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1、(10)申请公布号 CN 102600244 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102600244 A *CN102600244A* (21)申请号 201210113447.0 (22)申请日 2012.04.18 A61K 36/60(2006.01) A61K 9/16(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 南京中医药大学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区仙林大道 138 号 (72)发明人 彭海燕 王文林 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (。
2、54) 发明名称 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂和制备 方法及应用 (57) 摘要 一种治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂及 制备方法和应用， 它是由楮实子、 黑豆、 泽兰或加 路路通按一定配比制成的颗粒剂， 其制备方法为 将楮实子、 黑豆加水煎煮、 浓缩、 过滤抽取得醇沉 浸膏 A， 将泽兰、 路路通醇提、 过滤获取醇沉浸膏 B， 再将 A 和 B 合并、 喷干、 制粒取得本发明的颗粒 剂、 、 型。 经体内外药理实验证实， 本发明药 物具有抗肝癌、 保护肝功能的作用， 能延长荷瘤动 物生存期。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局。
3、 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 1/1 页 2 1. 一种治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂， 其特征在于该颗粒剂是由下列重量配比 的原料药所制成 ： 楮实子 2 4 份， 黑豆 2 4 份。 2. 根据权利要求 1 所述的中药颗粒剂， 其特征在于在上述原料药中加一味辅药泽兰， 由楮实子 2 4 份， 黑豆 2 4 份， 泽兰 1 2 份所制成。 3. 根据权利要求 2 所述的中药颗粒剂， 其特征在于在上述原料药中再加一味辅助药路 路通， 由楮实子 2 4 份， 黑豆 2 4 份， 泽兰 1 2 份， 路路通 1 2 份所制成。 4. 一种制备权利要求 1、 2 或 。
4、3 所述的中药颗粒剂的方法， 其特征在于制备步骤如下 ： （1） 取楮实子 2 4 份， 黑豆 2 4 份， 第一次加 10 倍量水， 煎煮 1.5 小时， 倒出药液， 在药渣中加 8 倍量水再煎煮 1.5h， 弃去药渣， 合并药液后浓缩滤液， 向浓缩液中加入 95 乙醇调节含醇量至 80， 充分搅拌， 室温下静置 12h， 获取滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇 味， 取得醇沉清膏 A ； （2） 取泽兰 1 2 份第一次加 7 倍量 60% 乙醇， 第二次加 8 倍量 60% 乙醇分别回流 2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇味， 取得醇沉清膏 B ； （3） 取泽兰 。
5、1 2 份， 路路通 1 2 份， 第一次加 7 倍量 60% 乙醇， 第二次加 8 倍量 60% 乙醇分别回流 2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇味， 取得醇沉清膏 C ； （4） 将醇沉清膏 A、 或 A 和 B、 A 和 C 分别浓缩、 喷干， 分别加入适量淀粉混匀、 干式制粒， 干燥、 整粒后分别获得颗粒剂、 、 型。 5. 如权利要求 1、 2 或 3 所述的中药颗粒剂在制备治疗肝癌药物中的应用。 6. 如权利要求 1、 2 或 3 所述的中药颗粒剂在制备治疗保护肝功能药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102600244 A 2 1/7 页 3 治疗肝癌。
6、和保护肝功能的中药颗粒剂和制备方法及应用 0001 一、 技术领域 本发明涉及中草药技术领域， 具体地说是涉及一种治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒 剂和制备方法。 0002 二、 背景技术 原发性肝癌 （HCC） 是我国常见的恶性肿瘤之一， 年死亡率居恶性肿瘤第二位， 国际癌症 研究中心 (IARC) 估计 2000 年全球肝癌发病 56.4 万， 肝癌死亡 54.9 万， 其中中国肝癌发病 30.6万， 死亡30.0万。 由于我国肝癌患者多有HBV感染背景， 原有的肝脏炎症损伤、 肝硬化 或纤维化病变导致了手术、 化疗、 放疗等均存在较大风险， 有可能加重患者的肝脏损伤， 而 且难以阻止肿瘤的。
7、复发与扩散， 亦难以有效地改善患者的临床症状并提高其生活质量。现 代医学药物治疗肝癌疗效不高， 作用靶点单一， 长期应用单体化学药物多出现药物的敏感 性下降和相应的副作用， 并且化学药品要经过肝脏代谢、 加重肝脏负担， 有些药物的赋形剂 或溶解剂可能有一定毒性， 对肝脏造成伤害。 0003 中医药治疗肝癌以 “治未病” 思想为指导， 强调 “未病先防” 及 “已病防变” ， 在 患者尚未发病前通过中医药辨证施治阻止疾病的发生， 而对已发病者重视防止病情加重恶 化、 复发转移， 因而可以贯穿于疾病治疗的全过程。中医药治疗肝癌不是单纯消除肿瘤本 身， 而更注重肝癌患者全身机体的调理， 多采用扶正固。
8、本与祛邪抗癌两大治法。复习古今 有关肝癌治疗的文献资料， 常用扶正方法有健脾益气、 滋阴养血和温补脾肾， 祛邪法有理气 开郁、 活血化瘀、 清热解毒、 化痰软坚、 利水渗湿、 攻下逐水等法， 对比而言， 今方已逐渐过度 到扶正中更注重滋阴而不是温阳， 祛邪中更注重化瘀而不是理气。中医药治疗肝癌具有独 特的优势， 可以贯穿于肝癌治疗的全过程， 不仅对肿瘤本身具有抑制作用， 还能通过对患者 全身机体功能的调节， 改善其临床症状、 提高生活质量、 延长生存期。中成药使用的特色在 于能体现中医辨证施治的特色， 查新结果显示， 目前临床上常用治疗肝癌的中成药或以清 热解毒抗癌为主， 或以益气健脾扶正为主。
9、， 前者造成的弊端是 ： 久用苦寒清热之品易消灼 阴液， 耗伤正气， 损伤脾胃， 凝滞血脉， 尤其是以毒攻毒的抗癌之品久用易耗伤阴血， 损伤肝 体， 加重病情。 后者造成的弊端是 ： 久用益气之品易致气盛化火， 而火热不仅更易伤阴， 还易 迫血妄行， 对于肝癌阴虚血瘀证患者， 用药不对证， 弊大于利。我们注意到已有的抗肝癌中 成药鲜有养阴化瘀制剂， 因而临床上肝癌阴虚血瘀证患者无从选择。 0004 三、 发明内容 1、 发明目的 ： 提供一种治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂及其制备方法， 用于肝癌 阴虚血瘀证患者， 作为手术、 放、 化疗前后患者的辅助治疗、 晚期患者的姑息治疗， 使其症状 改。
10、善、 生活质量提高、 生存期延长。 0005 2、 技术方案 ： 本发明采用的中药颗粒剂针对肝癌病因病机演变以至形成阴虚血瘀的证型而立， 配方 合理， 用药简炼， 临床疗效确定。 方中楮实子性味甘寒， 补肾清肝， 利水明目， 为君药 ； 黑豆性 味甘平， 补肾养阴， 健脾解毒， 活血利水， 消肿下气， 配合楮实子加强滋水涵木之功， 为臣药 ； 泽兰性味苦辛微温， 入肝脾二经， 有活血化瘀、 行水消肿之效， 擅长化瘀而为佐药 ； 路路通性 说 明 书 CN 102600244 A 3 2/7 页 4 味苦平， 通行十二经， 具有祛风通络， 利水除湿的功效， 引他药走行全身而达病所， 为使药。 全。
11、方二补二泻， 药性平和， 扶正不留邪， 祛邪不伤正， 共奏滋补肝肾， 化瘀除湿之效。 0006 本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的 ： 一种治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂， 其特征在于该颗粒剂是由楮实子24份， 黑豆 2 4 份所制成的。 0007 上述颗粒剂中加一到二味药物， 即一味泽兰 1 2 份， 再加一味路路通 1 2 份， 增加一味泽兰具有活血化瘀， 行水消肿的作用， 再增加一味路路通具有祛风通络， 利水除湿 的功效。 0008 上述颗粒剂的制法如下 ： （1） 取楮实子 2 4 份， 黑豆 2 4 份， 第一次加 10 倍量水， 煎煮 1.5 小时， 倒出药液， 在药渣中加。
12、 8 倍量水再煎煮 1.5h， 弃去药渣， 合并药液后浓缩滤液， 向浓缩液中加入 95 乙醇调节含醇量至 80， 充分搅拌， 室温下静置 12h， 获取滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇 味， 取得醇沉清膏 A ； （2） 取泽兰 1 2 份第一次加 7 倍量 60% 乙醇， 第二次加 8 倍量 60% 乙醇分别回流 2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇味， 取得醇沉清膏 B ；（3） 取泽兰 1 2 份， 路 路通 1 2 份， 第一次加 7 倍量 60% 乙醇， 第二次加 8 倍量 60% 乙醇分别回流 2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇味， 取得。
13、醇沉清膏 C。 0009 （4） 将醇沉清膏 A、 或 A 和 B、 A 和 C 分别浓缩、 喷干， 分别加入适量淀粉混匀、 干式 制粒， 干燥、 整粒后分别获得颗粒剂、 、 型。 0010 所述的中药颗粒剂在制备治疗肝癌药物中的应用。 0011 所述的中药颗粒剂在制备治疗保护肝功能药物中的应用。 0012 3、 有益效果 ： 本发明中药颗粒剂具有治疗肝癌和保护肝功能、 消除腹水的功能， 可用于晚期原发性 肝癌的姑息治疗、 肝癌手术及放、 化疗前后的辅助治疗。临床研究显示， 治疗肝癌有效率为 77.91%， 治疗肝癌腹水总有效率为 94.4%， 治疗化疗肝损害的总有效率为 87.5%， 治疗药。
14、物 性肝损伤的总有效率为98.4%。 动物实验研究显示， 中药颗粒剂对DEN诱发的大鼠肝癌模型 具有降低肝癌结节数、 肝 / 体质量比、 血清及肝组织匀浆的 GST、 血清 ALT、 AST 水平等作用， 对小鼠移植性肝癌的肿瘤抑制率为 46.85%， 并能减轻肿瘤造成的肝功能损伤， 还能使艾氏 腹水癌腹水型小鼠的生存期延长， 体外细胞实验研究显示， 中药颗粒剂对肝癌细胞株 HepG2 的最高抑制率为 91.48%， 对 SMMC-7721 的最高抑制率为 89.42%。 0013 四、 具体实施方式 实施例 1 ： 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂的制备方法 取楮实子 2 4 份， 黑豆 2。
15、 4 份， 第一次加 10 倍量水， 第二次加 8 倍量水分别煎煮 1.5h， 弃去药渣， 药液浓缩滤液， 向浓缩液中加入 95乙醇调节含醇量至 80， 充分搅拌， 室温下静置12h， 获取滤液低温、 减压， 回收乙醇至无醇味， 取得醇沉清膏A ； 取泽兰12份 第一次加7倍量60%乙醇， 第二次加8倍量60%乙醇分别回流2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减 压、 回收乙醇至无醇味， 取得醇沉清膏 B ； 取泽兰 1 2 份， 路路通 1 2 份， 第一次加 7 倍 量 60% 乙醇， 第二次加 8 倍量 60% 乙醇分别回流 2h， 弃去药渣， 将滤液低温、 减压， 回收乙醇 至无醇味， 取。
16、得醇沉清膏 C ； 将醇沉清膏 A、 或 A 和 B、 A 和 C 分别浓缩、 喷干， 分别加入适量淀 说 明 书 CN 102600244 A 4 3/7 页 5 粉混匀、 干式制粒， 干燥、 整粒后分别获得颗粒剂、 、 型。实施例 2 ： 治疗肝癌和保护肝 功能的中药颗粒剂型对 DEN 所致大鼠肝癌形成的防治作用 1 动物与试剂 健康雄性 SD 大鼠 60 只， 体重 180-220g， 随机分为 5 组， 即 ： 正常组 (A)、 模型组 (B)、 中 药颗粒剂高(C)、 中(D)、 低(E)剂量组。 二乙基亚硝胺(DEN)， Sigma公司产品， 货号:N0756， 广洲泛宏贸易有限公。
17、司代销。 0014 2 实验方法 适应性喂养 3d 后， 除 A 组外， 参考文献法开始造模 ： 用灭菌自来水配制浓度为 95g/ mL 的 DEN 溶液供实验组大鼠自由饮用， 每天更换 1 次， 连续饮用 4 周后， 改饮一般的灭菌自 来水 4 周， 再继续饮含 95g/mL 的 DEN 溶液分笼饲养， 造模后第 4 周开始分组用药 ： C、 D、 E 组分别给予浓度为 2.0g/ml、 1.0g/ml、 0.5g/ml 的中药颗粒剂溶液灌胃， 给药容积为 5mL/ kg， A、 B 组给予等容积生理盐水灌胃。给药 10 周后停药， 正常喂养， 第 18 周处死动物。观 察大鼠一般情况、 体。
18、重、 肝癌结节、 肝 / 体重比、 病理形态、 血清 AFP、 GST、 ALT、 AST。 0015 3 实验结果 结果显示， DEN 造成大鼠肝脏形成癌结节， 与模型组对照， 给予中药颗粒剂的用药组大 鼠肝脏表面癌结节数明显减少， 模型组的肝 / 体重明显升高， 而给予中药颗粒剂的用药组 较接近于正常组 （详见表 1） ， 大鼠血清及肝组织匀浆 GST 比较见表 2， 大鼠血液生化检测结 果见表3。 肝脏病理观察显示， 各实验组的大鼠肝脏差别显著， 正常组大鼠肝脏外观正常， 表 面无结节， 给 DEN 的各组肝脏表面均可见到大小不等的灰白色结节， 明显不同于正常组的 肝脏表面光滑。 光镜下。
19、， 模型组大鼠肝脏肿大， 表面布满大小不一的灰白结节， 伴出血斑点， 光镜下呈典型的柱状及腺管样癌巢结构， 且周围组织肝细胞异型性明显， 伴癌细胞浸润。 10 倍高倍镜下观察， 除 A 组外， 各组肝脏的小叶结构都被破坏， 均可见有肿瘤细胞。 0016 表 1 大鼠体重、 肝重、 肝 / 体重比 分组体重 (g)肝重 (g)肝 / 体重比 (%) A 组502.3429.3912.551.272.498 B 组359.2787.9418.8315.625.241 C 组456.8857.5813.951.833.053 D 组436.9266.7213.871.963.174 E 组423.6。
20、787.2616.074.873.793 注 ： C、 D、 E 组肝 / 体重比与 B 组两两对比， P0.05。 0019 实施例 3 ： 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂型对小鼠移植性肝癌的体内作 用 1 动物与试剂 昆明种健康成年小鼠， 均为雄性， 平均体重 19.21.49g， 随机分为 6 组， 每组 10 只 ： 空 白组(A)， 模型阴性对照组(B)、 5-Fu阳性对照组(C)、 中药颗粒剂高剂量组(D)、 中药颗粒剂 中剂量组 (E)、 中药颗粒剂低剂量组 (F)。5-Fu， 250mg/10 ml/ 瓶， 天津金耀氨基酸有限公 司， 批号 ： 0311171。 0020 2。
21、 实验方法 除A组外， 均接种肝癌Heps造模 ： 选取生长旺盛的肝癌Heps腹水小鼠， 颈椎脱臼处死， 置净化台中， 消毒腹部皮肤， 抽取腹水， 苔盼蓝染色后光镜下观察活细胞数 95%， 以注射用 水稀释， 制成瘤细胞悬液。 取0.2 ml注射于每只小鼠前肢右腋皮下， 制造移植性肝癌的实体 瘤模型。自造模第 2 天起给药 ： A、 B 组每天灌服生理盐水 0.3ml， D、 E、 F 组分别每天予浓度 为 2.0g/ml、 1.0g/ml、 0.5g/ml 的中药颗粒剂溶液 0.3ml 灌胃， C 组每天按小鼠体重 40 mg/ kg 腹腔注射 5-Fu 溶液 0.2ml。连续用药 7 天，。
22、 停药 24h、 禁食不禁水后处死小鼠。摘眼球 取血 1.5 ml， 立即离心取血清， 检测血清 ALT、 AST、 UREA、 CREA， 完整剥离脾脏、 胸腺， 精确称 重， 按文献公式计算脾指数及胸腺指数 ： 脾指数 = 脾脏重量 (mg)/ 体重 (g)10， 胸腺指数 胸腺重量 (mg) 体重 (g) 10。 0021 3 实验结果 结果显示， A 组一般状态良好， B 组由于肿瘤生长较快， 小鼠表现为消瘦、 皮毛不光泽、 不安、 精神不振 ； C 组小鼠肿瘤生长较慢， 但食欲欠振， 精神稍差 ； D、 E、 F 组小鼠体重均增加 明显， 精神状态好， 食欲旺盛， 活动力强， 肿瘤生。
23、长相对于 B 组较慢。比较造模前、 用药中期 及处死前体重可见 ： B 组小鼠体重前后对比无显著性差异， 其余各组小鼠体重均有所增加， 而尤其以 E、 F 组为显著。血生化结果显示， 与 A 组对照， 接种肝癌的小鼠肝功能受到损伤， 尤其以 B 组为显， 中药颗粒剂及 5-Fu 作用后小鼠肝功能有所改善， 且以 D、 E 组作用为最好， 与 A 组对比差异无显著性， 说明有保护肿瘤造成的肝功能损伤的作用。与 A 组比较， 接种肿 瘤后小鼠的脾、 胸腺指数下降， 但中药颗粒剂治疗组小鼠脾、 胸腺指数有改善， 而 5-Fu 对小 鼠脾、 胸腺指数的影响不明显， 详见表 4。 0022 表 4 小鼠。
24、各组肝功能及脾、 胸腺指数比较 组别 （n=10）ALT(IU/L)AST(IU/L)脾指数胸腺指数 A 组80.3317.54460.7877.8177.929.8237.565.18 B 组198.1137.411787.11299.0845.467.7329.325.24 C 组110.4416.66*687.11136.99*55.699.0727.994.63 D 组92.3317.65*471.8975.98*75.769.69*36.965.22* E 组82.1115.07*479.2299.54*72.688.96*36.485.96* F 组107.1415.23*627.。
25、36108.64*65.579.07*34.943.46* 注 ： * 与 B 组对照， P0.01， * 与 B 组对照， P0.05。 说 明 书 CN 102600244 A 6 5/7 页 7 0023 实施例 4 ： 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂型对 EAC 腹水型小鼠的体内作用 1 动物与试剂 昆明种健康成年小鼠 50 只， 均为雄性， 平均体重 19.21.49g， 随机分为 5 组， 每组 10 只 ： 模型阴性对照组 (A)、 5-Fu 阳性对照组 (B)、 中药颗粒剂高剂量组 (C)、 中药颗粒剂中剂 量组 (D)、 中药颗粒剂低剂量组 (E)。5-Fu， 250mg/。
26、10 ml/ 支， 天津金耀氨基酸有限公司， 批 号 ： 0311171。 0024 2 实验方法 在无菌条件下， 选择接种后 710 天一般状况较好的瘤种动物， 仰卧固定， 消毒皮肤， 抽 取腹水， 用 0.9% 生理盐水稀释成 1 3 的溶液， 取上述腹水， 每只小鼠腹腔注射 0.2ml。自 造模后第 2 天起给药 ： A 组每天灌服生理盐水 0.3ml， C、 D、 E 组分别每天予浓度为 2.0g/ml、 1.0g/ml、 0.5g/ml 的中药颗粒剂药液 0.3ml 灌胃， B 组每天按小鼠体重 30 mg/kg 腹腔注射 5-Fu 溶液 0.2ml。 0025 3 实验结果 模型阴。
27、性对照组 (A) 小鼠在接种 EAC 癌细胞后腹部增大速度最快， 7 天左右即可见腹 部明显增大， 其余各组 7 天后才见小鼠腹部逐渐增大， 较 A 组为慢。在用药过程中， 中药颗 粒剂方组 （C、 D、 E） 小鼠的活动力、 进食、 精神状况均较好， 表现为活动力强， 食欲旺盛， 精神 尤佳， 整个用药过程中未见小鼠异常活动。而 5-Fu 组 (B) 与 A 组小鼠均见毛发较稀疏， 不 整齐， 无光泽， 食欲下降， 活动能力较差。 在观察中发现， 给予中药颗粒剂的小鼠尿量明显增 加， 垫料潮湿需每天更换， 而 A、 B 组小鼠尿量较少。从体重的增长情况看， 艾氏腹水癌的潜 伏期为 46 天，。
28、 生长旺盛期从第 7 天开始， 此时， 由于腹水形成， 荷瘤小鼠的体重增长迅速， 证明本实验的诱瘤率为 100%。5-Fu 及中药颗粒剂组小鼠的体重增长速度均较模型阴性对 照组减缓， 具体结果见表 5。 0026 表 5 各组小鼠体重变化对比 组别 种瘤前 （g）种瘤后 5d（g）种瘤后 10d（g） A 组 19.31.4229.43.2735.32.36 B 组 19.21.5425.62.8628.93.42 C 组 19.51.4323.92.9427.62.26 D 组 19.41.4624.33.4229.32.75 E 组 19.11.5128.22.8731.33.12 经腹腔。
29、接种 EAC 癌细胞悬液后， 模型阴性对照组小鼠一般在 12 日左右死亡， 说明实验 条件稳定， 符合评定标准。经用中药颗粒剂方或 5-Fu 后的小鼠， 与模型阴性对照组比较， 存 活时间均不同程度地延长， 尤以中药颗粒剂方中、 高剂量组为明显， 各组小鼠的平均生存时 间及生命延长率见表 6。 0027 表 6 各组小鼠生存期对比 组别 剂量平均生存时间 （d）生命延长率 （%） A 组 -12.34.12- B 组 40mg/kg19.43.86*57.72 C 组 2.0g/ml23.73.09*92.68 D 组 1.0g/ml22.83.24*85.37 E 组 0.5g/ml19.8。
30、3.19*60.98 注 ： 与空白对照组比较， *P0.05， * P0.01 说 明 书 CN 102600244 A 7 6/7 页 8 实施例 5 ： 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂型对急性肝损伤小鼠肝功能的保护 作用 1 动物与试剂 昆明种健康成年小鼠 60 只， 均为雄性， 平均体重 18-22g， 按照随机数字表法分为 6 组 ： 正常组 （A） 、 模型组 （B） 、 阳性药物组 (C， 联苯双酯片， 0.15g/kg)、 中药颗粒剂高 （D） 、 中 （E） 、 低 （F） 剂量组。四氯化碳分析纯， 北京精细化学品有限公司， 分子量 153.82。 0028 2 实验方法 。
31、适应性喂养 1 周后给药 ： 分别给予浓度为 2.0g/ml、 1.0g/ml、 0.5g/ml 的中药颗粒剂溶 液 0.3ml 灌胃， 模型组给予等容积蒸馏水灌胃， 阳性药物组按 0.15g/kg 给予等容积联苯双 酯溶液， 每天 1 次， 连续 30d。末次给药后 1h， 除 A 组外， B、 C、 D、 E、 F 组均腹腔注射 0.1% CCl4 花生油溶液 10ml/kg， A 组腹腔注射等体积花生油。禁食不禁水， 16h 后颈椎脱臼法处死小 鼠， 摘眼球取血。检测血清 ALT、 AST、 肝组织匀浆 MDA、 SOD 含量， 观测药物对肝功能的保护 作用。 0029 3 实验结果 腹。
32、腔注射 CCl4后模型组小组表现出精神萎靡， 进食减少， 反应迟钝， 大便稀软不成形， 而各用药组小鼠一般情况较模型组为好， 尤其是D、 E组小鼠进食及大便情况接近于A组。 模 型组小鼠血清 ALT、 AST 含量显著增高， 而联苯双酯及中药颗粒剂用药组小鼠血清 ALT、 AST 水平较模型组有所降低， 模型组小鼠肝匀浆 SOD 活性降低、 MDA 含量增加， 而联苯双酯及中 药颗粒剂用药组小鼠 SOD 活性较模型组升高、 MDA 含量降低， 组间对照有显著性差异， 详见 表 7。 0030 表 7 中药颗粒剂对急性肝损伤小鼠 ALT、 AST、 SOD、 MDA 的影响 ALT(U/L)AS。
33、T(U/L)SOD（U/mg）MDA(nmol/mL) A组 35.8710.97*47.7111.25*325.7821.06*0.760.25* B组 320.1420.54235.9816.23141.5323.421.890.31 C组 127.9228.85*86.9823.85*248.7216.08*0.960.23* D组 136.446.77*85.572.62*259.4619.12*0.920.24* E组 197.0720.22*101.4310.43*237.3820.58*1.350.29* F组 215.7620.58*128.7324.74*185.5221.3。
34、5*1.470.36* 注 ： 与 B 组比较， *P0.05， *P0.01。 0031 实施例 6 ： 治疗肝癌和保护肝功能的中药颗粒剂型对人肝癌细胞株 HepG2、 SMMC-7721 的生长抑制作用 1 制备含药血清 健康雄性SD大鼠30只， 体重180-220g， 随机分为5组， 即 ： 正常组 （A） 、 阳性药物组(B， 5-Fu ， 40mg/kg)、 中药颗粒剂高 （C） 、 中 （D） 、 低 （E） 剂量组。C、 D、 E 组给药容积为 10mL/kg 灌胃， B 组每天按小鼠体重 40 mg/kg 腹腔注射 5-Fu 溶液 0.2ml， A 组给予等容积生理盐水 灌胃。。
35、每日 1 次， 持续 7d， 末次给药 1h 后， 无菌条件下由腹主动脉取血， 离心分离血清， 560C 水浴中灭活 30min， 分装， -800C 冷冻保存备用。 0032 2 细胞培养 将冻存的人肝癌细胞 HepG2、 SMMC-7721 按常规方法复苏， 接种于含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液中， 传代培养， 至细胞呈指数生长期时， 弃培养液， 加入 0.25% 胰蛋白酶消 化 3 分钟， 用 RPMI-1640 培养液中止消化后弃去， 重新加入含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培 说 明 书 CN 102600244 A 8 7/7 页 9 养液吹打， 调。
36、整细胞数为 1105/ml， 接种于 96 孔培养板， 每孔加细胞悬液 90l。 0033 3 MTT 检测 将培养的细胞接种于 96 孔的培养板中， 置于 370C、 5%CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱 中继续培养 24 ， 弃去培养液， 然后每孔加入 RPMI-1640 培养液 70l， 空白组加入无含药 的空白大鼠血清30l和PBS组加入含10%小牛血清的培养液30l， 含药血清组用10%小 牛血清调整浓度， 使终浓度分别为10%， 20%， 30%， 每孔终体积均为100l， 每组6孔。 C组为 30l 中药大剂量大鼠纯含药血清 ； D 组为 20l 中药中剂量大鼠含药血清及 10。
37、l 的 10% 小牛血清 ； E组为10l中药小剂量大鼠含药血清及20l的10%小牛血清。 继续培养24h， 每孔加入 MTT 溶液， 37孵育 3h， 吸去每孔中的培养液， 每孔加入二甲基亚砜 （DMSO） ， 振荡 后采用酶联免疫反应检测仪测定各孔 OD 值， 测定波长为 570nm， 调零孔只含有 DMSO。所得 各孔平均 OD 值按下述公式计算肿瘤细胞抑制率 ： 抑制率 (%)=( 对照组平均 OD 值给药组 平均 OD 值 )/ 对照组平均 OD 值 100%。检测药物对肝癌细胞的体外抑制作用。 0034 4 实验结果 结果表明中药颗粒剂对 HepG2 有明显的抑制作用， 各浓度含药。
38、血清的 OD 值与 PBS 组均 有显著差异， 高、 中浓度含药血清的 OD 值与空白血清组对照有显著差异， 高浓度含药血清 的抑瘤率可达 91.48%， 高于含 5-Fu 血清组， 结果见表 8。对 SMMC-7721 亦有抑制作用， 高、 中浓度含药血清的 OD 值与 PBS 组、 空白血清组对照均有显著差异， P0.001， 高浓度含药血 清的肿瘤细胞抑制率可达 89.42%， 高于 5-Fu 组， 结果见表 9。 0035 表 8 中药颗粒剂对 HepG2 肝癌细胞的作用 组别 OD 值肿瘤细胞抑制率 (%) PBS0.7400.053- A 组 0.6530.049- B 组 0.2。
39、470.05584.75 C 组 0.0630.021* 91.48 D 组 0.1200.020 83.86 E 组 0.1770.025 76.23 注 ： 与 B 组比较， *P0.01 ； 0.05。与 PBS 比较， P0.001 ； P0.005 ； P0.05。 0036 表 9 中药颗粒剂对 SMMC-7721 肝癌细胞的作用 组别 OD 值肿瘤细胞抑制率 (%) PBS0.6330.107 A 组 0.5870.021- B 组 0.2530.01560.03 C 组 0.0670.021* 89.42 D 组 0.0700.017* 88.94 E 组 0.1730.038 72.67 注 ： 与 B 组比较， *P0.01 ； P0.05。与 PBS 比较， P0.001 ； P0.01。 说 明 书 CN 102600244 A 9 。