一种 miRNA 的抗肿瘤作用、 实施方法及用途 技术领域 本发明属于生物技术和医学领域， 具体地说， 本发明涉及一种 RNA 小分子 —— miR-99a 的抗肿瘤作用、 实施方法及用途。
背景技术 微小 RNA(micro RNA， 简称 miRNA) 是一类短序列、 非编码、 具有调控功能的单链 小分子 RNA， 长约 18 ～ 24nt。关于 miRNA 的最早报道是 1993 年 Lee 等报道的在秀丽线 虫 (C.elegants) 体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子 RNA， 即可调节线虫发育的 lin-4 【Lee， R.C. 等， The C.elegans heterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell.1993， 75 ： 843-854】 。2000 年， Reinhart 等 【Reinhart， B.J. 等， The 21-nucleotide let-7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature.2000， 403 ： 901-906】 又发现不同时期表达的 let-7。到 目前， 公用 miRNA 数据库中已收录了数百种人类 miRNA 序列， 其中三分之二已被实验证实。
微 小 RNA 来 源 于 长 度 约 为 1000bp 的 长 链 RNA 初 始 转 录 产 物 (Pri-miRNA)， Pri-miRNA 分子在细胞核中经 Drosha 酶剪切形成长度约 60 ～ 80nt 的具有茎环结构的 miRNA 前体 (Pre-miRNA)。miRNA 前体转运至胞质后， 被进一步加工成 miRNA。
微小 RNA 在动植物细胞中通过对目标 mRNA 的切割和转录抑制发挥重要作用， 参与 细胞生长、 组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA 在物种间具有高度的保守性、 时续性和 组织特异性。目前认为 miRNA 在细胞凋亡、 增殖、 分化、 血管生成及肿瘤形成等方面均具有 重要的调节作用， 参与人体大约 30％的基因调节， 与肿瘤、 心血管疾病、 肝病、 免疫紊乱及代 谢紊乱等多种发病有关。
在上述疾病中， miRNA 与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干 miRNA 通 过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、 肺癌、 乳腺癌、 结肠癌高度相关。 miRNA 的正 调控靶基因现象是最近的发现， 具体机制还不明确。
有学者提出了 “癌 microRNA” (OncomiRs)”的 观 点 【Esquela-Kerscher， A. 等， Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer.2006， 6： 259-269 ； Hammond， SM. 等， MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet.2006， 16 ： 4-9】 ， 即认为某些 miRNA 的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。
miRNA 的表达主要由 miRNA 基因首先表达为 miRNA 前体 (pri-miRNA)， pri-miRNA 经转运出核后， 由 Dicer 酶剪切成为 pre-miRNA， pre-miRNA 表现为典型的茎环结构， 茎部序 列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体 miRNA 从而发挥生物学功能。
miR-99a 位于人基因组的 21q21 位。根据已有文献报道， miR-99a 在舌鳞状细 胞 癌 【Wong TS 等， Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA ofsquamous cell carcinoma of tongue.Clinical Cancer Research.2008， 14 ： 2588-2592.】 ，儿 童 肾上腺皮质瘤 【Doghman M 等， Regulation of Insulin-likeGrowth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA inChildhood Adrenocortical Tumors.
Cancer Research.2010， 70 ： 4666-4675.】 、 暴露于香烟烟雾的大鼠肺中 【Izzotti A 等， Downregulation of microRNAexpression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke.Faseb Journal.2009， 23 ： 806-812.】下 降。miR-99a 在 HCMV 感 染 MRC-5( 人 胎 肺 细 胞 ) 后 下 降 并 抑 制 HCMV 的 增 殖。 【Wang FZ 等， Human cytomegalovirus infection alters the expression ofcellular microRNA species that affect its replication. J Virol.2008， 82(18) ： 9065-74.】 。另有报道表明 miR-99a/let-7c/miR-125b 基因簇在肺 癌中易丢失 【George Adrian Calin 等， Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers.PNAS.2004， 101(9) ： 2999-3004.】 ， 说明 miR-99a 可能参与了肿瘤的发生发展。 然而， 本领域中尚无关于 miR-99a 在肝癌中的作用的报道。
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一， 其造成了诸多患者和家庭的痛苦， 也给医 疗卫生系统带来了极大的压力。目前虽然已开发和应用了多种肿瘤治疗的药物和方法， 但 本领域仍然迫切需要开发出可有效地治疗和预防肿瘤的新型药物。
以原发性肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma， HCC) 为例， 其是我国常见的恶性 肿瘤， 患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。 根据世界卫生组织的统计， 全球每年新增约 60 万 HCC 患者， 而每年死于肝癌的人数也约为 60 万。 HCC 的发生是一个多步骤渐进的过程， 和慢性肝炎及肝硬化紧密相关。我国约有 1.2 亿乙肝病毒携带者， 占全球感染人数的 1/3。 因此， 如何有效的干预 HCC 的发生并治疗 HCC 患者是一个紧迫的重要问题。目前， HCC 患者 在手术或药物治疗后的转移复发比例依然很高， 5 年存活率仅约为 50％。因此， 探求 HCC 的 发病机制并寻求有效的治疗靶点十分重要。
近年来， 随着 miRNA 功能研究的不断深入， miRNA 在肝癌发生发展过程中的作用也 逐渐为研究者所关注。自 2006 年 Murakami 等 【Murakami， Y. 等， Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues.Oncogene.2006， 25 ： 2537-45】 首次报道 miRNA 在正常肝脏和 HCC 中的表达差异以 来， 已有多篇文献报道了 HCC 中异常表达的 miRNA。
例如， 对 HCC 组织 miRNA 表达谱进行基因芯片研究发现， 肝癌组织中 miR-222、 miR-221 和 miR-31 上调， miR-223、 miR-126 和 miR-122a 下调 【Wong， QW. 等， MicroRNA-223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma and potentiates expression of Stathminl.Gastroenterology.2008 ； 135 ： 257-269】 。 对 52 例肝癌前和 HCC 患者进行研 究发现， miR-122、 miR-10 和 miR-10a 在肝癌中表达上调， miR-145 下降 【Varnholt， H. 等， MicroRNA gene expression profile ofhepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma.Hepatology.2008 ； 47 ： 1223-1232】 。
对肝硬化患者的肝组织 miRNA 情况也开展了研究， 发现肝硬化发病与 miRNA 表 达异常有关， 而且是发生肝癌的重要参考指标， 研究者还对人肝癌标本进行了研究， 发 现 miR-21 和 miR-301 在肝癌中表达明显， 且与预后有关 【Jiang， J. 等， Association of MicroRNA expressionin hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res.2008 ； 14 ： 419-427】 。
基于上述研究， 有学者认为 miRNA 是肝癌诊断和治疗研究的重要靶点 【Ji， J. 等， New kids on the block ： diagnostic and prognostic microRNAs inhepatocellularcarcinoma.Cancer Br.2009 ； 8： 1686-1693】 。
总体来说， 与 HCC 癌旁组织相比， 在 HCC 中表达上调的 miRNA 有 ： miR-1、 miR-21、 miR-221、 miR-222、 miR-224 和 miR-301 等， 在 HCC 中表达下调的 miRNA 有 ： let-7a、 miR-101、 miR-122、 miR-125a、 miR-139a、 miR-143、 miR-195、 miR-26 和 miR-29 等。
然而， 本领域中已知的 miRNA 种类繁多， 功能各异， 要从中筛选出与肿瘤相关的 miRNA 存在较大的难度。目前尚无 miR-99a 在肝癌中作用的研究报道。
综上所述， 本领域中迫切需要开发出可有效针对肝癌诊断和治疗的抗肿瘤天然免 疫剂。 发明内容 本发明正是从数百种已知的 miRNA 中筛选出了肿瘤 ( 尤其是肝癌 ) 表达相关性及 其对肝癌生长的具有调控作用的 miRNA--miR-99a， 由此本发明提供了 miR-99a 有效抗肿瘤 的新用途。
在本发明的第一方面中， 提供了微小 RNA miR-99a 或其前体在制备预防或治疗肝 癌的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中， 所述 miR-99a 的序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
在本发明的另一个实施方式中， 所述 miR-99a 的前体在对象体内经加工转化为 miR-99a。
在本发明的另一个实施方式中， 所述 miR-99a 或其前体来自 ： 人、 大鼠、 小鼠、 犬、 马、 牛、 兔或猴。
在一个优选例中， 所述肝癌选自 ： 原发性肝癌、 肝细胞癌、 胆管细胞癌、 转移性肝 癌、 或继发性肝癌， 优选原发性肝癌， 更优选原发性肝细胞癌。
在本发明的另一个实施方式中， 所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。
在本发明的第二方面中， 提供了一种组合物， 所述组合物包含 ： (a) 有效量的微小 RNA miR-99a 或其前体 ； 和 (b) 药学上或免疫学上可接受的载体。
在一个优选例中， 组分 (a) 的含量占组合物总重量的 0.001 ～ 99.9wt％， 优选 1 ～ 95wt％， 更优选 5 ～ 90wt％。
在本发明的一个实施方式中， 所述组合物还包含治疗或预防肿瘤 ( 优选肝癌 ) 的 其它活性成分。
在一个优选例中， 所述治疗或预防肿瘤 ( 优选肝癌 ) 的其它活性成分包括 ： 化疗剂 或放疗剂。
在一个优选例中， 所述其它活性成分选自 ： 烷化剂、 抗代谢药、 抗肿瘤抗生素、 植 物类抗癌药、 激素、 或免疫制剂， 优选 ： 细胞有丝分裂抑制剂、 喜树碱、 高三尖杉酯碱、 丙卡 巴肼、 门冬酰胺酶、 顺铂、 卡铂、 米托蒽醌、 他莫昔芬、 环磷酰胺、 盐酸氮芥、 洛莫司汀、 司莫司 汀、 塞替派、 白消安、 氮甲、 苯丁酸氮芥、 氟尿嘧啶、 喃氟啶、 优氟啶、 卡莫氟、 巯嘌呤、 甲氨蝶 呤、 阿糖胞苷、 环胞苷、 巯鸟嘌呤、 六甲蜜胺、 羟基脲、 丝裂霉素、 阿霉素、 表柔比星、 博莱霉 素、 培莱霉素、 阿伐司汀、 赫赛汀、 格列卫、 吉西他滨、 托泊替康和 / 或亮丙瑞林。
在另一个优选例中， 所述细胞有丝分裂抑制剂选自 ： 长春碱、 长春新碱、 长春地辛、 长春瑞滨、 秋水仙胺、 秋水仙碱、 秋水仙酰胺、 鬼臼毒素、 依托泊苷、 替尼泊苷、 紫杉醇或多西
他赛。 在本发明的另一个实施方式中， 所述组合物的形式适于 ： 直接裸 RNA 注射法、 脂质 体包裹 RNA 直接注射法、 金包被 RNA 基因枪轰击法、 繁殖缺陷细菌携带质粒 RNA 法或复制缺 陷腺病毒携带目的 RNA 法。
在本发明的另一方面中， 提供了一种预防和 / 或治疗肿瘤的方法， 所述方法包括 ： 给予需要预防和 / 或治疗的对象有效量的微小 RNA miR-99a 或其前体。
在一个优选例中， 所述微小 RNA miR-99a 或其前体是通过如下方法给予对象的 ： 直接裸 DNA 注射法、 脂质体包裹 DNA 直接注射法、 金包被 DNA 基因枪轰击法、 繁殖缺陷细菌 携带质粒 DNA 法或复制缺陷腺病毒携带目的 DNA 法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
附图说明
图1： HCC 中 miR-99a 表达水平与患者生存时间之间的关系。其中， 图 1A 为无瘤生 存时间的 Kaplan-Meier 生存曲线 ； 图 1B 为总体生存时间的 Kaplan-Meier 生存曲线 (P 值 使用 SPSS 17.0 中的 log-rank test 计算 )。
图2： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 增殖的影响。其中， 图 2A 和 图 2B 为 EdU 检测结果， 图 2C 为 MTT 检测结果 ( 结果显示为平均值 ± 标准差 (n ＝ 4) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。
图3： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 细胞周期 (G1 期 ) 的阻滞作 用。其中， 图 3A 为各细胞系在所示时间点的细胞周期分析图， 同步化后的释放时间点记为 0h ； 图 3B 为细胞同步化释放后 3h(HepG2 和 SMMC7721) 或 9 小时 (Huh7) 时， 各细胞系不同 处理的 G1 期细胞比例的统计 ( 结果显示为平均值 ± 标准差 (n ＝ 4) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。
图4： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 克隆形成能力的降低作用。
图5： 瘤内注射 miR-99a 后， miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤中的表达情况的 qRT-PCR 检测 (**， P ＜ 0.01)。
图6： 瘤内注射 miR-99a 后对肿瘤生长的影响。其中， 图 6A 为剥离的肿瘤图片 ； 图 6B 为肿瘤生长曲线 ； 图 6C 为血清 AFP 含量 ( 结果显示平均值 ± 标准差 (n ＝ 8) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。 具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究发现 ： HCC 患者的肿瘤组织中微小 RNAmiR-99a 的 表达会显著下调， 且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性， 其低表达与患者的预后差 显著相关， 从而证实了 miR-99a 在肿瘤进展和患者预后中起重要作用。发明人在此基础上 进行进一步的研究发现 ： miR-99a 可在体、 内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长， 从而发挥 抗肿瘤的作用。由此， 发明人发现了 miR-99a 在抗肿瘤中的新用途， 从而在此基础上完成了 本发明。
如本文所用， “含有” 、 “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构成” 、 “基本上由 ...... 构成” 、 和 “由 ...... 构成” “主要由 ...... 构成” ； “基本上由 ...... 构成” 、 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
如本文所用， “分离的” 或 “分离纯化的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果 是天然的物质， 原始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分 开， 则为分离纯化的。
本发明提到的特征， 或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所 有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以任何可提供相同、 均等 或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特征的 一般性例子。
miR-99a 及其前体
如本文所用， 术语 “miR-99a” 或 “微小 RNA miR-99a” 可互换使用， 是指包含 SEQ ID NO ： 1 所示序列或其同源序列的微小 RNA。本领域中已知各种来源的 miR-99a， 例如人、 黑猩 猩、 马、 鸡等， 这些同源序列均包含在本发明的术语 “miR-99a” 中。本发明的术语中还包含 上述天然存在的 miR-99a 序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个核苷酸， 或经过生物学 化学修饰， 且仍然具有抗肿瘤活性的衍生 RNA。 如本文所用， 术语 “miR-99a 前体”是指在被施予对象的细胞内或体内可被加 工成为 miR-99a 的 miRNA 前体。本领域普通技术人员知晓获得天然存在的 miR-99a 前 体的方法和手段， 也可基于分子和遗传学理论和手段构建所述前体， 例如 【Doghman M 等， Regulation of Insulin-like Growth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA in Childhood Adrenocortical Tumors.Cancer Research.2010， 70 ： 4666-4675】 。
本领域中已知 miR-99a 编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后， 形 成成熟的 miR-99a。miR-99a 前体只有在加工成成熟的 miR-99a 后才具有相应的生物学功 能， 因此， 本领域普通技术人员可合理预期利用 miR-99a 的成熟序列及能够产生或加工成 为 miR-99a 的各种其它形式的核酸物质 ( 即本发明所述的 “miR-99a 前体” ) 均可获得本发 明所需获得的效果， 即起到抗肿瘤的效果， 从而均可用于制备治疗或预防肿瘤的组合物。
本发明还包括一种载体， 它含有携带所述 miRNA 或其前体的构建物。所述的表达 载体通常还含有启动子、 复制起点和 / 或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用 于构建本发明所需的构建物或表达载体。 这些方法包括但不限于 ： 基因重组技术、 体外合成 技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状， 如卡拉霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 氨苄青霉素抗性。
组合物
本发明还提供了一种组合物 ( 尤其是药物组合物或疫苗组合物 )， 所述的组合物 可用于预防和 / 或治疗肿瘤、 及由其引起的相关症状和疾病。所述组合物含有有效量的本 发明的 miR-99a 以及药学上或免疫学上可接受的载体。
所述 “药学上可接受的” 的成分是适用于人和 / 或动物而无过度不良副反应 ( 如 毒性、 刺激和变态反应 ) 的， 即有合理的效益 / 风险比的物质。所述 “有效量” 是指可对人 和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 / 或动物所接受的量。
所述 “药学上 / 免疫学上可接受的载体” 指用于治疗剂或疫苗给药的载体， 包括 各种赋形剂、 稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体 ： 它们本身并不是必要的 活性成分， 且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中可找到关于药学上 可接受的赋形剂的充分讨论。
这类载体包括 ( 但并不限于 ) ： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 通 常药物 / 疫苗制剂应与给药方式相匹配， 例如， 本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡 萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备， 以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌 条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。
本发明的 miR-99a 的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变 化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 ( 例如通过临床 试验 )。 所述的因素包括但不限于 ： miR-99a 的药代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰 期等 ； 患者所要治疗的疾病、 患者的体重、 患者的免疫状况、 给药的途径等。
当本发明的 miR-99a 或其前体以适当剂量给予对象时可获得令人满意的效果。例 如， 当本发明的 miR-99a 或其前体， 每天以约 2.5-25nmol/20g( 优选的为 20nmol/20g) 动物 ( 如小鼠 ) 体重的剂量给予动物时， 可获得令人满意的抗肿瘤效果。 给药方式
本发明的组合物， 可以为固态 ( 如颗粒剂、 片剂、 冻干粉、 栓剂、 胶囊、 舌下含片 ) 或 液态 ( 如口服液 ) 或其它合适的形状。
给药途径可采用例如 ( 但不限于 ) ： (1) 直接裸 RNA 注射法 ； (2) 脂质体包裹 RNA 直接注射法 ； (3) 金包被 RNA 基因枪轰击法 ； (4) 繁殖缺陷细菌携带质粒 RNA 法 ； (5) 复制缺 陷腺病毒携带目的 RNA 法 ； (6) 电打孔法， 等等。
此外， 本发明的组合物中还可含有用于改善和 / 或治疗肿瘤的其它活性物质， 所 述的其它活性物质选自下组 ( 包括但不限于 ) ： 临床常用抗肿瘤药物 ( 包括但不限于 ) ： 化 疗剂或放疗剂， 优选烷化剂、 抗代谢药、 抗肿瘤抗生素、 植物类抗癌药、 激素、 或免疫制剂， 更 优选细胞有丝分裂抑制剂、 喜树碱、 高三尖杉酯碱、 丙卡巴肼、 门冬酰胺酶、 顺铂、 卡铂、 米托 蒽醌、 他莫昔芬、 环磷酰胺、 盐酸氮芥、 洛莫司汀、 司莫司汀、 塞替派、 白消安、 氮甲、 苯丁酸氮 芥、 氟尿嘧啶、 喃氟啶、 优氟啶、 卡莫氟、 巯嘌呤、 甲氨蝶呤、 阿糖胞苷、 环胞苷、 巯鸟嘌呤、 六 甲蜜胺、 羟基脲、 丝裂霉素、 阿霉素、 表柔比星、 博莱霉素、 培莱霉素、 阿伐司汀、 赫赛汀、 格列 卫、 吉西他滨、 托泊替康和 / 或亮丙瑞林。
本发明的 miR-99a 还可以与其它药物和治疗手段 ( 例如手术疗法 ) 联合， 用于肿 瘤的预防和治疗。
本发明的优点
本发明的优点主要在于 ：
(a) 本发明揭示了 miR-99a 在预防和 / 或治疗肝癌中的新用途， 为 miR-99a、 乃至 miRNA 的研究和开发利用提供了新的思路和途径 ；
(b) 本发明的 miR-99a 或其前体可有效用于抗肝癌， 从而为本领域提供了一种新 颖的肝癌发生诊断剂和 / 或治疗剂， 具有一定的临床应用前景。
实施例
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人 《分子克隆 ： 实验室指南》 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1 ： miR-99a 表达量与 HCC 的关系
采用实时定量反转录 PCR(qRT-PCR) 方法对 2002 至 2006 年收集的共 142 例 HCC 患者的 HCC 组织与癌旁组织 ( 来自东方肝胆医院标本库 ) 中 miR-99a 的表达进行了分析。
采用 TRIzol(Invitrogen 公司 ) 抽提组织总 RNA。qRT-PCR 使用 SYBR RT-PCR 试 剂盒 (Takara 公司 )， 在 LightCycler1.5(Roche 公司 ) 实时定量 PCR 仪上完成。
miR-99a 反转录引物为 ：
5′ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAG-3′ (SEQ ID NO ： 2) ； 定量 PCR 引物 ：
5′ -GCAACCCGTAGATCCGAT-3′ ( 上游， SEQ ID NO ： 3) 和
5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ( 下游， SEQ ID NO ： 4) ；
内参 U6 小核 RNA 的反转录反应引物与其定量 PCR 的下游引物相同， 序列为 ：
5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’ (SEQ ID NO ： 5) ；
定量 PCR 引物 ：
5’ -CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’ ( 上游， SEQ ID NO ： 6) ； 和
5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’ ( 下游， 同上 SEQ ID NO ： 5)。 -ΔΔCt
miRNA 的相对定量使用 2 法计算 (U6 为内参 )【Livak， KJ. 等， Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods.2001 ； 25 ： 402-408】 。
qRT-PCR 结果显示， miR-99a 在约 87％的 HCC 癌旁组织中有所下降 ( 结果未显示 )。 对 miR-99a 的低表达与患者生存时间的性关性进行分析， P 值使用 SPSS17.0 中的 log-rank test 计算， 结果分别如图 1A 和图 1B 所示。
通过试验结果发现 ： miR-99a 的低表达与患者更短的无瘤生存时间和总体生存时 间显著相关。
对影响 HCC 预后的危险因素进行 Cox 回归分析， 危害比 (95％可信区间 ) 和 P 值使 用 SPSS 17.0 中的单因素和多因素 Cox 回归分析计算。
结果如表 1 所示。
表 1 影响 HCC 患者预后危险因素的单因素和多因素 Cox 回归分析
通过单因素和多因素分析发现， miR-99a 的低表达是一个显著独立的预测 HCC 患 者较低无瘤生存时间的危险因素。
实施例 2 ： miR-99a 体外抑制 HCC 细胞的生长
分别采用如下序列 ( 由上海吉玛公司合成 ) 在人 HCC 细胞系 Hep3B 细胞中使得 miR-99a 高表达 ：
miR-99a ： AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO ： 1)
对照 RNA ： UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO ： 7， 3′端加 TT 突出是小 RNA 序列 合成中常用的修饰方法， 对其功能没有影响， 主要是起到稳定核苷酸的作用 【Wilda， M. 等， Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion geneby RNA interference(RNAi).
Oncogene.2002 ； 21 ： 5176-5124】 )。
人 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC7721、 Huh7 细胞购自上海生化细胞所。 使用 INTERFERin 转染试剂 (Polyplus 公司 ) 转染小 RNA， miR-99a 转染终浓度为 50nM， 对照 RNA 转染浓度为 50nM， 步骤按说明书标准步骤操作。
EdU 检测 ： 将 2×104 个细胞分别铺入 24 孔板并培养过夜， 次日转染对照 RNA 或 miR-99a， 并于转染后 72 小时检测。首先， 弃去培养上清， 换入 500μl 含 EdU50uM(RiboBio 公司 ) 的新鲜培养基 ； 然后 37℃孵育 2 小时， 流式细胞仪检测。
细胞增殖检测 ： 细胞的体外增殖使用 MTT 法检测。5×103 个细胞分别铺入 96 孔板 并培养过夜， 次日转染对照 RNA 或 miR-99a， 并于转染后 0、 24、 48、 72 小时检测。首先， 弃去 培养上清， 换入 100μl 含 MTT 0.5mg/ml(Sigma 公司 ) 的新鲜培养基 ； 然后 37℃孵育 4 小 时； 最后换入 100μl DMSO(Sigma 公司 ) 并振荡 10 分钟。最终吸光度使用 570nm 波长检 测。
细胞周期检测 ： 使用流式细胞术检测细胞周期。上述各细胞转染 72 小时后， 收取 细胞并 PB S 洗涤一遍， 随后使用 75％的乙醇 4℃固定 1 小时。固定后的细胞使用 PBS 洗三 遍， 并加入 1ml 含 40μg 碘化丙啶 (Sigma 公司 ) 和 100μg RNA 酶 A(Sigma 公司 ) 的 PBS。 最后使用 FACS Calibur 流式细胞仪检测细胞周期。 软琼脂克隆形成 ： 上述各细胞转染 24 小时后， 收取细胞， 各取 1×104 个用 0.3％低 熔点软琼脂 (Lonza 公司 ) 重悬， 铺入预铺 0.6％低熔点软琼脂的六孔板。10 天后检测克隆 形成数。
转染 miR-99a 后影响 HCC 细胞增殖的结果如图 2 所示， 影响 HCC 细胞周期的结果 如图 3 所示， 影响 HCC 细胞克隆形成的结果如图 4 所示。
结果显示 ： 在 HCC 细胞系中， 高表达 miR-99a 能够抑制细胞增殖、 抑制细胞周期和 克隆形成。
实施例 3 ： miR-99a 在裸鼠人肝癌荷瘤模型 SMMC-LTNM 中表达降低
按照文献方法构建人原代 HCC 组织皮下荷瘤裸鼠模型 SMMC-LTNM【Tao， WZ. 等， The tumor invasion and metastasis in the transplantation of transplanted human hepatocellular carcinoma into nude mice abdominal cavity and orthotopic hepatic tissue.Dier Junyi Daxue Xuebao.1998 ； 19 ： 54-56】 。 根据文献报道， 与常规使用的 HCC 细 胞系构建的裸鼠荷瘤模型相比， SMMC-LTNM 与人 HCC 的临床进展更为相似， 它能够发生局部 侵袭和其它器官的转移， 此外还能大量分泌甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein， AFP)。
利用实施例 1 所述 qRT-PCR 方法对人正常肝脏组织 ( 来自东方肝胆医院标本库 ) 和 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况进行检测， 结果显示 miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤 中表达量显著降低 ( 结果未示出 )。
实施例 4 ： miR-99a 抑制 HCC 细胞在体内的生长 利用人原代 HCC 组织皮下荷瘤裸鼠模型 SMMC-LTNM 观察 miR-99a 的体内抑瘤效果。 胆固醇偶联的 miR-99a 及胆固醇偶联的对照 RNA( 即 SEQ ID NO ： 7 所示的 RNA) 均由广州锐博公司合成 ( 胆固醇偶联后可的 miRNA 可自主通过细胞膜进入细胞内， 转染 效率较高 【Wolfrum， C. 等， Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs.Nat Biotechnol.2007 ； 25 ： 1149-1157.】 )。 体 内 转 染 RNA 时，将 10nmol(0.1ml) 胆固醇偶联的 miR-99a( 或胆固醇偶联的对照 RNA) 直接瘤内注射， 每三天注 射一次， 持续注射两周。
利用实施例 1 所述 qRT-PCR 方法对人正常肝脏组织和 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况进行检测。肿瘤体积的计算按文献操作 【Qi， R. 等， Notch1signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction ofcell cycle arrest and apoptosis.Cancer Res.2003 ； 63 ： 8323-8329】 。血清 AFP 的测定使用 AFP ELISA 试剂 盒 ( 购自 Autobio 公司 )。
miR-99a 瘤内注射后 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况如图 5 所示。结果显 示： 通过瘤内注射胆固醇偶联的 miR-99a 后， miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤中的表达显著增 高。
miR-99a 体内对肿瘤细胞生长和血清 AFP 含量作用试验结果如图 6 所示。结果显 示： 瘤内注射胆固醇偶联的 miR-99a 显著抑制了肿瘤的生长和血清 AFP 的含量。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
背景技术 微小 RNA(micro RNA， 简称 miRNA) 是一类短序列、 非编码、 具有调控功能的单链 小分子 RNA， 长约 18 ～ 24nt。关于 miRNA 的最早报道是 1993 年 Lee 等报道的在秀丽线 虫 (C.elegants) 体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子 RNA， 即可调节线虫发育的 lin-4 【Lee， R.C. 等， The C.elegans heterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell.1993， 75 ： 843-854】 。2000 年， Reinhart 等 【Reinhart， B.J. 等， The 21-nucleotide let-7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature.2000， 403 ： 901-906】 又发现不同时期表达的 let-7。到 目前， 公用 miRNA 数据库中已收录了数百种人类 miRNA 序列， 其中三分之二已被实验证实。
微 小 RNA 来 源 于 长 度 约 为 1000bp 的 长 链 RNA 初 始 转 录 产 物 (Pri-miRNA)， Pri-miRNA 分子在细胞核中经 Drosha 酶剪切形成长度约 60 ～ 80nt 的具有茎环结构的 miRNA 前体 (Pre-miRNA)。miRNA 前体转运至胞质后， 被进一步加工成 miRNA。
微小 RNA 在动植物细胞中通过对目标 mRNA 的切割和转录抑制发挥重要作用， 参与 细胞生长、 组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA 在物种间具有高度的保守性、 时续性和 组织特异性。目前认为 miRNA 在细胞凋亡、 增殖、 分化、 血管生成及肿瘤形成等方面均具有 重要的调节作用， 参与人体大约 30％的基因调节， 与肿瘤、 心血管疾病、 肝病、 免疫紊乱及代 谢紊乱等多种发病有关。
在上述疾病中， miRNA 与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干 miRNA 通 过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、 肺癌、 乳腺癌、 结肠癌高度相关。 miRNA 的正 调控靶基因现象是最近的发现， 具体机制还不明确。
有学者提出了 “癌 microRNA” (OncomiRs)”的 观 点 【Esquela-Kerscher， A. 等， Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer.2006， 6： 259-269 ； Hammond， SM. 等， MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet.2006， 16 ： 4-9】 ， 即认为某些 miRNA 的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。
miRNA 的表达主要由 miRNA 基因首先表达为 miRNA 前体 (pri-miRNA)， pri-miRNA 经转运出核后， 由 Dicer 酶剪切成为 pre-miRNA， pre-miRNA 表现为典型的茎环结构， 茎部序 列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体 miRNA 从而发挥生物学功能。
miR-99a 位于人基因组的 21q21 位。根据已有文献报道， miR-99a 在舌鳞状细 胞 癌 【Wong TS 等， Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA ofsquamous cell carcinoma of tongue.Clinical Cancer Research.2008， 14 ： 2588-2592.】 ，儿 童 肾上腺皮质瘤 【Doghman M 等， Regulation of Insulin-likeGrowth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA inChildhood Adrenocortical Tumors.
Cancer Research.2010， 70 ： 4666-4675.】 、 暴露于香烟烟雾的大鼠肺中 【Izzotti A 等， Downregulation of microRNAexpression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke.Faseb Journal.2009， 23 ： 806-812.】下 降。miR-99a 在 HCMV 感 染 MRC-5( 人 胎 肺 细 胞 ) 后 下 降 并 抑 制 HCMV 的 增 殖。 【Wang FZ 等， Human cytomegalovirus infection alters the expression ofcellular microRNA species that affect its replication. J Virol.2008， 82(18) ： 9065-74.】 。另有报道表明 miR-99a/let-7c/miR-125b 基因簇在肺 癌中易丢失 【George Adrian Calin 等， Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers.PNAS.2004， 101(9) ： 2999-3004.】 ， 说明 miR-99a 可能参与了肿瘤的发生发展。 然而， 本领域中尚无关于 miR-99a 在肝癌中的作用的报道。
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一， 其造成了诸多患者和家庭的痛苦， 也给医 疗卫生系统带来了极大的压力。目前虽然已开发和应用了多种肿瘤治疗的药物和方法， 但 本领域仍然迫切需要开发出可有效地治疗和预防肿瘤的新型药物。
以原发性肝细胞癌 (Hepatocellular carcinoma， HCC) 为例， 其是我国常见的恶性 肿瘤， 患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。 根据世界卫生组织的统计， 全球每年新增约 60 万 HCC 患者， 而每年死于肝癌的人数也约为 60 万。 HCC 的发生是一个多步骤渐进的过程， 和慢性肝炎及肝硬化紧密相关。我国约有 1.2 亿乙肝病毒携带者， 占全球感染人数的 1/3。 因此， 如何有效的干预 HCC 的发生并治疗 HCC 患者是一个紧迫的重要问题。目前， HCC 患者 在手术或药物治疗后的转移复发比例依然很高， 5 年存活率仅约为 50％。因此， 探求 HCC 的 发病机制并寻求有效的治疗靶点十分重要。
近年来， 随着 miRNA 功能研究的不断深入， miRNA 在肝癌发生发展过程中的作用也 逐渐为研究者所关注。自 2006 年 Murakami 等 【Murakami， Y. 等， Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues.Oncogene.2006， 25 ： 2537-45】 首次报道 miRNA 在正常肝脏和 HCC 中的表达差异以 来， 已有多篇文献报道了 HCC 中异常表达的 miRNA。
例如， 对 HCC 组织 miRNA 表达谱进行基因芯片研究发现， 肝癌组织中 miR-222、 miR-221 和 miR-31 上调， miR-223、 miR-126 和 miR-122a 下调 【Wong， QW. 等， MicroRNA-223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma and potentiates expression of Stathminl.Gastroenterology.2008 ； 135 ： 257-269】 。 对 52 例肝癌前和 HCC 患者进行研 究发现， miR-122、 miR-10 和 miR-10a 在肝癌中表达上调， miR-145 下降 【Varnholt， H. 等， MicroRNA gene expression profile ofhepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma.Hepatology.2008 ； 47 ： 1223-1232】 。
对肝硬化患者的肝组织 miRNA 情况也开展了研究， 发现肝硬化发病与 miRNA 表 达异常有关， 而且是发生肝癌的重要参考指标， 研究者还对人肝癌标本进行了研究， 发 现 miR-21 和 miR-301 在肝癌中表达明显， 且与预后有关 【Jiang， J. 等， Association of MicroRNA expressionin hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res.2008 ； 14 ： 419-427】 。
基于上述研究， 有学者认为 miRNA 是肝癌诊断和治疗研究的重要靶点 【Ji， J. 等， New kids on the block ： diagnostic and prognostic microRNAs inhepatocellularcarcinoma.Cancer Br.2009 ； 8： 1686-1693】 。
总体来说， 与 HCC 癌旁组织相比， 在 HCC 中表达上调的 miRNA 有 ： miR-1、 miR-21、 miR-221、 miR-222、 miR-224 和 miR-301 等， 在 HCC 中表达下调的 miRNA 有 ： let-7a、 miR-101、 miR-122、 miR-125a、 miR-139a、 miR-143、 miR-195、 miR-26 和 miR-29 等。
然而， 本领域中已知的 miRNA 种类繁多， 功能各异， 要从中筛选出与肿瘤相关的 miRNA 存在较大的难度。目前尚无 miR-99a 在肝癌中作用的研究报道。
综上所述， 本领域中迫切需要开发出可有效针对肝癌诊断和治疗的抗肿瘤天然免 疫剂。 发明内容 本发明正是从数百种已知的 miRNA 中筛选出了肿瘤 ( 尤其是肝癌 ) 表达相关性及 其对肝癌生长的具有调控作用的 miRNA--miR-99a， 由此本发明提供了 miR-99a 有效抗肿瘤 的新用途。
在本发明的第一方面中， 提供了微小 RNA miR-99a 或其前体在制备预防或治疗肝 癌的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中， 所述 miR-99a 的序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
在本发明的另一个实施方式中， 所述 miR-99a 的前体在对象体内经加工转化为 miR-99a。
在本发明的另一个实施方式中， 所述 miR-99a 或其前体来自 ： 人、 大鼠、 小鼠、 犬、 马、 牛、 兔或猴。
在一个优选例中， 所述肝癌选自 ： 原发性肝癌、 肝细胞癌、 胆管细胞癌、 转移性肝 癌、 或继发性肝癌， 优选原发性肝癌， 更优选原发性肝细胞癌。
在本发明的另一个实施方式中， 所述组合物是药物组合物或疫苗组合物。
在本发明的第二方面中， 提供了一种组合物， 所述组合物包含 ： (a) 有效量的微小 RNA miR-99a 或其前体 ； 和 (b) 药学上或免疫学上可接受的载体。
在一个优选例中， 组分 (a) 的含量占组合物总重量的 0.001 ～ 99.9wt％， 优选 1 ～ 95wt％， 更优选 5 ～ 90wt％。
在本发明的一个实施方式中， 所述组合物还包含治疗或预防肿瘤 ( 优选肝癌 ) 的 其它活性成分。
在一个优选例中， 所述治疗或预防肿瘤 ( 优选肝癌 ) 的其它活性成分包括 ： 化疗剂 或放疗剂。
在一个优选例中， 所述其它活性成分选自 ： 烷化剂、 抗代谢药、 抗肿瘤抗生素、 植 物类抗癌药、 激素、 或免疫制剂， 优选 ： 细胞有丝分裂抑制剂、 喜树碱、 高三尖杉酯碱、 丙卡 巴肼、 门冬酰胺酶、 顺铂、 卡铂、 米托蒽醌、 他莫昔芬、 环磷酰胺、 盐酸氮芥、 洛莫司汀、 司莫司 汀、 塞替派、 白消安、 氮甲、 苯丁酸氮芥、 氟尿嘧啶、 喃氟啶、 优氟啶、 卡莫氟、 巯嘌呤、 甲氨蝶 呤、 阿糖胞苷、 环胞苷、 巯鸟嘌呤、 六甲蜜胺、 羟基脲、 丝裂霉素、 阿霉素、 表柔比星、 博莱霉 素、 培莱霉素、 阿伐司汀、 赫赛汀、 格列卫、 吉西他滨、 托泊替康和 / 或亮丙瑞林。
在另一个优选例中， 所述细胞有丝分裂抑制剂选自 ： 长春碱、 长春新碱、 长春地辛、 长春瑞滨、 秋水仙胺、 秋水仙碱、 秋水仙酰胺、 鬼臼毒素、 依托泊苷、 替尼泊苷、 紫杉醇或多西
他赛。 在本发明的另一个实施方式中， 所述组合物的形式适于 ： 直接裸 RNA 注射法、 脂质 体包裹 RNA 直接注射法、 金包被 RNA 基因枪轰击法、 繁殖缺陷细菌携带质粒 RNA 法或复制缺 陷腺病毒携带目的 RNA 法。
在本发明的另一方面中， 提供了一种预防和 / 或治疗肿瘤的方法， 所述方法包括 ： 给予需要预防和 / 或治疗的对象有效量的微小 RNA miR-99a 或其前体。
在一个优选例中， 所述微小 RNA miR-99a 或其前体是通过如下方法给予对象的 ： 直接裸 DNA 注射法、 脂质体包裹 DNA 直接注射法、 金包被 DNA 基因枪轰击法、 繁殖缺陷细菌 携带质粒 DNA 法或复制缺陷腺病毒携带目的 DNA 法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
附图说明
图1： HCC 中 miR-99a 表达水平与患者生存时间之间的关系。其中， 图 1A 为无瘤生 存时间的 Kaplan-Meier 生存曲线 ； 图 1B 为总体生存时间的 Kaplan-Meier 生存曲线 (P 值 使用 SPSS 17.0 中的 log-rank test 计算 )。
图2： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 增殖的影响。其中， 图 2A 和 图 2B 为 EdU 检测结果， 图 2C 为 MTT 检测结果 ( 结果显示为平均值 ± 标准差 (n ＝ 4) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。
图3： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 细胞周期 (G1 期 ) 的阻滞作 用。其中， 图 3A 为各细胞系在所示时间点的细胞周期分析图， 同步化后的释放时间点记为 0h ； 图 3B 为细胞同步化释放后 3h(HepG2 和 SMMC7721) 或 9 小时 (Huh7) 时， 各细胞系不同 处理的 G1 期细胞比例的统计 ( 结果显示为平均值 ± 标准差 (n ＝ 4) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。
图4： miR-99a 对 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC-7721、 Huh7 克隆形成能力的降低作用。
图5： 瘤内注射 miR-99a 后， miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤中的表达情况的 qRT-PCR 检测 (**， P ＜ 0.01)。
图6： 瘤内注射 miR-99a 后对肿瘤生长的影响。其中， 图 6A 为剥离的肿瘤图片 ； 图 6B 为肿瘤生长曲线 ； 图 6C 为血清 AFP 含量 ( 结果显示平均值 ± 标准差 (n ＝ 8) ； *， P ＜ 0.05 ； **， P ＜ 0.01)。 具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究发现 ： HCC 患者的肿瘤组织中微小 RNAmiR-99a 的 表达会显著下调， 且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性， 其低表达与患者的预后差 显著相关， 从而证实了 miR-99a 在肿瘤进展和患者预后中起重要作用。发明人在此基础上 进行进一步的研究发现 ： miR-99a 可在体、 内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长， 从而发挥 抗肿瘤的作用。由此， 发明人发现了 miR-99a 在抗肿瘤中的新用途， 从而在此基础上完成了 本发明。
如本文所用， “含有” 、 “具有” 或 “包括” 包括了 “包含” 、 “主要由 ...... 构成” 、 “基本上由 ...... 构成” 、 和 “由 ...... 构成” “主要由 ...... 构成” ； “基本上由 ...... 构成” 、 和 “由 ...... 构成” 属于 “含有” 、 “具有” 或 “包括” 的下位概念。
如本文所用， “分离的” 或 “分离纯化的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果 是天然的物质， 原始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分 开， 则为分离纯化的。
本发明提到的特征， 或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所 有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以任何可提供相同、 均等 或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特征的 一般性例子。
miR-99a 及其前体
如本文所用， 术语 “miR-99a” 或 “微小 RNA miR-99a” 可互换使用， 是指包含 SEQ ID NO ： 1 所示序列或其同源序列的微小 RNA。本领域中已知各种来源的 miR-99a， 例如人、 黑猩 猩、 马、 鸡等， 这些同源序列均包含在本发明的术语 “miR-99a” 中。本发明的术语中还包含 上述天然存在的 miR-99a 序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个核苷酸， 或经过生物学 化学修饰， 且仍然具有抗肿瘤活性的衍生 RNA。 如本文所用， 术语 “miR-99a 前体”是指在被施予对象的细胞内或体内可被加 工成为 miR-99a 的 miRNA 前体。本领域普通技术人员知晓获得天然存在的 miR-99a 前 体的方法和手段， 也可基于分子和遗传学理论和手段构建所述前体， 例如 【Doghman M 等， Regulation of Insulin-like Growth Factor-Mammalian Target of Rapamycin Signaling by MicroRNA in Childhood Adrenocortical Tumors.Cancer Research.2010， 70 ： 4666-4675】 。
本领域中已知 miR-99a 编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后， 形 成成熟的 miR-99a。miR-99a 前体只有在加工成成熟的 miR-99a 后才具有相应的生物学功 能， 因此， 本领域普通技术人员可合理预期利用 miR-99a 的成熟序列及能够产生或加工成 为 miR-99a 的各种其它形式的核酸物质 ( 即本发明所述的 “miR-99a 前体” ) 均可获得本发 明所需获得的效果， 即起到抗肿瘤的效果， 从而均可用于制备治疗或预防肿瘤的组合物。
本发明还包括一种载体， 它含有携带所述 miRNA 或其前体的构建物。所述的表达 载体通常还含有启动子、 复制起点和 / 或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用 于构建本发明所需的构建物或表达载体。 这些方法包括但不限于 ： 基因重组技术、 体外合成 技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状， 如卡拉霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 氨苄青霉素抗性。
组合物
本发明还提供了一种组合物 ( 尤其是药物组合物或疫苗组合物 )， 所述的组合物 可用于预防和 / 或治疗肿瘤、 及由其引起的相关症状和疾病。所述组合物含有有效量的本 发明的 miR-99a 以及药学上或免疫学上可接受的载体。
所述 “药学上可接受的” 的成分是适用于人和 / 或动物而无过度不良副反应 ( 如 毒性、 刺激和变态反应 ) 的， 即有合理的效益 / 风险比的物质。所述 “有效量” 是指可对人 和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 / 或动物所接受的量。
所述 “药学上 / 免疫学上可接受的载体” 指用于治疗剂或疫苗给药的载体， 包括 各种赋形剂、 稀释剂和佐剂。该术语指这样一些药剂或疫苗载体 ： 它们本身并不是必要的 活性成分， 且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中可找到关于药学上 可接受的赋形剂的充分讨论。
这类载体包括 ( 但并不限于 ) ： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 通 常药物 / 疫苗制剂应与给药方式相匹配， 例如， 本发明的组合物可以用生理盐水或含有葡 萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备， 以制得针剂形式。所述组合物宜在无菌 条件下制造。本发明的制剂还可制成缓释制剂。
本发明的 miR-99a 的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变 化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 ( 例如通过临床 试验 )。 所述的因素包括但不限于 ： miR-99a 的药代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰 期等 ； 患者所要治疗的疾病、 患者的体重、 患者的免疫状况、 给药的途径等。
当本发明的 miR-99a 或其前体以适当剂量给予对象时可获得令人满意的效果。例 如， 当本发明的 miR-99a 或其前体， 每天以约 2.5-25nmol/20g( 优选的为 20nmol/20g) 动物 ( 如小鼠 ) 体重的剂量给予动物时， 可获得令人满意的抗肿瘤效果。 给药方式
本发明的组合物， 可以为固态 ( 如颗粒剂、 片剂、 冻干粉、 栓剂、 胶囊、 舌下含片 ) 或 液态 ( 如口服液 ) 或其它合适的形状。
给药途径可采用例如 ( 但不限于 ) ： (1) 直接裸 RNA 注射法 ； (2) 脂质体包裹 RNA 直接注射法 ； (3) 金包被 RNA 基因枪轰击法 ； (4) 繁殖缺陷细菌携带质粒 RNA 法 ； (5) 复制缺 陷腺病毒携带目的 RNA 法 ； (6) 电打孔法， 等等。
此外， 本发明的组合物中还可含有用于改善和 / 或治疗肿瘤的其它活性物质， 所 述的其它活性物质选自下组 ( 包括但不限于 ) ： 临床常用抗肿瘤药物 ( 包括但不限于 ) ： 化 疗剂或放疗剂， 优选烷化剂、 抗代谢药、 抗肿瘤抗生素、 植物类抗癌药、 激素、 或免疫制剂， 更 优选细胞有丝分裂抑制剂、 喜树碱、 高三尖杉酯碱、 丙卡巴肼、 门冬酰胺酶、 顺铂、 卡铂、 米托 蒽醌、 他莫昔芬、 环磷酰胺、 盐酸氮芥、 洛莫司汀、 司莫司汀、 塞替派、 白消安、 氮甲、 苯丁酸氮 芥、 氟尿嘧啶、 喃氟啶、 优氟啶、 卡莫氟、 巯嘌呤、 甲氨蝶呤、 阿糖胞苷、 环胞苷、 巯鸟嘌呤、 六 甲蜜胺、 羟基脲、 丝裂霉素、 阿霉素、 表柔比星、 博莱霉素、 培莱霉素、 阿伐司汀、 赫赛汀、 格列 卫、 吉西他滨、 托泊替康和 / 或亮丙瑞林。
本发明的 miR-99a 还可以与其它药物和治疗手段 ( 例如手术疗法 ) 联合， 用于肿 瘤的预防和治疗。
本发明的优点
本发明的优点主要在于 ：
(a) 本发明揭示了 miR-99a 在预防和 / 或治疗肝癌中的新用途， 为 miR-99a、 乃至 miRNA 的研究和开发利用提供了新的思路和途径 ；
(b) 本发明的 miR-99a 或其前体可有效用于抗肝癌， 从而为本领域提供了一种新 颖的肝癌发生诊断剂和 / 或治疗剂， 具有一定的临床应用前景。
实施例
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人 《分子克隆 ： 实验室指南》 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 1 ： miR-99a 表达量与 HCC 的关系
采用实时定量反转录 PCR(qRT-PCR) 方法对 2002 至 2006 年收集的共 142 例 HCC 患者的 HCC 组织与癌旁组织 ( 来自东方肝胆医院标本库 ) 中 miR-99a 的表达进行了分析。
采用 TRIzol(Invitrogen 公司 ) 抽提组织总 RNA。qRT-PCR 使用 SYBR RT-PCR 试 剂盒 (Takara 公司 )， 在 LightCycler1.5(Roche 公司 ) 实时定量 PCR 仪上完成。
miR-99a 反转录引物为 ：
5′ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAG-3′ (SEQ ID NO ： 2) ； 定量 PCR 引物 ：
5′ -GCAACCCGTAGATCCGAT-3′ ( 上游， SEQ ID NO ： 3) 和
5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ( 下游， SEQ ID NO ： 4) ；
内参 U6 小核 RNA 的反转录反应引物与其定量 PCR 的下游引物相同， 序列为 ：
5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’ (SEQ ID NO ： 5) ；
定量 PCR 引物 ：
5’ -CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’ ( 上游， SEQ ID NO ： 6) ； 和
5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’ ( 下游， 同上 SEQ ID NO ： 5)。 -ΔΔCt
miRNA 的相对定量使用 2 法计算 (U6 为内参 )【Livak， KJ. 等， Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods.2001 ； 25 ： 402-408】 。
qRT-PCR 结果显示， miR-99a 在约 87％的 HCC 癌旁组织中有所下降 ( 结果未显示 )。 对 miR-99a 的低表达与患者生存时间的性关性进行分析， P 值使用 SPSS17.0 中的 log-rank test 计算， 结果分别如图 1A 和图 1B 所示。
通过试验结果发现 ： miR-99a 的低表达与患者更短的无瘤生存时间和总体生存时 间显著相关。
对影响 HCC 预后的危险因素进行 Cox 回归分析， 危害比 (95％可信区间 ) 和 P 值使 用 SPSS 17.0 中的单因素和多因素 Cox 回归分析计算。
结果如表 1 所示。
表 1 影响 HCC 患者预后危险因素的单因素和多因素 Cox 回归分析
通过单因素和多因素分析发现， miR-99a 的低表达是一个显著独立的预测 HCC 患 者较低无瘤生存时间的危险因素。
实施例 2 ： miR-99a 体外抑制 HCC 细胞的生长
分别采用如下序列 ( 由上海吉玛公司合成 ) 在人 HCC 细胞系 Hep3B 细胞中使得 miR-99a 高表达 ：
miR-99a ： AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG(SEQ ID NO ： 1)
对照 RNA ： UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO ： 7， 3′端加 TT 突出是小 RNA 序列 合成中常用的修饰方法， 对其功能没有影响， 主要是起到稳定核苷酸的作用 【Wilda， M. 等， Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion geneby RNA interference(RNAi).
Oncogene.2002 ； 21 ： 5176-5124】 )。
人 HCC 细胞系 HepG2、 SMMC7721、 Huh7 细胞购自上海生化细胞所。 使用 INTERFERin 转染试剂 (Polyplus 公司 ) 转染小 RNA， miR-99a 转染终浓度为 50nM， 对照 RNA 转染浓度为 50nM， 步骤按说明书标准步骤操作。
EdU 检测 ： 将 2×104 个细胞分别铺入 24 孔板并培养过夜， 次日转染对照 RNA 或 miR-99a， 并于转染后 72 小时检测。首先， 弃去培养上清， 换入 500μl 含 EdU50uM(RiboBio 公司 ) 的新鲜培养基 ； 然后 37℃孵育 2 小时， 流式细胞仪检测。
细胞增殖检测 ： 细胞的体外增殖使用 MTT 法检测。5×103 个细胞分别铺入 96 孔板 并培养过夜， 次日转染对照 RNA 或 miR-99a， 并于转染后 0、 24、 48、 72 小时检测。首先， 弃去 培养上清， 换入 100μl 含 MTT 0.5mg/ml(Sigma 公司 ) 的新鲜培养基 ； 然后 37℃孵育 4 小 时； 最后换入 100μl DMSO(Sigma 公司 ) 并振荡 10 分钟。最终吸光度使用 570nm 波长检 测。
细胞周期检测 ： 使用流式细胞术检测细胞周期。上述各细胞转染 72 小时后， 收取 细胞并 PB S 洗涤一遍， 随后使用 75％的乙醇 4℃固定 1 小时。固定后的细胞使用 PBS 洗三 遍， 并加入 1ml 含 40μg 碘化丙啶 (Sigma 公司 ) 和 100μg RNA 酶 A(Sigma 公司 ) 的 PBS。 最后使用 FACS Calibur 流式细胞仪检测细胞周期。 软琼脂克隆形成 ： 上述各细胞转染 24 小时后， 收取细胞， 各取 1×104 个用 0.3％低 熔点软琼脂 (Lonza 公司 ) 重悬， 铺入预铺 0.6％低熔点软琼脂的六孔板。10 天后检测克隆 形成数。
转染 miR-99a 后影响 HCC 细胞增殖的结果如图 2 所示， 影响 HCC 细胞周期的结果 如图 3 所示， 影响 HCC 细胞克隆形成的结果如图 4 所示。
结果显示 ： 在 HCC 细胞系中， 高表达 miR-99a 能够抑制细胞增殖、 抑制细胞周期和 克隆形成。
实施例 3 ： miR-99a 在裸鼠人肝癌荷瘤模型 SMMC-LTNM 中表达降低
按照文献方法构建人原代 HCC 组织皮下荷瘤裸鼠模型 SMMC-LTNM【Tao， WZ. 等， The tumor invasion and metastasis in the transplantation of transplanted human hepatocellular carcinoma into nude mice abdominal cavity and orthotopic hepatic tissue.Dier Junyi Daxue Xuebao.1998 ； 19 ： 54-56】 。 根据文献报道， 与常规使用的 HCC 细 胞系构建的裸鼠荷瘤模型相比， SMMC-LTNM 与人 HCC 的临床进展更为相似， 它能够发生局部 侵袭和其它器官的转移， 此外还能大量分泌甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein， AFP)。
利用实施例 1 所述 qRT-PCR 方法对人正常肝脏组织 ( 来自东方肝胆医院标本库 ) 和 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况进行检测， 结果显示 miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤 中表达量显著降低 ( 结果未示出 )。
实施例 4 ： miR-99a 抑制 HCC 细胞在体内的生长 利用人原代 HCC 组织皮下荷瘤裸鼠模型 SMMC-LTNM 观察 miR-99a 的体内抑瘤效果。 胆固醇偶联的 miR-99a 及胆固醇偶联的对照 RNA( 即 SEQ ID NO ： 7 所示的 RNA) 均由广州锐博公司合成 ( 胆固醇偶联后可的 miRNA 可自主通过细胞膜进入细胞内， 转染 效率较高 【Wolfrum， C. 等， Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs.Nat Biotechnol.2007 ； 25 ： 1149-1157.】 )。 体 内 转 染 RNA 时，将 10nmol(0.1ml) 胆固醇偶联的 miR-99a( 或胆固醇偶联的对照 RNA) 直接瘤内注射， 每三天注 射一次， 持续注射两周。
利用实施例 1 所述 qRT-PCR 方法对人正常肝脏组织和 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况进行检测。肿瘤体积的计算按文献操作 【Qi， R. 等， Notch1signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction ofcell cycle arrest and apoptosis.Cancer Res.2003 ； 63 ： 8323-8329】 。血清 AFP 的测定使用 AFP ELISA 试剂 盒 ( 购自 Autobio 公司 )。
miR-99a 瘤内注射后 SMMC-LTNM 肿瘤中 miR-99a 的表达情况如图 5 所示。结果显 示： 通过瘤内注射胆固醇偶联的 miR-99a 后， miR-99a 在 SMMC-LTNM 肿瘤中的表达显著增 高。
miR-99a 体内对肿瘤细胞生长和血清 AFP 含量作用试验结果如图 6 所示。结果显 示： 瘤内注射胆固醇偶联的 miR-99a 显著抑制了肿瘤的生长和血清 AFP 的含量。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
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