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1、(10)申请公布号 CN 102614532 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102614532 A *CN102614532A* (21)申请号 201210094346.3 (22)申请日 2012.04.01 A61K 49/12(2006.01) (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301 号 (72)发明人 陈秋云 陶艮平 刘颖奇 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (54) 发明名称 一种多功能肿瘤成像剂、 制备方法及应用 (57) 摘要 本发明一种多功能肿瘤成像剂、 制备方法及 。
2、应用， 属于肿瘤成像剂领域。它具备肿瘤靶向性、 磁共振成像和抗肿瘤的特性。以 Fe3O4为核， 通过 微乳液方法制备了包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为 壳的纳米颗粒。 SiO2的表面修饰了肿瘤靶向肽RGD 及甲氧基聚乙二醇， 最终得到了一种肿瘤靶向性 多功能的纳米复合成像剂。具有肿瘤靶向肽诱导 的肿瘤细胞主动靶向性， 可以用于肿瘤细胞与正 常细胞的磁共振成像鉴别剂， 可运用于临床磁共 振成像监测治疗用药， 实现肿瘤治疗过程的时时 监测， 而目前临床运用的抗肿瘤药物仅具有肿瘤 抑制性能， 无法实现药物治疗过程的实时监测。 (51)Int.Cl. 权利要求。
3、书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种多功能肿瘤成像剂， 其结构式为 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD， 其中 LMnCl 为二氯 N-（2- 丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰， RBITC 为异硫氰酸罗丹明 B， RGD 为精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸三肽， PEG 为甲氧基聚乙二醇， 其中 表示核壳结构。 2. 权利要求 1 所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法， 其特征在于按照下述步骤进 行 ：。
4、 （1） 将Fe3O4和四甲氧基硅烷 （TEOS） 以质量比1 ： 11 ： 6， 混合并超声分散于三氯甲烷， 其中 Fe3O4与三氯甲烷质量比 1 ： 1 1 ： 10， 再加入 Fe3O4的量 0.1 1.0 倍的十六烷基三 甲氧基溴化銨 （CTAB） 水溶液， 接着加入水和 1 5 M 的 NaOH 溶液 ； ， 其中水与 TEOS 的质量 比例 1 ： 1 1 ： 10， 其中 NaOH 与 TEOS 的质量比例 1 ： 2 1 ： 10， 温度控制在 30 70 C 制 成溶液 A ； 将 TEOS 和 异硫氰酸罗丹明 B(RBITC) 按照质量比 4 ： 1 1 ： 1， 混合后制。
5、成溶液 B ； 将溶液B加入溶液A中， 再加入乙酸乙酯， 其中乙酸乙酯用量为反应液体积的5%40%， ， 反应 1 30 min， 后加入氨丙基三乙氧基硅烷 （APS） ， 其中 APS ： Fe3O4质量比为 10 ： 1 1 ： 1， 搅拌反应 1 5 h， 磁性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次得 RBITC-Fe3O4SiO2； （2） 将精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸三肽 ( (RGD)、 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 N- 羟 基丁二酰亚胺 （NHS） 混合， 其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 5 ： 2 1 ： 1 ： 4， 加入一定量的 D。
6、MF 至固体刚好溶解， 其中质量比 DMF ： NHS 为 2 ： 1 8 ： 1， 溶液在常温下搅拌反应 10 36 h ； 再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2， 继续搅拌反应1036 h ； 结束反应， 磁性分离 得固体 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD ； （3）称取甲氧基聚乙二醇酸溶于 DMF 制成饱和溶液中， 其中甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为4:11:2， 再依次加入DCC和NHS， 其中质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:13:2:4， 让其在常温下搅拌反应1036 h ； 再将RBITC-Fe3O4 。
7、SiO2-RGD 加入其中， 常温搅拌反应 10 36 h 后加入一定量的乙醇超声分散 5 分钟， 其中与 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为1 ： 16 ： 1 ； 然后加入顺磁性抗肿瘤配合物二氯N- （2-丙 酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰 , 其中质量比 LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 为 1 ： 2 4 ： 1， 混和溶液在 40 80 C 下搅拌反应 1 6 h ； 磁性分离， 真空干燥得产物一种 肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂。 3. 根据权利要求 2 所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法， 其特征在于其中步骤 （1。
8、） Fe3O4为粒径20 nm磁性纳米Fe3O4， 磁性纳米Fe3O4和TEOS质量比为1 ： 2 ； Fe3O4与三氯甲 烷质量比为 1 ： 2 ； 再加入 Fe3O4的量 0.5 倍的 CTAB 水溶液， 水与 TEOS 的质量比例为 1 ： 4.5 ； NaOH 溶液为 2 M， 其中 NaOH 与 TEOS 的质量比例为 1 ： 5， 温度控制在 70 C ； TEOS 和 RBITC 的质量比为 2 ： 1 ； 其中乙酸乙酯用量为反应液体积的 20%， 反应 10 min ； 其中 APS ： Fe3O4质 量比为 5 ： 1， 搅拌反应 3 h。 4. 根据权利要求 2 所述的一种。
9、多功能肿瘤成像剂的制备方法， 其特征在于其中步骤 （2） 中将 RGD、 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 N- 羟基丁二酰亚胺 （NHS） 以质量比 1 ： 1.5 ： 1.5 混合， 加入 NHS 质量 4 倍的 DMF 至固体刚好溶解， 溶液在常温下搅拌反应 24 h 后。 5. 根据权利要求 2 所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法， 其特征在于其中步骤 （3） 中甲氧基聚乙二醇酸的分子量 2000 ； 称取 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 两倍质量的甲氧基 聚乙二醇酸溶于 DMF 制成饱和溶液， 其中 DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸质量比为 3:3:2 ； 让 。
10、其在常温下搅拌反应 24 h ； 再将 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 加入其中， 继续常温搅拌反应 24 权 利 要 求 书 CN 102614532 A 2 2/2 页 3 h 后加入 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量 3 倍的乙醇超声分散 5 分钟 ； 然后加入 RBITC-Fe3O4 SiO2-RGD 质量两倍的顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N- （2- 丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰， 混和溶液在 80C 下搅拌反应 4 h。 6. 权利要求 1 所述的一种多功能肿瘤成像剂的应用， 具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞 主动靶向性， 可以用于肿瘤细胞。
11、与正常细胞的磁共振成像鉴别剂。 权 利 要 求 书 CN 102614532 A 3 1/7 页 4 一种多功能肿瘤成像剂、 制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种多功能肿瘤成像剂及其制备技术， 属于肿瘤成像剂领域， 特指靶 向性肿瘤成像剂及其制备方法和应用。 0002 背景技术 0003 由于肿瘤细胞的过度增殖和对正常组织的侵犯、 转移， 癌症成为威胁人类健康的 严重疾病。然而目前在临床肿瘤诊断和治疗中广泛应用的药物多为非选择性药物， 体内分 布广泛， 常规治疗剂量即可对正常组织器官产生显著的毒副作用， 导致患者不能耐受， 故提 高药物的肿瘤选择性， 减少其在非靶向部位的聚集是提。
12、高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向性 药物能最大限度地进入到靶区， 并在靶区浓集， 直接作用于病变组织、 器官和细胞， 延长药 物与靶部位的作用时间， 使到达需药部位的药量增加， 从而减少用药量、 药物的毒副作用， 达到高效低毒的治疗效果。生物靶向纳米药物和磁性靶向纳米药物 （Cho H S, Dong Z Y, Pauletti G M, Zhang J M, Xu H, Gu H C, Wang L M, Ewing R C, Huth C, Wang F, Shi D L. Fluorescent, superparamagnetic nanospheres for drug storage,。
13、 targeting, and imaging: a multifunctional nanocarrier system for cancer diagnosis and treatment, ACS Nano, 2010, 4(9):5398-5404） 是目前靶向纳米药物研究的两大热点， 其中具有核壳结构的纳米颗粒 （Gao J H, Liang G L, Cheung J S. Multifunctional yolk-shell nanoparticles: a potential MRI contrast and anticancer agent, J. Am. Chem. Soc。
14、., 2008, 130:11828-11833） 引起了人们的关注， 二氧化硅具备良好的生物 安全性， 表面的硅羟基易于修饰， 可与各种生物分子通过多种方式偶联且不会对生理活动 造成危害。使得二氧化硅包覆的纳米颗粒 (Jiang S, Gnanasammandhan M K, Zhang Y. Optical imaging-guided cancer therapy with fluorescent nanoparticles, J. R. Soc. Interface, 2010, 7:3-18) 在核壳结构的纳米粒子中脱颖而出。 0004 发明内容 本发明报道了一种新型多功能的纳米复合。
15、成像剂， 它具备肿瘤靶向性、 磁共振成像和 抗肿瘤的特性。以粒径 20 nm 磁性纳米四氧化三铁 （Fe3O4） 为核， 通过微乳液方法制备了包 裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的 纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2， 其中 表示核壳结构） 。接着在 SiO2的表面修饰了肿瘤靶向 肽精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸 (RGD) 及甲氧基聚乙二醇 （PEG） ， 获得肿瘤靶向纳米多孔药 物载体 （RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD) ； 最后将顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N-（2- 丙酸乙酯 基） -N， N- 二 （2- 。
16、吡啶甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） 吸附到多孔药物载体中最终得到了一种 肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂 （LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD） 。 0005 一种多功能肿瘤成像剂， 其结构式为 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD， 其中 LMnCl 为二氯 N-（2- 丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰， RBITC 为异硫氰酸罗丹 明 B， RGD 为精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸三肽， PEG 为甲氧基聚乙二醇 , 其中 表示核壳结 说 明 书 CN 102614532 A 4 2/7 页 5 构。 000。
17、6 上述一种多功能肿瘤成像剂的制备方法， 按照下述步骤进行 ： （1） 将 Fe3O4和四甲氧基硅烷 （TEOS） 以质量比 1 ： 1 1 ： 6， 混合并超声分散于三氯甲 烷， 其中 Fe3O4与三氯甲烷质量比 1 ： 1 1 ： 10， 再加入 Fe3O4的量 0.1 1.0 倍的十六烷基 三甲基溴化銨 （CTAB） 水溶液， 接着加入水和 1 5 M 的 NaOH 溶液 ； 其中水与 TEOS 的质量 比例 1 ： 1 1 ： 10， 其中 NaOH 与 TEOS 的质量比例 1 ： 2 1 ： 10， 温度控制在 30 70 C 制 成溶液A ； 将TEOS和 RBITC按照质量比4。
18、 ： 1 1 ： 1， 混合后制成溶液B ； 将溶液B加入溶液 A 中， 再加入乙酸乙酯， 其中乙酸乙酯用量为反应液体积的 5% 40%， 反应 1 30 min 后加 入氨丙基三乙氧基硅烷 （APS） ， 其中 APS ： Fe3O4质量比为 10 ： 1 1 ： 1， 搅拌反应 1 5 h， 磁 性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次得荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多孔磁性纳米 四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2， 其中 表示核壳结构） 。 0007 （2） 将精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸三肽 (RGD)、 1,3- 二环己基碳二亚胺。
19、 （DCC） 和 N- 羟基丁二酰亚胺 （NHS） 混合， 其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 5 ： 2 1 ： 1 ： 4， 加入一定量 的 DMF 至固体刚好溶解， 其中质量比 DMF ： NHS 为 2 ： 1 8 ： 1， 溶液在常温下搅拌反应 10 36 h ； 再加入上述干燥后的固体 RBITC-Fe3O4SiO2， 继续搅拌反应 10 36 h ； 结束反应， 磁 性分离得表面修饰 RGD 的荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁 为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2-RGD） 。 0008 （3） 称。
20、取甲氧基聚乙二醇酸溶于 DMF 制成饱和溶液中， 其中甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为4:11:2， 再依次加入DCC和NHS， 其中质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:13:2:4， 让其在常温下搅拌反应1036 h ； 再将RBITC-Fe3O4 SiO2-RGD 加入其中， 常温搅拌反应 10 36 h 后加入一定量的乙醇超声分散 5 分钟， 其中与 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为1 ： 16 ： 1 ； 然后加入顺磁性抗肿瘤配合物二氯N- （2-丙 酸乙酯基） -N， N-二 （2-吡啶甲基） 胺合锰 （简写为LMn。
21、Cl） ， 其中质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4 SiO2 -RGD 为 1 ： 2 4 ： 1， 混和溶液在 40 80 C 下搅拌反应 1 6 h ； 磁性分离， 真空干 燥得产物 ： 一种肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂 （LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD） 。 0009 其中步骤 （1） Fe3O4为粒径 20 nm 磁性纳米 Fe3O4中， 磁性纳米 Fe3O4和四甲氧基硅 烷 （TEOS） 质量比为 1 ： 2 ； Fe3O4与三氯甲烷质量比为 1 ： 2 ； 再加入 Fe3O4的量 0.5 倍的 CTAB 水溶液， 水与 TEOS 的质量比例为。
22、 1 ： 4.5 ； NaOH 溶液为 2 M， 其中 NaOH 与 TEOS 的质量比例 为 1 ： 5， 温度控制在 70 C ； TEOS 和 RBITC 的质量比为 2 ： 1 ； 其中乙酸乙酯用量为反应液体 积的20%， 反应10 min ； 其中氨丙基三乙氧基硅烷 （APS） ： Fe3O4质量比为5 ： 1， 搅拌反应3 h。 0010 其中步骤 （2） 中将精氨酰 - 甘氨酰 - 天冬氨酸 (RGD)、 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 N- 羟基丁二酰亚胺 （NHS） 以质量比 1 ： 1.5 ： 1.5 混合， 加入 NHS 质量 4 倍的 DMF 至 固体刚好溶。
23、解， 溶液在常温下搅拌反应 24 h 后。 0011 其中步骤 （3） 中甲氧基聚乙二醇酸的分子量 2000 ； 称取 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 两 倍质量的甲氧基聚乙二醇酸溶于 DMF 制成饱和溶液， 其中 DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸质 量比为 3:3:2 ； 让其在常温下搅拌反应 24 h ； 再将 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 加入其中， 继续常 温搅拌反应 24 h 后加入 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量 3 倍的乙醇超声分散 5 分钟 ； 然后加入 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量两倍的顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N-（2- 丙酸。
24、乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） ， 混和溶液在 80C 下搅拌反应 4 h。 说 明 书 CN 102614532 A 5 3/7 页 6 0012 上述一种多功能肿瘤成像剂的应用， 具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞主动靶向 性， 可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂。 0013 本发明的优点 ： 上述所说的一种多功能肿瘤成像剂的应用， 具有肿瘤靶向肽诱导 的肿瘤细胞主动靶向性， 可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂， 能借助磁共 振成像技术或荧光成像技术区别肿瘤细胞与正常细胞， 而传统的磁共振成像剂仅具有成像 功能， 不能区别肿瘤细。
25、胞和正常细胞 ； 此外这种多功能肿瘤成像剂， 还具有抗肿瘤活性， 可 运用于临床磁共振成像监测治疗用药， 实现肿瘤治疗过程的时时监测， 而目前临床运用的 抗肿瘤药物仅具有肿瘤抑制性能， 无法实现药物治疗过程的实时监测。 0014 附图说明 0015 图 1 ： LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 引起的 HeLa 细胞形状的变化 (A: 1g/ ml, B: 10g/ml; C: 30g/ml)。纳米颗粒对肿瘤生长的抑制活性 （实验 1） 。30 g/ml 的 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 处理 HeLa 细胞时， 几乎所有细胞全部皱缩、 。
26、变圆， 即所 有细胞全部死亡， 说明其对肿瘤细胞的抑制活性较好。 0016 图 2 ： LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 的 MRI 图 (WRL-68 细胞 ) (a: 空白 ; b: 10g/ml; c: 30g/ml; d: 50g/ml)。 WRL-68细胞为正常地肝细胞， 附图2较弱的磁共 振信号表示 L3MnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 纳米颗粒在正常细胞里的吸收较少。 0017 图 3 ： LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 的 MRI 图 (HepG-2 细胞 ) (a: 空白 ; b: 10g/ml; 。
27、c: 30g/ml; d: 50g/ml)。 HepG-2细胞为肝癌细胞， 附图3较强的信号表示 肝癌细胞对 L3MnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 纳米颗粒吸收较强， 即制备的纳米颗粒具有 肿瘤选择性吸收和磁共振成像的特性。 0018 经生物活性测试， LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 同时具有动物体外磁共振成 像， 抗肿瘤以及肿瘤靶向性的特征， 能特定地杀死 HeLa 细胞， 30g/ml 能够引起细胞显著 死亡 ； 此外 这种纳米复合物对肝肿瘤细胞 HepG-2 聚集度显著高于正常肝细胞 WRL-68 （见 图 2 与图 3， 实验 1 与。
28、 2） ， 说明具有较好的肿瘤细胞靶向性， 从而有望作为一种诊断、 治疗癌 症的多功能靶向纳米药物或用于肿瘤磁共振成像、 荧光成像剂。 0019 具体实施方式 0020 试剂和原料 实验中所用试剂均为分析纯， 除特别注明外， 未经进一步处理。元素分析用 Carlo-Erba-1106 型元素分析仪测定， 红外光谱用 Fr-IR 169( 固体用 KBr 压片 )。 0021 抗肿瘤试验试剂如下 ：（1） RPMI 1640 培养基 （RPMI 1640+10% 小牛血清 +HEPES 3.5g/l +NaHCO3 2.2g/l + 青霉素 0.13g/l + 链霉素 0.15g/l） 。 （2。
29、） 高糖 DMEM 培养基 （DMEM +10%小牛血清+HEPES 3.5g/l +NaHCO3 2.2g/l +青霉素 0.13g/l +链霉素 0.15g/ l） 。 （3） MTT（美国 Amresco 公司产品） 纳米颗粒对水质子弛豫速率增强的能力影响其在体内磁共振成像的效果， 弛豫效率用 R1表示，R1值越大， 其弛豫能力越强， 活体成像效果也越好。弛豫效率用下式计算 : 说 明 书 CN 102614532 A 6 4/7 页 7 R1=(1/t1)obsd-(1/t1)d/M (1) 式中(1/t1)obsd与(1/t1)d分别为在造影剂存在下观察到水质子的纵向弛豫速率和纯水 。
30、中质子的弛豫速率。M 为造影剂的浓度， 计算得 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 的纵 向弛豫效率R1分别为 11.99 mmol- 1L s- 1。数据表明所合成是纳米颗粒对水质子的弛 豫速率起良好的加速作用。附图 2 为 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 的 WRL-68 细胞的 MRI 图， 附图 3 为 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 作用 HepG-2 细胞的 MRI 图， 从图可以 看出， 两者都有一定的磁共振成像效果。比较附图 2 和附图 2 可知， LMnCl-RBITC-Fe3O4 SiO2-PE。
31、G-RGD 纳米颗粒能特定地靶向于肿瘤细胞， 而对正常细胞的吸收较弱。以上结果表 明， LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 能作为肿瘤靶向性磁共振成像剂， 从而有望用于肿瘤 的诊断和治疗。 0022 实施例 1（最价制备条件举例） ： 将粒径 20 nm 磁性纳米 Fe3O4 (40 mg) 和四甲氧基硅 烷 （TEOS ） (80mg) 以质量 1 ： 2 混合并超声分散于 80 mg 三氯甲烷 （Fe3O4与三氯甲烷质量 比 1 ： 2） ， 再加入 0.5M 十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB） 水溶液 0.8ml， 接着加入水 2ml 和 2 M 的 NaOH 溶。
32、液 0.4 g （其中 NaOH 与 TEOS 的质量比例 1 ： 5） ， 温度控制在最佳 70 C 获得溶液 A ； 将另一份 TEOS (120mg) 和异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） (60mg) 以质量比 2 ： 1 混合后制 成溶液 B ； 将溶液 B 加入溶液 A 中， 再加入反应液体积的 20% 乙酸乙酯， 反应 10 min 后加入 APS (200mg) （APS ： Fe3O4质量比 5 ： 1） ， 搅拌反应 3 h， 磁性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次 得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为 壳的纳米颗粒 （R。
33、BITC-Fe3O4SiO2， 其中 表示核壳结构） 。 0023 将 22 mg RGD、 (33mg) 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 (33mg)N- 羟基丁二酰亚 胺 （NHS） 的 N， N- 二甲基甲酰胺混合 （其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 1.5 ： 1.5） ， 加入 20 ml DMF至固体刚好溶解， 溶液在常温下搅拌反应24 h。 再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4 SiO2， 继续搅拌反应24 h。 结束反应， 磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B （RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的。
34、纳米颗粒 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (69.1 mg)。 0024 称取甲氧基聚乙二醇酸 （分子量 2000） (138.2 mg) 溶于 DMF 制成饱和溶液中 （其 中甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量比 2 ： 1 中， 再依次加入 207.3 mg 的 DCC 和207.3 mg NHS (质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:2） ， 让其在常温下搅拌反应 24 h。再将 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD(69.1 mg) 加入其中， 常温搅拌反应 24 h 后加入 18ml 乙 醇超声分散 5 分钟 ； 然后加入 13。
35、8.4 mg 顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N-（2- 丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） ( 质量比 LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为 2 ： 1)， 混和溶液在 80 C 下搅拌反应 4 h。磁性分离， 真空干燥得产物 LMnCl-RBITC-Fe3O4 SiO2-PEG-RGD (132 mg)。 0025 IR（KBr, cm-1） 3440, 1608, 1428, 1065, 562. UV (H2O, nm), 555, 260. Mn 12.68%. 粒径 （TEM） , 20-30 nm。 油脂分布系数 1。
36、.2。测得纳米颗粒的 t1迟豫时 间分别为 83.410 ms， 纵向弛豫效率R1为 11.99 mmol- 1L s- 1。 经生物活性测试， LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 同时具有动物体外磁共振成像， 抗肿瘤配合物的输送以 及肿瘤靶向性的特征， 能特定地杀死 HeLa 细胞， 30g/ml 能够引起细胞显著死亡。 说 明 书 CN 102614532 A 7 5/7 页 8 0026 实施例 2 ： 将粒径 20 nm 磁性纳米 Fe3O4 (40 mg) 和 TEOS (40mg) 以质量 1 ： 1 混 合并超声分散于 40 mg 三氯甲烷 （Fe3O4与。
37、三氯甲烷质量比 1 ： 1） ， 再加入 0.5M 十六烷基三 甲基溴化銨 （CTAB） 水溶液 0.12ml， 接着加入水 0.3 ml 和 2 M 的 NaOH 溶液 0.1 g（其中 NaOH与TEOS的质量比例1 ： 1） ， 温度控制在最佳70 C制得溶液A ； 将另一份TEOS(20mg)和 RBITC(20mg) 以质量比 1 ： 1 混合后制成溶液 B ； 将溶液 B 加入溶液 A 中， 再加入反应液体积 的5%乙酸乙酯， 反应10 min后加入APS (400mg) （APS ： Fe3O4质量比10 ： 1） ， 搅拌反应3 h， 磁性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次得包。
38、裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B （RBITC） 和多孔磁性 纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2， 其中表示核壳结构） 。 0027 将 15 mg RGD、 (15 mg) 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 (60 mg)N- 羟基丁二酰 亚胺 （NHS） 的 N， N- 二甲基甲酰胺混合 （其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 1 ： 4） ， 加入 10 ml DMF至固体刚好溶解， 溶液在常温下搅拌反应10 h。 再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4 SiO2， 继续搅拌反应10 h。 结束反应， 磁性分离得表。
39、面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B （RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (27.6 mg)。 0028 称取甲氧基聚乙二醇酸 （分子量 2000） (70.6 mg) 溶于 DMF 制成饱和溶液中 （其中 甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量比 4 ： 1 中， 再依次加入 211.8 mg 的 DCC 和 NHS ( 质量比 DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为 3:3:1） ， 让其在常温下搅拌反应 10 h。再将 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (27.6 mg) 加入其。
40、中， 常温搅拌反应 10 h 后加入 9.5 ml 乙醇超声 分散 ； 然后加入 13.8 mg 顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N-（2- 丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶 甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） ( 质量比 LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为 1 ： 2)， 混和溶 液在 80 C 下搅拌反应 1 h。磁性分离， 真空干燥得产物 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (49 mg)。 0029 实施例3 ： 将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (240mg)以质量比1 ： 6混 合并超声分散于 6。
41、00 mg 三氯甲烷 （Fe3O4与三氯甲烷质量比 1 ： 10） 中， 再加入 0.5M 十六烷 基三甲基溴化銨 （CTAB） 水溶液 1.2 ml， 接着加入水 240 ml 和 2 M 的 NaOH 溶液 2.4 g（其 中NaOH与TEOS的质量比例1 ： 10） ， 温度控制在最佳30 C制得溶液A ； 将另一份TEOS (120 mg)和 RBITC (120 mg)以质量比1 ： 1混合后制成溶液B ； 将溶液B加入溶液A中， 再加入反 应液体积的 40% 乙酸乙酯， 反应 30 min 后加入 APS (60mg) （APS ： Fe3O4质量比 1 ： 1） ， 搅拌 反应 。
42、3 h， 磁性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2， 其中 表 示核壳结构） 。 0030 将 15 mg RGD、 15 mg 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 15 mgN- 羟基丁二酰亚胺 （NHS） 的 N， N- 二甲基甲酰胺混合 （其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 1 ： 1） ， 加入 36 ml DMF 至固体刚好溶解， 溶液在常温下搅拌反应 10 h。再加入上述干燥后的固体 RBITC-Fe3O4 SiO2， 继。
43、续搅拌反应 36 h。结束反应， 磁性分离得表面修饰 RGD 的荧光染料异硫氰酸罗丹 明 B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 RBITC-Fe3O4 SiO2-RGD(46.8 mg)。 0031 称取甲氧基聚乙二醇酸 （分子量 2000） (23.4 mg) 溶于 DMF 制成饱和溶液中 （其中 甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量比 1 ： 2 中， 再依次分别加入 34.2 mg 的 DCC 说 明 书 CN 102614532 A 8 6/7 页 9 和 22.8 mg 的 NHS ( 质量比 DCC:NHS: 甲氧基聚。
44、乙二醇酸为 3:2:4） ， 让其在常温下搅拌反 应36 h。 再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (46.8 mg)加入其中， 常温搅拌反应36 h后加入30 ml 乙醇超声分散5分钟 ； 然后加入107.2 mg顺磁性抗肿瘤配合物二氯N- （2-丙酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） ( 质量比 LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为 4 ： 1)， 混和溶液在 80 C 下搅拌反应 1 h。磁性分离， 真空干燥得产物 LMnCl-RBITC-Fe3O4 SiO2-PEG-RGD (68 mg)。 0032 实施例4。
45、 ： 将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (60 mg)以质量比1 ： 1混合并 超声分散于240 mg三氯甲烷 （Fe3O4与三氯甲烷质量比1 ： 4） 中， 再加入 0.5M十六烷基三甲 基溴化銨 （CTAB） 水溶液 1.4 ml， 接着加入水 240 ml 和 2 M 的 NaOH 溶液 6 mg （其中 NaOH 与TEOS的质量比例1 ： 10） ， 温度控制在最佳30 C制的溶液A ； 将另一份TEOS (120 mg)和 RBITC (120 mg)以质量比1 ： 1混合后制成溶液B ； 将溶液B加入溶液A中， 再加入反应液体 积的 30% 乙酸乙酯，。
46、 反应 30 min 后加入 APS (90mg) （APS ： Fe3O4质量比 1.5 ： 1） ， 搅拌反应 3 h， 磁性分离， 固体用乙醇和水各洗 2 次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明 B（RBITC） 和多 孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 （RBITC-Fe3O4SiO2， 其中 表示核 壳结构） 。 0033 将 44 mg RGD、 (44 mg) 1,3- 二环己基碳二亚胺 （DCC） 和 (44 mg)N- 羟基丁二酰 亚胺 （NHS） 的 N， N- 二甲基甲酰胺混合 （其中 RGD ： DCC ： NHS 质量比为 1 ： 1 ： 1） ， 加入 42。
47、 ml DMF至固体刚好溶解， 溶液在常温下搅拌反应20 h。 再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4 SiO2， 继续搅拌反应20 h。 结束反应， 磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B （RBITC） 和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、 二氧化硅为壳的纳米颗粒 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (56.8 mg)。 0034 称取甲氧基聚乙二醇酸 （分子量 2000） (113.6 mg) 溶于 DMF 制成饱和溶液中 （其 中甲氧基聚乙二醇酸 ： RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 质量比 1 ： 2 中， 再依次分别加入 169.8 mg 的 DCC 和 16。
48、9.8 mg 的 NHS ( 质量比 DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为 3:3:2） ， 让其在常温下 搅拌反应 20 h。再将 RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (56.8 mg) 加入其中， 常温搅拌反应 20 h 后 加入 38ml 乙醇超声分散 5 分钟 ； 然后加入 85.2 mg 顺磁性抗肿瘤配合物二氯 N-（2- 丙 酸乙酯基） -N， N- 二 （2- 吡啶甲基） 胺合锰 （简写为 LMnCl） ( 质量比 LMnCl: RBITC-Fe3O4 SiO2 -RGD 约为 1.5 ： 1)， 混和溶液在 80 C 下搅拌反应 1.5 h。磁性分离， 真空干燥得产物 LM。
49、nCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (86 mg)。 0035 实验 1 ： 抗肿瘤活性测定及细胞增殖形态学观察 以实施例 1 得到的配合物为受试化合物 将 HeLa 细胞在含 10% 热灭活的胎牛血清 （FCS） 的 RPMI1640 培养液中， 于 CO2培养箱 （37 C， 5%CO2、 饱和湿度） 内连续培养。取对数生长期细胞， 消化、 计数， 以 2104/ml 的密 度接种于 96 孔培养板中， 每孔 100 l。培养 24 h 后， 分别用浓度为 1 g/ml， 10 g/ ml 和 30 g/ml 的 LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 。