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1、(10)申请公布号 CN 103525753 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525753 A (21)申请号 201310436011.X (22)申请日 2013.09.23 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 四川新生命干细胞科技股份有限公 司 地址 610037 四川省成都市金牛区金泉路 15 号 (72)发明人 赖真阳 陈强 李雪莲 钟立武 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 张娟 (54) 发明名称 一种内皮克隆形成细胞的分离方法 (57) 摘要 本发明公开了一种内皮克隆形成。
2、细胞的分离 方法， 包括如下步骤 ：（1） 酶消化 ： 取脐带， 用碱性 或中性缓冲液冲洗脐带静脉至流出的液体透明， 在脐带静脉中充入胶原酶或者胶原酶与胰酶的混 合酶， 消化 15 60min， 收集消化液 ；（2） 机械刮 取 ： 将脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用 细胞刮刮取脐带静脉内表面 3 10 分钟， 用碱性 或中性缓冲液洗涤， 收集洗涤液 ；（3） 将步骤 （1） 的消化液和步骤 （2）的洗涤液合并， 离心， 去上 清， 即可。本发明内皮克隆形成细胞的分离方法， 可以从脐带静脉中有效分离内皮克隆形成细胞， 临床应用前景优良。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说。
3、明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103525753 A CN 103525753 A 1/1 页 2 1. 一种内皮克隆形成细胞的分离方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： （1） 酶消化 ： 取脐带静脉， 用碱性或中性缓冲液灌注冲洗至流出的液体透明， 灌入胶原 酶或者胶原酶与胰酶的混合酶， 封闭两端， 消化 15 60min， 打开两端， 收集消化液 ； （2） 机械刮取 ： 将脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮刮取脐带静脉内表 面 3 10 分钟， 再用碱。
4、性或中性缓冲液洗涤， 收集洗涤液 ； （3） 将步骤 （1） 的消化液和步骤 （2） 的洗涤液合并， 离心， 去上清， 即可。 2. 根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述碱性或中性缓冲液 是 PBS 缓冲液、 DPBS 缓冲液或者 Hanks 缓冲液。 3.根据权利要求1所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述胶原酶是II型胶原 酶。 4. 根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述胶原酶的浓度为 0.2%， 所述胰酶的浓度为 0.5%， 胶原酶与胰酶的体积比为 1:1。 5. 根据权利要求 1 所述的。
5、分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （1）中， 所述消化的温度为 37。 6.根据权利要求1所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述消化的时间是15 30min。 7. 根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 所述刮取的时间是 5 分 钟。 8. 根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 所述碱性或中性缓冲液 是 PBS 缓冲液、 DPBS 缓冲液或者 Hanks 缓冲液。 9. 根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 所述缓冲液的用量为脐 带静脉长度的 0.5 1.5 倍 （ml/c。
6、m） 。 10. 根据权利要求 9 所述的分离方法， 其特征在于 ： 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度 的 1 倍 （ml/cm） 。 权 利 要 求 书 CN 103525753 A 2 1/5 页 3 一种内皮克隆形成细胞的分离方法 技术领域 0001 本发明涉及内皮克隆形成细胞的分离方法。 背景技术 0002 内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞， 在维持血管内皮环境稳定中扮演着重要的角 色。根据内皮祖细胞 （EPCs） 克隆形态、 出现时间先后和细胞增殖潜力， 体外培养的外周血 MNCs 可分化出早期和晚期 EPCs。内皮克隆形成细胞是近年来发现的一种晚期 EPCs 亚群， 因具有更强的增殖能。
7、力及血管形成能力， 是理想的移植种子细胞。内皮克隆形成细胞可以 从骨髓、 脐带血、 外周血、 脐带等多种组织当中分离获得。 0003 脐带静脉含有大量的内皮克隆形成细胞， 取材容易， 操作简单， 是分离内皮克隆形 成细胞的良好来源。 目前， 通常采取酶消化法或机械刮取法， 从脐带静脉上获取内皮克隆细 胞， 接种到适合的培养基中培养。但是， 采用机械刮取的方法， 内皮克隆形成细胞与胶原组 织不能成功分离， 分离效率低， 而酶消化法的分离也往往不够彻底， 分离效率低。 0004 建立一种高效的内皮克隆形成细胞分离培养方法， 对临床大规模应用有重要的意 义。 发明内容 0005 为了克服现有技术的缺。
8、陷， 本发明提供了一种新的内皮克隆形成细胞的分离方 法。 0006 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法， 包括如下步骤 ： 0007 （1） 酶消化 ： 取脐带静脉， 用碱性或中性缓冲液灌注冲洗至流出的液体透明， 灌入 胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合酶， 封闭两端， 消化 15 60min， 打开两端， 收集消化液 ； 0008 （2） 机械刮取 ： 将脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮刮取脐带静脉 内表面 3 10 分钟， 再用碱性或中性缓冲液洗涤， 收集洗涤液 ； 0009 （3） 将步骤 （1） 的消化液和步骤 （2） 的洗涤液合并， 离心， 去上清， 即可。 0010 步骤 。
9、（1） 中， 所述碱性或中性缓冲液是 PBS 缓冲液、 DPBS 缓冲液或者 Hanks 缓冲 液。 0011 步骤 （1） 中， 所述胶原酶是 II 型胶原酶。 0012 步骤 （1） 中， 所述胶原酶的浓度为 0.2%， 所述胰酶的浓度为 0.5%， 胶原酶与胰酶的 体积比为 1:1。 0013 步骤 （1） 中， 所述消化的温度为 37。 0014 步骤 （1） 中， 所述消化的时间是 15 30min。 0015 步骤 （2） 中， 所述刮取的时间是 5 分钟。 0016 步骤 （2） 中， 所述碱性或中性缓冲液是 PBS 缓冲液、 DPBS 缓冲液或者 Hanks 缓冲 液。 001。
10、7 步骤 （2） 中， 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的0.51.5倍 （ml/cm） 。 优选地， 说 明 书 CN 103525753 A 3 2/5 页 4 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的 1 倍 （ml/cm） 。 0018 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法， 通过酶消化工艺和机械刮取工艺的特定组 合， 有效地将内皮克隆形成细胞从脐带静脉组织中分离， 获得的细胞数量多， 分离效率高， 临床应用前景优良。 0019 下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明， 但是并不是对本发明的限 制， 根据本发明的上述内容， 按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述 基本技术思想。
11、前提下， 还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。 附图说明 ： 0020 图 1 为 P0 代细胞形态特征 ； 0021 图 2 为内皮克隆形成细胞细胞表面标志检测 ； 0022 图 3 为内皮克隆形成细胞的 LDL 内吞实验， 图中的光信号为内皮克隆形成细胞内 吞后的 LDL 在激光的激发下发出的阳性信号 ； 0023 图 4 为内皮克隆形成细胞的体外血管形成实验。 具体实施方式 ： 0024 实施例 1 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法 0025 脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇， 采集后放于含双抗的 PBS 溶液中 4保 存， 48h 内处理。反复清洗， 并用磷酸缓冲液 PBS 。
12、灌注冲洗脐带静脉， 直至流出液体透明。 0026 用止血钳夹住脐带一端， 用移液枪将 II 型胶原酶 （浓度 0.2%） 加入并充满脐带静 脉， 用止血钳夹住脐带另一端 ； 37摇床消化 30 分钟 ； 消化完成后， 取下止血钳， 收集消化 液到 50ml 离心管中 ； 将脐带沿脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮轻刮脐带 静脉5分钟 ； 用PBS溶液清洗， 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1倍 （ml/cm） ， 收集洗涤 液与离心管中。 0027 将收集细胞的离心管在 4、 500g 的条件下， 离心 5 分钟， 即可。 0028 实施例 2 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法 。
13、0029 脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇， 采集后放于含双抗的 DPBS 缓冲液中 4 保存， 48h 内处理。反复清洗， 并用磷酸缓冲液 PBS 灌注冲洗脐带静脉， 直至流出液体透明。 0030 用止血钳夹住脐带一端， 用移液枪将 II 型胶原酶 （浓度 0.2%） 加入并充满脐带静 脉， 用止血钳夹住脐带另一端 ； 37摇床消 15 分钟 ； 消化完成后， 取下止血钳， 收集消化液 到 50ml 离心管中 ； 将脐带沿脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮轻刮脐带静 脉 3 分钟 ； 用 DPBS 缓冲液清洗， 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的 1.5 倍 （ml/cm） ，。
14、 收集 洗涤液与离心管中。 0031 将收集细胞的离心管在 4、 500g 的条件下， 离心 5 分钟， 即可。 0032 实施例 3 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法 0033 脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇， 采集后放于含双抗的 Hanks 缓冲液中 4保存， 48h 内处理。反复清洗， 并用磷酸缓冲液 PBS 灌注冲洗脐带静脉， 直至流出液体透 明。 0034 用止血钳夹住脐带一端， 用移液枪将 II 型胶原酶 （浓度 0.2%）与胰酶 （浓度为 说 明 书 CN 103525753 A 4 3/5 页 5 0.5%） 按 1 ： 1（v/v） 组成的混合酶 （双酶） ， 加入并充满。
15、脐带静脉， 用止血钳夹住脐带另一端 ； 37摇床消 60 分钟 ； 消化完成后， 取下止血钳， 收集消化液到 50ml 离心管中 ； 将脐带沿脐 带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮轻刮脐带静脉 10 分钟 ； 用 Hanks 缓冲液清 洗， 所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的 0.5 倍 （ml/cm） ， 收集洗涤液与离心管中。 0035 将收集细胞的离心管在 4、 500g 的条件下， 离心 5 分钟， 即可。 0036 实施例 4 不同内皮克隆形成细胞的分离方法的比较 0037 1、 材料与方法 0038 脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇， 采集后放于含双抗的 PBS 溶液中。
16、 4保 存， 48h 内处理。反复清洗， 并用磷酸缓冲液 PBS 灌注冲洗脐带静脉， 直至流出液体透明。分 别用不同的方法进行分离。 0039 A. 酶消化法 ： 用止血钳夹住脐带一端， 用移液枪将 II 型胶原酶 （0.2%） 加入并充 满脐带静脉， 用止血钳夹住脐带另一端 ； 37摇床消化 15 分钟 ； 消化完成后， 取下止血钳， 收集消化液到 50ml 离心管中， 再用 PBS 溶液冲洗静脉， PBS 溶液的用量为脐带静脉长度的 1 倍 （ml/cm） ， 收集洗涤液到离心管。 0040 B. 机械刮取法 ： 将脐带沿脐带静脉剖开， 暴露出脐带静脉内表面， 用细胞刮刮脐 带静脉 5 分。
17、钟 ； 用 PBS 溶液清洗， PBS 溶液的用量为脐带静脉长度的 1 倍 （ml/cm） ， 收集洗涤 液于离心管中。 0041 C. 本发明方法 （酶消化 + 机械刮取法） ： 用止血钳夹住脐带一端， 用移液枪将 II 型 胶原酶 （0.2%） 加入并充满脐带静脉， 用止血钳夹住脐带另一端 ； 37摇床消化 30 分钟 ； 消 化完成后， 取下止血钳， 收集消化液到 50ml 离心管中 ； 将脐带沿脐带静脉剖开， 暴露出脐带 静脉内表面， 用细胞刮刮脐带静脉 5 分钟 ； 用 PBS 清洗， PBS 溶液的用量为脐带静脉长度的 1 倍 （ml/cm） ， 收集洗涤液与离心管中。 0042 。
18、三种方法处理后， 收集细胞的离心管分别 4， 500g， 离心 5 分钟。分别用 EGM2-MV 培养基重悬， 接种到 I 型鼠尾胶原铺板后的 35mm 培养皿中， 按每 2cm 脐带接种一个 35mm 皿 的量接种细胞， 置于 37， 体积分数 5% 的 CO2饱和湿度培养箱中培养。根据细胞生长情况， 每 2-3 天全量换液一次。生长最快组别的细胞达到 90% 汇合度时， 用 0.05% 的胰酶 /EDTA 消化， 计数比较各组 P0 代细胞的数量。 0043 2、 实验结果 0044 如图 1 所示， 本发明方法获得的细胞形态呈铺路石状， 折光较好， 属于内皮克隆形 成细胞。 0045 三。
19、种方法获得的内皮克隆形成细胞 P0 代数量如表 1 所示 ： 0046 表 1 不同方法获得的细胞数量比较 0047 P0 代收获量 （万） 机械刮取8.5 胶原酶消化13.8 说 明 书 CN 103525753 A 5 4/5 页 6 胶原酶消化 + 机械刮取31.5 0048 如表 1 所示， 机械刮取法和酶消化法获得的 P0 代细胞仅分别为 8.5 万和 13.8 万， 而本发明的方法采用酶消化法和机械刮取相结合的工艺， 得到P0代细胞为31.5万， 是单独 采用前二种方法的 3.7 倍和 2.3 倍。 0049 本发明方法获得的内皮克隆形成细胞数量， 非常显著高于单独使用机械刮取法和。
20、 酶消化法获得的内皮克隆形成细胞数量， 说明本发明通过将机械刮取法和酶消化法进行组 合， 非常显著地提高了内皮克隆形成细胞的分离效率。 0050 实施例 5 本发明内皮克隆形成细胞分离方法的优化 0051 1、 实验方法 0052 其余条件同实施例 1， 消化酶分别为 0.2%II 型胶原酶 （单酶） ， 或者 0.2%II 型胶原 酶与 0.5% 胰酶按 1 ： 1 混合组成的双酶 ； 消化时间分别为 15 分钟、 30 分钟和 60 分钟。 0053 生长最快组别的细胞达到 90% 汇合度时， 用 0.05% 的胰酶 /EDTA 消化， 计数比较各 组 P0 代细胞的数量。 0054 2、。
21、 实验结果 0055 用不同的酶消化条件消化后， 再刮取收集细胞。 双酶消化后， 经过培养获得了更多 的细胞 （表 2） 。 0056 表 2 采用胶原酶消化 + 机械刮取的方法， 对不同的酶消化条件进行优化的结果 0057 15min30min60min 胶原酶 11.8 万 24.0 万 3.3 万 胰酶 + 胶原酶 31.5 万 24.8 万 2.8 万 0058 如表2所示， 单独采用II型胶原酶消化时， 获得的细胞数量随着消化时间的延长， 先增加后降低， 消化30min时， 获得的细胞数量最多， 为24.0万 ； 用胰酶和II型胶原酶的混 合酶消化时， 获得的细胞数量随着消化时间的延。
22、长而降低， 消化 15mim 时， 获得的细胞数量 最多， 为 31.5 万， 优于单独采用 II 型胶原酶消化获得的细胞数量。 0059 实验结果说明， 采用胰酶和 II 型胶原酶的混合酶消化 15min， 获得的内皮克隆形 成细胞数量最多。 0060 实施例 6 本发明方法分离的内皮克隆形成细胞的鉴定 0061 1、 实验方法 0062 （1） 内皮克隆形成细胞的传代培养 0063 取实施例 3 本发明方法获得的 P0 代细胞， 按 10000 个 /cm2按的密度进行传代接 种。传代培养过程中， 每 3 天全量换液， 直至贴壁细胞达到 90% 汇合度时， 重复上述操作进 行传代。 006。
23、4 （2） 内皮克隆形成细胞表面标志检测 0065 酶消化 + 机械刮取法分离培养的 P5 代细胞常规消化后， 以 PE 标记的 CD14、 CD73、 VEGFR2， FITC 标记的 CD31、 CD90、 CD34、 CD45 抗体及其相应的同型对照标记细胞， 进行流式 检测。 0066 （3） 内皮克隆形成细胞低密度脂蛋白 （LDL） 内吞实验 说 明 书 CN 103525753 A 6 5/5 页 7 0067 酶消化+机械刮取法分离培养的P5代细胞生长到汇合度达70%时， 加入10g/ml Dil-Ac 标记的 LDL， 37孵育 4 小时 ； 移去培养基， PBS 洗涤 3 次。
24、， 用 3% 多聚甲醛在室温固 定 30 分钟 ； 用 PBS 反复清洗 3 次， 在荧光显微镜下观察。 0068 （4） 内皮克隆形成细胞体外血管形成实验 0069 将 Matrigel 放在冰上， 过夜融化 ； 将融化后的 Matrigel 加入预冷的 24 孔板中， 37孵育 1 小时 ； 将 P5 代内皮克隆形成细胞用 0.05% 的胰酶 /EDTA 消化， 按 10000 个细胞 每孔的量接种到准备好的 Matrigel 培养板中 ； 置于 37， 体积分数 5% 的 CO2 饱和湿度培 养箱中培养 4 小时后， 取出在显微镜下观察管状结构形成情况。 0070 2、 实验结果 007。
25、1 实验结果如图 2 图 4 所示 ： 0072 如图 2 所示， P5 代的内皮克隆形成细胞的细胞表面表达 CD31、 VEGFR2 和 CD73 标 志 ； 不表达 CD14、 CD90、 CD45， 而 CD34 呈弥散型的表达， 符合文献报道的内皮克隆形成细胞 的表面标志表达的特征。 0073 如图 3 所示， 与标记后的 LDL 孵育后， 对后者进行内吞， 在激光的激发下呈现荧光 信号， 显示细胞具有正常的 LDL 内吞功能。 0074 如图4所示， 在Matrigel培养表面上， 形成管状结构， 并且相互连接， 形成网状， 显 示了细胞具有很强的体外血管形成能力。 0075 实验结果说明， 本发明分离得到的细胞， 具有内皮克隆形成细胞的表面标志物， 具 有 LDL 内吞功能和很强的体外血管形成能力， 属于内皮克隆形成细胞。 0076 实验结果说明， 本发明方法可以从脐带静脉中， 有效分离内皮克隆形成细胞， 获得 的细胞数量多， 应用前景良好。 说 明 书 CN 103525753 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103525753 A 8 2/2 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103525753 A 9 。