + H]+. IR (KBr) 3321, 3064, 2970, 2935, 1737, 1664, 1629, 1529, 1454, 1394, 1369, 1311, 1217, 1107, 1031, 864, 744, 698, 597, 459 cm-1. 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) δ/ppm= 10.83 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.28 (m, 2H), 8.17 (d, J = 7.55 Hz, 1H), 7.80-8.00 (m,1H), 7.53 (d, J = 7.40 Hz, 1H), 7.39-7.17 (m, 11H), 7.04 (t, J = 7.10 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.20 Hz, 1H), 5.16-5.06 (m, 4H), 4.78 (m, 1H), 4.27 (s, 1H), 4.18 (t, J = 6.25 Hz, 1H), 3.75-3.64 (ddd, J = 6.40, 14.50, 17.70 Hz, 2H), 3.18 (m, 2H) , 3.10 (m, 2H), 3.08-2.80 (m, 1H), 2.76-2.72 (dd, J = 5.15, 12.70 Hz, 1H), 2.61-2.55 (m, 1H), 2.06 (m, 1H), 1.63 (m, 1H), 1.54-1.44 (m, 14H), 0.88-0.83 (m, 6H). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) δ/ppm= 171.85, 171.51, 171.04, 170.24, 169.11, 159.76, 136.60, 136.46, 136.28, 128.87, 128.57, 128.51, 128.45, 128.37, 126.61, 121.29, 118.84, 118.24, 111.39, 80.77, 66.41, 66.20, 58.11, 52.52, 49.54, 49.07, 42.14, 36.68, 30.23, 28.46, 24.81, 20.83, 19.35, 18.57.
实施例17制备Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly- Asp-(OBzl)-Phe-OBzl (3c)
使用实施例1的操作, 从0.5 g (1.51 mmol) (1S,3S)-Boc-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与1.26 g (1.67 mmol) HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到0.80 g (50%)标题化合物, 为无色固体。Mp 113 - 114 oC. [α]D25 = 5.68 (c = 0.8, CH3OH);ESI/MS 1031 [M + H]+. IR (KBr) 3323, 3305, 3062, 3032, 2976, 2935, 1741, 1668, 1629, 1521, 1454, 1394, 1367, 1311, 1273, 1166, 1107, 1031, 1006, 974, 912, 852, 746, 698, 596, 487 cm-1. 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) δ/ppm= 10.83 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.40 (m, 1H), 8.29 (m, 1H), 8.23 (d, J = 8.05 Hz, 1H), 7.80-8.05 (m, 1H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39-7.17 (m, 17H), 7.04 (t, J = 7.10 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.25 Hz, 1H), 5.11-5.02 (m, 6H), 4.73 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.28 (s, 1H), 4.11 (q, J = 5.3 Hz, 1H), 3.70 (ddd, J = 6.20, 17.45, 25.14 Hz, 2H), 3.21-3.17 (m, 2H), 3.10 (s, 2H), 3.06-2.95 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.73-2.68 (dd, J = 5.15, 16.20 Hz, 1H), 1.63-1.54 (m, 2H), 1.49 (m, 14H).13C-NMR (DMSO, 75 MHz) δ/ppm= 171.93, 171.88, 171.40, 170.75, 170.22, 168.94, 159.74, 137.33, 136.64, 136.46, 136.12, 134.24, 129.56, 128.85, 128.81, 128.73, 128.47, 128.44, 128.35, 128.31, 127.03, 126.64, 121.29, 118.85, 118.25, 111.38, 80.78, 66.52, 66.21, 54.34, 52.59, 49.50, 42.27, 37.01, 36.75, 30.12, 28.48, 24.30, 19.60。
实施例18制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg-Gly-Asp-Ser (4a)
冰浴和搅拌下将0.810 g (0.764 mmol) Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly-Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于3 ml三氟醋酸, 充分搅拌5分钟, 往里滴加1 ml三氟甲磺酸, 冰浴反应2 h, 原料消失, 加大量无水乙醚并搅拌10分钟, 静置, 将上层清液弃去, 再加无水乙醚搅拌, 静置, 倾倒出上层清液, 如此反复多次。减压浓缩, 得到棕黄色粉末, 用少量水溶解, 滴加稀氨水调溶液pH至7, 用SephdexG15除盐, 水为洗脱剂, 收集洗脱液, 冻干, 得到0.310 g (63%)标题化合物, 为淡黄色固体。Mp 59 oC. [α]D25 = 4.62 (c = 0.25, H2O/CH3OH). ESI/MS 646 [M + H]+. IR (KBr) 3523, 3444, 3215, 3074, 2972, 1672, 1552, 1458, 1400, 1255, 1172, 1114, 1031, 802, 761, 723, 640, 576, 518 cm-1. 1H-NMR (DMSO, 300 MHz) δ/ppm= 12.55 (s, 2H), 11.34 (s, 1H), 10.03 (m, 1H), 9.52 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 9.00 (m, 1H), 8.37 (m, 1H), 8.22 (m, 1H), 7.97 (m, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.12 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.49 (m, 2H), 4.33 (m, 1H), 3.77 (m, 2H), 3.62 (m, 1H), 3.16 (m, 2H), 2.91 (m, 1H) , 2.71 (m, 1H), 1.78 (m, 1H), 1.69 (m, 3H), 1.62 (m, 3H). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) δ/ppm= 172.06, 171.68, 171.48, 171.22, 168.98, 168.58, 157.57, 138.50, 136.91, 131.35, 128.70, 127.99, 122.22, 119.70, 118.45, 111.93, 105.27, 72.72, 69.76, 65.37, 56.38, 53.05, 49.93, 42.26, 36.88, 29.50, 25.36, 24.70。
实施例19制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg-Gly-Asp-Val (4b)
使用实施例18的操作, 从0.196 g (0.20 mmol) Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl得到0.120 g(92%)标题化合物, 为淡黄色固体。Mp 63 oC. [α]D25 = 5.48 (c = 0.3, H2O/CH3OH). ESI/MS 658 [M + H]+. IR (KBr) 3360, 3300, 3226, 3095, 2970, 1668, 1552, 1402, 1253, 1172, 1114, 1031, 761, 667, 640, 578, 518, 459 cm-1. 1H-NMR (DMSO, 300 MHz) δ/ppm= 12.52 (s, 2H), 11.37 (s, 1H), 10.19 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 9.55 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 9.03 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.38 (m, 2H), 8.79 (m, 2H), 7.46 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.15 (m, 1H), 7.02 (m, 1H), 4.70 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.80 (m, 2H), 3.16 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.70 (m, 2H) , 2.08 (m, 1H), 1.80 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 1.08 (m, 3H), 0.87 (m, 6H).13C-NMR (DMSO, 125 MHz) δ/ppm = 173.18, 172.09, 171.48, 171.26, 169.11, 168.59, 157.53, 136.87, 131.37, 126.14, 122.21, 119.69, 118.43, 111.94, 105.23, 65.39, 57.78, 56.31, 52.99, 53.05, 49.88, 44.26, 42.18, 36.60, 31.25, 25.39, 23.82, 19.59, 18.43。
实施例20制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg-Gly-Asp-Phe (4c)
使用实施例18的操作, 从0.190 g (0.184 mmol)Boc-(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰基-Arg(NO2)-Gly-Asp-(OBzl)-Phe-OBzl制得0.115 g (89%) 标题化合物, 为淡黄色固体。Mp 166 - 167 oC. [α]D25 = 8.93 (c = 0.25, H2O/CH3OH). ESI/MS 706 [M + H]+. IR (KBr) 3350, 3290, 3217, 3061, 1664, 1531, 1456, 1398, 1276, 1249, 1168, 1114, 1029, 866, 759, 704, 640, 576, 520 cm-1.1H-NMR (DMSO, 300 MHz) δ/ppm= 12.67 (m, 2H), 11.37 (s, 1H), 10.19 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 9.53 (m, 1H), 9.03 (m, 1H), 8.38 (m, 1H), 8.31 (m, 1H), 8.12 (m, 1H), 7.93 (m, 1H), 7.72-7.18 (m, 7H), 7.12 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.63 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.71 (m, 1H), 3.16 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 2.72 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.70 (m, 4H), 1.63 (m, 3H). 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) δ/ppm= 173.03, 172.03, 171.50, 171.06, 168.92, 157.54, 137.88, 136.87, 131.37, 129.66, 128.69, 126.95, 126.13, 122.21, 119.69, 118.44, 111.94, 105.22, 65.39, 56.32, 54.17, 52.96, 52.72, 49.88, 49.68, 44.26, 42.20, 37.01, 36.70, 29.55, 25.39, 23.84。
试验例1 4a-c的抗血小板聚集活性试验
取新鲜的猪血用3.8%枸橼酸钠抗凝（V枸橼酸钠:V猪血=9:1）, 然后1000 r/min离心10 分钟得富血小板血浆, 再以3000 r/min离心10分钟, 得贫血小板血浆。以ADP(二磷酸腺苷, 终浓度 1×10-5 M), PAF (血小板活化因子, 终浓度 1×10-7 M), TH(凝血酶, 终浓度 1 U/ml) 和AA(花生四烯酸, 终浓度 0.15 mg/ml)为诱导剂诱导血小板聚集。分别测试化合物1及4a-c在10 mM, 0.1 mM, 0.01 mM, 1 μM, 0.1 μM, 0.01 μM, 0.001 μM浓度下的血小板聚集率，计算IC50。结果列入表1。结果表明, 4a-c抑制TH, PAF, ADP和AA诱导的血小板聚集的IC50值分别为0.2 - 3.0 μM, 37.4 - 528.0 μM, 13.6 - 126.0 μM和456.0 - 1180.0 μM。4a-c抑制TH诱导的血小板聚集的IC50值分别比PAF, ADP和AA诱导的血小板聚集的IC50值低176 - 187倍, 42 - 68倍和393 - 2280倍, 4a-c高度选择性地抑制TH诱导的血小板聚集。
表1 4a-c的抗血小板聚集作用 (n = 6)
试验例24a-c的口服抗血栓活性
实验前将4a-c 配成 0.33 nM的生理盐水溶液 (加入少量的吐温80 润湿助溶), 用于口服的剂量为 0.1 nmol/kg, 0.01 nmol/kg 和0.001 nmol/kg。1 配成 0.33 nM的生理盐水溶液 (加入少量的吐温80 润湿助溶), 用于口服的剂量为 10 nmol/kg。RGD肽配成 0.33 nM的生理盐水溶液, 用于口服的剂量为 100 nmol/kg。阳性药 Asprin 配成 10 g/L的生理盐水溶液, 即 55.5 mM的浓度, 用于体内的剂量为 167 mmol/kg。空白对照为生理盐水, 抗凝剂为肝素钠 2.4 mg/ml 生理盐水溶液。将雄性SD大鼠随机分组, n = 12, 以 (3 ml/kg) 给大鼠灌胃, 30 分钟后, 用乌拉坦 (20 g/100 ml, 7 ml/kg) , 麻醉后, 分离右颈动脉和左颈静脉。把一根 6 cm 长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中, 将插管充满肝素钠的生理盐水溶液 (50 IU/ml) 后, 一端插入左侧静脉, 从一端加入定量肝素钠抗凝, 然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉。15 min后取出附有血栓的丝线, 在滤纸上轻轻蘸掉血滴, 放入事先称重好的离心管中, 精确称重并记录。减重法计算出血栓的湿重。并记录湿重。每个化合物重复12次给药。统计各组的血栓湿重, 并做t 检验。结果表明4a-c有非常好的剂量依赖的抗血栓活性(表2) 有效剂量低至0.001 nmol/kg。
表2 4a-c的口服抗血栓活性
n = 12; a) 与生理盐水比p < 0.01; b) 与生理盐水及1比p < 0.01; c) 与生理盐水比p < 0.01,与1比p < 0.05; d) 与生理盐水比p < 0.05。
实验例3 电镜表征4a-c的纳米结构
将4a-c溶于水中配置成浓度为10-11 M的溶液, 滴在特制铜网上, 室温自然挥发干, 在透射电子显微镜(TEM, JEM-200 CX; JEOL, Tokyo, Japan)下观察其形态及粒径并用照片记录如图2。从图2可以看出, 4a-c呈现纳米球, 在10-11 M时4a的纳米球的直径为23 - 95 nm, 4b的纳米球的直径为20 - 62 nm, 4c的纳米球的直径为50 - 82 nm。