一类含硒氟硼染料荧光探针及其在CLOSUP/SUP检测上的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103571458 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103571458 A (21)申请号 201210273941.3 (22)申请日 2012.08.02 C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) A61K 49/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 韩克利 王炳帅 李鹏 于法标 孙小飞 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (5。

2、4) 发明名称 一类含硒氟硼染料荧光探针及其在ClO-检测 上的应用 (57) 摘要 一类含硒氟硼染料荧光探针的合成与其在 ClO-检测上的应用， 本发明涉及一类在 ClO -存在 下荧光强度或波长产生变化， 在还原性物质存在 下荧光强度或波长又恢复原来状态的荧光探针， 可实现对 ClO-的可逆或比率检测。本发明提供了 一种可用于选择性检测细胞内ClO-的可逆荧光探 针。本发明采用氟硼染料 （BODIPY）作为荧光母 体， 在染料母体上引入有机硒醚结构形成探针体 系， 以硒作为与ClO-反应的活性中心， 以实现选择 性地检测 ClO-； 利用有机硒醚被氧化后形成的有 机硒氧化物容易被生物体系中。

3、的还原性小分子如 半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽、 金属硫蛋白等还原为 有机硒醚的性质， 实现探针分子的可逆性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 附图9页 (10)申请公布号 CN 103571458 A CN 103571458 A 1/3 页 2 1. 一类氟硼染料荧光探针， 其特征在于所述的荧光探针具有下列结构通式 I ： 通式 I 中 ： R1为 H、 通式 X、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-。

4、12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O)nH、 (CH2CH2O)n Ac、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M、 含邻、 间、 对位取代的 C6H4R11或苯环上邻、 间、 对位取代的 CH2C6H4R11； R11为 H、 C1-12烷基、 卤素、 CN、 OR12、 N(R12)2、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； R2、 R3、 R5、 R6、 R8、 R10为相同或不同的 R13； R13为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基 取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 。

5、C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 卤素、 CN、 OR12、 N(R12)2、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； R4、 R7分别为 H、 通式 Y、 Z、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环 上带有C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 五元或六元O、 N、 S杂环、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O) nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； R12为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄 基、 苯。

6、环上带有 C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； M 为 H、 K、 Na、 Li、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 苄基、 NH4、 NH3R14、 NH2(R14)2、 NH(R14)3或 N(R14)4； R14为 H 或 C1-12烷基 ； m=0-15 整数、 n=1-15 正整数 ； R9为 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12烷基取 代的苄基、 萘基或 C1-12烷基取代的萘基 ； 当 R1不为通式 X。

7、 时， R4、 R7中至少有一个为通式 Z ； 当 R4和 R7同时不为 Z 时， R1必须为 X。 2. 根据权利要求 1 所述探针， 其特征在于 ： R1=X， 所述探针优化结构通式为 ： 其中 ： R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9的含义同权利要求 1。 3. 根据权利要求 1 所述探针， 其特征在于 ： R4和 R7之一或同时为 Z， 所述探针优化结构 权 利 要 求 书 CN 103571458 A 2 2/3 页 3 通式为 ： 通式中， R1、 R2、 R3、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9的含义同权利要求 1。 4. 一种权利要求 1 所述探针用。

8、于生物体内或外的活性氧的检测。 5. 一种权利要求 2 所述的荧光探针在实时可逆检测次氯酸的应用， 其特征在于， 将通 式 II 应用于检测次氯酸时， 其与次氯酸作用， 生成具有通式结构的化合物， 从而导致荧 光强度的改变 ； 并且在还原性物质存在下， 能恢复到通式 II 的状态， 从而导致荧光的恢复， 此过程可定性检测次氯酸 ； 6. 一种权利要求 3 所述的荧光探针在实时可逆检测次氯酸的应用， 其特征在于， 将通 式， 应用于检测次氯酸时， 其与次氯酸作用， 生成具有通式， 结构的化合物， 从而导 致荧光强度和波长的改变 ； 并且在还原性物质存在下， 能恢复到通式， 的状态 ； 7.根据权。

9、利要求5或6所述的荧光探针在实时可逆检测次氯酸的应用， 其特征在于， 所 述还原性物质为硫化氢、 半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白等， 但不仅限于此。 8.根据权利要求5或6所述的荧光探针在实时可逆检测次氯酸的应用， 其特征在于， 用 通式 II、 、 测定生物体系中的次氯酸， 其荧光强度或波长随生物体系的氧化还原电位而 权 利 要 求 书 CN 103571458 A 3 3/3 页 4 改变， 能够对生物体系中的次氯酸的进行实时可逆检测。 权 利 要 求 书 CN 103571458 A 4 1/9 页 5 一类含硒氟硼染料荧光探针及其在 ClO-检测上的应用 技术领域 0001 本。

10、发明涉及一类用于检测 ClO-的荧光探针， 具体的说， 在 ClO-存在下荧光强度或 波长产生变化， 在还原性物质如半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽、 金属硫蛋白等存在下荧光强度 或波长又恢复原来状态的荧光探针。 背景技术 0002 活性氧 (Reactive Oxygen Species,ROS), 就是比起普通的氧分子 , 它们有着更 高的氧化还原活性。活性氧是生物过程和病理过程所必须的。当感染和发炎时， 噬菌白细 胞， 包括嗜中性粒细胞、 单核细胞、 巨噬细胞都会产生活性氧以杀死病菌和病原体。 因此， 活 性氧对于人体具有十分重要的意义。 次氯酸是一种高活性的ROS， 与其他的活性氧和活性氮 。

11、(reactive nitrogen species， RNS), 不同， 次氯酸在日常生活中广泛用作消毒剂、 抗菌剂 和漂白剂。在人体内， 它是在由嗜中性粒细胞分泌的绿过氧化酶 （MPO） 的催化下， 由双氧水 和氯离子生成的。内生的次氯酸根离子是生命所必须的， 具有重要的抗菌性能且能抵抗微 生物入侵， 在人体的免疫系统中扮演着重要的角色。但人体中过量的次氯酸会导致组织损 伤和诱发多种疾病， 如 ： 动脉硬化、 癌症、 心血管疾病、 风湿性关节炎等。这些可能是因为生 理条件下， 次氯酸可以与 DNA、 RNA、 脂肪酸、 胆固醇和蛋白等生物分子发生反应。但是， 次氯 酸在这些疾病中的准确作用。

12、机理还没被研究透彻， 由次氯酸引起的细胞死亡机理， 细胞抵 抗、 适应次氯酸的机理仍然是未知的。 在研究次氯酸根离子的生理功能和有害影响方面， 研 究人员已经开展了许多工作， 并且提出了许多灵敏度高、 选择性好的分析方法。 虽然已经报 道了许多用于检测次氯酸的分析方法如电分析、 电位测定、 分光光度法、 化学发光法， 但荧 光探针技术由于可以减少对细胞损伤、 可在活细胞中进行较高时间和空间分辨的可视化分 析， 成为一种有应用前景的分析方法。因此， 为了更好地揭示次氯酸在生物系统中的作用， 发展方便、 灵敏的、 特异的次氯酸荧光探针是迫切需要的。 0003 一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前。

13、后荧光变化明显、 对目标分子响应 快、 选择性好、 可用于实时可逆检测等优点。 Dan Yang等公开了一类用于检测次氯酸的荧光 探针 HKOCl-1（结构见图 1， Dan Yang et.al,Organic Letters,2008,10,2171） ， 与次氯酸 作用后 , 通过对苯二酚氧化成对苯二醌引起探针荧光增强， 从而检测次氯酸的存在。最近， Tetsuo Nagano 等公开了一种检测次氯酸的荧光探针 MMSiR（结构见图 1， Tetsuo Nagano et.al,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,5680） ， 通过罗丹名染料氧化前后的开闭环原理检测次 氯酸。

14、根。 以上探针虽对次氯酸有较好的选择行， 但都是单一波长荧光增强型探针， 受外部环 境的干扰较强 ； 而且不具有可逆性， 不能用于次氯酸的实时检测， 使其应用前景受到了很大 的限制。实时可逆检测， 对深入研究 ClO-在生物体内的产生、 输送及累积等过程的动力学 机理， 进一步了解 ClO-的生理和毒理作用具有重要意义。比率检测由于可建立内标， 从而 大大降低外部条件的干扰。 因此， 开发具有高选择性， 可用于生物体系中次氯酸实时可逆检 测、 比率检测的荧光探针具有重要意义。 说 明 书 CN 103571458 A 5 2/9 页 6 发明内容 0004 本发明就是针对上述问题， 提供了一类。

15、可用于选择性检测细胞内次氯酸的可逆荧 光探针， 此类探针可以选择性地与次氯酸作用， 作用后荧光强度或波长发生改变， 在还原性 物质如半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽、 金属硫蛋白等存在下荧光又可以恢复到原先状态。 0005 为了实现本发明的上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 本发明采用氟硼荧染料 （BODIPY） 作为荧光母体， 在染料母体上引入有机硒醚结构作为与次氯酸反应的活性中心， 以实现选择性地检测次氯酸 ； 利用有机硒醚被氧化后形成的有机硒氧化物容易被生物体系 中的还原性小分子如半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽、 金属硫蛋白等还原为有机硒醚的性质， 实 现探针分子的可逆性 ； 并同时利用有机硒。

16、醚氧化前后电子性质的变化及其对整个化合物荧 光性质的影响调变探针分子的荧光性质。 0006 所述的荧光探针的通式为 ： 0007 一类氟硼染料荧光探针， 其特征在于所述的荧光探针具有下列结构通式 I ： 0008 0009 通式 I 中 ： 0010 R1为 H、 通式 X、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上 带有 C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O)nH、 (CH2CH2O)n Ac、 (CH2) mCOOM或(CH2)mSO3M、 含邻、 间、 对位取代的C6H4R11或苯环上邻、 间、 对。

17、位取代的CH2C6H4R11； R11 为 H、 C1-12烷基、 卤素、 CN、 OR12、 N(R12)2、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； 0011 R2、 R3、 R5、 R6、 R8、 R10为相同或不同的 R13； R13为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12 烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 卤素、 CN、 OR12、 N(R12)2、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； 0012 R4、 R7为 H、。

18、 通式 Y、 Z、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环 上带有C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 五元或六元O、 N、 S杂环、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O) nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； R12为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄 基、 苯环上带有 C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 (CH2CH2O)nH、 (CH2)mCOOM 或 (CH2)mSO3M ； 0013 M 为 H、 K、 Na、 Li、 C1-12烷基。

19、、 C3-8环烷基、 苯基、 苄基、 NH4、 NH3R14、 NH2(R14)2、 NH(R14)3 或 N(R14)4； R14为 H 或 C1-12烷基 ； 0014 n=1-15 正整数、 m=0-15 整数 ； 0015 R9为 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12烷 基取代的苄基、 萘基或 C1-12烷基取代的萘基 ； 0016 当 R1不为通式 X 时， R4、 R7中至少有一个为通式 Z ； 0017 当 R4和 R7同时不为 Z 时， R1必须为 X。 说 明 书 CN 103571458 A 6 3/9 页 。

20、7 0018 当 R1为 X， R4、 R7之一或同时为 Z 时， 通式分别为、 、 。 0019 0020 通式、 、 中 ： 0021 R1为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12 烷基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 含邻、 间、 对位取代的苯基或苯环上含邻、 间、 对位取代的苄基 ； 0022 R2、 R3、 R5、 R6为相同或不同的 R15； R15为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取 代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 C1-1。

21、2烷基取代的萘基、 卤素或 CN ； 0023 R4、 R7为 H、 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12烷基取代的苄基、 萘基、 五元或六元 O、 N、 S 杂环、 C1-12烷基取代的萘基或取代的苯乙烯 基 ； 0024 R9为 C1-12烷基、 C3-8环烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上带有 C1-12烷 基取代的苄基、 萘基、 C1-12烷基取代的萘基、 含邻、 间、 对位取代的苯基或苯环上含邻、 间、 对 位取代的苄基。 0025 除另有说明外， 本文中使用的术语具有以下含义 ： 0026 本。

22、文中使用的术语 “烷基” 包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如 “丙基” ， 则只特指直链烷基， 如提及单个支链烷基如 “异丙基” ， 则只特指支链烷基。 例如，“C1-6烷基” 包括 C1-4烷基、 C1-3烷基、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明 书中使用的其它基团。 0027 本文中使用的术语 “卤素” 包括氟、 氯、 溴和碘。 0028 本文中使用的术语 “苄基” 是指 -CH2-Ph 基团。当用 “任选取代” 修饰苄基时， 指该 苄基可以未取代的形式存在， 或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代 基包括但不限于 H、 C1-18烷基。

23、、 CN、 COOH、 NH2、 NO2、 OH、 SH、 C1-6烷氧基、 C1-6烷基氨基、 C1-6酰 氨基、 卤素、 或 C1-6卤代烷基等， 只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基 由 COOH、 NH2、 OH、 C1-6烷氧基、 卤素任选取代。 0029 在本发明的通式 I、 、 、 化合物中 ： 0030 优选 R1选自 C1-4烷基、 苯基、 C1-4烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上含 C1-4烷基取代的 苄基、 含邻、 间、 对位取代的苯基或苯环邻、 间、 对位被取代的苄基 ； 最优选 R1为 C1-4烷基、 苯 基。 0031 优选 R2、 R5各自独立选自 。

24、C1-12烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 CN ； 最优选 R2、 R5 均为甲基。 说 明 书 CN 103571458 A 7 4/9 页 8 0032 优选 R3、 R6各自独立选自 H、 C1-12烷基、 卤素 ； 最优选 R3、 R6均为 H。 0033 优选 R4、 R7各自独立选自 C1-12烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 五元或六元 O、 N、 S 杂环、 取代的苯乙烯基 ； 最优选 R4、 R7均为甲基、 对位取代的苯乙烯基。 0034 优选 R9为 C1-12烷基、 苯基、 C1-12烷基取代的苯基、 苄基、 苯环上含有 C1-12烷基取代 的苄基 。

25、； 最优选 R9为苯基和对位甲氧基取代的苯基。 0035 将通式、 、 应用于检测次氯酸时， 其与次氯酸作用后， 生成具有通式、 、 结构的化合物， 从而导致荧光光谱的改变 ； 0036 0037 具有通式、 、 结构的化合物， 在还原性物质存在下， 重新变为具有通式、 、 结构的化合物， 从而导致荧光的恢复。 0038 所述还原性物质为半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白。 0039 通式、 、 结构的化合物可对次氯酸进行定性、 定量的检测。 0040 将浓度呈梯度变化的次氯酸水溶液分别加入通式、 、 结构的化合物的水溶 液中， 分别测定加入后各体系的荧光强度， 然后将次氯酸溶液的浓度和加。

26、入后体系的荧光 强度为横坐标、 纵坐标作图， 根据荧光强度， 即可从图中读出溶液中次氯酸的含量。 0041 用通式、 、 结构的化合物测定生物体系中的次氯酸， 其荧光随生物体系的氧 化还原电位而改变， 能够对生物体系中的次氯酸进行实时可逆检测。 0042 通式所代表的化合物， 本身荧光很弱， 可以特异性地与次氯酸迅速作用， 生成通 式所代表的的硒氧化物， 同时荧光增强 ； 通式、 所代表的化合物， 可以特异性地与次 氯酸迅速作用， 生成通式、 所代表的的硒氧化物， 同时荧光波长和强度发生变化。 0043 通式、 、 所代表的硒氧化物与还原性物质如硫化氢、 半胱氨酸、 还原型谷胱 甘肽、 金属硫。

27、蛋白等作用会重新回到具有通式、 、 所代表的结构的化合物， 相应的荧 光也变回初始的状态。 0044 硒原子是本发明所述荧光探针的反应中心， 即硒原子提供具有通式、 、 结构 的化合物与次氯酸选择性作用的活性中心， 也提供具有通式、 、 结构的化合物与还原 性物质如半胱氨酸作用的活性中心。同时， 本发明所述荧光探针的荧光变化也是由有机硒 片段的氧化还原状态调节。 具有通式、 I、 结构的化合物， 其硒原子具有很强的给电子 能力， 通式化合物容易通过光诱导电子转移过程淬灭染料母体的荧光 ； 通式、 化合物 通过分子内电荷转移过程， 使染料母体荧光波长红移。具有通式、 、 结构的化合物与 次氯酸作。

28、用后变为具有通式、 、 结构的化合物， 具有通式、 、 结构的化合物其硒 说 明 书 CN 103571458 A 8 5/9 页 9 原子由于被氧化而不再具有强的给电子能力， 通式结构的化合物不能有效淬灭荧光母体 的荧光， 从而出现体系荧光增强的现象 ； 通式、 的化合物荧光波长蓝移， 荧光强度相应 变化， 从而可对次氯酸比率检测。 0045 本发明的有益效果 ： 0046 这类化合物用作次氯酸荧光探针， 在次氯酸存在下荧光发生增强或波长变化 ； 再 在还原性物质如半胱氨酸、 还原型谷胱甘肽或金属硫蛋白等存在下荧光恢复原来状态， 可 用于次氯酸的实时可逆检测。 尤其是， 这类化合物用作荧光探。

29、针， 可用于细胞内次氯酸的实 时可逆检测， 这对深入研究次氯酸在生物体内的产生、 输送及累积等过程的动力学机理， 进 一步了解过次氯酸的生理和毒理作用具有重要意义。 附图说明 0047 图 1 背景技术中所举的已公开的次氯酸荧光探针结构示意图 ； 0048 图 2 本发明提供的探针合成路线示意图 ； 0049 图 3 本发明提供的探针检测原理示意图 ； 0050 图 4 实施例 2 所采用的荧光探针 A 在不同 PH 值下的荧光强度示意图 ； 下方曲线表 明探针荧光强度随 pH 的变化， 上方曲线表明探针加次氯酸后随 pH 的变化 ； 0051 图 5 实施例 2 所采用的荧光探针 A 对次氯。

30、酸的选择性示意图 ； 0052 图 6 实施例 2 所采用的荧光探针 A 的荧光强度随次氯酸浓度变化的示意图 ； 0053 图 7 实施例 2 所采用的荧光探针 A 荧光强度随次氯酸浓度变化的线性拟合曲线 ； 0054 图 8 实施例 5 所采用的荧光探针 A 与次氯酸作用后， 再与二硫苏糖醇作用的荧光 强度随时间变化示意图 ； 0055 图 9 表示实施例 5 所采用的荧光探针 A 用于检测细胞内次氯酸的共聚焦显微镜照 片。图 9a 表示探针 A 进入细胞后的成像照片 ； 图 9b 表示图 9a 细胞内产生次氯酸后的成像 照片 ； 图 9c 表示图 9b 细胞加入还原剂二硫苏糖醇之后的成像照。

31、片。图 9d、 9e、 9f 分别表示 图 9a、 9b、 9c 对应的细胞明场图片。图 9g、 9h、 9i 分别表示图 9a、 9b、 9c 与其对应的细胞明 场图片的叠加图片。 0056 图 10 实施例 3 所采用的荧光探针 B 在不同 PH 值下的荧光强度示意图 ； 0057 图 11 实施例 3 所采用的荧光探针 B 对次氯酸的选择性示意图 ； 图 11a 表明探针在 710nm 处荧光随不同活性氧的变化， 图 11b 表明探针在 634nm 处荧光随不同活性氧的变化。 0058 图 12 实施例 3 所采用的荧光探针 B 的荧光强度随次氯酸浓度变化的示意图 ； 图 12a表明71。

32、0nm处荧光强度随次氯酸浓度的变化， 图12b表明634nm处荧光强度随次氯酸浓 度的变化。 0059 图 13 实施例 3 所采用的荧光探针 B 710nm 处荧光强度与 634nm 处荧光强度随次 氯酸浓度变化的拟合曲线 ； 0060 图 14 表示实施例 3 所采用的荧光探针 B 用于检测细胞内次氯酸的比率共聚焦显 微镜照片。图 14a 表示探针进入细胞后， 长波长通道比短波长通道的比率成像图片 ； 图 14b 表示图 14a 的细胞产生次氯酸后， 短波长通道比长波长通道的比率成像图片。图 14c、 14d 分别表示图 14a、 14b 对应的细胞明场图片。 说 明 书 CN 10357。

33、1458 A 9 6/9 页 10 具体实施方式 0061 实施例用于进一步说明本发明， 但本发明不限于实施例。 0062 实施例 1 0063 对甲氧基苯甲醛的合成 ： 0064 将 1.26g 镁粉加入到 250mL 三口瓶中， N2保护， 加入 40mL THF， 加入几粒碘 （约 0.5g） 引发反应， 滴加对溴苯甲醛 10g/50mL THF， 加完后继续回流使之充分反应。然后回 流状态下， 再滴加 19.5g 对甲氧基二苯二硒 （OrganicSyntheses Coll.1988， 6,533） /50mL THF， 继续搅拌 20 小时。蒸干溶剂， 用二氯甲烷溶解， 过滤。蒸干。

34、溶剂， 柱分纯化。 0065 1H NMR(400MHz,CDCl 3,ppm):3.84(s,3H,OCH3),6.93(d,2H,Ar-H， J=8.0),7.3(d,2H,Ar-H，J=8.0),7.57(d,2H,Ar-H，J=8.0),7.65(d,2H,Ar-H， J=8.0),9.88(s,1H,CHO).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):55.34,115.58,117.35,128.92, 130.01,134.09,138.01,144.35,160.62,191.33.77Se NMR(95MHz,CDCl3,ppm):419.14. HRMS(TOF 。

35、LD+)calcd.for C14H12O2Se 292.0003,found292.0014. 0066 实施例 2 0067 探针 A 的合成 ： 0068 如图 2 所示， 本实施例所采用的探针化合物的结构用代号 A 表示。 0069 将 0.5g 对甲氧基苯甲醛和 0.35g 2， 4- 二甲基吡咯加入 60mL 二氯甲烷中， 滴几滴 （约 1mL） 三氟乙酸作为催化剂， 室温搅拌至原料反应完全。加入 2， 3- 二氯 -5， 6- 二氰基对 苯二醌 （DDQ） 0.39g， 继续搅拌 10-30 分钟后， 加入三氟化硼乙醚 3g， 三乙胺 1.5g， 室温搅拌 10 小时后， 蒸干溶。

36、剂， 柱分离纯化， 蒸干溶剂得橙色固体粉末。 0070 1H NMR(400MHz,CDCl 3,ppm):1.42(s,6H,CH3),2.54(s,6H,CH3),3.83(s,3H,OCH3) ,5.97(s,2H,CH),6.9(d,2H,J=8.0,Ar-H),7.1(d,2H,J=8.0,Ar-H),7.39(d,2H,J=8.0,Ar -H),7.54(d,2H,J=8.0,Ar-H).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm):14.56,29.8,55.34,115.39,1 19.07,121.27,128.72,130.87,131.44,132.92,135.1。

37、1,136.84,141.11,143.03,155.56 ,160.13.77Se NMR(95MHz,DMSO-d6,ppm):396.8.HRMS(TOF LD+)calcd.for C26H25BF2N2OSe 510.1193,found 510.1173. 0071 实施例 3 0072 探针 B 的合成 ： 0073 如图 2 所示， 本实施例所采用的探针化合物的结构用代号 B 表示， 原料 BODIPY 用 代号 C 表示。 0074 原料 C(J.Phys.Chem.A 1998,102,10211)0.65g， 对甲氧基苯甲醛 1.2g， 哌啶 1mL， 甲苯 20mL， 。

38、氮气保护下， 100-165 C 反应过夜。蒸干溶剂， 柱分纯化， 蒸干溶剂得蓝色固体 粉末。 0075 1H NMR(400MHz,CDCl 3,ppm):1.42(s,6H,CH3),3.84(s,6H,OCH3),6.6(s,2H,CH), 6.9(d,4H,J=7.2,Ar-H),7.15(d,2H,J=13,CH CH),7.29-7.31(m,6H,Ar-H),7.44(d,4H ,J=6.8,Ar-H),7.47-7.49(m,3H,Ar-H),7.54(d,4H,J=7.2,Ar-H),7.66(d,2H,J=13,CH CH).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm。

39、):14.59,55.36,115.32,117.85,119.08,119.38,128.07, 128.44,128.86,129.00,129.09,130.61,133.49,134.82,135.16,135.45,136.94,138.8 3,142.11,152.48,160.08.77SeNMR (95MHz,CDCl3,ppm):406.48.HRMS (TOF LD+)calcd.for 说 明 书 CN 103571458 A 10 7/9 页 11 C47H39BF2N2O2Se2872.1403,found 872.1412. 0076 实施例 4 0077 探针 A。

40、 对次氯酸的选择性 ： 0078 pH 采用 PBS 缓冲溶液控制。于 10ml 比色管中加入 10.0M 探针 A， 再加入 20mM PBS， 超纯水定容到 10ml， 摇匀溶液， 平衡 1min 后， 将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光 谱。然后分别加入 100uM 次氯酸， 测定荧光光谱。荧光强度随 pH 的变化如图 4 所示。图 4 表明在 pH 4.0 12 的范围内探针 A 与探针 A 与次氯酸作用后的荧光强度没有明显变化， 即在 pH 4.0 12 的 PBS 体系中， 都可以使用探针 A 检测次氯酸。 0079 为尽可能模拟生理条件， 以下各项实验均在 pH=7.4 条件下进。

41、行 （PBS 缓冲溶液， 浓 度为 20mM） ， 探针浓度仍采用 10.0M。 0080 于10ml比色管中加入10.0M探针， 再加入20mM PBS pH 7.4， 再加超纯水到5ml， 摇匀， 然后加入各种待测物 （空白实验不加待测物） ， 最后用超纯水定容到 10ml。摇匀溶液， 平衡 10min， 将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。探针 A 对次氯酸的选择性如图 5 所示。图 5表明探针A对次氯酸具有很好的选择性， 体系荧光增强。 测定条件下其他活性氧物种几乎 不能使探针荧光发生变化。 0081 实施例 5 0082 探针 A 对次氯酸的定量检测 ： 0083 于 10ml 比色管中。

42、加入 10.0M 探针 A， 再加入 20mM PBS pH 7.4， 再加超纯水到 5ml， 摇匀， 然后加入不同浓度次氯酸， 最后用超纯水定容到 10ml。摇匀溶液， 平衡 10min， 将 工作液倒进荧光皿测定荧光光谱， 取各荧光光谱最大值， 输入软件 OriginPro 8.0, 得到线 性工作曲线。 0084 定容后次氯酸浓度 ： 0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0， 8.0， 9.0， 10， 12， 14， 16， 18， 20， 24， 28， 32， 36， 40， 50M. 0085 图 6 表示随次氯酸浓度的变化体系荧光强度。

43、的变化， 表明随次氯酸浓度的增加， 体系荧光明显增强 ； 图 7 表示荧光强度随次氯酸浓度 （0-40uM） 变化的线性拟合曲线， 线性 拟合曲线的线性回归常数为 0.9991， 表明探针能定量的测定次氯酸的浓度。 0086 实施例 6 0087 探针 A 的可逆性测试 ： 0088 于10ml比色管中加入10.0M探针， 再加入20mM PBS pH 7.4， 再加超纯水到5ml， 摇匀， 然后加入次氯酸 30.0M， 最后用超纯水定容到 10ml。摇匀溶液， 平衡 10min， 将工作 液倒进荧光皿测定荧光光谱。将荧光皿中的工作液倒回比色管中， 加入 30.0M 还原性物 质二硫苏糖醇， 。

44、同时记录不同时间的荧光光谱。 图8表示在探针A与次氯酸作用后的溶液中 加入二硫苏糖醇后体系荧光强度随时间的变化趋势。图 8 表明二硫苏糖醇能有效的还原探 针 A 的氧化产物， 即具有通式结构的化合物， 重新生成荧光较弱的探针 A。二硫苏糖醇基 本可使体系荧光强度恢复到最初状态。图 8 表明探针 A 作为次氯酸荧光探针具有可逆性， 能实时检测次氯酸的浓度变化。 0089 实施例 7 0090 探针 A 用于细胞内次氯酸的可逆检测 ： 0091 RAW264 细胞按照 American type Tissue Culture Collection 规定进行培养。 说 明 书 CN 10357145。

45、8 A 11 8/9 页 12 10.0uM 探针 A 孵育 RAW264 细胞 10 分钟， 用培养基洗涤 3 次， 置于共聚焦荧光显微镜下拍 照， 结果如图 9a 所示 ； 然后 2.0uM PMA（刺激细胞产生次氯酸） 孵育细胞 10 分钟， 用培养基 洗涤3次， 共聚焦显微镜拍照， 结果如图9b所示， 荧光强度明显增强 ； 再用30uM还原谷胱甘 肽孵育细胞 30 分钟后， 用培养基洗涤 3 次， 共聚焦显微镜拍照， 结果如图 9c 所示， 荧光强度 又减弱。图 9d、 9e、 9f 表示细胞的明场， 图 9g、 9h、 9i 为荧光图片与明场的叠加图片。 0092 实施例 8 009。

46、3 探针 B 对次氯酸的选择性 ： 0094 pH 采用 PBS 缓冲溶液控制。于 10ml 比色管中加入 10.0M 探针 B， 再加入 20mM PBS， 超纯水定容到 10ml， 摇匀溶液， 平衡 1min 后， 将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光 谱。然后分别加入 100uM 次氯酸， 测定荧光光谱。荧光强度随 pH 的变化如图 10 所示。图 10 表明在 pH 4.0 12 的范围内探针的荧光强度没有明显变化， 而探针 B 与次氯酸作用后 的荧光强度随 pH 有变化， 但在中性条件下， 可得到最大的荧光强度， 这样可提高检测灵敏 度， 即在 PH 7.0 8.0 的 PBS 体系中。

47、， 可以使用探针 B 检测次氯酸。 0095 为尽可能模拟生理条件， 以下各项实验均在 pH=7.4 条件下进行 （PBS 缓冲溶液， 浓 度为 20mM） ， 探针浓度仍采用 10.0M。 0096 于10ml比色管中加入10.0M探针， 再加入20mM PBS pH 7.4， 再加超纯水到5ml， 摇匀， 然后加入各种待测物 （空白实验不加待测物） ， 最后用超纯水定容到 10ml。摇匀溶液， 平衡 10min， 将工作液倒进荧光皿测定荧光光谱。探针 A 对次氯酸的选择性如图 11 所示。 图 11 表明探针 A 对次氯酸具有很好的选择性。测定条件下 , 虽然一些活性氧物种可以是 探针在 。

48、710nm 处荧光减弱， 但只有次氯酸可使探针在 634nm 出荧光明显增强。 0097 实施例 9 0098 探针 B 对次氯酸的检测 ： 0099 于 10ml 比色管中加入 10.0M 探针 B， 再加入 20mM PBS pH 7.4， 再加超纯水到 5ml， 摇匀， 然后加入不同浓度次氯酸， 最后用超纯水定容到 10ml。摇匀溶液， 平衡 10min， 将 工作液倒进荧光皿测定荧光光谱， 取各荧光光谱最大值， 输入软件 OriginPro 8.0, 得到线 性工作曲线。 0100 定 容 后 次 氯 酸 浓 度 ： 0,2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0、 15.0、 20.0、 25.0、 30.0、 35.0、 40.0、 45.0、 50.0、 60.0、 70.0、 80.0、 90.0、 100.0M. 0101 图 12 表示随次氯酸浓度的变化体系荧光强度的变化， 表明随次氯酸浓度的增加， 体系荧光明显增强 ； 图 13 表示荧光强度随次氯酸浓度变化的拟合曲线。 0102 实施例 10 0103 探针 B 用于细胞内次氯酸的可逆检测 ： 0104 RAW264 细胞按照 American type Tissue Culture Collection 规定进行培养。 10.0uM探针A孵育RAW264细胞10分钟， 用培养基洗涤。