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1、(10)申请公布号 CN 103074435 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074435 A *CN103074435A* (21)申请号 201310033247.9 (22)申请日 2013.01.25 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 海尔施生物医药股份有限公司 地址 315800 浙江省宁波市小港街道前进村 半港河西 159 号 (72)发明人 南丽 颜进 徐冰 王晴晴 吴勇 (54) 发明名称 一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表 达水平的试剂盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种同步检测 14 种抗肿瘤用 药相关基因表。
2、达水平的试剂盒及其检测方法， 该 试剂盒包括 DEPC 水、 5RT 缓冲液、 反转录引物、 反转录酶、 X溶液、 10PCR缓冲液、 PCR引物， 25mM 氯化镁溶液， DNA 聚合酶和阳性对照品， 上述反转 录引物包括 14 种抗肿瘤用药相关基因的 RT 扩增 引物及 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基因序列如 SEQ ID NO.1-NO.18 所示， PCR 引物包括 14 种抗肿瘤 用药相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩 增引物及DNA内参的正反向PCR扩增引物， 基因序 列如SEQ ID NO.19-NO.38所示， 优点是特异性强、 灵敏度高、 通量高。
3、、 可靠性强、 成本低、 无假阴性结 果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 10 页 序列表 12 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书10页 序列表12页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103074435 A CN 103074435 A *CN103074435A* 1/3 页 2 1. 一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒， 包括 DEPC 水、 5RT 缓 冲液、 反转录引物、 反转录酶、 X 溶液， 10PCR 缓冲液， PCR 引物、 25mM 氯化镁溶液、 DNA 聚合 。
4、酶和阳性对照品， 其特征在于所述的反转录引物包括以下表中 14 种抗肿瘤用药相关基因 的 RT 扩增引物及 RNA 内参的 RT 扩增引物， 所述的 PCR 引物包括以下表中 14 种抗肿瘤用药 相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩增引物及 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物， 基 因序列如下表所示 ： 权 利 要 求 书 CN 103074435 A 2 2/3 页 3 2.根据权利要求1所述的一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物正向扩 增引物序列为 AGGTGAC。
5、ACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述的 通用引物正向引物带荧光标记。 3.根据权利要求1所述的一种同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的阳性对照品为上述 14 种抗肿瘤用药相关基因、 RNA 内参及反应内参的 引物克隆所得 DNA 片段。 4. 一种利用权利要求 1-3 中任一项所述的同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表达水 平的试剂盒的检测方法， 其特征在于具体包括以下步骤 ： （1） 采集样本并提取核酸 采集患者肿瘤组织的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； （2） 以患者核酸为模板进行 R。
6、T 反应 取5-20ng/ul的核酸样品RNA5L， DEPC水8L， 5RT缓冲液4L， RT引物溶液2L， RT 酶 1L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录， 反应条件 ： 48 C1 分钟 ； 42 C60 分 钟 ； 95 C5 分钟 ； 4 C 直至收取 RT 产物 ； 其中 RT 引物溶液中各 RT 引物浓度均为 500nM， 所述的 RT 引物包括 14 种抗肿瘤用药相关基因的 RT 扩增引物及 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基因序列如序列表中 SEQ ID NO.1 NO.18 所示 ； （3） 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 取 RT 产物 8.6L， 10。
7、PCR 缓冲液 2L， 25mM 的氯化镁 4L， PCR 引物溶液 2L， DNA 聚合酶1.4L， X溶液2L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应， 反应条件 ： 95C10 分钟 ； 94 C30 秒钟， 55 C30 秒钟， 70 C1 分钟， 循环 35 次 ； 70 C1 分钟 ； 4 C 直至收 取PCR产物 ； 其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物正向 扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述 的通用引物正向引物带荧光标记， PCR 引物溶液中各 PCR 引物浓。
8、度均为 200nM， PCR 引物包 括 14 种抗肿瘤用药相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩增引物及 DNA 内参的正反 向 PCR 扩增引物， 基因序列如序列表中 SEQ IDNO.19 NO.38 所示 ； （4） GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品 取 PCR 产物 0.1-1L， GeXP 遗传分析仪配套的上样缓冲液 38.75L， DNA 标准品 0.5L， 矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品， 将GeXP遗 权 利 要 求 书 CN 103074435 A 3 3/3 页 4 传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比， 获得抗肿。
9、瘤用药相关基因表达水平。 权 利 要 求 书 CN 103074435 A 4 1/10 页 5 一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂 盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法， 尤其是涉 及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基因表达水 平的试剂盒及其检测方法。 背景技术 0002 最近几年， 药物遗传学 / 药物基因组学在抗肿瘤药物作用机制等方面的研究获得 了突破性进展， 发现某些抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种 （或一组） 基因的 表达和 / 或多态性显著相关。通过相关基。
10、因的检测， 预测化疗及靶向药物的疗效， 选择合适 的药物进行个体化化疗， 已经成为提高疗效、 减少无效治疗的合理选择。 0003 个体化治疗是根据患者的遗传学特点， 采用特异和最佳的药物方案进行治疗的方 法。大量临床数据表明， 肿瘤组织中 ERCC1/RRM1/TYMS/TUBB3 等靶标基因 mRNA 表达水平可 以分别预测患者对铂类 / 吉西他滨 / 氟尿嘧啶类 / 抗微管类等常用化疗药物的反应。根据 患者肿瘤组织中 mRNA 表达水平的检测结果， 制订个体化治疗方案， 有助于选择适合患者的 化疗药物， 提高治疗的针对性。 通过靶标检测选择化疗药物可以避免无效或有害的化疗、 节 省宝贵的治。
11、疗时间与治疗费用。 0004 目前检测基因表达 （mRNA 水平） 的方法主要为荧光定量 PCR 法。荧光定量 PCR 通 过设计特异性的探针序列， 经实时定量 PCR 对目的基因的表达水平进行定量检测。荧光定 量 PCR 具有较高的灵敏度与准确性， 可精确定量， 操作简单快捷， 是当前基因定量检测的主 流方法。但是， 荧光定量 PCR 的如下不足限制了它的市场应用 ：（1） 通量低 ： 一次反应只能 检测一个基因， 对于复杂的药物代谢和调控系统， 需要检测多个位点时， 就需要多台 PCR 仪 同时工作， 效率低， 周期长。 （2） 多个位点检测成本较高 ： 需要进行多个反应才能得到所需 的基。
12、因表达信息， 从而使总的检测成本较高。 （3） 难以设置内参基因 ： 只能设置外控基因， 无法有效的监测 RNA 质量及整个反应系统。 0005 GenomeLabTMGeXP 多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳 分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成， 一束 8 道的毛细管陈列设计充分利用 了 96 孔板的排列特性， 降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重 PCR 方法， 通过 Beckman Coulter 染色标记， 在同一个 EP 管中同时分析多个基因的表达， 能快速有效 地检测基因的表达状况， 克服了上述荧光定量 PCR 法存在的缺陷， 具有以下优。
13、点 ： 0006 1、 高通量 ： 本系统采用双 （96 孔） 板、 自动加样和样品追踪技术， 实现单个反应检 测 30-40 个位点， 可同时做 192 个反应 （如 192 个患者样品， 每个样品检测 30 种腹泻病毒， 30 个位点） ， 一天出结果 ； 对于交叉感染患者， 本方法可一次性给出准确报告， 避免漏检。 0007 2、 准确性强 ： GeXP 采用毛细管电泳对 PCR 产物进行分离检测， 可将非特异性扩增 产物、 引物二聚体和特异性扩增产物分离， 最大程度降低假阳性 ； 0008 3、 敏感性高， 结果重复性好 ： GeXP 系统克服了传统 PCR 扩增方法的不均等扩增造 说。
14、 明 书 CN 103074435 A 5 2/10 页 6 成的偏差， 提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性， 采用激光诱导荧光 -PMT， 具有 超高灵敏度 ； 0009 4、 方法简便， 使用经济 ： GeXP 提供从试剂、 多重 PCR 引物设计、 结果及定量表达谱 分析等全套实验方案 ； 每个样品的检测成本少于￥50， 利于大规模推广 ； 0010 5、 精确定量、 灵活性强 ： 可精确定量病原体基因拷贝数， 可随时根据需求调整检测 的靶基因。 0011 6、 易于实现自动化 ： 就样品制备而言， Biomek 系列自动液体处理仪可以与 GeXP 分 析仪和 Ampligrid。
15、 扩增仪完全匹配， 集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报 告。 0012 目前， 国内外还没有关于基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测 14 种 抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。 发明内容 0013 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 成本低、 无假阴性结果的基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测 14 种抗肿瘤用 药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法。 0014 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 一种同步检测 14 种抗肿瘤用药 相关基因表达水平的试剂盒， 包括 DEP。
16、C 水、 5RT 缓冲液、 反转录引物、 反转录酶、 X 溶液， 10PCR 缓冲液， PCR 引物、 25mM 氯化镁溶液、 DNA 聚合酶和阳性对照品， 所述的反转录引物 包括以下表 1 中 14 种抗肿瘤用药相关基因的 RT 扩增引物及 RNA 内参的 RT 扩增引物， 所述 的 PCR 引物包括以下表 1 中 14 种抗肿瘤用药相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩 增引物及 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物， 基因序列如下表 1 所示 ： 0015 表 1 0016 说 明 书 CN 103074435 A 6 3/10 页 7 0017 0018 所述的 。
17、X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 所述的通用引物正 向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所 说 明 书 CN 103074435 A 7 4/10 页 8 述的通用引物正向引物带荧光标记。 0019 所述的阳性对照品为从肿瘤细胞提取的 RNA 混合物， 所述的 RNA 混合物包含所述 的 14 种抗肿瘤用药相关基因 mRNA。 0020 一种利用同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒的检测方法， 其 特征在于具体包括以下步骤 ： 0021 （1） 采集样本并提取核酸 。
18、0022 采集患者肿瘤组织的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； 0023 （2） 以患者核酸为模板进行 RT 反应 0024 取 5-20ng/ul 的核酸样品 RNA5L， DEPC 水 8L， 5RT 缓冲液 4L， RT 引物溶 液 2L， RT 酶 1L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录， 反应条件 ： 48 C1 分钟 ； 42 C60 分钟 ； 95 C5 分钟 ； 4 C 直至收取 RT 产物 ； 其中 RT 引物溶液中各 RT 引物浓度 均为 500nM， 所述的 RT 引物包括 14 种抗肿瘤用药相关基因的 RT 扩增引物及 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基。
19、因序列如序列表中 SEQ ID NO.1 NO.18 所示 ； 0025 （3） 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 0026 取RT产物8.6L， 10PCR缓冲液2L， 25mM的氯化镁4L， PCR引物溶液2L， DNA 聚合酶 1.4L， X 溶液 2L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行 PCR 反应， 反应条件 ： 95C10分钟 ； 94C30秒钟， 55C30秒钟， 70C1分钟， 循环35次 ； 70C1分钟 ； 4C直 至收取PCR产物 ； 其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物 正向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反。
20、向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述的通用引物正向引物带荧光标记， PCR 引物溶液中各 PCR 引物浓度均为 200nM， PCR 引 物包括 14 种抗肿瘤用药相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩增引物及 DNA 内参的 正反向 PCR 扩增引物， 基因序列如序列表中 SEQ IDNO.19 NO.38 所示 ； 0027 （4） GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品 0028 取 PCR 产 物 0.1-1L， GeXP 遗 传 分 析 仪 配 套 的 上 样 缓 冲 液 38.75L， DNA Marker0.5L， 矿物油一滴混合均匀。
21、后加入到 96 孔分离液板上进行毛细电泳分离样品， 将 GeXP 遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比， 获得抗肿瘤用药相关基因表达水平。 0029 与现有技术相比， 本发明的优点在于 ： 本发明一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关 基因表达水平的试剂盒及其检测方法， 由于该试剂盒引入了针对 14 个抗肿瘤用药相关的 基因、 4 个内参基因等所设计的特异性扩增引物， 根据这些基因的表达水平来指导多达 24 种抗肿瘤药物的用药情况， 一天之内可完成 192 个患者样品的检测， 既节约了生产成本和 检测成本， 又提高了检测效率及缩短了时间 ； 四个内参基因的使用可用于监测整个反应系 统、 RT。
22、-PCR 反应的效率以及评估 RNA 模板的质量， 避免假阴性 ； 反应内参的使用可用于监测 整个反应系统、 PCR 反应的效率， 避免假阴性， 使得检测具有更好的灵敏度和特异性， 从而避 免了其他检测方法特异性不高的问题。 0030 综上所述， 本发明基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测 14 种抗肿瘤 用药相关基因表达水平的试剂盒及其检测方法， 可以同时针对 14 个抗肿瘤用药相关的基 因进行检测， 检测敏感性高， 特异性好， 降低了常规 PCR 扩增的假阳性率， 还能够有效解决 常规 PCR 的易污染问题 ； 具有非竞争性内对照体系， 可靠性强， 无假阴性结果， 利用 Ge。
23、XP 遗 传分析系统灵敏、 准确定量、 快速、 高通量的技术优势， 为临床提供一种优越的低成本的分 说 明 书 CN 103074435 A 8 5/10 页 9 子诊断方法， 有助于化疗药物安全有效地使用。 附图说明 0031 图 1 为 GeXP 遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。 具体实施方式 0032 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0033 具体实施例一 0034 本发明一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因表达水平的试剂盒， 该试剂盒中 包括以下试剂 ： 0035 1） RT 引物 （反转录引物 RT primer Mix） 0036 2） PCR 引物 （。
24、PCR Primer Mix） 0037 3） 25mM 氯化镁 （25mM MgCl2） 0038 4） 逆转录酶 （Reverse transcripatase） 0039 5） DNA 聚合酶 （Taq DNA Polymerase） 0040 6） X 溶液 （Solution X） 0041 7） 10PCR 缓冲液 （10PCR Buffer） 0042 8） 5RT 缓冲液 （5RT buffer） 0043 9） 阳性对照 （Positive Control） 0044 11） 无 RNA 酶 /DNA 酶超纯水 （Dnase/Rnase Free ddH2O） 0045 上述。
25、反转录引物包括以下表中 14 种抗肿瘤用药相关基因的 RT 扩增引物及 RNA 内 参的 RT 扩增引物， 上述 PCR 引物包括以下表中 14 种抗肿瘤用药相关基因的 PCR 扩增引物、 RNA 内参的 PCR 扩增引物及 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物， 基因序列如表 1 所示 ： 0046 表 1 抗肿瘤用药相关基因多重基因检测寡核苷酸序列 0047 说 明 书 CN 103074435 A 9 6/10 页 10 0048 0049 上述 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 所述的通用引物正向 说 明 书 CN 103074435 A 10 7/10 。
26、页 11 扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述 的通用引物正向引物带荧光标记。 0050 上述阳性对照品为从肿瘤细胞提取的 RNA 混合物， 该 RNA 混合物包含 14 种抗肿瘤 用药相关基因 mRNA。 0051 根据上述14种抗肿瘤用药相关基因的表达水平来指导多达24种抗肿瘤药物的用 药情况， 具体如下 ： 0052 （1） BRCA1 ： 表达水平与患者对铂类和抗微管类药物的敏感性呈正相关 ； 0053 （2） DPYD ： 表达水平与 5-FU（5- 氟尿嘧啶） 敏感性呈负相关 ； 0054 （3。
27、） EGFR ： 表达水平与西妥昔单抗耐药性呈正相关 ； 0055 （4） PTEN ： 表达下调是乳腺癌分化和转移的潜在标志 ； 0056 （5） ERCC1 ： 表达水平与铂类药物疗效呈负相关 ； 0057 （6） STMN1 ： 低表达水平接受紫杉醇类 / 顺铂 （指紫杉醇与顺铂的联合用药） 治疗效 果较好 ； 高表达水平患者肿瘤有转移风险 ； 0058 （7） TUBB3 ： 低表达水平接受紫杉醇类 / 顺铂或长春碱类治疗效果较好 ； 高表达水 平患者肿瘤有转移风险 ； 0059 （8） RRM1 ： 表达水平与吉西他滨耐药性呈正相关 ； 0060 （9） VEGFR ： 表达水平与贝。
28、伐单抗疗效呈正相关 ； 0061 （10） HER2 ： 表达水平与赫赛汀疗效呈正相关 ； 0062 （11） TYMP ： 表达水平与卡培他滨疗效呈正相关 ； 表达水平低患者有较好的预后 ； 0063 （12） TYMS ： 表达水平与 5-FU 疗效呈正相关 ； 0064 （13） PDGFR ： 表达水平变化预测索拉非尼疗效 ； 0065 （14） TOP2A ： 表达水平与患者对依托泊苷的敏感性呈正相关。 0066 具体实施例二 0067 本发明一种同步检测 14 种抗肿瘤用药相关基因的检测方法， 采集患者肿瘤组织 提取核酸， 以患者核酸为模板进行反转录和 PCR 反应， 最终用毛细电。
29、泳方法分离样品， 具体 步骤如下 ： 0068 1、 生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测14种抗肿瘤用药相关基 因的试剂盒， 试剂盒中包括的组分同上述实施例 1 ； 0069 2、 采集样本并提取核酸 0070 采集患者肿瘤组织的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； 0071 3、 以患者核酸为模板进行反转录 （RT） 反应 0072 1） 按以下比例在 96 孔样品板上加入试剂和样品 （RT 板见表 2） ： 0073 表 2RT 反应试剂和样品混合比例 0074 RT 反应试剂量 / 孔 DEPC 水 （无 RNA 酶 /DNA 酶超纯水 Dnase/Rnase Fre。
30、e）8L 5RT 缓冲液4L 说 明 书 CN 103074435 A 11 8/10 页 12 RT 引物 （各 RT 引物浓度均为 500nM）2L RT 酶1L 样品 RNA(5-20ng/ul)5L Total20L 0075 注 ： 在RT反应中加入阳性对照品， 该阳性对照品为从肿瘤细胞提取的RNA混合物， 包含上述 14 种抗肿瘤用药相关基因 mRNA， 阳性对照品的用量同样品。 0076 2） 混匀后按以下温度孵育 （见表 3） ： 0077 表 3RT 反应条件 0078 步骤温度时间 148 C 1 分钟 242 C 60 分钟 395 C 5 分钟 44 C 持续 : 直至。
31、收取 RT 产物 0079 4、 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 0080 1） 按以下比例在 96 孔样品板上加入试剂和样品 （PCR 板见表 4） ： 0081 表 4PCR 反应试剂和样品混合比例 0082 PCR 反应试剂量 / 孔 10PCR 缓冲液4L 25mM MgCl24L PCR 引物2L DNA 聚合酶1.4L X 溶液2L RT 产物8.6L Total20L 0083 注 ： X 溶液包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 通用引物正向扩增引物序 列为 AGGTGACACTATAGAATA， 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA，。
32、 通用引物正向引 说 明 书 CN 103074435 A 12 9/10 页 13 物带荧光标记。 0084 2） 混匀后按以下温度进行热循环反应 （见表 5） ： 0085 表 5PCR 反应条件 0086 步骤温度时间 195C 10 分钟 294C 30 秒钟 355C 30 秒钟 470C 1 分钟 5N/A重复 2-4 步骤 34 次 （共 35 次） 670C 1 分钟 74 C 持续 : 直至收取 PCR 产物 0087 5、 GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品 0088 1） 制备 GeXP 样品 （见表 6） ： 0089 表 6GeXP 样品混合比例 0090 GeXP。
33、 样品量 / 孔 上样缓冲液 （Beckman GeXP 系统配套试剂）38.75L DNA 大小标准 4000.5L PCR 产物0.1-1L 矿物油1 滴 0091 2） 毛细电泳分离样品 0092 将 GeXP 样品加入 96 孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中 ； 毛细管电泳分离 是一类以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术， 具体程序为 90变性 120 秒， 进样电压 2kv， 30 秒， 分离电压 6kv， 35 分钟。 0093 6、 结果分析 （见 GenomeLab GeXP 遗传分析仪说明书） 0094 根据 GeXP 遗传分析仪自有软件上默认的参。
34、数对结果进行片段大小分析， 其横坐 标表示片段大小， 纵坐标为信号强弱。将 GeXP 遗传分析仪的软件获得的数据进行分析， 计 算出相关基因的表达水平， 根据这些基因的表达水平来指导多达 24 种抗肿瘤药物的用药 情况。标准图谱如图 1 所示， 其结果能准确检测出 14 种抗肿瘤用药相关基因且信号不至于 过饱和， 各靶标间信号相对持平， 且没有宽峰、 双峰等现象。 说 明 书 CN 103074435 A 13 10/10 页 14 0095 具体实施例三 0096 检测试剂盒灵敏度、 特异性分析 0097 灵敏度分析 ： 将阳性对照品按一定 ng 值倍比稀释后， 经 PCR 扩增和毛细管电泳。
35、检 测直至检测不到信号， 该 ng 值为最低检测线， 也就是试剂盒的灵敏度。本试剂盒的灵敏度 为 1.0ng。 0098 特异性分析 ： 单重 PCR 扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。 0099 上述说明并非对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内， 作出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护 范围。 说 明 书 CN 103074435 A 14 1/12 页 15 0001 0002 序 列 表 CN 103074435 A 15 2/12 页 16 0003 序 列 表 CN 103074435 A 16 3/12。
36、 页 17 0004 序 列 表 CN 103074435 A 17 4/12 页 18 0005 序 列 表 CN 103074435 A 18 5/12 页 19 0006 序 列 表 CN 103074435 A 19 6/12 页 20 0007 序 列 表 CN 103074435 A 20 7/12 页 21 0008 序 列 表 CN 103074435 A 21 8/12 页 22 0009 序 列 表 CN 103074435 A 22 9/12 页 23 0010 序 列 表 CN 103074435 A 23 10/12 页 24 0011 序 列 表 CN 103074435 A 24 11/12 页 25 0012 序 列 表 CN 103074435 A 25 12/12 页 26 序 列 表 CN 103074435 A 26 1/1 页 27 图 1 说 明 书 附 图 CN 103074435 A 27 。