表达人源化嵌合抗体CHAB18的重组新城疫病毒/基因组质粒及其抗肿瘤治疗的应用.pdf

一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒/基因组质粒及其抗肿瘤治疗的应用，它是基于新城疫病毒Italien株的基础上构建的重组新城疫病毒；该病毒可以选择性杀伤人肿瘤细胞，并且同时表达人源化嵌合抗体cHAb18；本发明能够高效表达cHAb18抗体，并将该外源基因编码的抗体释放至细胞周围的环境之中，可以发挥抗体靶向封闭肿瘤相关抗原的抑癌侵袭转移功能，该重组病毒无疑为抗体治疗联合溶瘤病毒治疗，从而为研制肿瘤靶向杀伤药物提供了一种新策略，显示良好的应用前景。

权利要求书
1.  一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒，其特征在于：它是基于新城疫病毒Italien株的基础上构建的重组新城疫病毒；该病毒可以选择性杀伤人肿瘤细胞，并且同时表达人源化嵌合抗体cHAb18。

2.  一种可以用于体外复活权利要求1所述的重组新城疫病毒的新城疫病毒基因组质粒，其特征在于：它是由从稳定表达人源化嵌合抗体cHAb18的工程细胞系CHO-TS28中获得该抗体轻、重链的编码基因，通过overlap PCR的方法获得cHAb18轻重链基因融合片段序列，并且在其上下游分别加入病毒转录调控序列；得到人源化嵌合抗体cHAb18抗体转录盒片段，再将该片段插入pBR-rNDV质粒中，获得重组新城疫病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL。

3.  根据权利要求1所述表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒，其特征在于：所述重组病毒基因序列的cDNA序列是序列表<400>1的序列。

4.  根据权利要求2所述表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒基因组质粒，其特征在于：所述新城疫病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL全长序列是序列表<400>2的序列。

5.  根据权利要求2所述表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒基因组质粒，其特征在于：所述cHAb18轻重链基因融合片段序列是序列表<400>3的序列。

6.  一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒的复活方法，该方法包括：将pBR-rNDV-18HL、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的细胞，获得复活的重组病毒rNDV-18HL。

7.  一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒的纯化方法，其特征在于：该方法采用噬菌斑纯化的方式对重组病毒进行纯化。

8.  一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒用于抗肿瘤研究和治疗的应用，其特征在于：该病毒感染肿瘤细胞后能表达人源化嵌合抗体cHAb18，人源化嵌合抗体cHAb18能够特异性封闭肿瘤相关抗原分子CD147，抑制肿瘤细胞和间质细胞表达和分泌基质金属蛋白酶，从而抑制肿瘤细胞的运动和侵袭能力；同时病毒自身复制可以干扰肿瘤细胞的正常代谢，引起细胞间融合并最终死亡，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

说明书表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒/基因组质粒及其抗肿瘤治疗的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒/基因组质粒及其抗肿瘤治疗的应用。 
背景技术
根据前期的研究基础，已成功构建人源化cHAb18抗体，并能够在CHO-TS28工程细胞中表达并分泌。 
另外专利号为ZL200710018423.6也公开了肿瘤靶向性重组新城疫病毒构建方法，NDV Italien株基因组全长为15186bp，以F和HN基因之间的非编码区为分割点，分别将NDV Ital ien基因组的上、下两部分构建于不同质粒当中，并命名为pBR-rNDV-Seg1和pBR-rNDV-Seg2。将上述分段基因组质粒pBR-rNDV-Seg1和pBR-rNDV-Seg2经酶切并连接，构建得到单一片段基因组质粒pBR-rNDV，同时在片段两侧插入T7RNA聚合酶启动子和HDV自身催化核酶序列，同时，该病毒基因组质粒F和HN基因之间的非编码区中插入了外源基因转录盒，利用AgeI酶切位点，能够插入外源片段，以构建表达外源基因的重组NDV。本申请旨在利用肿瘤靶向性重组新城疫病毒构建方法构建携带人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒，并对其进行了纯化以及鉴定。通过对病毒功能的研究，充分证实了利用NDV反向遗传操作系统所构建的重组病毒rNDV-18HL具有肿瘤杀伤效应，同时，还能够高效表达cHAb18抗体，并将该外源基因编码的抗体释放至细胞周围的环境之中，可以发挥抗体靶向封闭肿瘤相关抗原的抑癌侵袭转移功能，该重组病毒无疑为抗体治疗联合溶瘤病毒治疗，从而研制肿瘤靶向杀伤药物提供了一种新策略，显示良好的应用前景。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒/基因组质粒及其抗肿瘤治疗的应用，其构建了携带人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒具备选择性杀伤肿瘤细胞能力，还能够高效表达人源化嵌合抗体cHAb18，并将该外源基因表达产物释放至细胞周围的环境中。 
本发明的技术解决方案是： 
一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒，其特征在于：它是基于新城疫病毒Italien株的基础上构建的重组新城疫病毒；该病毒可以选择性杀伤人肿瘤细胞，并且同时表达人源化嵌合抗体cHAb18。 
一种可以用于体外复活上述的重组新城疫病毒的新城疫病毒基因组质粒，其特征在于：它是由从稳定表达人源化嵌合抗体cHAb18的工程细胞系CHO-TS28中获得该抗体轻、重链的编码基因，通过overlap PCR的方法获得cHAb18轻重链基因融合片段序列，并且在其上下游分别加入病毒转录调控序列；得到人源化嵌合抗体cHAb18转录盒片段，再将该片段插入pBR-rNDV质粒中，获得重组新城疫病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL。 
上述重组病毒基因序列的cDNA序列是序列表<400>1的序列。 
上述新城疫病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL全长序列是序列表<400>2的序列。 
上述cHAb18轻重链基因融合片段序列是序列表<400>3的序列。 
一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒的复活方法，该方法包括：将pBR-rNDV-18HL、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，获得复活的重组病毒rNDV-18HL。 
一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒的纯化方法，其特征在于：该方法采用噬菌斑纯化的方式对重组病毒进行纯化。 
一种表达人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒用于抗肿瘤研究和治疗的应用，其特征在于：该病毒感染肿瘤细胞后能表达人源化嵌合抗体cHAb18，人源化嵌合抗体cHAb18能够特异性封闭肝癌相关抗原分子CD147，抑制肿瘤细胞和间质细胞表达和分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，从而抑制肿瘤细胞的运动和侵袭能力；同时病毒自身复制可以干扰肿瘤细胞的正常代谢，引起细胞间融合并最终死亡，达到杀伤肿瘤细胞的目的。 
本发明的有益效果是： 
本发明利用肿瘤靶向性重组新城疫病毒的构建方法构建了携带人源化嵌合抗体cHAb18的重组新城疫病毒。并提供了一套行之有效的复活及纯化方法，充分证实了利用NDV反向遗传操作系统所构建的重组病毒rNDV-18HL具有肿瘤杀伤 效应，同时，还能够高效表达cHAb18抗体，并将该外源基因表达产物释放至细胞周围的环境中，可以发挥抗体靶向封闭肿瘤相关抗原的抑癌侵袭转移功能，该重组病毒无疑为抗体治疗联合溶瘤病毒治疗，从而研制肿瘤靶向杀伤药物提供了一种新策略，显示良好的应用前景。 
附图说明
图1为本发明实验路径流程图； 
图2为本发明基因组质粒结构示意图； 
图3为cHAb18抗体轻、重链片段T载体的菌液PCR鉴定结果图； 
其中左图为cHAb18重链片段鉴定结果，引物为18H-F/R，1至8道均为目的片段，1.5kb；右图为cHAb18轻链片段鉴定结果，引物为18L-F/R，1至5道均为目的片段，750bp； 
图4为cHAb18抗体全长序列T载体的PCR鉴定结果图； 
cHAb18抗体全长序列，2.3kb，扩增引物为18H-F/18L-R，图中道3、道4、道7和道8为目的片段； 
图5为pBR-rNDV和外源基因cHAb18HL轻重链片段的酶切和纯化结果图； 
图中第1道为pBR-rNDV酶切产物，19kb；第2道为cHAb18抗体全长序列(HL)酶切片段，2.3kb；第3道为cHAb18抗体重链(H)酶切片段，1.5kb；第4道为cHAb18抗体轻链(L)酶切片段，750bp； 
图6为cHAb18HL片段与pBR-rNDV连接产物的PCR鉴定； 
图中箭头所指均为PCR鉴定阳性片段，引物为L-F/VT-R； 
图7为重组病毒rNDV-18HL的复活结果图； 
倒置显微镜观察重组病毒质粒pBR-rNDV-18HL与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共同转染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，细胞形成合胞体(100×)； 
图8为重组病毒rNDV-18HL感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞48h后检测人源化嵌合抗体cHAb18的表达效果图； 
Western blot方法检测重组病毒rNDV-18HL感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，cHAb18抗体的表达情况；图中对照组为稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞正常培养，cHAb18为抗体纯品，rNDV-18HL为BHK-21细胞感染重 组病毒rNDV-18HL；显色抗体为HRP-羊抗人IgG；图中160kDa处为cHAb18抗体非还原条带，52kDa处为cHAb18抗体还原条带； 
图9为rNDV-18HL感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后检测人源化嵌合抗体cHAb18的分泌量； 
ELISA方法检测重组病毒rNDV-18HL以MOI＝0.01感染BHK-21细胞后，不同时间点细胞培养上清中cHAb18抗体的分泌浓度；显色抗体：HRP-羊抗人IgG；图为3次独立实验统计得到的结果(mean±SD)； 
图10为rNDV-18HL感染摇瓶培养稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后检测人源化嵌合抗体cHAb18的分泌量； 
ELISA方法检测重组病毒rNDV-18HL感染摇瓶培养稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，不同时间点cHAb18抗体的分泌浓度；显色抗体：HRP-羊抗人-IgG；图为3次独立实验统计得到的结果(mean±SD)。 
图11为rNDV-18HL和NDV Italien感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后上清中的病毒滴度的测定； 
TCID50法比较rNDV-18HL和NDV Italien分别以MOI＝0.01感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，病毒的增殖复制能力，以上为3次独立实验的结果(mean±SD)，rNDV-18HL与NDVItalien的毒力在各时间点比较均无显著性差异，P＞0.05； 
图12rNDV-18HL和NDV Italien感染不同肝癌细胞后细胞的存活率； 
MTT法比较rNDV-18HL和NDV Italien体外杀伤人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和Huh-7的能力；上图均为3次独立实验的结果(mean±SD)，rNDV-18HL与NDVItalien病毒相比，对肿瘤细胞的杀伤能力相似，P＞0.05； 
图13为cHAb18抗体作用细胞24h后，收集细胞上清液，利用明胶酶谱法检测各浓度抗体对THP-1细胞和人成纤维细胞Fb的MMPs分泌水平抑制的代表性图像。 
图14Real-time PCR方法检测cHAb18抗体对SMMC-7721和SMMC-K7721细胞中MMP-2、MMP-9mRNA表达的抑制，GAPDH为内参。图为3次独立实验的结果(mean±SD)。SMMC-K7721为CD147基因敲除细胞系。***P＜0.001。 
图15为采用人工基底膜法分析cHAb18抗体抑制人肝癌细胞SMMC-7721和 SMMC-K7721的侵袭能力。图中所示为3次独立实验中细胞经33％冰醋酸震荡溶解Transwell外室表面细胞，酶标仪A570处测OD值，结果用cHAb18抗体各剂量组与对照组相比穿膜细胞数的百分比表示(mean±SD)。SMMC-K7721为CD147基因敲除细胞系。*P＜0.05，**P＜0.01。 
图16为Transwell实验检测细胞迁移能力。代表3次独立实验中细胞经33％冰醋酸震荡溶解Transwell外室表面细胞，酶标仪A570处测OD值，结果用cHAb18抗体各剂量组与对照组相比穿膜细胞数的百分比表示(mean±SD)。*P＜0.05，**P＜0.01。 
图17为划痕实验检测细胞的迁移能力，代表3次独立实验所得到cHAb18抗体组细胞迁移距离相对于对照组细胞迁移距离的百分比(mean±SD)。SMMC-K7721为CD147基因敲除细胞系。***P＜0.01。 
具体实施方式
1.方法 
1.1重组病毒rNDV-18HL的构建策略 
参见图1，NDV Italien基因组全长为15186bp，以F和HN基因之间的非编码区为分割点，分别将NDVItalien基因组的上、下两部分构建于不同质粒当中，并命名为pBR-rNDV-Seg1和pBR-rNDV-Seg2。将上述分段基因组质粒pBR-rNDV-Seg1和pBR-rNDV-Seg2经酶切并连接，构建得到单一片段基因组质粒pBR-rNDV，同时在片段两侧插入T7RNA聚合酶启动子和HDV自身催化核酶序列，同时，该病毒基因组质粒F和HN基因之间的非编码区中插入了外源基因转录盒，利用AgeI酶切位点，能够插入外源片段，以构建表达外源基因的重组NDV，本实验从稳定表达人源化嵌合抗体cHAb18的工程细胞系CHO-TS28中获得该抗体轻、重链的编码基因，通过overlap PCR的方法获得轻重链基因的串联表达片段，并且在其上下游分别加入病毒转录调控序列。最终将该片段插入pBR-rNDV质粒中，获得重组病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL，该基因组质粒结构示意图参见图2。 
将重组病毒基因组质粒pBR-rNDV-18HL与前期构建完成的NP、P和L基因的真核表达质粒，共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞。在该细胞中，病毒基因组质粒通过T7RNA聚合酶转录得到负链的病毒全长基因组RNA， 同时利用辅助质粒转录并且表达出病毒复制所必须的NP、P和L蛋白，三者与病毒基因组RNA共同形成RNP复合物，启动病毒基因组的复制和病毒蛋白的表达，并且自行组装形成子代病毒颗粒。 
1.2携带cHAb18抗体的重组病毒基因组质粒的构建 
1.2.1cHAb18抗体轻、重链片段的扩增 
根据本实验室前期研究基础，已成功构建人源化cHAb18抗体，并能够在CHO-TS28工程细胞中表达并分泌。本研究通过裂解该细胞，提取总RNA，反转录为cDNA作为以下实验扩增cHAb18抗体轻、重链片段的模板。 
提取RNA操作步骤详见OMEGA公司total RNA extraction kit II产品说明书，最终以20μLRNase free H2O溶解RNA。 
同时依据NDV基因组的6碱基原则，插入其基因组中的外源片段也必需满足6碱基原则，从而保证外源基因插入后病毒基因组数目仍然保持6的整数倍。分别在HO的上游和LO的下游添加AgeI酶切位点用于连入pBR-rNDV，同时在起始密码子前添加Kozak序列提高转录效率。cHAb18抗体轻链完全编码序列由引物18L-F/R以CHO-TS28细胞总RNA反转录的cDNA为模板扩增。cHAb18抗体重链完全编码序列由引物18H-F/R以CHO-TS28细胞总RNA反转录的cDNA为模板扩增。 
18LO序列引物： 
18L-F：5’-TTAGAAAAAAATACGGGTAGAAATAAGCCACCATGGACTCACATACTC-3’ 
18L-R：5’-TATTCCGGATTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’ 
18HO序列引物： 
18H-F：5’-ATATCCGGAGCCACCATGAACTTCGGGCTGAGC-3’ 
18H-R：5’-TTCTACCCGTATTTTTTTCTAAGTGATAGTGATCATTTACCCGGAGAC-3’ 
以上两个片段的扩增均采用TaKaRa公司的PrimeSTARHS高保真DNA聚合酶，反应体系和反应条件参见产品说明书，其中延伸时间在扩增片段18HO时为2min；扩增片段18LO时为1.5min。 
利用OMEGA公司E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收，方法详见产品说明书，最终用50μL无菌去离子水洗脱目的片段。 
PCR产物的末端“+A”，采用10μL体系，配制如下： 

70℃孵育50min。 
PCR“+A”产物与T载体的连接，采用TaKaRa公司pMD-18T载体试剂盒，连接体系10μL，配制参见产品说明书： 
连接产物转化DH5α感受态，该感受态采用TSS方法制备，冻存于-80℃冰箱，转化感受态采用标准步骤进行。 
连接产物的鉴定和测序 
以小枪头随机挑取平板上24个克隆，在装有10μL预混PCR反应液的PCR管中震荡数次，随后在含有1mL Amp(+)LB培养基的Eppendorf管中吹打数次并继续培养。预混PCR反应液采用润德公司Taq2×Master Mix PCR预混试剂，利用引物18HO-F和18HO-R鉴定。预混方式和反应条件参见产品说明书，反应结束后，将5μL反应液进行电泳检测，确定阳性克隆。 
将鉴定所得到的阳性克隆摇菌，测序。 
1.2.2Overlap PCR扩增cHAb18全长序列 
以所得到的PCR片段18HO和18LO作为模板，18H-F/18L-R作为引物，利用Overlap PCR的方法扩增得到cHAb18全长序列，50μL反应体系如下： 

反应条件如下： 


循环10次 
补加引物18H-F/18L-R，反应条件如下： 

循环25次 

PCR产物通过凝胶回收试剂盒进行回收，最终将其溶于50μL无菌去离子水中，同时利用凝胶成像系统进行定量。 
PCR产物“+A”，连接T载体，转化并连接与前步骤相同。 
阳性克隆摇菌，并送测序。 
1.2.3PCR产物和质粒pBR-rNDV的酶切 
所得到的18HL-T与pBR-rNDV分别利用NEB公司Kpn21和AgeI限制性核酸内切酶进行酶切，反应条件详见产品说明书。酶切结束后通过TaKaRa公司Cycle-pure对产物进行快速纯化回收。 
1.2.4pBR-rNDV酶切产物的去磷酸化 
由于载体pBR-rNDV为单酶切产物，因此需要将酶切产物进行去磷酸的处理，以防止其快速自连接再次形成环状。去磷酸化采用TaKaRa公司的CIAP碱性磷酸激酶，反应体系为50μL，反应体系和反应条件详见产品说明书。 
反应结束后，使用TaKaRa公司Cycle-pure试剂盒对产物进行快速回收，所得到的产物于酶标仪A260/280进行定量。 
1.3携带外源基因cHAb18抗体的重组病毒的复活、纯化和鉴定 
1.3.1重组新城疫病毒rNDV-18HL的复活 
(1)质粒的制备 
A：将含有pBR-rNDV、pBR-rNDV-18HL、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L五种质粒的菌液，分别加入到200mL的Amp(+)LB培养基中，37℃，250rpm摇菌，当吸光度值A600为3左右时停止培养。 
D：采用天根生物公司的除内毒素质粒中量提取试剂盒，操作步骤详见产品说明书，最终用2mL预热的TE Buffer溶解质粒，采用紫外分光光度计测定A260/280比值，确定质粒含量。 
(2)质粒共转染 
A：利用6孔板接种稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，共6孔，待细胞贴壁长至90％时开始实验。 
B：设定5组，复活组(2孔)：为重组病毒pBR-rNDV-18HL基因组质粒与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染组；阳性对照组(1孔)：为pBR-rNDV与三个辅助质粒共转染组；阴性对照组1(1孔)：为3个辅助质粒共转染组；阴性对照组2(1孔)：为pBR-rNDV转染组；空白对照组(1孔)：不加任何质粒和试剂；Mock组(1孔)：只加入转染试剂。 
C：按照下表配制转染液，配制完成的PEI和质粒于室温下孵育15min。 

D：弃掉培养上清，用不含血清的DMEM培养液洗细胞3次，按照分组，依次加入相对应的PEI/质粒混合液各500μL，37℃，5％CO2培养箱中孵育6h后， 更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养。 
(3)重组病毒rNDV-18HL的收集 
转染后连续3-10天内观察细胞有无病变，收集形成融合细胞的孔中的培养上清，同时将含有少量培养液的细胞反复冻融3次以裂解细胞，将上清以及细胞裂解液收集后，4℃离心，3,000g×10min，去除沉淀，继续在250mL培养瓶中接种感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞以扩增病毒。 
1.3.2.重组病毒rNDV-18HL的纯化 
采用噬菌斑纯化的方式对重组病毒进行纯化： 
A：稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种35mm培养皿，待细胞贴壁长至90％以上开始实验。 
B：用不含血清的DMEM培养基倍比稀释含有病毒的细胞培养液，稀释浓度从104倍开始，至107倍终止，各组稀释液体积为2mL。 
C：采用标准病毒噬斑纯化的方法对病毒进行纯化，2-3天后观察到细胞病变，挑取单个病变的细胞及其凝胶，感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞以进行病毒增殖。 
D：扩大培养的病毒采用1.3.1.(3)相同的方法进行病毒悬液的收获，所得到病毒悬液冻存于-80℃冰箱中。 
1.3.3.重组病毒rNDV-18HL的鉴定 
在我们构建的重组病毒中，插入了所有野生型NDV中均没有的AgeI酶切位点(GS…AgeI…GE)和转录盒。使用RNA提取试剂盒提取病毒感染细胞后的总RNA，反转录为cDNA，以其为模板扩增病毒基因组中HN和F基因之间的非编码区序列。 
A：将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于6孔板中，待其贴壁长至90％以上开始实验。 
B：提取RNA操作步骤详见OMEGA total RNA extraction kitII产品说明书，最终以45μLRNase free H2O溶解RNA。 
C：将所得到的RNA溶液直接进行RT-PCR，引物为cHAb18抗体序列引物和病毒特异性引物(VT-F/L-R)。 
病毒检测的引物序列： 
VT-F5’-GACGGGATAACTCTGAGG-3’ 
L-R5’-ATAACCGGTATATTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’ 
病毒基因组的RT-PCR采用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒，反应体系和反应条件详见产品说明书。 
RT-PCR反应结束后，直接采用TaKaRa公司PrimeSTAR HS进行片段的扩增，反应体系和反应条件详见产品说明书。 
反应结束，将反应产物进行电泳检测，将其中约800bp大小条带通过凝胶回收试剂盒进行回收，随后“+A”，与pMD-18T载体连接，并送测序。根据测序结果与野生型NDV Italien的基因组序列进行比对，确认是否有特征性片段的插入。鉴定正确的重组病毒株，命名为rNDV-18HL。 
1.4重组病毒rNDV-18HL的鸡胚扩增 
A：将含有重组病毒rNDV-18HL的细胞上清，按105四个滴度进行稀释，稀释液置于冰上。 
B：选用无特定病原(SPF)种蛋，按照标准鸡胚尿囊腔病毒培养方法，每只种蛋注入病毒稀释液的体积为100μL。 
C：24h内观察并弃去病毒接种后死亡的鸡胚，收集于24-72h内死亡的鸡胚，置于4℃冰箱保存。将病毒注射后72h时仍然存活的鸡胚置于4℃冰箱过夜，以至鸡胚死亡。 
D：将收集到的鸡胚沿气室剪开，使用巴氏吸管吸取鸡胚尿囊液至50mL离心管，所收集的尿囊液置于4℃冰箱中保存。 
1.5病毒的浓缩及纯化 
A：将尿囊液4℃离心4,500g×30min，吸取上清。 
B：将20％无菌蔗糖溶液5mL置于Beckman34.5mL超速离心专用离心管中，再将经上步粗离得到的尿囊液加至蔗糖溶液之上，4℃离心100,000g×4h。 
C：小心弃去上清，每管加入2mL TNE缓冲液重选并收集沉淀，随后利用20-50％不连续蔗糖密度梯度离心，4℃条件下离心150,000g×4h以分离病毒悬液，收集不同密度界面的白色雾状悬液并且用TNE缓冲液定容至20mL(TNE buffer体积至少大于收集液4倍)。 
D：将C中所收集的病毒悬液分别在4℃离心150,000g×4h，最终用1mL TNE 缓冲液收集各梯度蔗糖溶液中的病毒，每管100μL分装冻存于-80℃冰箱中。 
1.6重组病毒rNDV-18HL的滴度测定——TCID50法 
A：将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞以5×104个/孔接种于96孔板中，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，待细胞贴壁且生长至90％时开始实验。 
B：将鸡胚扩增所得到的病毒用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行以10为倍数的倍比稀释，以104为初始稀释倍数，1013为终止倍数，稀释体积均为1mL。 
C：将96孔板中培养上清弃掉，每孔加入100μL病毒稀释液，每个稀释倍数设8个孔，同时设置8个空白对照孔(细胞不做任何处理)，将细胞继续置于37℃，5％CO2孵箱中培养。 
D：感染病毒5天后，检查96孔板中的细胞，与空白对照组比较，标记出现病变的孔并作记录。 
E：利用TCID50法计算病毒滴度，采用Reed&Muench Calculator程序进行计算。 
1.7重组病毒rNDV-18HL表达和分泌外源基因的检测 
将TCID50法测定重组病毒滴度所得到的TCID50/mL值换算成pfu值，并且将病毒稀释到104pfu/mL，当病毒悬液以1mL/孔(6孔板)感染细胞时，其感染复数(MOI)约为0.01。 
1.7.1重组病毒rNDV-18HL表达cHAb18抗体的检测(western blot) 
A：将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于6孔板，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，待细胞贴壁且生长至80％时开始实验。 
B：实验分为2组，空白对照组：细胞不感染病毒；实验组：将稀释的重组病毒rNDV-18HL悬液以1mL/孔(MOI＝0.01)感染细胞；将孔板置于37℃，5％CO2孵箱中培养，每日观察直至实验组细胞产生融合。 
C：采用北京鼎国试剂的RIPA细胞裂解液裂解细胞，方法详见产品说明书。 
D：采用Invitrogen公司BCA试剂盒对样品进行总蛋白定量，以BSA做标准曲线，计算2组样品中总蛋白的浓度。 
E：利用Western blot方法分别对还原样品与非还原样品进行电泳，转膜以及发光检测，同时以人源化嵌合抗体cHAb18纯品作为阳性对照组。 
1.7.2重组病毒rNDV-18HL分泌cHAb18抗体产量的检测(ELISA) 
A：将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于6孔板，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，待细胞贴壁且生长至80％时，弃掉培养上清，替换为稀释好的病毒悬液，1mL/孔(MOI＝0.01)。 
B：分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h和96h收集细胞培养上清，冻存于-80℃冰箱。 
C：同时用包被液稀释纯化的HAb18G/CD147蛋白至15μg/mL，加入ELISA板条中，4℃过夜。 
D：次日，将B步中收集的细胞上清，置于冰上融化。 
E：利用包被有HAb18G/CD147分子的ELISA板条，以浓度为0.1mg/mL人源化嵌合抗体cHAb18纯品制作标准曲线。实验组则将细胞上清加入到提前包被好HAb18G/CD147蛋白的ELISA板条中，按照标准ELISA检测方法对抗体浓度进行检测。 
1.8重组病毒rNDV-18HL与野生型NDV Italien毒株增殖速率的比较(TCID50法) 
为检测重组病毒在插入外源基因片段导致其基因组长度增加后，病毒的复制能力及其增殖效率是否会降低，我们利用TCID50的方法检测rNDV-18HL和NDVItalien以相同MOI感染同一细胞系、不同时间点的病毒滴度，从而反映重组病毒的增殖能力。 
A：将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于6孔板中，待细胞于37℃，5％CO2培养箱中贴壁长至90％开始实验。 
B：细胞以无血清DMEM洗3次后，分为2组，分别感染rNDV-18HL和NDVItalien，每组设3个复孔。加入1mL病毒稀释液(MOI＝0.01)，37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。 
C：弃掉病毒稀释液，用无血清DMEM洗细胞3次，随即加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，此时刻点作为0h。 
D：分别于病毒感染细胞6h、12h、24h、48h和72h后收集病毒感染上清。 
E：同时，另将稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于96孔板中，待细胞长至90％时，用TCID50法测定病毒滴度。 
F：将收集的上清液按10的倍数倍比稀释，每个时间点设立6个浓度梯度。6h、12h、24h、36h、48h和72h的起始稀释倍数分别为101、102、103、104、105和105。 
G：将96孔板中培养上清弃掉，每孔加入100μL病毒稀释液，每个稀释倍数设8个孔，同时设置8个空白对照孔(细胞不做任何处理)，将细胞继续置于37℃，5％CO2孵箱中培养。 
H：感染病毒5天后，检查96孔板中的细胞，与空白对照组比较，标记出现病变的孔并作记录。 
1.9重组病毒rNDV-18HL与野生型NDV Italien毒株在体外对不同肝癌细胞系的杀伤作用比较(MTT法) 
本实验是通过比较重组病毒rNDV-18HL和NDV Italien在体外对不同肿瘤细胞系的杀伤能力，检测外源片段插入的同时能否影响病毒对肿瘤细胞的杀伤能力。通过MTT法测定细胞感染病毒后，不同时间点的细胞存活率，评判重组病毒rNDV-18HL的体外抗肿瘤能力。 
A：该实验选用3株人肝癌细胞系，分别为SMMC-7721、HepG2和Huh-7。 
B：将3株细胞分别接种于96孔板中，待细胞贴壁长至60％，按照病毒感染组和空白对照组，分别于相对应孔内加入病毒稀释液100μL/孔(MOI＝0.01)，于37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。 
C：感染结束，弃掉病毒稀释液，用无血清DMEM洗细胞3次，加入200μL含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，此时即为0d。 
D：分别于0d、0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d，采用标准的MTT检测细胞活力方法检测各时间点的细胞存活率。细胞存活率＝[(实验组OD值-校正孔OD值)/(对照组OD值-校正孔OD值)]×100％。 
1.10明胶酶谱分析 
A：取对数期生长人急性单核白血病细胞THP-1在无血清培养基37℃孵育24h，用抗体处理时，分别加入终浓度为0、0.01、0.05和0.1mg/mL cHAb18抗体。同时取对数期生长人成纤维细胞Fb加入0.1mg/mL cHAb18抗体。 
B：分别收集相应培养上清，离心去沉淀，根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度。 
C：等蛋白质量样品与5×非还原上样缓冲液1∶4混合，55℃水浴3-5min。 
D：样品以160V恒压于含0.1％明胶的SDS-PAGE电泳1h。 
E：2.5％TritonX-100中震荡洗涤3次，每次5min。 
F：加入孵育缓冲液，孵箱孵育18h。 
G：将SDS-PAGE胶放入考马斯亮蓝染色液中染色10-24h。 
H：脱色液脱色，拍照。 
1.11Real-time PCR检测SMMC-7721肝癌细胞中MMPs表达 
A：cHAb18抗体处理人SMMC-7721肝癌细胞24h后，采用invitrogen公司Trizol试剂提取细胞的RNA，操作方法参见产品说明书，最终用DEPC水洗脱RNA，紫外分光光度仪检测RNA样品A260及A280OD值，计算总RNA的浓度和纯度。 
B：反转录采用TOYOBO公司的ReverTra Ace-试剂盒以上述总RNA为模板进行反转录，10μL体系，反应体系和条件参见产品说明书。 
C：Real-time PCR，将上述反转录得到的cDNA经紫外分光光度法定量后，用设计好的引物进行PCR扩增，引物序列如下： 
MMP-2：Forward sequence5’-GGCAGTGCAATACCTGAACACC-3’ 
Reverse sequence5’-GTCTGGGGCAGTCCAAAGAACT-3’ 
MMP-9：Forward sequence5’-TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA-3’ 
Reverse sequence5’-CGCCACGAGGAACAAACTGTAT-3’ 
GAPDH：Forward sequence：5’-ACCACAGTCCATGCCATCA-3’ 
Reverse sequence：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 
反应采用TaKaRa公司Prime Script RT reagent试剂盒进行，体系为20μL，反应体系和条件参见产品说明书。 
D：抑制率＝[(对照组相对量-处理组相对量)/对照组相对量]×100％ 
1.12细胞侵袭实验 
A：将培养小室置于24孔板上，培养小室聚碳酸酯膜上包被Matrigel(5μg/mL)。 
B：取对数期生长人肝癌细胞SMMC-7721和SMMC-K7721，细胞密度为4×104个/mL，培养小室内部加入250μL细胞悬液，小室外部空间加入500μL含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基作为化学趋化剂。 
C：每个小室内分别加入终浓度为0、0.01、0.05和0.1mg/mL cHAb18抗体。 
D：采用标准的细胞侵袭实验流程，利用结晶紫染料检测24h后小室下表面细胞数目。 
E：细胞侵袭率＝[(实验组OD值-校正孔OD值)/(对照组OD值-校正孔OD值)]×100％。 
1.13细胞划痕实验 
A：消化对数生长期人肝癌细胞SMMC-7721，计数后，在24孔板每孔中加入约2×105个细胞，置37℃，5％CO2培养箱中孵育至细胞贴壁生长。 
B：采用标准的划痕实验方法，分别取3点(a，b，c)测量，检测划痕后24h和48h细胞迁移距离。 
C：细胞移动距离取3点平均值，每条件设定3个复孔，计算平均值±标准差。实验重复3次。 
1.14小室迁移实验 
A：接种对数生长期SMMC-7721细胞于24孔板内，待细胞贴壁生长后，分别加入0.01、0.05和0.1mg/mL cHAb18抗体，于37℃，5％CO2培养箱中培养18h。 
B：按照Transwell小室迁移实验标准步骤，在抗体处理18h后的细胞计数并接种于上室，培养6h后，利用结晶紫染色的方法检测下室中细胞数目。 
C：细胞迁移率＝[(实验组OD值-校正孔OD值)/(对照组OD值-校正孔OD值)]×100％。 
2.实验结果 
2.1外源基因cHAb18抗体轻、重链及全长序列片段的扩增 
为扩增得到CHO-TS28细胞分泌人源化嵌合抗体cHAb18的轻、重链及全长序列的片段，我们首先提取CHO-TS28细胞的总RNA，反转录为cDNA后，分别以18HO-F/R、18LO-F/R作为引物，以CHO-TS28细胞cDNA作为模板，PCR扩增得到cHAb18抗体的轻、重链片段。PCR产物电泳分析表明，目的片段分别为cHAb18L(750bp)和cHAb18H(1.5kb)。产物经过凝胶回收试剂盒纯化后，以18H-F/18L-R作为引物，cHAb18L和cHAb18H作为模板，通过Overlap PCR的方法，扩增得到cHAb18HL(2.3kb)。以上片段均为经PCR片段“+A”并连接pDM18-T载体产物，转化TSS DH5α感受态菌后，涂布于LB(Amp+)平板，24h后观察18HO-T涂板 后长出41个克隆，18LO-T涂板后长出30个克隆，18HL-T涂板后长出11个克隆。经菌液PCR参见图3和图4，挑选出的阳性克隆全部提取质粒，并进行测序，将测序结果正确的质粒用于与pBR-rNDV质粒的连接。 
pBR-rNDV质粒和18HL-T质粒均分别经过Age I和Kpn21酶切后Cycle-pure试剂盒回收，pBR-rNDV产物经过去磷酸化的处理，再次使用Cycle-pure试剂盒回收，产物经电泳参见图5，回收成功。 
2.2外源基因cHAb18HL全长序列与pBR-rNDV的连接和鉴定 
在得到酶切产物后，为连接得到表达cHAb18抗体的重组NDV，我们按照相对定量结果，连接体系中pBR-rNDV与外源基因cHAb18HL全长序列的用量分别为6.5μL和1.5μL。连接完成后，将连接产物转化DH5α感受态菌，并涂布于LB(Amp+)平板之上。24h后检测平板，空白对照组共长出60个克隆，pBR-rNDV与cHAb18HL连接组有31个克隆。连接产物利用VT-F/L-R作为引物进行菌液PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.8kb，参见图6。将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序，测序结果正确的质粒命名为pBR-rNDV-18HL。 
2.3携带外源基因cHAb18抗体的重组病毒的复活、纯化和鉴定 
为拯救该重组病毒，我们用pBR-rNDV-18HL与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共同转染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞。在转染后第5天，孔板中出现了明显的细胞融合现象参见图7，且通过病毒增殖培养、噬菌斑纯化以及病毒基因组测序鉴定后，将测序结果正确的病毒命名为rNDV-18HL，此病毒携带人源化嵌合抗体cHAb18的全长序列。 
2.4重组病毒rNDV-18HL的鸡胚尿囊腔培养、浓缩和纯化 
我们将复活得到的重组病毒rNDV-18HL利用SPF种蛋鸡胚尿囊腔进行扩增。首先将该病毒稀释后感染鸡胚，一枚种蛋收获到8-10mL尿囊液。接着病毒经过粗离心以及20％、30％、40％和50％蔗糖密度梯度离心后，收集各梯度蔗糖溶液内重组病毒，TNE重悬后进行TCID50滴度测定，以出现融合细胞为阳性孔，结果如下： 


2.5重组病毒rNDV-18HL表达外源基因cHAb18抗体 
在得到纯化的rNDV-18HL重组病毒后，为检测该病毒表达外源基因的能力，我们将该重组病毒以MOI＝0.01感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，于第2天形成明显可见细胞融合现象，收集细胞，提取总蛋白，western blot分析结果显示，病毒感染组与空白对照组相比，重组病毒rNDV-18HL可以在细胞中高效表达外源蛋白cHAb18抗体参见图8。 
2.6重组病毒rNDV-18HL感染细胞后，随时间的延长外源基因cHAb18抗体的分泌量逐渐增加 
重组病毒rNDV-18HL以MOI＝0.01感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞后，分别于0h、12h、24h、36h、48h、72h和96h收集细胞上清，ELISA方法检测细胞分泌cHAb18抗体的浓度。结果显示，cHAb18抗体随病毒感染细胞时间的延长，其分泌量逐渐增加，且于48h达到最高浓度7μg/mL参见图9，随后趋近饱和。分析可能随着细胞的崩解，细胞存活率逐渐降低，病毒的复制也随之停止，导致抗体的表达量不再增加。 
为检测rNDV-18HL所表达的cHAb18抗体的生物学活性，我们进行了病毒体外细胞摇瓶培养技术，利用2L摇瓶培养稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，感染重组病毒rNDV-18HL后，分别于第1天、第2天、第3天、第4天和第5天收集培养上清，通过ElISA的方法检测培养上清中抗体的浓度。结果显示，用该重组病毒感染细胞后，cHAb18抗体的分泌浓度与实验室常规细胞培养cHAb18抗体的分泌浓度达到同一数量级，且于第3天cHAb18抗体分泌浓度达到最大值2.4μg/mL参见图10。 
2.7重组病毒rNDV-18HL与NDV Italien的病毒毒力无显著性差异 
理论上在插入外源基因的同时会引起病毒基因组下游基因的转录水平下降，为检测重组病毒rNDV-18HL与NDV Italien野生毒株毒力的差异，本研究将两株病毒分别感染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，并在6h、12h、24h、 48h和72h检测病毒的滴度，结果显示参见图11，两株病毒的滴度无显著性差异(P＞0.05)。表明在HN和F基因之间插入外源基因并不会降低病毒的复制增殖能力，说明重组病毒rNDV-18HL依然保留了其模板NDV Italien野生毒株高效复制增殖的能力。 
2.8重组病毒rNDV-18HL体外杀伤肿瘤细胞的作用 
为检测重组病毒rNDV-18HL体外杀伤肿瘤细胞的能力，本研究选用SMMC-7721、HepG2和Huh-7三株肝癌细胞系，分别用重组病毒rNDV-18HL和野生毒株NDVItalien以MOI＝0.01感染细胞，MTT法测定感染后7天内细胞的存活率。实验结果显示参见图12，不同肝癌细胞对两株病毒的敏感性不同，感染NDV Italien和rNDV-18HL后第7天，SMMC-7721细胞的存活率分别为22.7±0.6％和26±1.0％；HepG2细胞的存活率分别为0.66±0.5％和0.66±0.4％；Huh-7细胞的存活率分别为1.33±0.4％和1.33±0.4％。重组病毒rNDV-18HL和NDV Italien在体外对肿瘤细胞的杀伤作用无显著性差异(P＞0.05)。该结果提示，重组病毒rNDV-18HL在表达外源基因的同时，依然能够在体外发挥其抗肿瘤功效。 
2.9cHAb18抗体抑制MMP-2、MMP-9的表达 
为阐明cHAb18抗体抑制肿瘤细胞侵袭能力的分子机制，我们分别以0.01mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/mL浓度cHAb18抗体作用于人急性单核白血病细胞THP-1，同时用0.1mg/mL浓度cHAb18抗体作用于人成纤维细胞Fb，24h后，明胶酶谱结果显示与无关抗体(抗汉坦病毒抗体)对照组和阴性对照组相比，THP-1和Fb细胞分泌MMPs(MMP-2，MMP-9)的量显著下降，提示cHAb18抗体可以抑制THP-1和Fb细胞MMPs的分泌，结果参见图13。 
2.10以相同浓度梯度的cHAb18抗体分别处理SMMC-7721和SMMC-K7721细胞，24h后，real-time PCR结果显示与对照组相比，SMMC-7721细胞MMPs(MMP-2，MMP-9)的相对mRNA水平均随cHAb18抗体浓度的增加而显著下降，MMP-2mRNA的抑制率分别为4.6±0.4％(P＞0.05)、57.7±3.9％(P＜0.001)及82.8±8.2％(P＜0.001)，MMP-9mRNA的抑制率分别为15.3±8.1％(P＞0.05)、68.8％±7.4％(P＜0.001)及75.2±3.9％(P＜0.001)。而cHAb18抗体以相同剂量作用于SMMC-K7721细胞，与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，该结果提示cHAb18 单抗可以通过特异性封闭肝癌细胞膜分子HAb18G/CD147的活性，有效抑制人肝癌细胞SMMC-7721的MMPs mRNA水平，结果参见图14。 
2.11cHAb18抗体能够显著抑制肝癌细胞体外的侵袭能力 
体外基底膜侵袭实验显示，参见图15，在0.01mg/mL、0.05mg/mL和0.1mg/mL cHAb18抗体作用细胞24h后，与对照组相比，SMMC-7721细胞的穿膜细胞数显著下降，侵袭率分别为87.3±8.1％(P＞0.05)、75.4±4.5％(P＜0.05)和71.6±2.7％(P＜0.01)，提示cHAb18单抗可以有效抑制人肝癌细胞SMMC-7721的体外侵袭能力。利用敲除CD147基因的SMMC-K7721肝癌细胞系作为对照组，以相同浓度梯度的cHAb18抗体处理该细胞，与对照组相比，细胞的侵袭率分别为93.8±2.3％，93.8±1.4％和92.4±3.3％，结果提示cHAb18抗体并不能够调节SMMC-K7721细胞的体外侵袭能力，该结果充分证明cHAb18抗体可以通过特异性封闭HAb18G/CD147分子而抑制肿瘤细胞的侵袭能力。 
2.12cHAb18抗体显著性抑制肝癌细胞的迁移能力 
Transwell小室实验结果显示，参见图16，与对照组相比，cHAb18抗体可显著抑制细胞的迁移能力，细胞迁移率随抗体浓度的增加分别为89.9±1.9％、75.4±5.7％(P＜0.05)和64.1±5.9％(P＜0.01)。以相同浓度cHAb18抗体作用于SMMC-7721和SMMC-K7721细胞24h进行划痕实验，结果显示参见图17，cHAb18抗体能够显著抑制SMMC-7721细胞的迁移能力，细胞迁移率随抗体浓度的增加分别为51.6±8.3％、41.7±4.7％(P＞0.05)、21.9±3.0％(P＜0.01)和15.2±2.2％(P＜0.01)。而cHAb18抗体处理SMMC-K7721肝癌细胞24h，细胞迁移率随抗体浓度的增加分别为43.7±2.6％，43.2±0.4％和41.2±3.8％，与对照组细胞迁移率48.5±2.1％相比无显著性差异(P＞0.05)，该结果证明cHAb18抗体不会影响敲除CD147基因的SMMC-K7721细胞的迁移能力，提示cHAb18抗体可以通过特异性封闭HAb18G/CD147来抑制细胞的运动能力。 
综上所述，通过本发明的研究，我们充分证实了利用NDV反向遗传操作系统所构建的重组病毒rNDV-18HL具有肿瘤杀伤效应，同时，还能够高效表达cHAb18抗体，并将该外源基因表达产物释放至细胞周围的环境中，发挥抗体靶向封闭肿瘤抗原的抑癌侵袭转移功能，该重组病毒无疑为抗体治疗联合溶瘤病毒治疗，从而建立肿瘤靶向杀伤和肿瘤选择性杀伤的新策略，显示良好的应用前景。