含有栗子皮提取物的化妆料组合物 【技术领域】
本发明涉及含有栗子皮提取物的化妆料组合物。背景技术 瘙痒被定义为诱发想搔抓的欲望的不愉快的皮肤感觉， 作为疼痛、 触觉、 冷或热之 类的生理性自我防御机制， 在皮肤被暴露于来自外部的有害刺激中时， 对其进行认知而起 到保护皮肤的作用。
瘙痒症是在多种皮肤疾病或全身疾病中经常表现的共同症状中的一种， 实际情况 是， 荨麻疹、 各种药物的副作用所致的急性瘙痒症能够容易地被治愈， 但是胆道闭锁、 肾脏 疾病或特应性疾病之类的重症慢性瘙痒症的治疗非常困难。
瘙痒由炎症、 癌、 代谢性疾病、 感染、 精神科疾病、 药物给药或压力等多种原因诱 发， 在最近的若干研究结果中， 明确了皮肤与末梢神经系统及中枢神经系统的有机连接与 针对诱发瘙痒的刺激的反应、 调节密切相关。
最近， 明确了特定的感觉神经细胞及其受体对瘙痒特异性地反应， 已经接受了瘙 痒不是疼痛的下位状态， 而是作为感觉神经系统的个别感觉， 认为互不相同的瘙痒介质 及其受体与多种诱发瘙痒的疾病相关 (Steinhoff et al.， Journal of Investigative Dermatology， 126， pp1705-1718， 2006)。
在迄今为止的用于瘙痒症研究的实验中， 主要使用组胺， 但是提出以下主张， 即 特应性之类的慢性瘙痒症与其说是由组胺依赖性通路 (pathway) 导致， 不如说是由神 经性原因导致， 这说明为什么抗组胺对特应性疾病的瘙痒症不起效 (Stander et al.， Experimental Dermatology， 11， pp12-24， 2002)。
另外， 已知第 1 代抗组胺剂主要用于全身给药， 具有抗副交感作用而显示镇静作 用， 作为第 1 代抗组胺剂的扑尔敏在局部给药时， 无法抑制特应性皮炎患者的瘙痒 (Munday et al.， Dermatology， 205， pp40-45， 2002)， 由于存在皮肤过敏反应的危险， 因此不鼓励对 特应性皮炎使用局部抗组胺剂。作为没有镇静作用的第 2 代抗组胺剂的依巴斯汀、 特非那 定与阻碍细胞色素 (cytochrome)P450 活性的药物 ( 酮康唑、 红霉素 ) 一起服用时， 有时引 起心律不齐 (Hey et al.， Arzneimittelforschung， 46， pp159-163， 1996)， 而引起与其相关 的副作用。
因此， 目前迫切需要开发在有效的同时副作用小且安全的瘙痒症缓和剂， 特别是 对特应性之类的慢性瘙痒症有效的缓和剂。
发明内容 因此， 本发明的目的是解决一直以来所要解决的技术课题。 具体而言， 本发明的一 个实施例的目的是提供含有栗子皮提取物的用于缓和或抑制瘙痒症的化妆料组合物、 以及 用于抑制免疫的化妆料组合物。
根据这样的目的， 本发明的一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用
于缓和或抑制瘙痒症的化妆料组合物， 其既减少以往的瘙痒症治疗剂具有的副作用、 又具 有优异的抑制或缓和瘙痒症的效果。
本发明的一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于改善皮肤屏障 功能的化妆料组合物。
本发明的一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于抑制免疫的化 妆料组合物。
本发明的一个实施例涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于改善或治疗特 应性皮炎的化妆料组合物。
本发明的化妆料组合物含有栗子皮提取物作为有效成分， 从而可通过抑制作为瘙 痒刺激源的蛋白分解酶活性受体 -2(Proteinase-Activated Receptor-2 ： PAR-2) 的活性 而发挥优异的瘙痒症抑制或缓和效果， 还可以通过栗子皮提取物的免疫抑制活性而根本性 地治疗能够成为诱发瘙痒症的原因的免疫过敏性反应。 附图说明 图 1 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物的 PAR-2 活性抑制效果 ( 胰蛋白 酶处理 ) 的测定结果的图表。
图 2 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物的 PAR-2 活性抑制效果 (SLIGKV 处理 ) 的测定结果的图表。
图 3 是示出本发明的一个实施例的栗子皮 1， 3- 丁二醇 (BG) 提取物的 PAR-2 活性 抑制效果 ( 胰蛋白酶、 SLIGKV 处理 ) 的测定结果的图表。
图 4 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少 TNF-α 分泌的效果的图表。
图 5 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少 IL-6 分泌的效果的图表。
图 6 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少 IL-1α 分泌的效果的图表。
图 7 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少 IL-8 分泌的效果的图表。
图 8 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少 GM-CSF 分泌的效果的图表。
图 9 是示出本发明的一个实施例的栗子皮提取物减少胰蛋白酶与活性肽 (SLIGKV) 所致 IL-6 分泌的效果的图表。
图 10 是 示 出 本 发 明 的 一 个 实 施 例 的 栗 子 皮 提 取 物 减 少 胰 蛋 白 酶 与 活 性 肽 (SLIGKV) 所致 IL-8 分泌的效果的图表。
图 11 是 示 出 本 发 明 的 一 个 实 施 例 的 栗 子 皮 提 取 物 减 少 胰 蛋 白 酶 与 活 性 肽 (SLIGKV) 所致 GM-CSF 分泌的效果的图表。
图 12 是示出本发明一个实施例的栗子皮提取物对特应性皮炎患者的瘙痒症抑制 效果的图表。
图 13 是示出本发明一个实施例的栗子的内皮 ( 内壳 ) 和外皮 ( 外壳 ) 提取物导 致的 PAR-2 活性抑制效果的测定结果的图表。
具体实施方式
本发明涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于缓和或抑制瘙痒症的化妆料 组合物。本申请的发明人将蛋白分解酶活性受体 -2(Proteinase-Activated Receptor-2 ：PAR-2) 作为瘙痒症治疗的目标， 测定栗子皮提取物导致的 PAR-2 活性抑制的程度， 结果如 后述实施例中所证实的那样， 确认了在试管内显示出优异的 PAR-2 拮抗作用， 另外确认了 对患有特应性皮炎的患者们显示瘙痒抑制效果。
上述瘙痒症也被称为搔痒症， 这种瘙痒症的诱发原因或形态没有特别限制， 例如， 由包括炎症性皮炎、 特应性皮炎、 肌肤皲裂所致的皮炎、 痱子、 溃疡、 冻伤、 接触性皮炎、 脂溢 性皮炎、 银屑病及副银屑病的皮炎中的一种以上诱发。
另外， 本发明含有栗子皮提取物作为有效成分， 显示出改善皮肤屏障功能的效果。 由此， 可以有效地预防或治疗因皮肤屏障功能降低而发生的疾病或由瘙痒诱发的二次性皮 肤损伤。
上述组合物对例如由来自特应性皮炎的瘙痒而发生的 2 次性皮肤损伤在缓和皮 肤屏障损伤或改善皮肤屏障恢复力方面显示出显著的效果， 由此， 可以显著地改善皮肤屏 障。
特别是， 上述组合物可以通过增进皮肤保湿、 防止皮肤角化过度而改善皮肤屏障， 如通过后述实施例而证实的那样， 本申请的发明人等利用对无毛小鼠 (Hairless mice) 用 唑酮 (oxazolon) 进行处理的过敏模型进行实验， 测定经表皮水分损失 (transepidermal water loss， TEWL) 和皮肤厚度 (skin thickness)， 结果确认了栗子皮提取物显示出有效的 增进皮肤保湿或防止角化过度的效果。
进而， 本发明涉及含有栗子皮提取物作为有效成分的用于抑制免疫的化妆料组合 物。上述组合物可以是用于治疗例如特应性、 类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis) 或 克罗恩病 (Crohn’ s disease) 的组合物， 其中， 可以是用于预防或治疗作为免疫过敏性反应 的特应性疾病的组合物。
在特应性疾病从皮肤损伤等引起的急性阶段向慢性疾病阶段发展时， 观察到免疫 介质的多种分泌状态的变化， 但在患有特应性疾病的患者的损伤皮肤中， 多数白细胞介素 (Interleukin) 的浓度变得增加。另外， 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 已知在 特应性皮肤疾病患者的损伤皮肤中， 其分泌量增加， 引起慢性炎症反应， 而会引起特应性患 者免疫体系的不均衡 (Matsubara et al.， FEBS Letters， 566， pp195-200， 2004)。
与此相关， 本申请的发明人等确认了栗子皮提取物可以显著减少与免疫过敏性反 应相关的肿瘤坏死因子 -α(Tumor Necrosis Factor-α ： TNF-α)、 白细胞介素 -6(IL-6)、 白 细 胞 介 素 -1α(IL-1α)、 白 细 胞 介 素 -8(IL-8) 或 粒 细 胞 - 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor ： GM-CSF) 的表达， 结果栗子皮提 取物适于作为用于抑制免疫的化妆料组合物的有效成分。
特别是本发明含有栗子皮提取物作为有效成分， 适合用于改善或治疗特应性皮炎 的化妆料组合物的有效成分。
另外， 上述白细胞介素 -6(IL-6) 和白细胞介素 -8(IL-8) 还被已知是在特应性疾 病中诱发瘙痒的因子， 栗子皮提取物可以有效地用于预防和治疗来自特应性疾病的瘙痒 症。
上述栗子皮是指覆盖栗子树果实的深褐色皮， 本说明书中使用的栗子皮提取物是 指选自栗子的内皮 ( 嫩皮 )、 外皮及其混合物中的一种以上的提取物。作为栗子皮， 可以使 用栗子的内皮 ( 嫩皮 )， 也可以使用栗子的外皮 ( 外壳 )， 但特别确认了在经栗子的外皮 ( 外壳 ) 提取物处理的组中可呈现优异的 PAR-2 拮抗作用。
上述栗子皮可以是来自任一种类的栗子的皮， 没有特别限制， 可以是选自例如 栗 (Castanea crenata S.et Z.， Castanea mollissima Bl.， Castanea bulgaris)、 板栗 (Castanea Bungeana Bl.) 和朝鲜栗 (Castanea crenata for.multicarpa(Uyeki)Chung) 中的一种以上的栗子的皮。
上述栗子皮提取物的提取方法没有特别限制， 例如可以通过选自水、 碳原子数为 1 ～ 4 的低级醇、 1， 3- 丁二醇及其混合溶剂中的一种以上的溶剂而进行提取， 上述溶剂可以 是例如选自水、 甲醇、 乙醇、 1， 3- 丁二醇、 丁醇及其混合物中的一种以上， 优选地， 上述栗子 皮提取物可以由 10 ～ 100％的醇水溶液或 10 ～ 100％的 1， 3- 丁二醇提取， 具体而言， 可以 是栗子皮的 20 ～ 90％乙醇水溶液提取物或 10 ～ 70％的 1， 3- 丁二醇提取物， 更具体而言， 可以是栗子皮的 40 ～ 90％乙醇水溶液提取物或 10 ～ 50％的 1， 3- 丁二醇提取物， 进一步 具体而言， 可以是栗子皮的 60 ～ 90％乙醇水溶液提取物或 20 ～ 40％的 1， 3- 丁二醇提取 物。
上述组合物中所含的栗子皮提取物的含量没有特别限制， 以组合物的总重量为基 准， 能以 0.005 ～ 80 重量％的含量含有， 优选能以 0.01 ～ 30 重量％含有。若上述栗子皮 提取物的含量过少， 则效果变得甚微， 若过多， 则剂型的稳定度会变低。
根据情况， 为了缓和或抑制瘙痒症、 以及抑制免疫， 栗子皮提取物也可以与抗组胺 剂、 类固醇剂、 局部麻醉剂、 免疫抑制剂中的一种或一种以上的物质并用。
以往， 用于缓和特应性皮炎和瘙痒症的技术是服用抗组胺剂、 将类固醇制剂作为 外用剂进行涂布， 但这些制剂具有即使呈现暂时性的治疗效果也很快复发这样的缺点， 进 而， 报告了服用这些药物时的中枢神经障碍、 消化器官障碍等副作用。 作为肾上腺皮质激素 的类固醇制剂由于高效的消炎作用和免疫抑制作用而效果优异， 但副作用也严重， 报告了 作为免疫抑制剂的他克莫司水合物软膏对特应性皮炎的治疗有效， 但可能诱发皮肤癌， 或 者在皮肤损伤部位大量吸收到体内时诱发肾脏障碍， 实际情况是在安全性方面考虑， 难以 长期使用。
因此， 将含有栗子皮提取物作为有效成分的组合物与抗组胺剂、 类固醇剂、 局部麻 醉剂、 免疫抑制剂中的一种或一种以上适当地并用时， 能够对瘙痒症的缓和或抑制、 以及免 疫抑制等不伴有副作用而安全地显示显著的效果。
上述化妆料组合物没有特别限定剂型， 可以根据目的而适当选择化妆品的剂型。 例如可以制成选自柔肤水 ( 润肤液和乳液 )、 营养化妆水、 精华、 营养霜、 按摩霜、 面膜、 凝 胶、 眼霜、 眼部精华、 洁肤霜、 洁肤泡沫、 洁肤水、 粉、 润体液、 润体霜、 润体油、 以及润体精华 中的一种以上的剂型， 但不一定限于这些。
上述有效成分的施用量的确定在本领域技术人员的水准内， 组合物的 1 日施用用 量根据要施用的对象的进展程度、 发病时期、 年龄、 健康状态、 合并症等多种因素不同而异， 若以成人为标准， 则一般可以将上述组合物 1 ～ 500mg/kg、 优选为 30 ～ 200mg/kg 按照 1 日 分成 1 ～ 2 次进行给药， 上述施用量无论用任何方法也不限定本发明的范围。
以下， 通过实施例进一步详细说明本发明， 但下述实施例是用于例示本发明， 本发 明的范围不被它们所限定。
[ 实施例 1] 栗子皮提取物的制备1-1) 栗子皮 1， 3- 丁二醇提取物的制备
利用 30％的 1， 3- 丁二醇 (1， 3-buthylene glycol)， 使果子皮在室温下浸出 3 天。 接着， 用 250 目、 3μm、 1μm、 0.5μm 大小的过滤器依次进行过滤。然后， 在 0 ～ 4℃下放置 (Standing)3 天后， 用 0.5μm、 0.3μm、 0.2μm 大小的过滤器依次进行过滤， 得到栗子皮的 1， 3- 丁二醇提取物。
1-2) 栗子皮乙醇提取物的制备
利用 70％乙醇， 使栗子皮在室温下浸出 3 天。 接着， 用 250 目、 3μm、 1μm、 0.5μm、 0.3μm、 0.2μm 大小的过滤器依次进行过滤。然后， 在 60℃下浓缩溶液后， 在 30℃下实施 18 小时的真空干燥， 得到粉末形态的栗子皮乙醇提取物。
[ 试验例 1] 栗子皮乙醇提取物的 PAR-2 活性抑制效果 ( 体外， 胰蛋白酶处理， HEK ： 人表皮角质细胞 )
实验前一天， 将角质形成细胞 ( 细胞株名 ： HaCaT， 获取地点 ： ATCC) 在 96 孔 (well) 4 板中以成为 4×10 细胞 / 孔的方式进行分株， ， 然后在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时。24 小时后， 将 96 孔板用 HBSS(Hanks’ Balanced Salt solution) 缓冲液 清洗 (washing)2 次后， 将反应缓冲液 (reaction buffer ： 2uM Fluo-4-AM， 20％ pluronic 酸， 2.5mM 丙磺舒 ) 加入细胞中。在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中反应 30 分钟， 在室温下反应 30 分钟后， 用 HBSS 缓冲液清洗 (washing)2 次， 将栗子皮乙醇提取物分别以 1ppm、 2ppm、 5ppm、 10ppm、 20ppm、 30ppm 和 50ppm 的浓度对细胞进行处理。反应 10 分钟后， 用 2U/ml 胰蛋白酶 (Trypsin) 进行处理， 测定 80 秒钟的细胞内 Ca2+ 浓度变化。细胞内 Ca2+ 浓度变化的测定利用 FlexStation 3( 分子器件， 美国 )。在栗子皮乙醇提取物与胰蛋白酶 (Trypsin) 处理后， 求出测定 80 秒钟的屈曲 (flex) 而得到的值中的最小值与最大值之差， 然后将该值与胰蛋白酶 (Trypsin) 处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。
参照图 1， 可以确认利用胰蛋白酶在 PAR-2 的 N- 末端剪切丝氨酸序列 (sequence) 而使 PAR-2 活化的情况下， 钙离子流入细胞内， 但经栗子皮提取物处理的组的情况下， PAR-2 活化被抑制， 钙离子的流入显著减少。
[ 试验例 2] 栗子皮乙醇提取物的 PAR-2 活性抑制效果 ( 体外， SLIGKV 处理， HEK ： 人表皮角质细胞 )
实验前一天， 将角质形成细胞 ( 细胞株名 ： HaCaT， 获取地点 ： ATCC) 在 96 孔 (well) 4 板中以成为 4×10 细胞 / 孔的方式进行分株， 然后在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时。24 小时后， 将 96 孔板用 HBSS(Hanks’ Balanced Salt solution) 缓冲液清 洗 (washing)2 次后， 将反应缓冲液 (reaction buffer ： 2uM Fluo-4-AM， 20％ pluronic 酸， 2.5mM 丙磺舒 ) 加入细胞中。在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中反应 30 分钟， 在室 温下反应 30 分钟后， 用 HBSS 缓冲液清洗 (washing)2 次， 将栗子皮乙醇提取物分别以 1ppm、 2ppm、 5ppm、 10ppm、 20ppm、 30ppm 和 50ppm 的浓度对细胞进行处理。反应 10 分钟后， 用 5uM 2+ 2+ PAR-AP(SLIGKV) 进行处理， 测定 80 秒钟的细胞内 Ca 浓度变化。细胞内 Ca 浓度变化的 测定利用 FlexStation 3( 分子器件， 美国 )。在栗子皮乙醇提取物与 5uM PAR-AP(SLIGKV) 处理后， 求出测定 80 秒钟的屈曲 (flex) 而得到的值中的最小值与最大值之差， 然后将该值 与 5uM PAR-AP(SLIGKV) 处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。
参照图 2， 可以确认如果作为活化肽的 SLIGKV( 人 ) 作为直接配体发挥作用而使PAR-2 活化， 则钙离子流入细胞内， 但经栗子皮提取物处理的组的情况下， PAR-2 活化被抑 制， 钙离子的流入显著减少。
[ 试验例 3] 栗子皮 1， 3- 丁二醇 (BG) 提取物的 PAR-2 活性抑制效果 ( 体外， SLIGKV 处理， HEK ： 人表皮角质细胞 )
实验前一天， 将角质形成细胞 ( 细胞株名 ： HaCaT， 获取地点 ： ATCC) 在 96 孔 (well) 4 板中以成为 4×10 细胞 / 孔的方式进行分株， 然后在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时。24 小时后， 将 96 孔板用 HBSS(Hanks’ Balanced Salt solution) 缓冲液 清洗 (washing)2 次后， 将反应缓冲液 (reaction buffer ： 2uM Fluo-4-AM， 20％ pluronic 酸， 2.5mM 丙磺舒 ) 加入细胞中。在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中反应 30 分钟， 在 室温下反应 30 分钟后， 用 HBSS 缓冲液清洗 (washing)2 次， 将栗子皮 1， 3- 丁二醇 (BG) 提 取物分别以 0.1w/v％、 0.5w/v％和 1w/v％的浓度对细胞进行处理。反应 10 分钟后， 用 2U/ 2+ ml 胰蛋白酶 (Trypsin) 或 5uM PAR-AP(SLIGKV) 进行处理， 测定 80 秒钟的细胞内 Ca 浓度 2+ 变化。细胞内 Ca 浓度变化的测定利用 FlexStation 3( 分子器件， 美国 )。经过栗子皮 1， 3- 丁二醇 (BG) 提取物与 2U/ml 胰蛋白酶 (Trypsin) 或 5uM PAR-AP(SLIGKV) 处理后， 求出 测定 80 秒钟的屈曲 (flex) 而得到的值中的最小值与最大值之差后， 将该值与经 2U/ml 胰 蛋白酶或 5uM PAR-AP(SLIGKV) 处理时的最小值与最大值之差进行比较而求出抑制率。 参照图 3， 可以确认胰蛋白酶或 PAR-2 活性肽 (SLIGKV) 导致的细胞内钙离子的流 入随着栗子皮提取物的浓度变高而显著减少。
[ 试验例 4] 栗子皮提取物导致 TNF-α 的分泌减少
实验前一天， 将皮肤角化上皮细胞 (Normal human skin keratinocyte， NHEK， 获 4 取地点 ： Lonza) 在 96 孔 (well) 板中以成为 5×10 细胞 / 孔的方式进行分株， 然后在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时。 24 小时后， 用 PBS 清洗 2 次细胞， 换成无血清 KBM(serum free KBM( 角质形成细胞基底介质 ))。 用栗子皮对各个孔 (well) 按浓度进行处 理 (10、 25、 50ppm)， 反应 30 分钟后， 分别用 PGSA(10、 50ppm)、 LPS(1ppm) 处理。在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时后， 取出培养液， 进行对 TNF-α 的 ELISA。ELISA 利用制造公司 (BD science) 的实验方法。
参照图 4， 可以观察到栗子皮使因 PGSA 和 LPS 而增加的 TNF-α 分泌显著减少。
[ 试验例 5] 栗子皮提取物导致 IL-6 的分泌减少
进行对 IL-6 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 4 实质上相同的方法。
参照图 5， 可以观察到栗子皮使因 PGSA 和 LPS 而增加的 IL-6 分泌得到不寻常的抑 制。
[ 试验例 6] 栗子皮提取物导致 IL-1α 的分泌减少
进行对 IL-1α 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 4 实质上相同的方法。
参照图 6， 可以观察到栗子皮使因 PGSA 和 LPS 而增加的 IL-1α 分泌量随浓度增加 而减少。
[ 试验例 7] 栗子皮提取物导致 IL-8 的分泌减少
进行对 IL-8 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 4 实质上相同的方法。
参照图 7， 可以观察到栗子皮使因 PGSA 和 LPS 而增加的 IL-8 分泌显著地减少。
[ 试验例 8] 栗子皮提取物导致 GM-CSF 的分泌减少
进行对 GM-CSF 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 4 实质上相同的方法。
参照图 8， 可以观察到随着栗子皮的浓度增加， 因 PGSA 和 LPS 而分泌的 GM-CSF 的 量减少。
[ 试验例 9] 栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 IL-6 分泌的抑制 效果
实验前一天， 将皮肤角化上皮细胞 (Normal human skin keratinocyte， NHEK， 获 4 取地点 ： Lonza) 在 96 孔 (well) 板中以成为 5×10 细胞 / 孔的方式进行分株， 然后在 37℃、 5 ％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时。24 小时后， 用 PBS 清洗 2 次细胞， 换成无 血清 KBM(serum free KBM( 角质形成细胞基底介质 ))。用栗子皮对各个孔 (well) 按浓度 进行处理 (10、 50ppm)， 反应 30 分钟后， 分别用胰蛋白酶 (10nM) 或 PAR-2 活化肽 (SLIGKV， 50uM) 进行处理。在 37℃、 5％ CO2 的培养箱 (incubator) 中培养 24 小时后， 取出培养液， 进行对 IL-6 的 ELISA。ELISA 利用制造公司 (BD science) 的实验方法。
参 照 图 9， 可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 IL-6 分泌。
[ 试验例 10] 栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 IL-8 分泌的抑 制效果 进行对 IL-8 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 9 实质上相同的方法。
参 照 图 10， 可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 IL-8 分泌。
[ 试验例 11] 栗子皮提取物对胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 GM-CSF 分泌的 抑制效果
进行对 GM-CSF 的 ELISA， 除此以外， 利用与试验例 9 实质上相同的方法。
参 照 图 11， 可以观察到栗子皮提取物浓度依赖性地抑制胰蛋白酶和活性肽 (SLIGKV) 导致的 GM-CSF 分泌。
[ 试验例 12] 栗子皮提取物对特应性皮炎患者的瘙痒症抑制效果
以 10 名特应性皮炎患者为对象， 将栗子皮提取物 (0.3％固体成分浓度 ) 在瘙痒部 位集中使用约 2 周后， 将使用前和使用后的瘙痒程度用 7 点量表的调查问卷进行测定， 确认 瘙痒缓和效果。
参照图 12， 可以观察到使用 2 周栗子皮提取物后， 瘙痒程度变得各降低 1 点。
[ 试验例 13] 栗子皮乙醇提取物的皮肤保湿效果测定
以 10 名特应性皮炎患者为对象， 将栗子皮提取物 (0.3％固体成分浓度 ) 在瘙痒部 位集中使用约 2 周后， 将使用前和使用后的皮肤湿润程度用 7 点量表的调查问卷进行测定， 确认瘙痒缓和效果。确认 10 人的点数， 结果平均为 6 点， 回答在涂布提取物后皮肤湿润， 可 以观察到显示优异的皮肤保湿效果。
[ 试验例 14] 栗子外皮乙醇提取物与栗子内皮乙醇提取物的 PAR-2 活性抑制效果 的比较 ( 体外， SLIGKV 处理， HEK ： 人表皮角质细胞 )
将栗子的外皮和内皮进行分离而干燥后， 按照与实施例 1-2) 相同的方法制备栗 子外皮提取物， 栗子内皮提取物也按照与实施例 1-2) 相同的方法制备。使用与试验例 2 相 同的方法测定栗子外皮乙醇提取物与栗子内皮乙醇提取物的 PAR-2 活性抑制效果， 并示于
下述表 6 和图 13 中。
表6
[ 试验例 15] 栗子外皮乙醇提取物与栗子内皮乙醇提取物的 PAR-2 活性抑制效果 的比较 ( 体外， SLIGKV 处理， HEK ： 人表皮角质细胞 )
将栗子外皮 ( 外壳 ) 与内皮 ( 嫩皮 ) 提取物的浓度进行下述表 7 所示的处理， 除 此以外， 按照与试验例 14 相同的方法测定 PAR-2 活性抑制效果。
表7
以下， 说明本发明的组合物的剂型例， 但化妆料组合物可以应用于各种剂型， 这不 是要限制本发明， 而只是要具体说明本发明。
[ 剂型例 1] 柔肤水 ( 润肤液 )
根据下述表 1 记载的组成， 用常规方法制备柔肤水。
表1
10CN 102458356 A 配合成分 实施例 1 甘油 丁二醇 丙二醇说明书含量 ( 重量％ ) 0.1 3.0 2.0 2.09/12 页羧基乙烯聚合物 PEG-12 壬基苯基醚 聚山梨酸酯 80 乙醇 三乙醇胺 防腐剂、 色素、 香料 纯化水
配合成分 实施例 10.1 0.2 0.4 10.0 0.1 适量 余量[ 剂型例 2] 营养化妆水 ( 乳液 ) 根据下述表 2 记载的组成， 用常规方法制备营养化妆水。 表2含量 ( 重量％ ) 0.1甘油 丁二醇 丙二醇 羧基乙烯聚合物 蜂蜡 聚山梨酸酯 603.0 3.0 3.0 0.1 4.0 1.511CN 102458356 A说辛酸 / 癸酸甘油三酯 角鲨烷明书5.0 5.0 1.5 0.5 1.0 0.2 适量 余量10/12 页失水山梨糖醇倍半油酸酯 液体石蜡 鲸蜡硬脂醇 三乙醇胺 防腐剂、 色素、 香料 纯化水
配合成分 实施例 1 甘油 丁二醇 液体石蜡 β- 葡聚糖 卡波姆 辛酸 / 癸酸甘油三酯 角鲨烷 鲸蜡硬脂基葡糖苷 失水山梨糖醇硬脂酸酯 聚山梨酸酯 60 三乙醇胺[ 剂型例 3] 营养霜 根据下述表 3 所述的组成， 用常规方法制备营养霜。 表3含量 ( 重量％ ) 0.1 3.0 3.0 7.0 7.0 0.1 3.0 5.0 1.5 0.4 1.2 0.112CN 102458356 A说防腐剂、 色素、 香料 纯化水明书适量 余量11/12 页
[ 剂型例 4] 按摩霜 根据下述表 4 记载的组成， 用常规方法制备按摩霜。 表4配合成分 实施例 1 甘油 丁二醇 液体石蜡 β- 葡聚糖 卡波姆 辛酸 / 癸酸甘油三酯 蜂蜡 鲸蜡硬脂基葡糖苷 失水山梨糖醇倍半油酸酯 凡士林 石蜡 防腐剂、 色素、 香料 纯化水 含量 ( 重量％ ) 0.1 8.0 4.0 45.0 7.0 0.1 3.0 4.0 1.5 0.9 3.0 1.5 适量 余量
[ 剂型例 5] 面膜 根据下述表 5 记载的组成， 用常规方法制备面膜。 表5配合成分 含量 ( 重量％ )13CN 102458356 A 实施例 1说明书0.112/12 页甘油 聚乙烯醇 透明质酸提取物 β- 葡聚糖 尿囊素 壬基苯基醚 聚山梨酸酯 60 乙醇防腐剂 防腐剂、 色素、 香料 纯化水4.0 15.0 5.0 7.0 0.1 0.4 1.2 6.0 适量 适量 余量