细胞膜通透性肽 技术领域 本发明涉及具有细胞膜通透性的新的肽以及含有该肽和亲水性生理活性物质的 药物组合物。
背景技术 细胞通过对蛋白质和核酸等亲水性生理活性物质为非通透性的细胞膜而与外界 隔离开。没有将这些亲水性生理活性物质运输到细胞内的方法， 这成为以细胞内为作用部 位的大量亲水性生理活性物质的临床使用的障碍。
报告了几项将这样的细胞非通透性的亲水性生理活性物质运输到细胞内的技术。 最一般的方法是使用脂质赋予亲水性生理活性物质以疏水性， 从而可以提高细胞膜的通过 性。另外， 还报告了使用肽性的配基来提高通透性的技术。
具有在不破坏细胞膜的状态下从细胞外向细胞内转移的性质的肽配基被称为细 胞膜通透性肽。作为著名的细胞膜通透性肽， 有由精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 来源于 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 作为来源于果蝇的肽的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2) 等。 除此以外， 还报告了以单纯的碱性为特征的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性 为特征的肽、 机制不明确的肽等各种肽。关于这些肽， 除了其自身的细胞内转移性之外， 如 上所述以其自身为媒介将所连接的基因等亲水性生理活性物质运输到细胞内部的用途的 研究正在盛行。但是， 虽然作为研究用试剂有实际成绩， 但用于临床应用的较少， 正在进行 各种摸索， 在各种用途中探索能够更高效地转移到细胞内的序列。
在一部分细胞膜通透性肽中， 报告了在与亲水性生理活性物质一起经口或经鼻施 用的情况下， 能够促进亲水性生理活性物质通过粘膜上皮细胞层， 从而能够使亲水性生理 活性物质以高效率转移到全身循环中的肽。 认为并不是所有的细胞膜通透性肽都具有促进 从粘膜通透的性质， 除了细胞膜通透性之外， 该性质还与细胞内的动态、 从细胞的脱离等特 性有关， 只有满足这些条件的一部分细胞膜通透性肽具有促进亲水性生理活性物质的经粘 膜吸收的能力， 但已被报告具有这样的功能的肽的种类较少。 另外， 即使是已被报告具有粘 膜通透促进性的肽， 现状也是其实用化还存在大量课题， 例如， 即使对于仅以与特定的生理 活性物质结合而确认了其效果的肽 ( 专利文献 2、 3)、 或显示了可能以不需要与药物共价结 合的形式使用的肽， 为了获得充分的效果， 也需要大量的细胞膜通透性肽 ( 专利文献 4)， 等 等。
亲水性生理活性物质近年来作为到目前为止占主流的低分子且疏水性的药物以 及药物的候选化合物受到关注， 显示显著的治疗效果， 但由于经粘膜的难吸收性， 现状是其 施用方法基本限于注射剂， 从粘膜吸收亲水性生理活性物质的技术开发在亲水性生理活性 物质的非注射剂化的用途中被强烈期待。 特别是利用细胞膜通透肽的吸收促进技术与到目 前为止被广泛研究的利用表面活性剂的吸收促进技术相比， 可期待对粘膜的刺激性低， 如 果发现能够高效地促进吸收的细胞膜通透肽， 则可能成为有希望的技术。
专利文献 1 ： 特开平 10-33186 号公报
专利文献 2 ： 特表 2002-530059 号公报 专利文献 3 ： W02004/037859 专利文献 4 ： 特开平 10-95738 号公报发明内容
发明所要解决的课题 本发明的课题是提供能够使亲水性生理活性物质转移到细胞内的新的细胞膜通透性肽。 用于解决课题的方法
本发明者们探索具有细胞膜通透性的肽序列， 发现了作为目标的具有细胞膜通透 性的新的肽序列。即， 本发明具有如下构成。
(1) 以下 (A) ～ (D) 的任一项所述的细胞膜通透性肽 ：
(A) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ；
(B) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(C) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个氨基酸 的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(D) 包含用 (A) ～ (C) 的任一项所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列， 在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基 酸序列， 或者在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽。
(2) 根据 (1) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (B) 的肽包含序列号 2 ～ 4、 9～ 10、 13 的任一者所示氨基酸序列。
(3) 根据 (1) 或 (2) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (C) 的肽包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列。
(4) 根据 (1) ～ (3) 的任一项所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (D) 的肽包含序 列号 5 或 14 所示氨基酸序列。
(5) 一种药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性 生理活性物质。
(6) 一种用于经口施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(7) 一种用于经鼻施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(8) 根据 (5) ～ (7) 的任一项所述的药物组合物， 其中， 亲水性生理活性物质是肽、 蛋白质或核酸。
发明的效果
根据本发明， 使亲水性生理活性物质能够高效地向细胞内转移， 从而可以实现以 细胞内的分子为靶标的新的药物治疗。另外， 可以将到目前为止仅能通过注射来施用的亲 水性生理活性物质通过经口、 经鼻施用等而非注射剂化， 从而可以实现简便且对患者温和
的药物治疗。 附图说明 图 1 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 2 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 3 是显示细胞膜通透性肽促进聚苯乙烯珠向 HeLa 细胞的转移的图。
图 4 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 5 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸 收性的图。
图 6 是通过生物利用率来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 7 是通过血浆中的 β- 干扰素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的 β- 干扰素的 经鼻吸收性的图。
图 8 是通过血浆中的艾塞那肽 -4 浓度来显示利用细胞膜通透性肽的艾塞那肽 -4 的经鼻吸收性的图。
图 9 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸收性的图。
图 10 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸 收性的图。
图 11 是通过 LDH 泄漏来显示细胞膜通透性肽的鼻腔障碍性的图。
图 12 是显示各细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的激光共聚焦显微 镜观察像。 各图中的 A( 左上 ) 显示罗丹明标记胰岛素的存在位置、 B( 右上 ) 显示经 DiD’ Oil 染色的细胞膜、 C( 左下 ) 显示微分干涉像、 A+B( 右下 ) 显示将 A 的像与 B 的像重叠表示的 像。
图 13 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 14 是通过 AUC 来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 15 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 16 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
具体实施方式
本发明者新发现了包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ( 以下也称为序列号 1 的 肽 ) 或其变构肽是细胞膜通透性肽， 从而完成了本发明。以下， 对于本发明的细胞膜通透性 肽进行详细说明。
本发明的细胞膜通透性肽的所谓细胞膜通透性， 表示通过将细胞的外部与内部隔 开的脂质膜的性质。 肽是否通过细胞膜通透性如下确认， 即， 将在该肽上连接荧光物质而得 的肽添加到细胞中， 用激光共聚焦显微镜等观察， 根据细胞内部是否能检测到荧光物质来 确认。 另外， 可以通过将摄入了连接有荧光物质的该肽的细胞进行破碎， 对破碎液使用分光 光度计来测定荧光强度， 从而定量地确认细胞内转移性。此外， 在本说明书中， 在连接了荧 光物质 ( 作为具体例是荧光素 ) 的肽向细胞内的转移量， 与连接了荧光物质的包含序列号 6 所示氨基酸序列的非细胞膜通透性的肽的细胞内转移量相比， 上升了 3 倍以上的情况下， 判断该肽是细胞膜通透性肽。另外， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的 特征。 此外， 在本说明书中， 在使经荧光标记的亲水性生理活性物质与肽连接或混合而与细 胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率， 与仅使荧光标记亲水性生理 活性物质与细胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率相比， 高 3 倍以 上的情况下， 判断该肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的特征。
而且， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以粘膜吸收性 ( 优 选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 的特征。具体来说， 对于单独难以经过粘膜而被摄入生物 体内的亲水性生理活性物质来说， 如果使细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质连接或混 合而得的产物与粘膜组织 ( 优选为肠道组织或鼻腔组织 ) 接触， 则亲水性生理活性物质的 经粘膜吸收 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 被促进。
包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽是通过细胞膜通透性肽的筛选而发现的新的 肽。 对该肽所通过的细胞的种类不特别限制， 可以是原核细胞也可以是真核细胞， 但优选为 真核细胞， 更优选可以通过哺乳类细胞的细胞膜， 进一步优选可以通过哺乳类的粘膜细胞 膜。 另外， 该肽不仅其本身是细胞膜通透性的， 而且可以通过使该肽与亲水性生理活性物质 共价结合来赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性， 优选是即使在该肽与亲水性生理活 性物质分别独立存在的组合物的状态下也能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性 的肽。 另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数 个碱性氨基酸的氨基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜 通透性肽。 这里所谓碱性氨基酸， 是指精氨酸、 赖氨酸、 组氨酸的任一氨基酸。 替换、 缺失、 插 入或添加的碱性氨基酸的数优选为 1 ～ 7 个， 更优选为 1 ～ 5 个， 进一步优选为 1 ～ 3 个， 特 别优选为 1 个。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异了的氨基酸序列中， 优选保存原来的 氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换为其他碱性氨基酸的变构肽的情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此是最能容许的改变。作为包含 在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列， 且 具有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 2 ～ 4、 9 ～ 10、 13 的任一者所示氨基 酸序列的肽。
另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱 性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的氨 基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜通透性肽。 此外， 在 通过序列号 1 所示氨基酸的替换、 缺失、 插入或添加而获得的变构肽中， 优选保存原来的氨 基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在 序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨基酸被替换成 其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由于替换成具有 同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最能容许。作为包含在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列， 且具 有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列的 肽。
另外， 对于包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序 列的肽， 或包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸 序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 或 者包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨 基酸序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨 基酸序列的肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也都是本发明的细胞膜通透性肽。这里所谓 包含反向序列的肽， 表示构成的氨基酸的排列相反， 例如， 当从 N 末端向 C 末端的氨基酸序 列的排列为精氨酸、 谷氨酰胺、 异亮氨酸、 赖氨酸时， 其反向肽是指从 N 末端向 C 末端的氨基 酸序列的排列为赖氨酸、 异亮氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸的肽。 作为本具体例， 可列举作为包含 用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列且具有细胞膜通透性 的肽的、 包含序列号 5 或 14 所示氨基酸序列的肽。
构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸除了作为天然存在的氨基酸的构型为 L 型的氨基酸之外， 还可以使用将天然氨基酸的结构进行部分改变而得的衍生物等非天然氨 基酸。例如， 构型为 D 型的氨基酸由于不易受到蛋白分解酶的分解而可以有效地使用， 因此 该肽的氨基酸序列中的一部分氨基酸可以是 D 型。 另外， 构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸无论是否在自然界存在， 只要是具 有羧基和氨基的分子即可， 也可以是经过羟基化、 磷氧化、 或糖基化等生物体内常见的翻 译后修饰的氨基酸， 优选为包含哺乳类细胞内通常存在的天然氨基酸及其光学异构体的 序列， 例如， 包含精氨酸 (Arg)、 赖氨酸 (Lys)、 天冬氨酸 (Asp)、 天冬酰胺 (Asn)、 谷氨酸 (Glu)、 谷氨酰胺 (Gln)、 组氨酸 (His)、 脯氨酸 (Pro)、 酪氨酸 (Tyr)、 色氨酸 (Trp)、 丝氨酸 (Ser)、 苏氨酸 (Thr)、 甘氨酸 (Gly)、 丙氨酸 (Ala)、 蛋氨酸 (Met)、 半胱氨酸 (Cys)、 苯丙氨酸 (Phe)、 亮氨酸 (Leu)、 缬氨酸 (Val)、 异亮氨酸 (Ile) 等的氨基酸序列。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过本领域技术人员公知的方法进行适宜修饰， 具 体可以是经过糖链修饰或荧光标记、 聚乙二醇 (PEG) 化或 N 末端的乙酰化或 C 末端的酰胺 化等化学修饰的衍生物。其中， 在将本发明的细胞膜通透性肽用于后述的药物组合物的情 况下， 该肽优选不被修饰。另外， 本发明的细胞膜通透性肽可以是线状的也可以是环状的。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过与其他公知的细胞膜通透性肽并用来利用。 另 外， 本发明的细胞膜通透性肽在具有细胞膜通透性的范围内， 可以通过后述的方法以该肽 与其他肽或蛋白质融合而成的融合肽或融合蛋白质的状态来利用。
本发明的细胞膜通过性肽可以通过一般的化学合成法来制造。 制造的方法包括通 常的利用液相法和固相法的肽合成法。所述肽合成法更详细地说包括 ： 基于氨基酸序列信 息将各氨基酸 1 个 1 个依次结合而使链延伸的逐步延伸法 ； 预先合成包含数个氨基酸的片 段， 接着使各片段进行连接反应的片段缩合法。本发明的细胞膜通过性肽可以通过任一种 方法来合成。
上述肽合成中所采用的缩合法也可以按照公知的各种方法来进行。作为其具体 例， 可例示例如， 叠氮化物法、 混合酸酐法、 DCC 法、 活性酯法、 氧化还原法、 DPPA( 叠氮磷酸 二苯酯 ) 法、 DCC+ 添加剂 (1- 羟基苯并三唑、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 N- 羟基 -5- 降冰片烯 -2，
3- 二甲酰亚胺等 )、 Woodward 法等。可以用于各方法的溶剂也可以从公知用于这种肽缩合 反应的一般溶剂中适宜选择。作为其例子， 可列举例如， 二甲基甲酰胺 (DMF)、 二甲基亚砜 (DMSO)、 六甲基磷酰胺、 二
烷、 四氢呋喃 (THF)、 乙酸乙酯等或它们的混合溶剂等。上述肽合成反应时， 不参与反应的氨基酸、 肽中的羧基一般可以通过酯化而形成 例如甲酯、 乙酯、 叔丁酯等低级烷基酯、 例如苄基酯、 对甲氧基苄基酯、 对硝基苄基酯等芳烷 基酯等进行保护。另外， 侧链具有官能基的氨基酸、 例如 Tyr 的羟基可以用乙酰基、 苄基、 苄 基氧基羰基、 叔丁基等进行保护， 但不是必须进行该保护。另外， 例如 Arg 的胍基可以通过 硝基、 甲苯磺酰基、 2- 甲氧基苯磺酰基、 亚甲基 -2- 磺酰基、 苄基氧基羰基、 异冰片基氧基羰 基、 金刚烷基氧基羰基等适当的保护基进行保护。具有上述保护基的氨基酸、 肽和最终得 到的本发明的肽中的这些保护基的脱保护反应也可以按照惯用方法、 例如接触还原法、 和/ 或使用液氨 / 钠、 氟化氢、 溴化氢、 氯化氢、 三氟乙酸、 乙酸、 甲酸、 甲磺酸等的方法来实施。
此外， 本发明的细胞膜通过性肽可以使用基因工程学方法通过常规方法来制备。 这样得到的本发明的细胞膜通过性肽可以按照通常的方法， 例如通过离子交换树脂法、 分 配色谱法、 凝胶色谱法、 亲和色谱法、 高速液相色谱法 (HPLC)、 反流分布法等肽化学领域通 用的方法适宜对其进行纯化。 此外， 本发明的细胞膜通透性肽可以以编码该肽的核酸的状态使用。 具体例如， 包 含编码融合有本发明的肽的融合蛋白质的重组核酸并能表达该肽的质粒载体、 病毒载体、 噬菌粒、 转座子等， 但不限于此。另外该重组核酸优选用于例如， 本发明的细胞膜通过性肽 或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的工业生产， 向从体内取出的生物体来源 的细胞导入编码本发明的细胞膜通过性肽的表达载体， 向体内施用本发明的细胞膜通过性 肽， 使体内细胞表达本发明的细胞膜通过性肽或融合蛋白质等。特别优选作为在生物体外 生产本发明的细胞膜通过性肽或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的方法使 用。
此外， 所述重组核酸是指人工制成的 DNA 或 RNA。该重组核酸包含使腺嘌呤、 胞嘧 啶、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 尿嘧啶等核酸结合而合成的， 切下生物所含的 DNA 或 RNA 的一部分并 除去部分碱基、 再通过与其他碱基结合等修饰而制成的， 以及将它们复制而得的。
另外， 本发明涉及含有细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的药物组合物、 或 通过并用本发明的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质来进行的向生物体内施用亲水 性生理活性物质的施用方法。
本发明的细胞膜通透性肽不仅该肽本身是细胞膜通透性的， 而且能够赋予亲水性 生理活性物质以细胞膜通透性， 因此通过在以亲水性生理活性物质为有效成分的药物组合 物中配合本发明的细胞膜通透性肽， 或者并用亲水性生理活性物质和本发明的细胞膜通透 性肽来进行施用， 可以将亲水性生理活性物质经过细胞膜输送到生物体内。 更详细地说， 本 发明的细胞膜通透性肽不仅优选能够通过粘膜细胞膜， 而且能够赋予亲水性生理活性物质 以经粘膜吸收性 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 )， 因此可以将亲水性生理活性物质经
过粘膜输送到生物体内。 亲水性生理活性物质的经粘膜吸收是指施用至粘膜的亲水性生理 活性物质通过粘膜层而转移到血液中， 其结果可以通过亲水性生理活性物质的血中浓度的 上升或药理活性的表达来确认。 亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等 本领域技术人员通常使用的方法来测定。 关于药理活性， 例如， 在酶的情况下可以以其酶活性为指标来测定， 在作用于细胞受体的物质的情况下， 可以以改变靶标细胞的功能或标记 物质的产生量的能力等为指标来测定。 例如， 在胰岛素的药理活性的情况下， 可以以施用的 动物的血中葡萄糖浓度为指标来测定。
作为能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性、 优选为经粘膜吸收性的细胞 膜通透性肽， 只要是上述本发明的细胞膜通透性肽即可， 不特别限定， 具体可列举包含序列 号 1 所示氨基酸序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱 性氨基酸的 1 ～ 7 个、 优选为 1 ～ 5 个、 更优选为 1 ～ 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。特别是作为赋予亲水性生理活性物质以鼻腔吸收性、 优选 用于经鼻施用的药物组合物的本发明的细胞膜通透性肽， 可列举包含序列号 1 所示氨基酸 序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。表 1 显示赋予亲水性生 理活性物质以鼻腔吸收性的本发明的细胞膜通透性肽的具体例， 该肽是使序列号 1 所示氨 基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的变构肽， 并且具有细胞膜 通透性。此外， 在变构肽中序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基 酸的情况下， 由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最可容许。
表1
作为包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基 酸的氨基酸序列、 且具有亲水性生理活性物质的经粘膜吸收性的肽的优选例， 可列举包含
序列号 4、 序列号 9、 序列号 10 的任一者所示氨基酸序列的肽， 特别作为具有亲水性生理活 性物质的经鼻吸收性的肽的优选例， 可列举包含序列号 9 或 10 所示氨基酸序列的肽。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的序列表示的变构肽， 且能 使亲水性生理活性物质经粘膜吸收。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异的序列中， 优选 保存原来的氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的 排列。而且， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨 基酸被替换成其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因而是最可容许的差异。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含用在序 列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的 反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 包含用在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向 序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的肽， 并且能使亲水性 生理活性物质经粘膜吸收。 亲水性生理活性物质是指具有亲水性的特征的生理活性物质。 亲水性是指对水的 溶解度高， 这里将在每 1ml 水中溶解 1μg 以上的物质定义为亲水性。另外， 生理活性物质 是指作用于生物体而给生物体带来变化的所有物质， 可例示与特定的细胞受体结合的蛋白 质、 与生物体内的物质具有亲和性的酶， 还可以是与生物体内物质不发生直接反应的物质， 例如， 代替血浆用于增血用途的葡聚糖等， 还可以是可作为医疗用途施用至生物体的物质。 优选为细胞膜、 经粘膜构成细胞层等生物体屏障的通透性缺乏的肽、 蛋白质或核酸， 更优选 为肽或蛋白质。 另外， 这些作为亲水性生理活性物质的蛋白质与糖链结合而成的糖蛋白质、 进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生物蛋白质也适合作为亲水性生理活性物质使 用。
对亲水性生理活性物质的分子量不特别限定， 在通过细胞膜方面如果分子量过大 则有时成为障碍， 因而分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
作为亲水性生理活性物质的具体例， 可列举甲状旁腺激素 (PTH)、 降钙素、 胰岛素、 血管紧张素、 胰高血糖素、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4、 胃泌素、 生长激素、 促乳 素 ( 黄体化激素 )、 促性腺激素、 亲细胞激素、 促肾上腺皮质激素、 促黑素细胞激素、 加压素、 催产素、 普罗瑞林、 黄体形成激素 (LH)、 促肾上腺皮质激素、 生长素、 促甲状腺激素、 促生长 素抑制素 ( 促生长激素因子 )、 下丘脑激素 (GnRH)、 G-CSF、 促红细胞生成素、 HGF、 EGF、 VEGF、 血管生成素、 α- 干扰素、 β- 干扰素、 γ- 干扰素、 白介素类、 超氧化物歧化酶 (SOD)、 尿激 酶、 溶菌酶、 疫苗等作为优选例， 更优选为胰岛素、 降钙素、 甲状旁腺激素、 生长激素、 干扰素 类、 白介素类、 G-CSF、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4。
在本发明中， 一种优选方式是细胞膜通过性肽与亲水性生理活性物质形成结合
物。这里所谓 “结合物” 是指 2 种以上物质能够同时运动的状态， 包括上述物质之间通过共 价键结合而得的产物、 通过离子键静电结合而得的产物、 以及即使不存在结合时也由于立 体结构而一者限制另一者的运动从而处于共同运动的状态的产物。例如， 在将本发明的肽 修饰于表面而得的胶束、 脂质体、 高分子等微粒中封入生物学活性的药物而得的产物也包 含在形成 “结合物” 的范畴中。例如， 本发明的肽与亲水性生理活性物质通过共价键连接而 成的产物。例如， 作为亲水性生理活性物质的蛋白质的氨基、 羧基和 / 或半胱氨酸所具有的 硫醇基与本发明的细胞膜通过性肽通过共价键结合而得的药物组合物。
在将细胞膜通透性肽和作为亲水性生理活性物质的蛋白质制成结合物的情况下， 可以作为融合蛋白质而制成。作为添加本发明的细胞膜通透性肽的位置不限于特别场所， 优选具有细胞膜通过性的肽位于蛋白质的外侧、 且对融合而得的蛋白质的活性、 功能的影 响低， 优选融合于 N 末端或 C 末端。作为融合的蛋白质的种类不特别限定， 但分子量过大的 药物会成为通过细胞膜的障碍， 因此分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
在制造与细胞膜通过性肽的融合蛋白质时， 可以通过一般的化学合成法来进行。 例如， 将本发明的细胞膜通过性肽与胰岛素混合并添加缩合剂使其结合的方法， 使用肽合 成装置 ( 例如 Applied Biosystems Medel 433) 的方法。另外还可以基于碱基序列信息使 用基因工程学的方法通过常规方法来制造。例如， 在具有蛋白表达启动子的基因表达载体 中插入编码本发明的细胞膜通过性肽和融合的蛋白质的碱基序列来制造的方法。 另外， 在本发明中， 细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质在各自不以共价键连 接的状态下使用也是一种优选方式。在施用本发明的药物组合物时， 即使细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质不通过共价键而形成结合物， 也可以由于在施用后细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质被混合， 通过离子键和 / 或疏水作用、 电荷作用， 从而肽与亲水性生 理活性物质形成结合物， 从而获得目标效果。 特别是在这种情况下， 不需要对亲水性生理活 性物质的直接修饰， 因此对亲水性生理活性物质本来所具有的生理活性效果没有影响， 因 此是优选的。
在本发明中， 对能够经粘膜吸收亲水性生理活性物质的粘膜不特别限定， 例如， 眼 睛、 鼻腔、 舌下、 肺、 口腔、 皮肤、 阴道、 肠道的粘膜， 优选为鼻腔或肠道的粘膜。另外， 对于通 过本发明使亲水性生理活性物质经粘膜吸收时的施用方法也不特别限定。可列举经口、 经 鼻、 经肠道、 经皮、 注射施用， 优选为经口、 经鼻或经肠道施用。
在本发明中， 将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至生物体时的施用 量、 施用次数可以根据亲水性生理活性物质、 施用方式、 患者的年龄、 体重、 症状的严重程度 来适宜选择， 通常可以以成人每 1 天作为亲水性生理活性物质含量为 0.01 ～ 50mg、 优选为 0.1 ～ 20mg 的范围施用。此时， 对于细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的配合比率不 特别限定， 优选根据配合的亲水性生理活性物质的种类、 细胞膜通透性肽和亲水性生理活 性物质的配合状态来确定， 为了赋予亲水性生理活性物质以充分的作用， 在任一种配合状 态中都优选使用相对于作用的亲水性生理活性物质的摩尔量为 1 倍以上的细胞膜通透性 肽， 更优选使用 2 倍以上的细胞膜通透性肽。这在细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质 以共价键形成结合物的情况下， 表示亲水性生理活性物质各自结合了 1 个以上的细胞膜通 透性肽的状态 ； 在以独立的状态使用的情况下， 表示如果设所用的亲水性生理活性物质的 摩尔量为 1， 则以含有 1 以上的摩尔量的细胞膜通透性肽的状态作用。
在本发明中， 对将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至动物 ( 包括人 ) 的情况下的具体方式没有制限。 例如， 可以直接施用干燥状态的物质或溶液状的物质， 或者 可以与赋形剂一起填充到胶囊中施用， 还可以将干燥状态的物质暂时溶解分散到水中然后 施用。
本发明的药物组合物， 可列举除了细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质以外还 包含可药用的添加剂的粉末形态， 或者包含与水等介质和除该介质以外的可药用的基剂的 混合物等的液状形态， 以及通过与可药用的基剂组合来固体化或半固体化的形态等。作为 所述基剂， 可列举作为制剂原料惯用的各种有机或无机物质， 例如赋形剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂、 溶剂、 溶解助剂、 悬浮剂、 等渗剂、 缓冲剂、 镇痛剂、 吸收促进剂等。例如， 可列举水、 可药用的有机溶剂、 胶原、 聚乙二醇、 聚乙烯基吡咯烷酮、 羧基乙烯基聚合物、 羧甲基纤维素 钠、 聚丙烯酸钠、 藻酸钠、 水溶性葡聚糖、 羧甲基淀粉钠、 果胶、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 黄 原酸胶、 阿拉伯树胶、 酪蛋白、 明胶、 琼脂、 双甘油、 丙二醇、 聚乙二醇、 凡士林、 石蜡、 硬脂醇、 硬脂酸、 人血清白蛋白 (HSA)、 甘露糖醇、 山梨糖醇、 乳糖、 作为医药添加剂可容许的表面活 性剂等。
另外， 不仅是单纯的添加剂， 还优选与高度的输送技术并用。例如为了通过经口 施用将本发明的药物组合物输送到肠道， 制成包含在肠溶性的胶囊、 粘膜附着性的羟丙基 纤维素和 / 或智能水凝胶聚乙二醇接枝聚甲基丙烯酸 (poly(methacrylic acid)grafted with poly(ethylene glycol)P(MAA-g-EG)) 等中的药物组合物， 在避免消化酶造成的肽和 药物的分解方面是优选的。 实施例
实施例 1 ： 肽向细胞内转移的转移性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入 含有终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス 社合成 )、 和终浓度 10％的 FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mMEDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的肽分解。 对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置 (HORIBA FLUOROMAX-3) 以激发波长 494nm、 荧 光波长 512nm 测定测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 1。各个值显示连续 3 次 进行的评价的平均值和标准误差。序列号 6 的随机肽基本不被摄入细胞中， 即不是细胞膜 通透性肽， 与此相对， 作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的荧光素标记体以序列号 6 的随 机肽的 10 倍以上的效率被摄入细胞内。
实施例 2 ： 促进胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入包
含终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス社 合成 )、 和含罗丹明标记人胰岛素 ( 终浓度 100μg/ml) 的 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。 用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的 溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保 温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素分解。对分解溶液回收总量， 用荧光 强度测定装置以激发波长 555nm、 荧光波长 580nm 测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素 量。
另外， 用同样的方法在 HeLa 细胞中加入含罗丹明标记人胰岛素和序列号 1 ～ 6 所 示的肽的溶液并保温， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基 300μl 洗涤 3 次， 用 4％低聚甲醛 溶液固定 3 小时， 用 300μl 的 PBS 洗涤 3 次。然后用 5％ DiD’ Oil 溶液 ( モルキユラ一プ ロ一ブ社 ) 保温一夜， 用激光共聚焦显微镜 ( オリンパス社 FV-1000) 观察罗丹明标记胰岛 素的存在位置。
罗丹明标记胰岛素用以下方法制作。将 20mg 的人胰岛素溶解在 0.5ml 的 0.1N 盐 酸中， 然后加入 3ml 的 PBS 和 0.5ml 的 0.1N 氢氧化钠进行中和。 将产物用脱盐柱 (PD-10 柱 ) 进行溶液置换， 得到 50mM NaHCO3 溶液 5ml( 胰岛素浓度 4mg/ml)。 向其中添加溶解于 0.5ml DMSO 的 4mg 的 NHS- 罗丹明 ( ピアス社 )， 在室温反应整夜。 加入 1M Tris-HCl(pH8)0.5ml 进 一步在室温反应 30 分钟， 然后使用 PD-10 柱对水进行脱盐， 再加入水， 得到最终量 10ml( 胰 岛素浓度为 2mg/ml) 的溶液。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 2。各个值显 示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加罗丹明标记胰岛素、 或将罗丹明标 记胰岛素与具有序列号 6 的随机序列的肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入细胞 中， 与此相对， 添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 与使用作为随机肽的 序列号 6 的肽的情况相比， 罗丹明标记胰岛素以 50 倍以上的效率被摄入细胞内。
另外， 将序列号 1 ～ 6 的肽分别与罗丹明标记胰岛素一起添加时的激光共聚焦显 微镜观察结果示于图 12。 确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽不使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部， 与此相对， 序列号 1 ～ 5 的本发明的细胞膜通透性肽使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部。
实施例 3 ： 促进聚苯乙烯珠向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入含 有终浓度 1μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 所示的肽 ( 委托シグマジエノシ ス社合成 )、 终浓度 1μl/ 孔的荧光聚苯乙烯珠 ( モルキユラ一プロ一ブ制 Fluorospheres Carboxylated Microbeads 0.1μm)、 和 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保 温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞 分解。对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置以激发波长 580nm、 荧光波长 605nm 测定 被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量。< 结果 >
被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量相对于各孔中的添加量示于图 3。各个值显示 连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加荧光聚苯乙烯珠、 或将荧光聚苯乙烯 珠与不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入 细胞中， 与此相对， 在添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 回收到添加量 的 0.7％以上的荧光聚苯乙烯珠。
实施例 4 ： 胰岛素的经鼻施用
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 溶解 在 0.1N HCl 中， 然后加入等量的 0.1N NaOH 制作胰岛素溶液。将单独的胰岛素溶液， 或者 将全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中并 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混 合溶液。对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥 50mg/kg 来进行麻醉， 然后将颈部切开露出气管。将聚乙烯管 (INTRAMEDICPE205， Clay Adams) 插入 气管， 接着将食道部分切开， 将相同直径的管从食道的切开部向后鼻孔小心地插入， 避免损 伤组织。将向后鼻孔插入的管的前端预先用脱脂棉和粘结剂密封。为了防止药液泄漏， 将 开口于口腔的上腭部的鼻腭管用合成粘结剂 ( 第一三共株式会社制 “アロンアルフア A” ) 封闭。然后施用制备的胰岛素和肽的混合液、 或仅胰岛素， 在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180、 240 分钟后由颈静脉采血 0.25ml， 使用血糖值测定装置 “ノボアシストプラ ス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离而分离出血浆， 用 EIA 试剂盒 ( レビ ス社 ) 测定血浆中胰岛素浓度。生物学的利用能 ( 生物利用率 ) 通过与胰岛素皮下施用时 的比较来计算出。
< 结果 >
图 4 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 5 显示血中胰岛素浓度变化。 各个值显 示连续 3 次或连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用胰岛素的大鼠中几 乎未发现血中的胰岛素浓度上升， 与此相对， 在与胰岛素一起施用序列号 1 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之后开始胰岛素向血中转移。 另外也发现了作为伴随胰岛素向血中转移的 药理活性的血糖值下降， 确认了与血中的胰岛素浓度相对应的血糖值下降。
实施例 5 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法调制胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者将全氨基酸序 列为 L 型的序列号 1、 序列号 7( 寡聚精氨酸 ) 或序列号 8( 穿膜肽 (penetratin)) 的肽 ( 委 托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制 备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。将各个混合溶液用与实施例 4 所记 载的相同的方法施用至大鼠， 经时地采血、 测定， 测定血浆中的胰岛素浓度， 通过与胰岛素 皮下施用时的比较来计算出生物学的利用能 ( 生物利用率 )。
< 结果 >
图 6 显示连续 3 次进行的评价中的施用单独的胰岛素、 或序列号 1、 7 或 8 的肽与 胰岛素的混合液时的生物利用率的平均值和标准误差。具有序列号 1 所示氨基酸序列的本发明的细胞膜通透性肽相对于序列号 7 或 8 的已知细胞膜通透性肽， 显示显著高的生物利 用率。
实施例 6 ： β- 干扰素的经鼻施用
< 方法 >
在冰冷下， 在人天然型 β- 干扰素 ( 东レ株式会社制 “フエロン” ) 中加入添加有 吐温 20 的 PBS 1ml， 制成 6,000,000IU/ml， 分取该溶液 100μl， 加入添加有吐温 20 的 PBS 566μl 制成 900,000IU/ml 溶液。将单独的 β- 干扰素， 或者全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述 β- 干扰素溶液合并， 6 在各个施用实验中制备 β- 干扰素 (0.18×10 IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用 与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。血浆中 β- 干扰素浓度通过 “人 β- 干扰素 ELISA 试剂盒” ( 株式会社镰仓テクノサイエンス ) 来测定。
< 结果 >
图 7 显示施用后的血浆中 β- 干扰素浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评价 的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了 β- 干扰素的大鼠中， 血中的 β- 干扰素浓度上升 低， 与此相对， 在与 β- 干扰素一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之 后开始 β- 干扰素向血中转移。 实施例 7 ： 艾塞那肽 -4 的经鼻施用
< 方法 >
将单独的艾塞那肽 -4( 委托シグマジエノシス社合成 )， 或者全氨基酸序列为 L 型 的序列号 1 或序列号 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述艾塞那 肽 -4 溶液合并， 在各个施用实验中， 制备艾塞那肽 -4(0.25mg/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。对于血浆中艾塞那肽 -4 浓度， 以抗艾塞那肽 -4 单克隆抗体为固相， 将生物素标记抗艾塞那肽 -4 多克隆抗体抗体和链霉 抗生物素蛋白 -HRP 用于检测， 通过夹心法 ELISA( 酶免疫测定法 ) 进行测定。
< 结果 >
图 8 显示施用后的血浆中艾塞那肽 -4 浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评 价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了艾塞那肽 -4 的大鼠中， 几乎未发现血中的艾塞那 肽 -4 浓度上升， 与此相对， 在与艾塞那肽 -4 一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现 从刚刚施用之后开始艾塞那肽 -4 向血中转移。
实施例 8 ： 胰岛素的肠道施用
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素溶液。将单独的胰岛素， 或者全氨基酸序列 为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (50IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 500μl 混合溶液。 对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥钠 50mg/kg 来进 行麻醉， 然后沿正中线进行开腹， 露出肠道。从距离回盲接合部 2-3cm 回肠的部分插入硅 管， 从其上部约 10cm 的部分插入探头， 进一步在内侧 6cm 的部分通入缝合线。从探头以流 速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 pH 值 7.4 的磷酸生理缓冲液 (PBS)20ml， 使内容物排 出， 然后在硅管加塞， 从探头施用预先加热至 37℃的 PBS 1ml， 使其停留 30 分钟。施用后迅
速给探头加塞， 并将肠道送回腹腔内将切开部用线夹封闭使其安静。 停留后， 拔出探头和硅 管的塞， 向回路内以流速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 PBS 20ml 使内容物排出， 然后将 预先通入缝合线的 6cm 的部分结扎并制成回路。向该回路内单独施用胰岛素溶液， 或者施 用胰岛素和序列号 1 或序列号 4 的肽混合溶液 0.5ml， 将肠道送回腹腔内， 将切开部用线夹 封闭使其安静。 实验中的大鼠以背位固定在通过温水循环泵加热至 37℃的电热板上来进行 体温调节。在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180 分钟后从颈静脉采血 0.25ml， 使用 血糖值测定装置 “ノボアシストプラス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离 而分离成血浆， 通过酶免疫测定法定量胰岛素浓度。对于仅将等量的胰岛素溶液施用至皮 下的大鼠， 也同样地进行采血、 测定。
< 结果 >
图 9 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 10 显示血中胰岛素浓度变化。各个值 显示连续 3 次～连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。确认了与对照的单独施用胰岛 素时相比， 通过将序列号 1 或 4 的肽与胰岛素并用施用， 血中胰岛素浓度明显上升， 而且血 糖值明显降低 ( 图 9 和图 10)。
实施例 9 ： 鼻腔伤害性评价 < 方法 >
用于实施例 4 同样的方法将单独的胰岛素、 或胰岛素与序列号 1 的肽、 或 5％ (w/ v) 的牛磺脱氧胆酸溶液鼻腔施用。15 分钟， 用 10ml 的加热至 37℃的 PBS 以 2ml/ 分钟洗涤 鼻腔。对洗涤溶液进行回收， 用 LDH 活性测定试剂盒 (Pointe scientific 社 ) 测定泄漏到 溶液中的 LDH 活性。
< 结果 >
图 11 显示洗涤溶液的 LDH 活性。各个值显示连续 3 次进行的评价的平均值和标 准误差。 与 5％牛磺脱氧胆酸钠相比， 从施用了序列号 1 的肽和胰岛素混合溶液的小鼠鼻腔 的 LDH 释放显著较低， 与施用了 PBS、 单独的胰岛素的情况下相同程度地低。
实施例 10 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 2
< 方法 >
除了使用序列号 1、 6、 9 ～ 11 的氨基末端未标记肽 ( 委托シグマジエノシス社合 成 ) 以外， 通过与实施例 2 同样的方法来评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。 在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛 素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 13。各个值 显示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在将确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 或 11 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 仅添加量的 0.05％以下的罗丹明标记胰岛素 被摄入细胞中， 与此相对， 一起添加了作为本发明的细胞膜通透性肽的序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽的情况下， 添加的罗丹明标记胰岛素的 0.7％以上被摄入细胞中。
实施例 11 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者全氨基酸序列
为 L 型的序列号 1、 9、 10 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。 将 各个混合溶液用于实施例 4 所记载的相同的方法施用至大鼠， 经时地进行采血、 测定， 测定 血浆中的胰岛素浓度， 以血中浓度 (μU/ml) 和时间 ( 分钟 ) 的变化为基础计算出 AUC( 药 物血中浓度 - 时间曲线下面积 )。
< 结果 >
图 14 显示在连续 3 次或连续 6 次进行的评价中， 单独施用胰岛素、 和施用序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽与胰岛素的混合液的情况下的 AUC 的平均值和标准误差。在将序列 号 1、 9、 10 的细胞膜通透性肽与胰岛素并用施用的情况下， 相对于单独施用胰岛素的情况， 显示显著较高的胰岛素的鼻腔吸收性。
实施例 12 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 3
< 方法 >
使用与实施例 2 同样的方法， 使用序列号 6、 12 ～ 30 的氨基末端被荧光素标记的 肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 )， 评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置来测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰 岛素量。另外， 用与实施例 1 同样的方法测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 15。 各个值显示连续 2 次 进行的评价的平均值和标准误差。添加了具有序列号 6 所示的随机序列的肽的情况下， 仅 添加的荧光素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在序列号 12 ～ 30 所示的本发明的 细胞膜通透性肽的情况下， 均有 0.8％以上被摄入细胞内。
另外， 被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 16。各 个值显示连续 2 次进行的评价的平均值和标准误差。在不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的 随机肽的情况下， 仅添加的罗丹明标记胰岛素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在 一起添加了序列号 12 ～ 30 的本发明的细胞膜通透性肽的情况下， 均有 1％以上被摄入细胞 内。
产业可利用性
通过本发明， 到目前为止困难的亲水性生理活性物质的细胞内导入变得容易， 可 以期待新的医疗技术的展开。具体来说， 通过本发明的细胞膜通透性肽可获得能够将亲水 性生理活性物质经粘膜施用的制剂， 因此可以大幅改善现有的包含亲水性生理活性物质的 制剂 ( 例如， 注射剂 ) 给患者带来的苦痛、 不便， 从而不仅能够实现医疗现场的以患者为本 的医疗， 而且可以从根本上改变到目前为止的亲水性生理活性物质制剂的概念， 实现划时 代的制剂创制。
序列表自由文字
序列号 1 ～ 5 本发明的细胞膜通透性肽
序列号 6 随机肽
序列号 7 寡聚精氨酸
序列号 8 穿膜肽 (penetratin)
背景技术 细胞通过对蛋白质和核酸等亲水性生理活性物质为非通透性的细胞膜而与外界 隔离开。没有将这些亲水性生理活性物质运输到细胞内的方法， 这成为以细胞内为作用部 位的大量亲水性生理活性物质的临床使用的障碍。
报告了几项将这样的细胞非通透性的亲水性生理活性物质运输到细胞内的技术。 最一般的方法是使用脂质赋予亲水性生理活性物质以疏水性， 从而可以提高细胞膜的通过 性。另外， 还报告了使用肽性的配基来提高通透性的技术。
具有在不破坏细胞膜的状态下从细胞外向细胞内转移的性质的肽配基被称为细 胞膜通透性肽。作为著名的细胞膜通透性肽， 有由精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 来源于 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 作为来源于果蝇的肽的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2) 等。 除此以外， 还报告了以单纯的碱性为特征的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性 为特征的肽、 机制不明确的肽等各种肽。关于这些肽， 除了其自身的细胞内转移性之外， 如 上所述以其自身为媒介将所连接的基因等亲水性生理活性物质运输到细胞内部的用途的 研究正在盛行。但是， 虽然作为研究用试剂有实际成绩， 但用于临床应用的较少， 正在进行 各种摸索， 在各种用途中探索能够更高效地转移到细胞内的序列。
在一部分细胞膜通透性肽中， 报告了在与亲水性生理活性物质一起经口或经鼻施 用的情况下， 能够促进亲水性生理活性物质通过粘膜上皮细胞层， 从而能够使亲水性生理 活性物质以高效率转移到全身循环中的肽。 认为并不是所有的细胞膜通透性肽都具有促进 从粘膜通透的性质， 除了细胞膜通透性之外， 该性质还与细胞内的动态、 从细胞的脱离等特 性有关， 只有满足这些条件的一部分细胞膜通透性肽具有促进亲水性生理活性物质的经粘 膜吸收的能力， 但已被报告具有这样的功能的肽的种类较少。 另外， 即使是已被报告具有粘 膜通透促进性的肽， 现状也是其实用化还存在大量课题， 例如， 即使对于仅以与特定的生理 活性物质结合而确认了其效果的肽 ( 专利文献 2、 3)、 或显示了可能以不需要与药物共价结 合的形式使用的肽， 为了获得充分的效果， 也需要大量的细胞膜通透性肽 ( 专利文献 4)， 等 等。
亲水性生理活性物质近年来作为到目前为止占主流的低分子且疏水性的药物以 及药物的候选化合物受到关注， 显示显著的治疗效果， 但由于经粘膜的难吸收性， 现状是其 施用方法基本限于注射剂， 从粘膜吸收亲水性生理活性物质的技术开发在亲水性生理活性 物质的非注射剂化的用途中被强烈期待。 特别是利用细胞膜通透肽的吸收促进技术与到目 前为止被广泛研究的利用表面活性剂的吸收促进技术相比， 可期待对粘膜的刺激性低， 如 果发现能够高效地促进吸收的细胞膜通透肽， 则可能成为有希望的技术。
专利文献 1 ： 特开平 10-33186 号公报
报告了几项将这样的细胞非通透性的亲水性生理活性物质运输到细胞内的技术。 最一般的方法是使用脂质赋予亲水性生理活性物质以疏水性， 从而可以提高细胞膜的通过 性。另外， 还报告了使用肽性的配基来提高通透性的技术。
具有在不破坏细胞膜的状态下从细胞外向细胞内转移的性质的肽配基被称为细 胞膜通透性肽。作为著名的细胞膜通透性肽， 有由精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 来源于 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 作为来源于果蝇的肽的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2) 等。 除此以外， 还报告了以单纯的碱性为特征的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性 为特征的肽、 机制不明确的肽等各种肽。关于这些肽， 除了其自身的细胞内转移性之外， 如 上所述以其自身为媒介将所连接的基因等亲水性生理活性物质运输到细胞内部的用途的 研究正在盛行。但是， 虽然作为研究用试剂有实际成绩， 但用于临床应用的较少， 正在进行 各种摸索， 在各种用途中探索能够更高效地转移到细胞内的序列。
在一部分细胞膜通透性肽中， 报告了在与亲水性生理活性物质一起经口或经鼻施 用的情况下， 能够促进亲水性生理活性物质通过粘膜上皮细胞层， 从而能够使亲水性生理 活性物质以高效率转移到全身循环中的肽。 认为并不是所有的细胞膜通透性肽都具有促进 从粘膜通透的性质， 除了细胞膜通透性之外， 该性质还与细胞内的动态、 从细胞的脱离等特 性有关， 只有满足这些条件的一部分细胞膜通透性肽具有促进亲水性生理活性物质的经粘 膜吸收的能力， 但已被报告具有这样的功能的肽的种类较少。 另外， 即使是已被报告具有粘 膜通透促进性的肽， 现状也是其实用化还存在大量课题， 例如， 即使对于仅以与特定的生理 活性物质结合而确认了其效果的肽 ( 专利文献 2、 3)、 或显示了可能以不需要与药物共价结 合的形式使用的肽， 为了获得充分的效果， 也需要大量的细胞膜通透性肽 ( 专利文献 4)， 等 等。
亲水性生理活性物质近年来作为到目前为止占主流的低分子且疏水性的药物以 及药物的候选化合物受到关注， 显示显著的治疗效果， 但由于经粘膜的难吸收性， 现状是其 施用方法基本限于注射剂， 从粘膜吸收亲水性生理活性物质的技术开发在亲水性生理活性 物质的非注射剂化的用途中被强烈期待。 特别是利用细胞膜通透肽的吸收促进技术与到目 前为止被广泛研究的利用表面活性剂的吸收促进技术相比， 可期待对粘膜的刺激性低， 如 果发现能够高效地促进吸收的细胞膜通透肽， 则可能成为有希望的技术。
专利文献 1 ： 特开平 10-33186 号公报
专利文献 2 ： 特表 2002-530059 号公报 专利文献 3 ： W02004/037859 专利文献 4 ： 特开平 10-95738 号公报发明内容
发明所要解决的课题 本发明的课题是提供能够使亲水性生理活性物质转移到细胞内的新的细胞膜通透性肽。 用于解决课题的方法
本发明者们探索具有细胞膜通透性的肽序列， 发现了作为目标的具有细胞膜通透 性的新的肽序列。即， 本发明具有如下构成。
(1) 以下 (A) ～ (D) 的任一项所述的细胞膜通透性肽 ：
(A) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ；
(B) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(C) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个氨基酸 的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(D) 包含用 (A) ～ (C) 的任一项所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列， 在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基 酸序列， 或者在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽。
(2) 根据 (1) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (B) 的肽包含序列号 2 ～ 4、 9～ 10、 13 的任一者所示氨基酸序列。
(3) 根据 (1) 或 (2) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (C) 的肽包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列。
(4) 根据 (1) ～ (3) 的任一项所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (D) 的肽包含序 列号 5 或 14 所示氨基酸序列。
(5) 一种药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性 生理活性物质。
(6) 一种用于经口施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(7) 一种用于经鼻施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(8) 根据 (5) ～ (7) 的任一项所述的药物组合物， 其中， 亲水性生理活性物质是肽、 蛋白质或核酸。
发明的效果
根据本发明， 使亲水性生理活性物质能够高效地向细胞内转移， 从而可以实现以 细胞内的分子为靶标的新的药物治疗。另外， 可以将到目前为止仅能通过注射来施用的亲 水性生理活性物质通过经口、 经鼻施用等而非注射剂化， 从而可以实现简便且对患者温和
的药物治疗。 附图说明 图 1 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 2 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 3 是显示细胞膜通透性肽促进聚苯乙烯珠向 HeLa 细胞的转移的图。
图 4 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 5 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸 收性的图。
图 6 是通过生物利用率来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 7 是通过血浆中的 β- 干扰素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的 β- 干扰素的 经鼻吸收性的图。
图 8 是通过血浆中的艾塞那肽 -4 浓度来显示利用细胞膜通透性肽的艾塞那肽 -4 的经鼻吸收性的图。
图 9 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸收性的图。
图 10 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸 收性的图。
图 11 是通过 LDH 泄漏来显示细胞膜通透性肽的鼻腔障碍性的图。
图 12 是显示各细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的激光共聚焦显微 镜观察像。 各图中的 A( 左上 ) 显示罗丹明标记胰岛素的存在位置、 B( 右上 ) 显示经 DiD’ Oil 染色的细胞膜、 C( 左下 ) 显示微分干涉像、 A+B( 右下 ) 显示将 A 的像与 B 的像重叠表示的 像。
图 13 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 14 是通过 AUC 来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 15 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 16 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
具体实施方式
本发明者新发现了包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ( 以下也称为序列号 1 的 肽 ) 或其变构肽是细胞膜通透性肽， 从而完成了本发明。以下， 对于本发明的细胞膜通透性 肽进行详细说明。
本发明的细胞膜通透性肽的所谓细胞膜通透性， 表示通过将细胞的外部与内部隔 开的脂质膜的性质。 肽是否通过细胞膜通透性如下确认， 即， 将在该肽上连接荧光物质而得 的肽添加到细胞中， 用激光共聚焦显微镜等观察， 根据细胞内部是否能检测到荧光物质来 确认。 另外， 可以通过将摄入了连接有荧光物质的该肽的细胞进行破碎， 对破碎液使用分光 光度计来测定荧光强度， 从而定量地确认细胞内转移性。此外， 在本说明书中， 在连接了荧 光物质 ( 作为具体例是荧光素 ) 的肽向细胞内的转移量， 与连接了荧光物质的包含序列号 6 所示氨基酸序列的非细胞膜通透性的肽的细胞内转移量相比， 上升了 3 倍以上的情况下， 判断该肽是细胞膜通透性肽。另外， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的 特征。 此外， 在本说明书中， 在使经荧光标记的亲水性生理活性物质与肽连接或混合而与细 胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率， 与仅使荧光标记亲水性生理 活性物质与细胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率相比， 高 3 倍以 上的情况下， 判断该肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的特征。
而且， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以粘膜吸收性 ( 优 选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 的特征。具体来说， 对于单独难以经过粘膜而被摄入生物 体内的亲水性生理活性物质来说， 如果使细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质连接或混 合而得的产物与粘膜组织 ( 优选为肠道组织或鼻腔组织 ) 接触， 则亲水性生理活性物质的 经粘膜吸收 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 被促进。
包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽是通过细胞膜通透性肽的筛选而发现的新的 肽。 对该肽所通过的细胞的种类不特别限制， 可以是原核细胞也可以是真核细胞， 但优选为 真核细胞， 更优选可以通过哺乳类细胞的细胞膜， 进一步优选可以通过哺乳类的粘膜细胞 膜。 另外， 该肽不仅其本身是细胞膜通透性的， 而且可以通过使该肽与亲水性生理活性物质 共价结合来赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性， 优选是即使在该肽与亲水性生理活 性物质分别独立存在的组合物的状态下也能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性 的肽。 另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数 个碱性氨基酸的氨基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜 通透性肽。 这里所谓碱性氨基酸， 是指精氨酸、 赖氨酸、 组氨酸的任一氨基酸。 替换、 缺失、 插 入或添加的碱性氨基酸的数优选为 1 ～ 7 个， 更优选为 1 ～ 5 个， 进一步优选为 1 ～ 3 个， 特 别优选为 1 个。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异了的氨基酸序列中， 优选保存原来的 氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换为其他碱性氨基酸的变构肽的情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此是最能容许的改变。作为包含 在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列， 且 具有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 2 ～ 4、 9 ～ 10、 13 的任一者所示氨基 酸序列的肽。
另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱 性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的氨 基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜通透性肽。 此外， 在 通过序列号 1 所示氨基酸的替换、 缺失、 插入或添加而获得的变构肽中， 优选保存原来的氨 基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在 序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨基酸被替换成 其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由于替换成具有 同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最能容许。作为包含在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列， 且具 有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列的 肽。
另外， 对于包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序 列的肽， 或包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸 序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 或 者包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨 基酸序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨 基酸序列的肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也都是本发明的细胞膜通透性肽。这里所谓 包含反向序列的肽， 表示构成的氨基酸的排列相反， 例如， 当从 N 末端向 C 末端的氨基酸序 列的排列为精氨酸、 谷氨酰胺、 异亮氨酸、 赖氨酸时， 其反向肽是指从 N 末端向 C 末端的氨基 酸序列的排列为赖氨酸、 异亮氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸的肽。 作为本具体例， 可列举作为包含 用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列且具有细胞膜通透性 的肽的、 包含序列号 5 或 14 所示氨基酸序列的肽。
构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸除了作为天然存在的氨基酸的构型为 L 型的氨基酸之外， 还可以使用将天然氨基酸的结构进行部分改变而得的衍生物等非天然氨 基酸。例如， 构型为 D 型的氨基酸由于不易受到蛋白分解酶的分解而可以有效地使用， 因此 该肽的氨基酸序列中的一部分氨基酸可以是 D 型。 另外， 构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸无论是否在自然界存在， 只要是具 有羧基和氨基的分子即可， 也可以是经过羟基化、 磷氧化、 或糖基化等生物体内常见的翻 译后修饰的氨基酸， 优选为包含哺乳类细胞内通常存在的天然氨基酸及其光学异构体的 序列， 例如， 包含精氨酸 (Arg)、 赖氨酸 (Lys)、 天冬氨酸 (Asp)、 天冬酰胺 (Asn)、 谷氨酸 (Glu)、 谷氨酰胺 (Gln)、 组氨酸 (His)、 脯氨酸 (Pro)、 酪氨酸 (Tyr)、 色氨酸 (Trp)、 丝氨酸 (Ser)、 苏氨酸 (Thr)、 甘氨酸 (Gly)、 丙氨酸 (Ala)、 蛋氨酸 (Met)、 半胱氨酸 (Cys)、 苯丙氨酸 (Phe)、 亮氨酸 (Leu)、 缬氨酸 (Val)、 异亮氨酸 (Ile) 等的氨基酸序列。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过本领域技术人员公知的方法进行适宜修饰， 具 体可以是经过糖链修饰或荧光标记、 聚乙二醇 (PEG) 化或 N 末端的乙酰化或 C 末端的酰胺 化等化学修饰的衍生物。其中， 在将本发明的细胞膜通透性肽用于后述的药物组合物的情 况下， 该肽优选不被修饰。另外， 本发明的细胞膜通透性肽可以是线状的也可以是环状的。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过与其他公知的细胞膜通透性肽并用来利用。 另 外， 本发明的细胞膜通透性肽在具有细胞膜通透性的范围内， 可以通过后述的方法以该肽 与其他肽或蛋白质融合而成的融合肽或融合蛋白质的状态来利用。
本发明的细胞膜通过性肽可以通过一般的化学合成法来制造。 制造的方法包括通 常的利用液相法和固相法的肽合成法。所述肽合成法更详细地说包括 ： 基于氨基酸序列信 息将各氨基酸 1 个 1 个依次结合而使链延伸的逐步延伸法 ； 预先合成包含数个氨基酸的片 段， 接着使各片段进行连接反应的片段缩合法。本发明的细胞膜通过性肽可以通过任一种 方法来合成。
上述肽合成中所采用的缩合法也可以按照公知的各种方法来进行。作为其具体 例， 可例示例如， 叠氮化物法、 混合酸酐法、 DCC 法、 活性酯法、 氧化还原法、 DPPA( 叠氮磷酸 二苯酯 ) 法、 DCC+ 添加剂 (1- 羟基苯并三唑、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 N- 羟基 -5- 降冰片烯 -2，
3- 二甲酰亚胺等 )、 Woodward 法等。可以用于各方法的溶剂也可以从公知用于这种肽缩合 反应的一般溶剂中适宜选择。作为其例子， 可列举例如， 二甲基甲酰胺 (DMF)、 二甲基亚砜 (DMSO)、 六甲基磷酰胺、 二
烷、 四氢呋喃 (THF)、 乙酸乙酯等或它们的混合溶剂等。上述肽合成反应时， 不参与反应的氨基酸、 肽中的羧基一般可以通过酯化而形成 例如甲酯、 乙酯、 叔丁酯等低级烷基酯、 例如苄基酯、 对甲氧基苄基酯、 对硝基苄基酯等芳烷 基酯等进行保护。另外， 侧链具有官能基的氨基酸、 例如 Tyr 的羟基可以用乙酰基、 苄基、 苄 基氧基羰基、 叔丁基等进行保护， 但不是必须进行该保护。另外， 例如 Arg 的胍基可以通过 硝基、 甲苯磺酰基、 2- 甲氧基苯磺酰基、 亚甲基 -2- 磺酰基、 苄基氧基羰基、 异冰片基氧基羰 基、 金刚烷基氧基羰基等适当的保护基进行保护。具有上述保护基的氨基酸、 肽和最终得 到的本发明的肽中的这些保护基的脱保护反应也可以按照惯用方法、 例如接触还原法、 和/ 或使用液氨 / 钠、 氟化氢、 溴化氢、 氯化氢、 三氟乙酸、 乙酸、 甲酸、 甲磺酸等的方法来实施。
此外， 本发明的细胞膜通过性肽可以使用基因工程学方法通过常规方法来制备。 这样得到的本发明的细胞膜通过性肽可以按照通常的方法， 例如通过离子交换树脂法、 分 配色谱法、 凝胶色谱法、 亲和色谱法、 高速液相色谱法 (HPLC)、 反流分布法等肽化学领域通 用的方法适宜对其进行纯化。 此外， 本发明的细胞膜通透性肽可以以编码该肽的核酸的状态使用。 具体例如， 包 含编码融合有本发明的肽的融合蛋白质的重组核酸并能表达该肽的质粒载体、 病毒载体、 噬菌粒、 转座子等， 但不限于此。另外该重组核酸优选用于例如， 本发明的细胞膜通过性肽 或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的工业生产， 向从体内取出的生物体来源 的细胞导入编码本发明的细胞膜通过性肽的表达载体， 向体内施用本发明的细胞膜通过性 肽， 使体内细胞表达本发明的细胞膜通过性肽或融合蛋白质等。特别优选作为在生物体外 生产本发明的细胞膜通过性肽或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的方法使 用。
此外， 所述重组核酸是指人工制成的 DNA 或 RNA。该重组核酸包含使腺嘌呤、 胞嘧 啶、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 尿嘧啶等核酸结合而合成的， 切下生物所含的 DNA 或 RNA 的一部分并 除去部分碱基、 再通过与其他碱基结合等修饰而制成的， 以及将它们复制而得的。
另外， 本发明涉及含有细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的药物组合物、 或 通过并用本发明的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质来进行的向生物体内施用亲水 性生理活性物质的施用方法。
本发明的细胞膜通透性肽不仅该肽本身是细胞膜通透性的， 而且能够赋予亲水性 生理活性物质以细胞膜通透性， 因此通过在以亲水性生理活性物质为有效成分的药物组合 物中配合本发明的细胞膜通透性肽， 或者并用亲水性生理活性物质和本发明的细胞膜通透 性肽来进行施用， 可以将亲水性生理活性物质经过细胞膜输送到生物体内。 更详细地说， 本 发明的细胞膜通透性肽不仅优选能够通过粘膜细胞膜， 而且能够赋予亲水性生理活性物质 以经粘膜吸收性 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 )， 因此可以将亲水性生理活性物质经
过粘膜输送到生物体内。 亲水性生理活性物质的经粘膜吸收是指施用至粘膜的亲水性生理 活性物质通过粘膜层而转移到血液中， 其结果可以通过亲水性生理活性物质的血中浓度的 上升或药理活性的表达来确认。 亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等 本领域技术人员通常使用的方法来测定。 关于药理活性， 例如， 在酶的情况下可以以其酶活性为指标来测定， 在作用于细胞受体的物质的情况下， 可以以改变靶标细胞的功能或标记 物质的产生量的能力等为指标来测定。 例如， 在胰岛素的药理活性的情况下， 可以以施用的 动物的血中葡萄糖浓度为指标来测定。
作为能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性、 优选为经粘膜吸收性的细胞 膜通透性肽， 只要是上述本发明的细胞膜通透性肽即可， 不特别限定， 具体可列举包含序列 号 1 所示氨基酸序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱 性氨基酸的 1 ～ 7 个、 优选为 1 ～ 5 个、 更优选为 1 ～ 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。特别是作为赋予亲水性生理活性物质以鼻腔吸收性、 优选 用于经鼻施用的药物组合物的本发明的细胞膜通透性肽， 可列举包含序列号 1 所示氨基酸 序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。表 1 显示赋予亲水性生 理活性物质以鼻腔吸收性的本发明的细胞膜通透性肽的具体例， 该肽是使序列号 1 所示氨 基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的变构肽， 并且具有细胞膜 通透性。此外， 在变构肽中序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基 酸的情况下， 由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最可容许。
表1
作为包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基 酸的氨基酸序列、 且具有亲水性生理活性物质的经粘膜吸收性的肽的优选例， 可列举包含
序列号 4、 序列号 9、 序列号 10 的任一者所示氨基酸序列的肽， 特别作为具有亲水性生理活 性物质的经鼻吸收性的肽的优选例， 可列举包含序列号 9 或 10 所示氨基酸序列的肽。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的序列表示的变构肽， 且能 使亲水性生理活性物质经粘膜吸收。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异的序列中， 优选 保存原来的氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的 排列。而且， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨 基酸被替换成其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因而是最可容许的差异。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含用在序 列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的 反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 包含用在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向 序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的肽， 并且能使亲水性 生理活性物质经粘膜吸收。 亲水性生理活性物质是指具有亲水性的特征的生理活性物质。 亲水性是指对水的 溶解度高， 这里将在每 1ml 水中溶解 1μg 以上的物质定义为亲水性。另外， 生理活性物质 是指作用于生物体而给生物体带来变化的所有物质， 可例示与特定的细胞受体结合的蛋白 质、 与生物体内的物质具有亲和性的酶， 还可以是与生物体内物质不发生直接反应的物质， 例如， 代替血浆用于增血用途的葡聚糖等， 还可以是可作为医疗用途施用至生物体的物质。 优选为细胞膜、 经粘膜构成细胞层等生物体屏障的通透性缺乏的肽、 蛋白质或核酸， 更优选 为肽或蛋白质。 另外， 这些作为亲水性生理活性物质的蛋白质与糖链结合而成的糖蛋白质、 进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生物蛋白质也适合作为亲水性生理活性物质使 用。
对亲水性生理活性物质的分子量不特别限定， 在通过细胞膜方面如果分子量过大 则有时成为障碍， 因而分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
作为亲水性生理活性物质的具体例， 可列举甲状旁腺激素 (PTH)、 降钙素、 胰岛素、 血管紧张素、 胰高血糖素、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4、 胃泌素、 生长激素、 促乳 素 ( 黄体化激素 )、 促性腺激素、 亲细胞激素、 促肾上腺皮质激素、 促黑素细胞激素、 加压素、 催产素、 普罗瑞林、 黄体形成激素 (LH)、 促肾上腺皮质激素、 生长素、 促甲状腺激素、 促生长 素抑制素 ( 促生长激素因子 )、 下丘脑激素 (GnRH)、 G-CSF、 促红细胞生成素、 HGF、 EGF、 VEGF、 血管生成素、 α- 干扰素、 β- 干扰素、 γ- 干扰素、 白介素类、 超氧化物歧化酶 (SOD)、 尿激 酶、 溶菌酶、 疫苗等作为优选例， 更优选为胰岛素、 降钙素、 甲状旁腺激素、 生长激素、 干扰素 类、 白介素类、 G-CSF、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4。
在本发明中， 一种优选方式是细胞膜通过性肽与亲水性生理活性物质形成结合
物。这里所谓 “结合物” 是指 2 种以上物质能够同时运动的状态， 包括上述物质之间通过共 价键结合而得的产物、 通过离子键静电结合而得的产物、 以及即使不存在结合时也由于立 体结构而一者限制另一者的运动从而处于共同运动的状态的产物。例如， 在将本发明的肽 修饰于表面而得的胶束、 脂质体、 高分子等微粒中封入生物学活性的药物而得的产物也包 含在形成 “结合物” 的范畴中。例如， 本发明的肽与亲水性生理活性物质通过共价键连接而 成的产物。例如， 作为亲水性生理活性物质的蛋白质的氨基、 羧基和 / 或半胱氨酸所具有的 硫醇基与本发明的细胞膜通过性肽通过共价键结合而得的药物组合物。
在将细胞膜通透性肽和作为亲水性生理活性物质的蛋白质制成结合物的情况下， 可以作为融合蛋白质而制成。作为添加本发明的细胞膜通透性肽的位置不限于特别场所， 优选具有细胞膜通过性的肽位于蛋白质的外侧、 且对融合而得的蛋白质的活性、 功能的影 响低， 优选融合于 N 末端或 C 末端。作为融合的蛋白质的种类不特别限定， 但分子量过大的 药物会成为通过细胞膜的障碍， 因此分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
在制造与细胞膜通过性肽的融合蛋白质时， 可以通过一般的化学合成法来进行。 例如， 将本发明的细胞膜通过性肽与胰岛素混合并添加缩合剂使其结合的方法， 使用肽合 成装置 ( 例如 Applied Biosystems Medel 433) 的方法。另外还可以基于碱基序列信息使 用基因工程学的方法通过常规方法来制造。例如， 在具有蛋白表达启动子的基因表达载体 中插入编码本发明的细胞膜通过性肽和融合的蛋白质的碱基序列来制造的方法。 另外， 在本发明中， 细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质在各自不以共价键连 接的状态下使用也是一种优选方式。在施用本发明的药物组合物时， 即使细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质不通过共价键而形成结合物， 也可以由于在施用后细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质被混合， 通过离子键和 / 或疏水作用、 电荷作用， 从而肽与亲水性生 理活性物质形成结合物， 从而获得目标效果。 特别是在这种情况下， 不需要对亲水性生理活 性物质的直接修饰， 因此对亲水性生理活性物质本来所具有的生理活性效果没有影响， 因 此是优选的。
在本发明中， 对能够经粘膜吸收亲水性生理活性物质的粘膜不特别限定， 例如， 眼 睛、 鼻腔、 舌下、 肺、 口腔、 皮肤、 阴道、 肠道的粘膜， 优选为鼻腔或肠道的粘膜。另外， 对于通 过本发明使亲水性生理活性物质经粘膜吸收时的施用方法也不特别限定。可列举经口、 经 鼻、 经肠道、 经皮、 注射施用， 优选为经口、 经鼻或经肠道施用。
在本发明中， 将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至生物体时的施用 量、 施用次数可以根据亲水性生理活性物质、 施用方式、 患者的年龄、 体重、 症状的严重程度 来适宜选择， 通常可以以成人每 1 天作为亲水性生理活性物质含量为 0.01 ～ 50mg、 优选为 0.1 ～ 20mg 的范围施用。此时， 对于细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的配合比率不 特别限定， 优选根据配合的亲水性生理活性物质的种类、 细胞膜通透性肽和亲水性生理活 性物质的配合状态来确定， 为了赋予亲水性生理活性物质以充分的作用， 在任一种配合状 态中都优选使用相对于作用的亲水性生理活性物质的摩尔量为 1 倍以上的细胞膜通透性 肽， 更优选使用 2 倍以上的细胞膜通透性肽。这在细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质 以共价键形成结合物的情况下， 表示亲水性生理活性物质各自结合了 1 个以上的细胞膜通 透性肽的状态 ； 在以独立的状态使用的情况下， 表示如果设所用的亲水性生理活性物质的 摩尔量为 1， 则以含有 1 以上的摩尔量的细胞膜通透性肽的状态作用。
在本发明中， 对将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至动物 ( 包括人 ) 的情况下的具体方式没有制限。 例如， 可以直接施用干燥状态的物质或溶液状的物质， 或者 可以与赋形剂一起填充到胶囊中施用， 还可以将干燥状态的物质暂时溶解分散到水中然后 施用。
本发明的药物组合物， 可列举除了细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质以外还 包含可药用的添加剂的粉末形态， 或者包含与水等介质和除该介质以外的可药用的基剂的 混合物等的液状形态， 以及通过与可药用的基剂组合来固体化或半固体化的形态等。作为 所述基剂， 可列举作为制剂原料惯用的各种有机或无机物质， 例如赋形剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂、 溶剂、 溶解助剂、 悬浮剂、 等渗剂、 缓冲剂、 镇痛剂、 吸收促进剂等。例如， 可列举水、 可药用的有机溶剂、 胶原、 聚乙二醇、 聚乙烯基吡咯烷酮、 羧基乙烯基聚合物、 羧甲基纤维素 钠、 聚丙烯酸钠、 藻酸钠、 水溶性葡聚糖、 羧甲基淀粉钠、 果胶、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 黄 原酸胶、 阿拉伯树胶、 酪蛋白、 明胶、 琼脂、 双甘油、 丙二醇、 聚乙二醇、 凡士林、 石蜡、 硬脂醇、 硬脂酸、 人血清白蛋白 (HSA)、 甘露糖醇、 山梨糖醇、 乳糖、 作为医药添加剂可容许的表面活 性剂等。
另外， 不仅是单纯的添加剂， 还优选与高度的输送技术并用。例如为了通过经口 施用将本发明的药物组合物输送到肠道， 制成包含在肠溶性的胶囊、 粘膜附着性的羟丙基 纤维素和 / 或智能水凝胶聚乙二醇接枝聚甲基丙烯酸 (poly(methacrylic acid)grafted with poly(ethylene glycol)P(MAA-g-EG)) 等中的药物组合物， 在避免消化酶造成的肽和 药物的分解方面是优选的。 实施例
实施例 1 ： 肽向细胞内转移的转移性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入 含有终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス 社合成 )、 和终浓度 10％的 FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mMEDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的肽分解。 对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置 (HORIBA FLUOROMAX-3) 以激发波长 494nm、 荧 光波长 512nm 测定测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 1。各个值显示连续 3 次 进行的评价的平均值和标准误差。序列号 6 的随机肽基本不被摄入细胞中， 即不是细胞膜 通透性肽， 与此相对， 作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的荧光素标记体以序列号 6 的随 机肽的 10 倍以上的效率被摄入细胞内。
实施例 2 ： 促进胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入包
含终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス社 合成 )、 和含罗丹明标记人胰岛素 ( 终浓度 100μg/ml) 的 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。 用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的 溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保 温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素分解。对分解溶液回收总量， 用荧光 强度测定装置以激发波长 555nm、 荧光波长 580nm 测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素 量。
另外， 用同样的方法在 HeLa 细胞中加入含罗丹明标记人胰岛素和序列号 1 ～ 6 所 示的肽的溶液并保温， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基 300μl 洗涤 3 次， 用 4％低聚甲醛 溶液固定 3 小时， 用 300μl 的 PBS 洗涤 3 次。然后用 5％ DiD’ Oil 溶液 ( モルキユラ一プ ロ一ブ社 ) 保温一夜， 用激光共聚焦显微镜 ( オリンパス社 FV-1000) 观察罗丹明标记胰岛 素的存在位置。
罗丹明标记胰岛素用以下方法制作。将 20mg 的人胰岛素溶解在 0.5ml 的 0.1N 盐 酸中， 然后加入 3ml 的 PBS 和 0.5ml 的 0.1N 氢氧化钠进行中和。 将产物用脱盐柱 (PD-10 柱 ) 进行溶液置换， 得到 50mM NaHCO3 溶液 5ml( 胰岛素浓度 4mg/ml)。 向其中添加溶解于 0.5ml DMSO 的 4mg 的 NHS- 罗丹明 ( ピアス社 )， 在室温反应整夜。 加入 1M Tris-HCl(pH8)0.5ml 进 一步在室温反应 30 分钟， 然后使用 PD-10 柱对水进行脱盐， 再加入水， 得到最终量 10ml( 胰 岛素浓度为 2mg/ml) 的溶液。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 2。各个值显 示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加罗丹明标记胰岛素、 或将罗丹明标 记胰岛素与具有序列号 6 的随机序列的肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入细胞 中， 与此相对， 添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 与使用作为随机肽的 序列号 6 的肽的情况相比， 罗丹明标记胰岛素以 50 倍以上的效率被摄入细胞内。
另外， 将序列号 1 ～ 6 的肽分别与罗丹明标记胰岛素一起添加时的激光共聚焦显 微镜观察结果示于图 12。 确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽不使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部， 与此相对， 序列号 1 ～ 5 的本发明的细胞膜通透性肽使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部。
实施例 3 ： 促进聚苯乙烯珠向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入含 有终浓度 1μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 所示的肽 ( 委托シグマジエノシ ス社合成 )、 终浓度 1μl/ 孔的荧光聚苯乙烯珠 ( モルキユラ一プロ一ブ制 Fluorospheres Carboxylated Microbeads 0.1μm)、 和 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保 温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞 分解。对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置以激发波长 580nm、 荧光波长 605nm 测定 被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量。< 结果 >
被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量相对于各孔中的添加量示于图 3。各个值显示 连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加荧光聚苯乙烯珠、 或将荧光聚苯乙烯 珠与不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入 细胞中， 与此相对， 在添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 回收到添加量 的 0.7％以上的荧光聚苯乙烯珠。
实施例 4 ： 胰岛素的经鼻施用
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 溶解 在 0.1N HCl 中， 然后加入等量的 0.1N NaOH 制作胰岛素溶液。将单独的胰岛素溶液， 或者 将全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中并 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混 合溶液。对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥 50mg/kg 来进行麻醉， 然后将颈部切开露出气管。将聚乙烯管 (INTRAMEDICPE205， Clay Adams) 插入 气管， 接着将食道部分切开， 将相同直径的管从食道的切开部向后鼻孔小心地插入， 避免损 伤组织。将向后鼻孔插入的管的前端预先用脱脂棉和粘结剂密封。为了防止药液泄漏， 将 开口于口腔的上腭部的鼻腭管用合成粘结剂 ( 第一三共株式会社制 “アロンアルフア A” ) 封闭。然后施用制备的胰岛素和肽的混合液、 或仅胰岛素， 在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180、 240 分钟后由颈静脉采血 0.25ml， 使用血糖值测定装置 “ノボアシストプラ ス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离而分离出血浆， 用 EIA 试剂盒 ( レビ ス社 ) 测定血浆中胰岛素浓度。生物学的利用能 ( 生物利用率 ) 通过与胰岛素皮下施用时 的比较来计算出。
< 结果 >
图 4 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 5 显示血中胰岛素浓度变化。 各个值显 示连续 3 次或连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用胰岛素的大鼠中几 乎未发现血中的胰岛素浓度上升， 与此相对， 在与胰岛素一起施用序列号 1 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之后开始胰岛素向血中转移。 另外也发现了作为伴随胰岛素向血中转移的 药理活性的血糖值下降， 确认了与血中的胰岛素浓度相对应的血糖值下降。
实施例 5 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法调制胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者将全氨基酸序 列为 L 型的序列号 1、 序列号 7( 寡聚精氨酸 ) 或序列号 8( 穿膜肽 (penetratin)) 的肽 ( 委 托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制 备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。将各个混合溶液用与实施例 4 所记 载的相同的方法施用至大鼠， 经时地采血、 测定， 测定血浆中的胰岛素浓度， 通过与胰岛素 皮下施用时的比较来计算出生物学的利用能 ( 生物利用率 )。
< 结果 >
图 6 显示连续 3 次进行的评价中的施用单独的胰岛素、 或序列号 1、 7 或 8 的肽与 胰岛素的混合液时的生物利用率的平均值和标准误差。具有序列号 1 所示氨基酸序列的本发明的细胞膜通透性肽相对于序列号 7 或 8 的已知细胞膜通透性肽， 显示显著高的生物利 用率。
实施例 6 ： β- 干扰素的经鼻施用
< 方法 >
在冰冷下， 在人天然型 β- 干扰素 ( 东レ株式会社制 “フエロン” ) 中加入添加有 吐温 20 的 PBS 1ml， 制成 6,000,000IU/ml， 分取该溶液 100μl， 加入添加有吐温 20 的 PBS 566μl 制成 900,000IU/ml 溶液。将单独的 β- 干扰素， 或者全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述 β- 干扰素溶液合并， 6 在各个施用实验中制备 β- 干扰素 (0.18×10 IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用 与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。血浆中 β- 干扰素浓度通过 “人 β- 干扰素 ELISA 试剂盒” ( 株式会社镰仓テクノサイエンス ) 来测定。
< 结果 >
图 7 显示施用后的血浆中 β- 干扰素浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评价 的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了 β- 干扰素的大鼠中， 血中的 β- 干扰素浓度上升 低， 与此相对， 在与 β- 干扰素一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之 后开始 β- 干扰素向血中转移。 实施例 7 ： 艾塞那肽 -4 的经鼻施用
< 方法 >
将单独的艾塞那肽 -4( 委托シグマジエノシス社合成 )， 或者全氨基酸序列为 L 型 的序列号 1 或序列号 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述艾塞那 肽 -4 溶液合并， 在各个施用实验中， 制备艾塞那肽 -4(0.25mg/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。对于血浆中艾塞那肽 -4 浓度， 以抗艾塞那肽 -4 单克隆抗体为固相， 将生物素标记抗艾塞那肽 -4 多克隆抗体抗体和链霉 抗生物素蛋白 -HRP 用于检测， 通过夹心法 ELISA( 酶免疫测定法 ) 进行测定。
< 结果 >
图 8 显示施用后的血浆中艾塞那肽 -4 浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评 价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了艾塞那肽 -4 的大鼠中， 几乎未发现血中的艾塞那 肽 -4 浓度上升， 与此相对， 在与艾塞那肽 -4 一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现 从刚刚施用之后开始艾塞那肽 -4 向血中转移。
实施例 8 ： 胰岛素的肠道施用
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素溶液。将单独的胰岛素， 或者全氨基酸序列 为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (50IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 500μl 混合溶液。 对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥钠 50mg/kg 来进 行麻醉， 然后沿正中线进行开腹， 露出肠道。从距离回盲接合部 2-3cm 回肠的部分插入硅 管， 从其上部约 10cm 的部分插入探头， 进一步在内侧 6cm 的部分通入缝合线。从探头以流 速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 pH 值 7.4 的磷酸生理缓冲液 (PBS)20ml， 使内容物排 出， 然后在硅管加塞， 从探头施用预先加热至 37℃的 PBS 1ml， 使其停留 30 分钟。施用后迅
速给探头加塞， 并将肠道送回腹腔内将切开部用线夹封闭使其安静。 停留后， 拔出探头和硅 管的塞， 向回路内以流速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 PBS 20ml 使内容物排出， 然后将 预先通入缝合线的 6cm 的部分结扎并制成回路。向该回路内单独施用胰岛素溶液， 或者施 用胰岛素和序列号 1 或序列号 4 的肽混合溶液 0.5ml， 将肠道送回腹腔内， 将切开部用线夹 封闭使其安静。 实验中的大鼠以背位固定在通过温水循环泵加热至 37℃的电热板上来进行 体温调节。在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180 分钟后从颈静脉采血 0.25ml， 使用 血糖值测定装置 “ノボアシストプラス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离 而分离成血浆， 通过酶免疫测定法定量胰岛素浓度。对于仅将等量的胰岛素溶液施用至皮 下的大鼠， 也同样地进行采血、 测定。
< 结果 >
图 9 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 10 显示血中胰岛素浓度变化。各个值 显示连续 3 次～连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。确认了与对照的单独施用胰岛 素时相比， 通过将序列号 1 或 4 的肽与胰岛素并用施用， 血中胰岛素浓度明显上升， 而且血 糖值明显降低 ( 图 9 和图 10)。
实施例 9 ： 鼻腔伤害性评价 < 方法 >
用于实施例 4 同样的方法将单独的胰岛素、 或胰岛素与序列号 1 的肽、 或 5％ (w/ v) 的牛磺脱氧胆酸溶液鼻腔施用。15 分钟， 用 10ml 的加热至 37℃的 PBS 以 2ml/ 分钟洗涤 鼻腔。对洗涤溶液进行回收， 用 LDH 活性测定试剂盒 (Pointe scientific 社 ) 测定泄漏到 溶液中的 LDH 活性。
< 结果 >
图 11 显示洗涤溶液的 LDH 活性。各个值显示连续 3 次进行的评价的平均值和标 准误差。 与 5％牛磺脱氧胆酸钠相比， 从施用了序列号 1 的肽和胰岛素混合溶液的小鼠鼻腔 的 LDH 释放显著较低， 与施用了 PBS、 单独的胰岛素的情况下相同程度地低。
实施例 10 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 2
< 方法 >
除了使用序列号 1、 6、 9 ～ 11 的氨基末端未标记肽 ( 委托シグマジエノシス社合 成 ) 以外， 通过与实施例 2 同样的方法来评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。 在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛 素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 13。各个值 显示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在将确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 或 11 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 仅添加量的 0.05％以下的罗丹明标记胰岛素 被摄入细胞中， 与此相对， 一起添加了作为本发明的细胞膜通透性肽的序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽的情况下， 添加的罗丹明标记胰岛素的 0.7％以上被摄入细胞中。
实施例 11 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者全氨基酸序列
为 L 型的序列号 1、 9、 10 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。 将 各个混合溶液用于实施例 4 所记载的相同的方法施用至大鼠， 经时地进行采血、 测定， 测定 血浆中的胰岛素浓度， 以血中浓度 (μU/ml) 和时间 ( 分钟 ) 的变化为基础计算出 AUC( 药 物血中浓度 - 时间曲线下面积 )。
< 结果 >
图 14 显示在连续 3 次或连续 6 次进行的评价中， 单独施用胰岛素、 和施用序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽与胰岛素的混合液的情况下的 AUC 的平均值和标准误差。在将序列 号 1、 9、 10 的细胞膜通透性肽与胰岛素并用施用的情况下， 相对于单独施用胰岛素的情况， 显示显著较高的胰岛素的鼻腔吸收性。
实施例 12 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 3
< 方法 >
使用与实施例 2 同样的方法， 使用序列号 6、 12 ～ 30 的氨基末端被荧光素标记的 肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 )， 评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置来测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰 岛素量。另外， 用与实施例 1 同样的方法测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 15。 各个值显示连续 2 次 进行的评价的平均值和标准误差。添加了具有序列号 6 所示的随机序列的肽的情况下， 仅 添加的荧光素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在序列号 12 ～ 30 所示的本发明的 细胞膜通透性肽的情况下， 均有 0.8％以上被摄入细胞内。
另外， 被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 16。各 个值显示连续 2 次进行的评价的平均值和标准误差。在不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的 随机肽的情况下， 仅添加的罗丹明标记胰岛素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在 一起添加了序列号 12 ～ 30 的本发明的细胞膜通透性肽的情况下， 均有 1％以上被摄入细胞 内。
产业可利用性
通过本发明， 到目前为止困难的亲水性生理活性物质的细胞内导入变得容易， 可 以期待新的医疗技术的展开。具体来说， 通过本发明的细胞膜通透性肽可获得能够将亲水 性生理活性物质经粘膜施用的制剂， 因此可以大幅改善现有的包含亲水性生理活性物质的 制剂 ( 例如， 注射剂 ) 给患者带来的苦痛、 不便， 从而不仅能够实现医疗现场的以患者为本 的医疗， 而且可以从根本上改变到目前为止的亲水性生理活性物质制剂的概念， 实现划时 代的制剂创制。
序列表自由文字
序列号 1 ～ 5 本发明的细胞膜通透性肽
序列号 6 随机肽
序列号 7 寡聚精氨酸
序列号 8 穿膜肽 (penetratin)
序列号 9 ～ 10 本发明的细胞膜通透性肽序列号 11 随机肽 2 序列号 12 ～ 30 本发明的细胞膜通透性肽18102428096 A CN 102428102
序列表1/12 页
19102428096 A CN 102428102序列表2/12 页
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发明所要解决的课题 本发明的课题是提供能够使亲水性生理活性物质转移到细胞内的新的细胞膜通透性肽。 用于解决课题的方法
本发明者们探索具有细胞膜通透性的肽序列， 发现了作为目标的具有细胞膜通透 性的新的肽序列。即， 本发明具有如下构成。
(1) 以下 (A) ～ (D) 的任一项所述的细胞膜通透性肽 ：
(A) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ；
(B) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(C) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个氨基酸 的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽 ；
(D) 包含用 (A) ～ (C) 的任一项所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列， 在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基 酸序列， 或者在用 (A) 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 ～ 5 个 氨基酸的氨基酸序列， 且具有细胞膜通透性的肽。
(2) 根据 (1) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (B) 的肽包含序列号 2 ～ 4、 9～ 10、 13 的任一者所示氨基酸序列。
(3) 根据 (1) 或 (2) 所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (C) 的肽包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列。
(4) 根据 (1) ～ (3) 的任一项所述的细胞膜通透性肽， 其中， 所述 (D) 的肽包含序 列号 5 或 14 所示氨基酸序列。
(5) 一种药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性 生理活性物质。
(6) 一种用于经口施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(7) 一种用于经鼻施用的药物组合物， 其包含 (1) ～ (4) 的任一项所述的细胞膜通 透性肽和亲水性生理活性物质。
(8) 根据 (5) ～ (7) 的任一项所述的药物组合物， 其中， 亲水性生理活性物质是肽、 蛋白质或核酸。
发明的效果
根据本发明， 使亲水性生理活性物质能够高效地向细胞内转移， 从而可以实现以 细胞内的分子为靶标的新的药物治疗。另外， 可以将到目前为止仅能通过注射来施用的亲 水性生理活性物质通过经口、 经鼻施用等而非注射剂化， 从而可以实现简便且对患者温和
的药物治疗。 附图说明 图 1 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 2 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 3 是显示细胞膜通透性肽促进聚苯乙烯珠向 HeLa 细胞的转移的图。
图 4 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 5 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸 收性的图。
图 6 是通过生物利用率来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 7 是通过血浆中的 β- 干扰素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的 β- 干扰素的 经鼻吸收性的图。
图 8 是通过血浆中的艾塞那肽 -4 浓度来显示利用细胞膜通透性肽的艾塞那肽 -4 的经鼻吸收性的图。
图 9 是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸收性的图。
图 10 是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸 收性的图。
图 11 是通过 LDH 泄漏来显示细胞膜通透性肽的鼻腔障碍性的图。
图 12 是显示各细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的激光共聚焦显微 镜观察像。 各图中的 A( 左上 ) 显示罗丹明标记胰岛素的存在位置、 B( 右上 ) 显示经 DiD’ Oil 染色的细胞膜、 C( 左下 ) 显示微分干涉像、 A+B( 右下 ) 显示将 A 的像与 B 的像重叠表示的 像。
图 13 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
图 14 是通过 AUC 来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。
图 15 是显示细胞膜通透性肽向 HeLa 细胞的转移的图。
图 16 是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向 HeLa 细胞的转移的图。
具体实施方式
本发明者新发现了包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽 ( 以下也称为序列号 1 的 肽 ) 或其变构肽是细胞膜通透性肽， 从而完成了本发明。以下， 对于本发明的细胞膜通透性 肽进行详细说明。
本发明的细胞膜通透性肽的所谓细胞膜通透性， 表示通过将细胞的外部与内部隔 开的脂质膜的性质。 肽是否通过细胞膜通透性如下确认， 即， 将在该肽上连接荧光物质而得 的肽添加到细胞中， 用激光共聚焦显微镜等观察， 根据细胞内部是否能检测到荧光物质来 确认。 另外， 可以通过将摄入了连接有荧光物质的该肽的细胞进行破碎， 对破碎液使用分光 光度计来测定荧光强度， 从而定量地确认细胞内转移性。此外， 在本说明书中， 在连接了荧 光物质 ( 作为具体例是荧光素 ) 的肽向细胞内的转移量， 与连接了荧光物质的包含序列号 6 所示氨基酸序列的非细胞膜通透性的肽的细胞内转移量相比， 上升了 3 倍以上的情况下， 判断该肽是细胞膜通透性肽。另外， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的 特征。 此外， 在本说明书中， 在使经荧光标记的亲水性生理活性物质与肽连接或混合而与细 胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率， 与仅使荧光标记亲水性生理 活性物质与细胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率相比， 高 3 倍以 上的情况下， 判断该肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的特征。
而且， 本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以粘膜吸收性 ( 优 选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 的特征。具体来说， 对于单独难以经过粘膜而被摄入生物 体内的亲水性生理活性物质来说， 如果使细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质连接或混 合而得的产物与粘膜组织 ( 优选为肠道组织或鼻腔组织 ) 接触， 则亲水性生理活性物质的 经粘膜吸收 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 ) 被促进。
包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽是通过细胞膜通透性肽的筛选而发现的新的 肽。 对该肽所通过的细胞的种类不特别限制， 可以是原核细胞也可以是真核细胞， 但优选为 真核细胞， 更优选可以通过哺乳类细胞的细胞膜， 进一步优选可以通过哺乳类的粘膜细胞 膜。 另外， 该肽不仅其本身是细胞膜通透性的， 而且可以通过使该肽与亲水性生理活性物质 共价结合来赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性， 优选是即使在该肽与亲水性生理活 性物质分别独立存在的组合物的状态下也能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性 的肽。 另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数 个碱性氨基酸的氨基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜 通透性肽。 这里所谓碱性氨基酸， 是指精氨酸、 赖氨酸、 组氨酸的任一氨基酸。 替换、 缺失、 插 入或添加的碱性氨基酸的数优选为 1 ～ 7 个， 更优选为 1 ～ 5 个， 进一步优选为 1 ～ 3 个， 特 别优选为 1 个。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异了的氨基酸序列中， 优选保存原来的 氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换为其他碱性氨基酸的变构肽的情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此是最能容许的改变。作为包含 在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列， 且 具有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 2 ～ 4、 9 ～ 10、 13 的任一者所示氨基 酸序列的肽。
另外， 对于包含在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱 性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的氨 基酸序列的变构肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜通透性肽。 此外， 在 通过序列号 1 所示氨基酸的替换、 缺失、 插入或添加而获得的变构肽中， 优选保存原来的氨 基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的排列。另外， 在 序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨基酸被替换成 其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由于替换成具有 同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最能容许。作为包含在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列， 且具 有细胞膜通透性的肽的优选例， 可列举包含序列号 12、 15 ～ 30 的任一者所示氨基酸序列的 肽。
另外， 对于包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序 列的肽， 或包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性 氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸 序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 或 者包含用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨 基酸序列的反向序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨 基酸序列的肽， 在具有细胞膜通透性的范围内也都是本发明的细胞膜通透性肽。这里所谓 包含反向序列的肽， 表示构成的氨基酸的排列相反， 例如， 当从 N 末端向 C 末端的氨基酸序 列的排列为精氨酸、 谷氨酰胺、 异亮氨酸、 赖氨酸时， 其反向肽是指从 N 末端向 C 末端的氨基 酸序列的排列为赖氨酸、 异亮氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸的肽。 作为本具体例， 可列举作为包含 用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列且具有细胞膜通透性 的肽的、 包含序列号 5 或 14 所示氨基酸序列的肽。
构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸除了作为天然存在的氨基酸的构型为 L 型的氨基酸之外， 还可以使用将天然氨基酸的结构进行部分改变而得的衍生物等非天然氨 基酸。例如， 构型为 D 型的氨基酸由于不易受到蛋白分解酶的分解而可以有效地使用， 因此 该肽的氨基酸序列中的一部分氨基酸可以是 D 型。 另外， 构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸无论是否在自然界存在， 只要是具 有羧基和氨基的分子即可， 也可以是经过羟基化、 磷氧化、 或糖基化等生物体内常见的翻 译后修饰的氨基酸， 优选为包含哺乳类细胞内通常存在的天然氨基酸及其光学异构体的 序列， 例如， 包含精氨酸 (Arg)、 赖氨酸 (Lys)、 天冬氨酸 (Asp)、 天冬酰胺 (Asn)、 谷氨酸 (Glu)、 谷氨酰胺 (Gln)、 组氨酸 (His)、 脯氨酸 (Pro)、 酪氨酸 (Tyr)、 色氨酸 (Trp)、 丝氨酸 (Ser)、 苏氨酸 (Thr)、 甘氨酸 (Gly)、 丙氨酸 (Ala)、 蛋氨酸 (Met)、 半胱氨酸 (Cys)、 苯丙氨酸 (Phe)、 亮氨酸 (Leu)、 缬氨酸 (Val)、 异亮氨酸 (Ile) 等的氨基酸序列。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过本领域技术人员公知的方法进行适宜修饰， 具 体可以是经过糖链修饰或荧光标记、 聚乙二醇 (PEG) 化或 N 末端的乙酰化或 C 末端的酰胺 化等化学修饰的衍生物。其中， 在将本发明的细胞膜通透性肽用于后述的药物组合物的情 况下， 该肽优选不被修饰。另外， 本发明的细胞膜通透性肽可以是线状的也可以是环状的。
本发明的细胞膜通透性肽可以通过与其他公知的细胞膜通透性肽并用来利用。 另 外， 本发明的细胞膜通透性肽在具有细胞膜通透性的范围内， 可以通过后述的方法以该肽 与其他肽或蛋白质融合而成的融合肽或融合蛋白质的状态来利用。
本发明的细胞膜通过性肽可以通过一般的化学合成法来制造。 制造的方法包括通 常的利用液相法和固相法的肽合成法。所述肽合成法更详细地说包括 ： 基于氨基酸序列信 息将各氨基酸 1 个 1 个依次结合而使链延伸的逐步延伸法 ； 预先合成包含数个氨基酸的片 段， 接着使各片段进行连接反应的片段缩合法。本发明的细胞膜通过性肽可以通过任一种 方法来合成。
上述肽合成中所采用的缩合法也可以按照公知的各种方法来进行。作为其具体 例， 可例示例如， 叠氮化物法、 混合酸酐法、 DCC 法、 活性酯法、 氧化还原法、 DPPA( 叠氮磷酸 二苯酯 ) 法、 DCC+ 添加剂 (1- 羟基苯并三唑、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 N- 羟基 -5- 降冰片烯 -2，
3- 二甲酰亚胺等 )、 Woodward 法等。可以用于各方法的溶剂也可以从公知用于这种肽缩合 反应的一般溶剂中适宜选择。作为其例子， 可列举例如， 二甲基甲酰胺 (DMF)、 二甲基亚砜 (DMSO)、 六甲基磷酰胺、 二
烷、 四氢呋喃 (THF)、 乙酸乙酯等或它们的混合溶剂等。上述肽合成反应时， 不参与反应的氨基酸、 肽中的羧基一般可以通过酯化而形成 例如甲酯、 乙酯、 叔丁酯等低级烷基酯、 例如苄基酯、 对甲氧基苄基酯、 对硝基苄基酯等芳烷 基酯等进行保护。另外， 侧链具有官能基的氨基酸、 例如 Tyr 的羟基可以用乙酰基、 苄基、 苄 基氧基羰基、 叔丁基等进行保护， 但不是必须进行该保护。另外， 例如 Arg 的胍基可以通过 硝基、 甲苯磺酰基、 2- 甲氧基苯磺酰基、 亚甲基 -2- 磺酰基、 苄基氧基羰基、 异冰片基氧基羰 基、 金刚烷基氧基羰基等适当的保护基进行保护。具有上述保护基的氨基酸、 肽和最终得 到的本发明的肽中的这些保护基的脱保护反应也可以按照惯用方法、 例如接触还原法、 和/ 或使用液氨 / 钠、 氟化氢、 溴化氢、 氯化氢、 三氟乙酸、 乙酸、 甲酸、 甲磺酸等的方法来实施。
此外， 本发明的细胞膜通过性肽可以使用基因工程学方法通过常规方法来制备。 这样得到的本发明的细胞膜通过性肽可以按照通常的方法， 例如通过离子交换树脂法、 分 配色谱法、 凝胶色谱法、 亲和色谱法、 高速液相色谱法 (HPLC)、 反流分布法等肽化学领域通 用的方法适宜对其进行纯化。 此外， 本发明的细胞膜通透性肽可以以编码该肽的核酸的状态使用。 具体例如， 包 含编码融合有本发明的肽的融合蛋白质的重组核酸并能表达该肽的质粒载体、 病毒载体、 噬菌粒、 转座子等， 但不限于此。另外该重组核酸优选用于例如， 本发明的细胞膜通过性肽 或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的工业生产， 向从体内取出的生物体来源 的细胞导入编码本发明的细胞膜通过性肽的表达载体， 向体内施用本发明的细胞膜通过性 肽， 使体内细胞表达本发明的细胞膜通过性肽或融合蛋白质等。特别优选作为在生物体外 生产本发明的细胞膜通过性肽或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的方法使 用。
此外， 所述重组核酸是指人工制成的 DNA 或 RNA。该重组核酸包含使腺嘌呤、 胞嘧 啶、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 尿嘧啶等核酸结合而合成的， 切下生物所含的 DNA 或 RNA 的一部分并 除去部分碱基、 再通过与其他碱基结合等修饰而制成的， 以及将它们复制而得的。
另外， 本发明涉及含有细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的药物组合物、 或 通过并用本发明的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质来进行的向生物体内施用亲水 性生理活性物质的施用方法。
本发明的细胞膜通透性肽不仅该肽本身是细胞膜通透性的， 而且能够赋予亲水性 生理活性物质以细胞膜通透性， 因此通过在以亲水性生理活性物质为有效成分的药物组合 物中配合本发明的细胞膜通透性肽， 或者并用亲水性生理活性物质和本发明的细胞膜通透 性肽来进行施用， 可以将亲水性生理活性物质经过细胞膜输送到生物体内。 更详细地说， 本 发明的细胞膜通透性肽不仅优选能够通过粘膜细胞膜， 而且能够赋予亲水性生理活性物质 以经粘膜吸收性 ( 优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性 )， 因此可以将亲水性生理活性物质经
过粘膜输送到生物体内。 亲水性生理活性物质的经粘膜吸收是指施用至粘膜的亲水性生理 活性物质通过粘膜层而转移到血液中， 其结果可以通过亲水性生理活性物质的血中浓度的 上升或药理活性的表达来确认。 亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等 本领域技术人员通常使用的方法来测定。 关于药理活性， 例如， 在酶的情况下可以以其酶活性为指标来测定， 在作用于细胞受体的物质的情况下， 可以以改变靶标细胞的功能或标记 物质的产生量的能力等为指标来测定。 例如， 在胰岛素的药理活性的情况下， 可以以施用的 动物的血中葡萄糖浓度为指标来测定。
作为能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性、 优选为经粘膜吸收性的细胞 膜通透性肽， 只要是上述本发明的细胞膜通透性肽即可， 不特别限定， 具体可列举包含序列 号 1 所示氨基酸序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱 性氨基酸的 1 ～ 7 个、 优选为 1 ～ 5 个、 更优选为 1 ～ 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。特别是作为赋予亲水性生理活性物质以鼻腔吸收性、 优选 用于经鼻施用的药物组合物的本发明的细胞膜通透性肽， 可列举包含序列号 1 所示氨基酸 序列的肽或者下述变构肽， 所述变构肽是使序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。表 1 显示赋予亲水性生 理活性物质以鼻腔吸收性的本发明的细胞膜通透性肽的具体例， 该肽是使序列号 1 所示氨 基酸序列的碱性氨基酸的 1 或 2 个替换、 缺失、 插入或添加而得的变构肽， 并且具有细胞膜 通透性。此外， 在变构肽中序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基 酸的情况下， 由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因此最可容许。
表1
作为包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或数个碱性氨基 酸的氨基酸序列、 且具有亲水性生理活性物质的经粘膜吸收性的肽的优选例， 可列举包含
序列号 4、 序列号 9、 序列号 10 的任一者所示氨基酸序列的肽， 特别作为具有亲水性生理活 性物质的经鼻吸收性的肽的优选例， 可列举包含序列号 9 或 10 所示氨基酸序列的肽。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 用在序列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个、 优选为 1 ～ 3 个、 更优选为 1 或 2 个、 进一步优选为 1 个氨基酸的序列表示的变构肽， 且能 使亲水性生理活性物质经粘膜吸收。此外， 在通过替换、 缺失或插入而变异的序列中， 优选 保存原来的氨基酸序列的 3 个以上氨基酸连续的排列， 更优选保存 5 个以上氨基酸连续的 排列。而且， 在序列号 1 所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、 亲水性氨 基酸被替换成其他亲水性氨基酸、 疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下， 由 于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化， 因而是最可容许的差异。
另外， 下述本发明的细胞膜通透性肽也可以用于本发明的药物组合物， 所述肽是 包含用包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含用在序 列号 1 所示氨基酸序列中替换、 缺失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的 反向序列表示的氨基酸序列的肽， 包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了 1 个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽， 包含用在序列号 1 所示氨基酸 序列中替换、 缺失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的反向 序列表示的氨基酸序列的肽， 或者包含在序列号 1 所示氨基酸序列的反向序列中替换、 缺 失、 插入或添加了不限于碱性氨基酸的 1 ～ 5 个氨基酸的氨基酸序列的肽， 并且能使亲水性 生理活性物质经粘膜吸收。 亲水性生理活性物质是指具有亲水性的特征的生理活性物质。 亲水性是指对水的 溶解度高， 这里将在每 1ml 水中溶解 1μg 以上的物质定义为亲水性。另外， 生理活性物质 是指作用于生物体而给生物体带来变化的所有物质， 可例示与特定的细胞受体结合的蛋白 质、 与生物体内的物质具有亲和性的酶， 还可以是与生物体内物质不发生直接反应的物质， 例如， 代替血浆用于增血用途的葡聚糖等， 还可以是可作为医疗用途施用至生物体的物质。 优选为细胞膜、 经粘膜构成细胞层等生物体屏障的通透性缺乏的肽、 蛋白质或核酸， 更优选 为肽或蛋白质。 另外， 这些作为亲水性生理活性物质的蛋白质与糖链结合而成的糖蛋白质、 进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生物蛋白质也适合作为亲水性生理活性物质使 用。
对亲水性生理活性物质的分子量不特别限定， 在通过细胞膜方面如果分子量过大 则有时成为障碍， 因而分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
作为亲水性生理活性物质的具体例， 可列举甲状旁腺激素 (PTH)、 降钙素、 胰岛素、 血管紧张素、 胰高血糖素、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4、 胃泌素、 生长激素、 促乳 素 ( 黄体化激素 )、 促性腺激素、 亲细胞激素、 促肾上腺皮质激素、 促黑素细胞激素、 加压素、 催产素、 普罗瑞林、 黄体形成激素 (LH)、 促肾上腺皮质激素、 生长素、 促甲状腺激素、 促生长 素抑制素 ( 促生长激素因子 )、 下丘脑激素 (GnRH)、 G-CSF、 促红细胞生成素、 HGF、 EGF、 VEGF、 血管生成素、 α- 干扰素、 β- 干扰素、 γ- 干扰素、 白介素类、 超氧化物歧化酶 (SOD)、 尿激 酶、 溶菌酶、 疫苗等作为优选例， 更优选为胰岛素、 降钙素、 甲状旁腺激素、 生长激素、 干扰素 类、 白介素类、 G-CSF、 胰高血糖素样肽 (GLP-1)、 艾塞那肽 -4。
在本发明中， 一种优选方式是细胞膜通过性肽与亲水性生理活性物质形成结合
物。这里所谓 “结合物” 是指 2 种以上物质能够同时运动的状态， 包括上述物质之间通过共 价键结合而得的产物、 通过离子键静电结合而得的产物、 以及即使不存在结合时也由于立 体结构而一者限制另一者的运动从而处于共同运动的状态的产物。例如， 在将本发明的肽 修饰于表面而得的胶束、 脂质体、 高分子等微粒中封入生物学活性的药物而得的产物也包 含在形成 “结合物” 的范畴中。例如， 本发明的肽与亲水性生理活性物质通过共价键连接而 成的产物。例如， 作为亲水性生理活性物质的蛋白质的氨基、 羧基和 / 或半胱氨酸所具有的 硫醇基与本发明的细胞膜通过性肽通过共价键结合而得的药物组合物。
在将细胞膜通透性肽和作为亲水性生理活性物质的蛋白质制成结合物的情况下， 可以作为融合蛋白质而制成。作为添加本发明的细胞膜通透性肽的位置不限于特别场所， 优选具有细胞膜通过性的肽位于蛋白质的外侧、 且对融合而得的蛋白质的活性、 功能的影 响低， 优选融合于 N 末端或 C 末端。作为融合的蛋白质的种类不特别限定， 但分子量过大的 药物会成为通过细胞膜的障碍， 因此分子量优选为 500,000 以下， 更优选为 30,000 以下。
在制造与细胞膜通过性肽的融合蛋白质时， 可以通过一般的化学合成法来进行。 例如， 将本发明的细胞膜通过性肽与胰岛素混合并添加缩合剂使其结合的方法， 使用肽合 成装置 ( 例如 Applied Biosystems Medel 433) 的方法。另外还可以基于碱基序列信息使 用基因工程学的方法通过常规方法来制造。例如， 在具有蛋白表达启动子的基因表达载体 中插入编码本发明的细胞膜通过性肽和融合的蛋白质的碱基序列来制造的方法。 另外， 在本发明中， 细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质在各自不以共价键连 接的状态下使用也是一种优选方式。在施用本发明的药物组合物时， 即使细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质不通过共价键而形成结合物， 也可以由于在施用后细胞膜通透性肽 和亲水性生理活性物质被混合， 通过离子键和 / 或疏水作用、 电荷作用， 从而肽与亲水性生 理活性物质形成结合物， 从而获得目标效果。 特别是在这种情况下， 不需要对亲水性生理活 性物质的直接修饰， 因此对亲水性生理活性物质本来所具有的生理活性效果没有影响， 因 此是优选的。
在本发明中， 对能够经粘膜吸收亲水性生理活性物质的粘膜不特别限定， 例如， 眼 睛、 鼻腔、 舌下、 肺、 口腔、 皮肤、 阴道、 肠道的粘膜， 优选为鼻腔或肠道的粘膜。另外， 对于通 过本发明使亲水性生理活性物质经粘膜吸收时的施用方法也不特别限定。可列举经口、 经 鼻、 经肠道、 经皮、 注射施用， 优选为经口、 经鼻或经肠道施用。
在本发明中， 将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至生物体时的施用 量、 施用次数可以根据亲水性生理活性物质、 施用方式、 患者的年龄、 体重、 症状的严重程度 来适宜选择， 通常可以以成人每 1 天作为亲水性生理活性物质含量为 0.01 ～ 50mg、 优选为 0.1 ～ 20mg 的范围施用。此时， 对于细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的配合比率不 特别限定， 优选根据配合的亲水性生理活性物质的种类、 细胞膜通透性肽和亲水性生理活 性物质的配合状态来确定， 为了赋予亲水性生理活性物质以充分的作用， 在任一种配合状 态中都优选使用相对于作用的亲水性生理活性物质的摩尔量为 1 倍以上的细胞膜通透性 肽， 更优选使用 2 倍以上的细胞膜通透性肽。这在细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质 以共价键形成结合物的情况下， 表示亲水性生理活性物质各自结合了 1 个以上的细胞膜通 透性肽的状态 ； 在以独立的状态使用的情况下， 表示如果设所用的亲水性生理活性物质的 摩尔量为 1， 则以含有 1 以上的摩尔量的细胞膜通透性肽的状态作用。
在本发明中， 对将亲水性生理活性物质和细胞膜通透性肽施用至动物 ( 包括人 ) 的情况下的具体方式没有制限。 例如， 可以直接施用干燥状态的物质或溶液状的物质， 或者 可以与赋形剂一起填充到胶囊中施用， 还可以将干燥状态的物质暂时溶解分散到水中然后 施用。
本发明的药物组合物， 可列举除了细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质以外还 包含可药用的添加剂的粉末形态， 或者包含与水等介质和除该介质以外的可药用的基剂的 混合物等的液状形态， 以及通过与可药用的基剂组合来固体化或半固体化的形态等。作为 所述基剂， 可列举作为制剂原料惯用的各种有机或无机物质， 例如赋形剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂、 溶剂、 溶解助剂、 悬浮剂、 等渗剂、 缓冲剂、 镇痛剂、 吸收促进剂等。例如， 可列举水、 可药用的有机溶剂、 胶原、 聚乙二醇、 聚乙烯基吡咯烷酮、 羧基乙烯基聚合物、 羧甲基纤维素 钠、 聚丙烯酸钠、 藻酸钠、 水溶性葡聚糖、 羧甲基淀粉钠、 果胶、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 黄 原酸胶、 阿拉伯树胶、 酪蛋白、 明胶、 琼脂、 双甘油、 丙二醇、 聚乙二醇、 凡士林、 石蜡、 硬脂醇、 硬脂酸、 人血清白蛋白 (HSA)、 甘露糖醇、 山梨糖醇、 乳糖、 作为医药添加剂可容许的表面活 性剂等。
另外， 不仅是单纯的添加剂， 还优选与高度的输送技术并用。例如为了通过经口 施用将本发明的药物组合物输送到肠道， 制成包含在肠溶性的胶囊、 粘膜附着性的羟丙基 纤维素和 / 或智能水凝胶聚乙二醇接枝聚甲基丙烯酸 (poly(methacrylic acid)grafted with poly(ethylene glycol)P(MAA-g-EG)) 等中的药物组合物， 在避免消化酶造成的肽和 药物的分解方面是优选的。 实施例
实施例 1 ： 肽向细胞内转移的转移性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入 含有终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス 社合成 )、 和终浓度 10％的 FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mMEDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的肽分解。 对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置 (HORIBA FLUOROMAX-3) 以激发波长 494nm、 荧 光波长 512nm 测定测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 1。各个值显示连续 3 次 进行的评价的平均值和标准误差。序列号 6 的随机肽基本不被摄入细胞中， 即不是细胞膜 通透性肽， 与此相对， 作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的荧光素标记体以序列号 6 的随 机肽的 10 倍以上的效率被摄入细胞内。
实施例 2 ： 促进胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入包
含终浓度 5μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 的肽 ( 委托シグマジエノシス社 合成 )、 和含罗丹明标记人胰岛素 ( 终浓度 100μg/ml) 的 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。 用 CO2 恒温箱保温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的 溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保 温 1 小时， 使细胞和被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素分解。对分解溶液回收总量， 用荧光 强度测定装置以激发波长 555nm、 荧光波长 580nm 测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素 量。
另外， 用同样的方法在 HeLa 细胞中加入含罗丹明标记人胰岛素和序列号 1 ～ 6 所 示的肽的溶液并保温， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基 300μl 洗涤 3 次， 用 4％低聚甲醛 溶液固定 3 小时， 用 300μl 的 PBS 洗涤 3 次。然后用 5％ DiD’ Oil 溶液 ( モルキユラ一プ ロ一ブ社 ) 保温一夜， 用激光共聚焦显微镜 ( オリンパス社 FV-1000) 观察罗丹明标记胰岛 素的存在位置。
罗丹明标记胰岛素用以下方法制作。将 20mg 的人胰岛素溶解在 0.5ml 的 0.1N 盐 酸中， 然后加入 3ml 的 PBS 和 0.5ml 的 0.1N 氢氧化钠进行中和。 将产物用脱盐柱 (PD-10 柱 ) 进行溶液置换， 得到 50mM NaHCO3 溶液 5ml( 胰岛素浓度 4mg/ml)。 向其中添加溶解于 0.5ml DMSO 的 4mg 的 NHS- 罗丹明 ( ピアス社 )， 在室温反应整夜。 加入 1M Tris-HCl(pH8)0.5ml 进 一步在室温反应 30 分钟， 然后使用 PD-10 柱对水进行脱盐， 再加入水， 得到最终量 10ml( 胰 岛素浓度为 2mg/ml) 的溶液。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 2。各个值显 示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加罗丹明标记胰岛素、 或将罗丹明标 记胰岛素与具有序列号 6 的随机序列的肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入细胞 中， 与此相对， 添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 与使用作为随机肽的 序列号 6 的肽的情况相比， 罗丹明标记胰岛素以 50 倍以上的效率被摄入细胞内。
另外， 将序列号 1 ～ 6 的肽分别与罗丹明标记胰岛素一起添加时的激光共聚焦显 微镜观察结果示于图 12。 确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽不使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部， 与此相对， 序列号 1 ～ 5 的本发明的细胞膜通透性肽使罗丹明标记 胰岛素转移到细胞内部。
实施例 3 ： 促进聚苯乙烯珠向细胞内转移的转移促进性评价
< 方法 >
将 HeLa 细胞在含 10％ FBS 的 DMEM 培养基中在 96 孔玻底板中接种 0.2ml， 在 37℃ 培养 48 ～ 72 小时， 使细胞粘附在底面上。 用 200μl 的 PBS 洗涤 3 次， 然后在各孔中加入含 有终浓度 1μM 的氨基末端被荧光素标记的序列号 1 ～ 6 所示的肽 ( 委托シグマジエノシ ス社合成 )、 终浓度 1μl/ 孔的荧光聚苯乙烯珠 ( モルキユラ一プロ一ブ制 Fluorospheres Carboxylated Microbeads 0.1μm)、 和 10％ FBS 的 DMEM 培养基 50μl。用 CO2 恒温箱保 温 3 小时， 然后用含 10％ FBS 的 DMEM 培养基洗涤 3 次， 然后加入 50μl 的溶解溶液 (10mM Tris-HCl、 5mM EDTA、 100mM NaCl、 1％ SDS、 100μg/ml 蛋白酶 K)， 在室温保温 1 小时， 使细胞 分解。对分解溶液回收总量， 用荧光强度测定装置以激发波长 580nm、 荧光波长 605nm 测定 被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量。< 结果 >
被摄入细胞中的荧光聚苯乙烯珠量相对于各孔中的添加量示于图 3。各个值显示 连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅添加荧光聚苯乙烯珠、 或将荧光聚苯乙烯 珠与不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 基本不被摄入 细胞中， 与此相对， 在添加了作为本发明的肽的序列号 1 ～ 5 的肽的情况下， 回收到添加量 的 0.7％以上的荧光聚苯乙烯珠。
实施例 4 ： 胰岛素的经鼻施用
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 溶解 在 0.1N HCl 中， 然后加入等量的 0.1N NaOH 制作胰岛素溶液。将单独的胰岛素溶液， 或者 将全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中并 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混 合溶液。对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥 50mg/kg 来进行麻醉， 然后将颈部切开露出气管。将聚乙烯管 (INTRAMEDICPE205， Clay Adams) 插入 气管， 接着将食道部分切开， 将相同直径的管从食道的切开部向后鼻孔小心地插入， 避免损 伤组织。将向后鼻孔插入的管的前端预先用脱脂棉和粘结剂密封。为了防止药液泄漏， 将 开口于口腔的上腭部的鼻腭管用合成粘结剂 ( 第一三共株式会社制 “アロンアルフア A” ) 封闭。然后施用制备的胰岛素和肽的混合液、 或仅胰岛素， 在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180、 240 分钟后由颈静脉采血 0.25ml， 使用血糖值测定装置 “ノボアシストプラ ス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离而分离出血浆， 用 EIA 试剂盒 ( レビ ス社 ) 测定血浆中胰岛素浓度。生物学的利用能 ( 生物利用率 ) 通过与胰岛素皮下施用时 的比较来计算出。
< 结果 >
图 4 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 5 显示血中胰岛素浓度变化。 各个值显 示连续 3 次或连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用胰岛素的大鼠中几 乎未发现血中的胰岛素浓度上升， 与此相对， 在与胰岛素一起施用序列号 1 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之后开始胰岛素向血中转移。 另外也发现了作为伴随胰岛素向血中转移的 药理活性的血糖值下降， 确认了与血中的胰岛素浓度相对应的血糖值下降。
实施例 5 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法调制胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者将全氨基酸序 列为 L 型的序列号 1、 序列号 7( 寡聚精氨酸 ) 或序列号 8( 穿膜肽 (penetratin)) 的肽 ( 委 托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述胰岛素溶液合并， 在各个施用实验中制 备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。将各个混合溶液用与实施例 4 所记 载的相同的方法施用至大鼠， 经时地采血、 测定， 测定血浆中的胰岛素浓度， 通过与胰岛素 皮下施用时的比较来计算出生物学的利用能 ( 生物利用率 )。
< 结果 >
图 6 显示连续 3 次进行的评价中的施用单独的胰岛素、 或序列号 1、 7 或 8 的肽与 胰岛素的混合液时的生物利用率的平均值和标准误差。具有序列号 1 所示氨基酸序列的本发明的细胞膜通透性肽相对于序列号 7 或 8 的已知细胞膜通透性肽， 显示显著高的生物利 用率。
实施例 6 ： β- 干扰素的经鼻施用
< 方法 >
在冰冷下， 在人天然型 β- 干扰素 ( 东レ株式会社制 “フエロン” ) 中加入添加有 吐温 20 的 PBS 1ml， 制成 6,000,000IU/ml， 分取该溶液 100μl， 加入添加有吐温 20 的 PBS 566μl 制成 900,000IU/ml 溶液。将单独的 β- 干扰素， 或者全氨基酸序列为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述 β- 干扰素溶液合并， 6 在各个施用实验中制备 β- 干扰素 (0.18×10 IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用 与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。血浆中 β- 干扰素浓度通过 “人 β- 干扰素 ELISA 试剂盒” ( 株式会社镰仓テクノサイエンス ) 来测定。
< 结果 >
图 7 显示施用后的血浆中 β- 干扰素浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评价 的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了 β- 干扰素的大鼠中， 血中的 β- 干扰素浓度上升 低， 与此相对， 在与 β- 干扰素一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现从刚刚施用之 后开始 β- 干扰素向血中转移。 实施例 7 ： 艾塞那肽 -4 的经鼻施用
< 方法 >
将单独的艾塞那肽 -4( 委托シグマジエノシス社合成 )， 或者全氨基酸序列为 L 型 的序列号 1 或序列号 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述艾塞那 肽 -4 溶液合并， 在各个施用实验中， 制备艾塞那肽 -4(0.25mg/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 用与实施例 4 所述的方法相同的方法进行评价。对于血浆中艾塞那肽 -4 浓度， 以抗艾塞那肽 -4 单克隆抗体为固相， 将生物素标记抗艾塞那肽 -4 多克隆抗体抗体和链霉 抗生物素蛋白 -HRP 用于检测， 通过夹心法 ELISA( 酶免疫测定法 ) 进行测定。
< 结果 >
图 8 显示施用后的血浆中艾塞那肽 -4 浓度变化。各个值显示连续 3 次进行的评 价的平均值和标准误差。在仅经鼻施用了艾塞那肽 -4 的大鼠中， 几乎未发现血中的艾塞那 肽 -4 浓度上升， 与此相对， 在与艾塞那肽 -4 一起施用了序列号 1 或 4 的肽的大鼠中， 发现 从刚刚施用之后开始艾塞那肽 -4 向血中转移。
实施例 8 ： 胰岛素的肠道施用
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素溶液。将单独的胰岛素， 或者全氨基酸序列 为 L 型的序列号 1 或 4 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (50IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 500μl 混合溶液。 对绝食 24 小时的体重约 200g 的 SD 系雄性大鼠通过腹腔内注射戊巴比妥钠 50mg/kg 来进 行麻醉， 然后沿正中线进行开腹， 露出肠道。从距离回盲接合部 2-3cm 回肠的部分插入硅 管， 从其上部约 10cm 的部分插入探头， 进一步在内侧 6cm 的部分通入缝合线。从探头以流 速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 pH 值 7.4 的磷酸生理缓冲液 (PBS)20ml， 使内容物排 出， 然后在硅管加塞， 从探头施用预先加热至 37℃的 PBS 1ml， 使其停留 30 分钟。施用后迅
速给探头加塞， 并将肠道送回腹腔内将切开部用线夹封闭使其安静。 停留后， 拔出探头和硅 管的塞， 向回路内以流速 5ml/ 分钟灌入预先加热至 37℃的 PBS 20ml 使内容物排出， 然后将 预先通入缝合线的 6cm 的部分结扎并制成回路。向该回路内单独施用胰岛素溶液， 或者施 用胰岛素和序列号 1 或序列号 4 的肽混合溶液 0.5ml， 将肠道送回腹腔内， 将切开部用线夹 封闭使其安静。 实验中的大鼠以背位固定在通过温水循环泵加热至 37℃的电热板上来进行 体温调节。在施用前和施用后 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180 分钟后从颈静脉采血 0.25ml， 使用 血糖值测定装置 “ノボアシストプラス” ( ノボ社 ) 测定血糖值。其余的血液通过离心分离 而分离成血浆， 通过酶免疫测定法定量胰岛素浓度。对于仅将等量的胰岛素溶液施用至皮 下的大鼠， 也同样地进行采血、 测定。
< 结果 >
图 9 显示施用后的血中葡萄糖浓度变化， 图 10 显示血中胰岛素浓度变化。各个值 显示连续 3 次～连续 6 次进行的评价的平均值和标准误差。确认了与对照的单独施用胰岛 素时相比， 通过将序列号 1 或 4 的肽与胰岛素并用施用， 血中胰岛素浓度明显上升， 而且血 糖值明显降低 ( 图 9 和图 10)。
实施例 9 ： 鼻腔伤害性评价 < 方法 >
用于实施例 4 同样的方法将单独的胰岛素、 或胰岛素与序列号 1 的肽、 或 5％ (w/ v) 的牛磺脱氧胆酸溶液鼻腔施用。15 分钟， 用 10ml 的加热至 37℃的 PBS 以 2ml/ 分钟洗涤 鼻腔。对洗涤溶液进行回收， 用 LDH 活性测定试剂盒 (Pointe scientific 社 ) 测定泄漏到 溶液中的 LDH 活性。
< 结果 >
图 11 显示洗涤溶液的 LDH 活性。各个值显示连续 3 次进行的评价的平均值和标 准误差。 与 5％牛磺脱氧胆酸钠相比， 从施用了序列号 1 的肽和胰岛素混合溶液的小鼠鼻腔 的 LDH 释放显著较低， 与施用了 PBS、 单独的胰岛素的情况下相同程度地低。
实施例 10 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 2
< 方法 >
除了使用序列号 1、 6、 9 ～ 11 的氨基末端未标记肽 ( 委托シグマジエノシス社合 成 ) 以外， 通过与实施例 2 同样的方法来评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。 在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛 素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 13。各个值 显示连续 3 次进行的评价的平均值和标准误差。在将确认了不是细胞膜通透性肽的序列号 6 或 11 的随机肽一起添加到细胞中的情况下， 仅添加量的 0.05％以下的罗丹明标记胰岛素 被摄入细胞中， 与此相对， 一起添加了作为本发明的细胞膜通透性肽的序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽的情况下， 添加的罗丹明标记胰岛素的 0.7％以上被摄入细胞中。
实施例 11 ： 胰岛素的经鼻施用 2
< 方法 >
用与实施例 4 同样的方法制备胰岛素， 将单独的胰岛素溶液， 或者全氨基酸序列
为 L 型的序列号 1、 9、 10 的肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解于 PBS 中， 与上述胰岛 素溶液合并， 在各个施用实验中制备胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液。 将 各个混合溶液用于实施例 4 所记载的相同的方法施用至大鼠， 经时地进行采血、 测定， 测定 血浆中的胰岛素浓度， 以血中浓度 (μU/ml) 和时间 ( 分钟 ) 的变化为基础计算出 AUC( 药 物血中浓度 - 时间曲线下面积 )。
< 结果 >
图 14 显示在连续 3 次或连续 6 次进行的评价中， 单独施用胰岛素、 和施用序列号 1、 序列号 9 或 10 的肽与胰岛素的混合液的情况下的 AUC 的平均值和标准误差。在将序列 号 1、 9、 10 的细胞膜通透性肽与胰岛素并用施用的情况下， 相对于单独施用胰岛素的情况， 显示显著较高的胰岛素的鼻腔吸收性。
实施例 12 ： 胰岛素向细胞内转移的转移促进性评价 3
< 方法 >
使用与实施例 2 同样的方法， 使用序列号 6、 12 ～ 30 的氨基末端被荧光素标记的 肽 ( 委托シグマジエノシス社合成 )， 评价胰岛素向 HeLa 细胞转移的转移促进性。在 CO2 恒温箱中的保温时间为 5 小时， 用荧光强度测定装置来测定被摄入细胞中的罗丹明标记胰 岛素量。另外， 用与实施例 1 同样的方法测定被摄入细胞中的荧光素量。
< 结果 >
被摄入细胞中的荧光素量相对于各孔中的添加量示于图 15。 各个值显示连续 2 次 进行的评价的平均值和标准误差。添加了具有序列号 6 所示的随机序列的肽的情况下， 仅 添加的荧光素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在序列号 12 ～ 30 所示的本发明的 细胞膜通透性肽的情况下， 均有 0.8％以上被摄入细胞内。
另外， 被摄入细胞中的罗丹明标记胰岛素量相对于各孔中的添加量示于图 16。各 个值显示连续 2 次进行的评价的平均值和标准误差。在不是细胞膜通透性肽的序列号 6 的 随机肽的情况下， 仅添加的罗丹明标记胰岛素量的 0.2％左右被摄入细胞内， 与此相对， 在 一起添加了序列号 12 ～ 30 的本发明的细胞膜通透性肽的情况下， 均有 1％以上被摄入细胞 内。
产业可利用性
通过本发明， 到目前为止困难的亲水性生理活性物质的细胞内导入变得容易， 可 以期待新的医疗技术的展开。具体来说， 通过本发明的细胞膜通透性肽可获得能够将亲水 性生理活性物质经粘膜施用的制剂， 因此可以大幅改善现有的包含亲水性生理活性物质的 制剂 ( 例如， 注射剂 ) 给患者带来的苦痛、 不便， 从而不仅能够实现医疗现场的以患者为本 的医疗， 而且可以从根本上改变到目前为止的亲水性生理活性物质制剂的概念， 实现划时 代的制剂创制。
序列表自由文字
序列号 1 ～ 5 本发明的细胞膜通透性肽
序列号 6 随机肽
序列号 7 寡聚精氨酸
序列号 8 穿膜肽 (penetratin)
序列号 9 ～ 10 本发明的细胞膜通透性肽序列号 11 随机肽 2 序列号 12 ～ 30 本发明的细胞膜通透性肽18102428096 A CN 102428102
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