用于在丝状真菌子实体中产生异源蛋白的调控元件.pdf

本发明提供了调控真菌中核苷酸序列表达的组合物和方法。所述组合物是分离自双孢蘑菇凝集素基因的组织偏好性启动子的新的核苷酸序列。所述序列偏好驱动表达至子实体组织。提供了利用本文所公开的调控序列在真菌中表达核苷酸序列的方法。所述方法包括，转化真菌细胞从而包含可操作地连接于本发明的一个或多个调控序列的核苷酸序列，并由转化的细胞再生稳定转化的真菌。

权利要求书
1.   分离的调控元件，其驱动目的蛋白或核苷酸序列在子实体组织中的积累，其中所述调控元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

2.   包含权利要求1的调控元件的表达盒，其中所述调控元件可操作地连接于核苷酸序列。

3.   用权利要求2的表达盒稳定转化的真菌。

4.   权利要求3的真菌，其中所述真菌是丝状真菌。

5.   权利要求4的真菌，其中所述丝状真菌是伞菌属(Agaricus)物种。

6.   权利要求3的真菌的子实体组织，其中所述组织包含所述表达盒。

7.   在真菌细胞中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)用表达盒转化真菌细胞，所述表达盒包含可操作地连接于核苷酸序列的分离的调控元件，其中所述调控元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；以及b)使所述真菌细胞生长以表达所述核苷酸序列。

8.   权利要求7的方法，其中所述分离的调控元件起始所述核苷酸序列的表达并实现在子实体组织细胞中表达。

9.   权利要求7的方法，还包括从所述真菌细胞再生稳定转化的真菌；其中所述核苷酸序列的表达改变所述真菌的表型。

10.   权利要求9的方法，其中所述真菌是丝状真菌。

11.   权利要求10的方法，其中所述丝状真菌是伞菌属物种。

12.   权利要求9的方法，其中所述真菌所产生的子实体组织包含所述表达盒。

说明书用于在丝状真菌子实体中产生异源蛋白的调控元件
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及真菌基因表达的调控领域。新组合物和方法可用于通过本领域技术人员已知的重组技术来改善真菌物种，如改善病原体、害虫以及杀虫剂抗性，产量和质量，延长生产保存期限，提高烹饪、营养以及医药价值等，以及改善异源蛋白的工业化生产。
背景技术
约40%商购可获得的酶来源于丝状真菌。Lowe,Handbook of Applied Mycology.Fungal Biotechnology(eds.)Arora,D.K.Elander,R.P.&Mukerji,K.G.681‑708(Marcel Dekker,New York;1992)。这些酶通常由曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)的物种产生。因为它们向培养基中分泌大量蛋白，它们可以在大规模发酵时生长，并且通常认为它们对于食品工业是安全的。
与商业栽培蘑菇(双孢蘑菇(Agaricus bisporus))相关的一般问题包括，病原体如菌生轮枝菌(Verticillium fungicola,干泡病)、侵占木霉(Trichoderma aggressivum,绿霉)、托拉氏假单胞菌(Pseudomonas tolaasii，斑)和dsRNA病毒(勒法郎士病(La France disease)和斑病(patch disease))引起的疾病、主要虫害[尖眼蕈蚊(sciarid fly)(尖眼蕈蚊(Lycoriella mali))]、与细菌性腐败和快速衰老有关的产品的极短保存期限以及与内源多酚氧化酶(PPO，如酪氨酸酶)的作用有关的子实体褐变(擦伤)。为了进一步提高产品质量，双孢蘑菇的常规育种程序仅仅是适度成功的，并且长期而言是不足够的。这是因为真菌的常规育种技术非常耗时，并且因为商购可获得菌株的遗传变异受到限制，从而提供很小的通过选择的改进(Horgen et al.“Homology between mitochondrial DNA of A.bisporus and an internal portion of a linear mitochondrial plasmid of Agaricus bitorquis”Curr Genet.1991.19:495‑502)。
对于双孢蘑菇而言，有效育种策略的主要障碍是涉及任一亲本核异常地同时分离成一个担孢子的相当异常的生活史。在这种担孢子长出后，形成异核菌丝，其所含有的核和遗传特征与亲本菌丝中存在的核和遗传特征并无不同。此外，在减数分裂期仅观察到很少的重组活性(Summerbell et al.Genetics,Oct.123(2)1989 pp.293‑300)。
为了克服常规育种的局限性，全世界的研究人员试图为商业蘑菇如双孢蘑菇开发和改善用于引入新特性的转化方法。对于其他真菌以及植物、动物和细菌而言，应用基因转移技术是相当常见的，并且已经导致商业应用。
为了提高微生物如真菌产生蛋白的经济性，已经做了大量努力来提高转录和翻译效率、最大化针对期望的产物产生的总蛋白的比例，提高修饰的宿主的生存力，并提高获得修饰的宿主的效率。目前用于真菌转化的主要启动子是甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(gpd)启动子。利用强启动子在适当的宿主中表达异源基因是生物技术应用的主要策略。Gpd启动子是可以通过任何碳源诱导的强启动子，并且已经广泛用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以及其他酵母中表达异源蛋白。
还从担子菌中克隆了gpd基因，包括裂褶菌(Schizophyllum commune)、黄孢原毛皮革菌(Phanerochaete chrysosporium)、双孢蘑菇(Harmsen et al.,1992)以及埃杜拉香菇(Lentinula edodes(Hirano et al.,1999))。据报道，利用同源gpd启动子在这些蘑菇中进行基因转化，仅在双孢蘑菇、绒状火菇(Flammulina velutipes)以及香菇(Hirano et al.,2000,Kuo et al.,2004,van de Rhee et al.,1996)中获得成功。尽管异源启动子已经用于表达药物抗性标记标志基因，但是基因转化并不足以表达异源基因(Ruiz‑Diez,2002)。为了充分且有效地表达异源基因，对宿主细胞而言重要的是通过其转录机制识别启动子序列。Chun‑Yi Kuo等证明异源基因即潮霉素B磷酸转移酶基因(hpt)可以在金针菇(Kuo et al.,2004)中表达。然而，据发现，尽管担子菌中的gpd基因高度相似，但是这些基因的启动子区明显不同。
如上文所述，本领域持续需要开发有效、便利且迅速的真菌转化系统和基因表达元件。
因此，本发明的目的是，为真菌提供满足上述需要的转化系统，特别是强调控元件。
本发明的另一目的是，提供应用转基因技术的机制，如应用于细菌、非丝状真菌(酵母)、植物以及动物的那些技术，来提高产量、疾病和害虫抗性、产品质量、保存期限或烹饪、营养或医药价值，来商业化生产异源蛋白，或其他此类方案。
本发明的另一目的是，提供能驱动可操作地连接的序列在真菌的子实体以及植物的组织或动物细胞中的高水平蛋白积累的调控元件。
本发明的另一目的是，提供用于这类转基因方案中的调控元件、多核苷酸构建体、载体以及转化的细胞。
根据随后的本发明的描述，本发明的其他目的会变得显而易见。
发明概述
本发明包括分离的调控元件/启动子，其包含选自以下的多核苷酸序列：a)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸序列；和b)能调控可操作地连接的多核苷酸分子在真菌细胞中的转录的a)的多核苷酸序列的片段。
本发明还包括多核苷酸构建体，其包含可操作地连接于异源多核苷酸分子的本发明的启动子。
本发明还包括包含本发明构建体的转化的细胞以及利用本发明的构建体的转化方法和由此产生的异源蛋白产物。
本发明涉及来自双孢蘑菇凝集素编码基因的启动子，用作调控区并提供目的核苷酸序列的表达。在一实施方案中，将异源蛋白或目的核苷酸序列的积累驱动到子实体组织。本发明还涉及驱动异源蛋白或目的核苷酸序列在子实体组织中表达的功能片段。并入了驱动核苷序列表达的启动子的表达盒，表达核苷酸序列的植物、真菌或细菌细胞，以及用于调控核苷酸序列表达的方法，都位于本发明的范围内。
附图说明
图1是从双孢蘑菇子实体提取的蛋白的2‑D凝胶分析。根据制造商的推荐，利用Invitrogen的IPG drystrips进行一维等电聚焦并利用NuPAGE预制凝胶系统进行二维分离来在2‑D SDS PAGE上实施蛋白分离。数字标记用于MS和MS/MS分析而切除的蛋白斑点。
图2是包括连接于报道基因的本发明启动子的二元载体pAGN‑750的图谱。
图3是表示GUS报道基因在生长于滤纸上的pAGN‑750事件的营养菌丝中表达的照片。
图4是表示独立的pAGN‑750转基因事件的子实体切片GUS染色的照片。样品1=750‑22B；样品2=750‑16A；样品3=750‑6B；样品4=750‑11C；样品5=750‑7A；样品6=750‑13A；样品7=750‑8A；样品8=750‑23A
图5是包括连接于感兴趣的靶基因的本发明启动子的二元载体pAGN‑755的图谱。
图6描述凝集素启动子的序列。每一载体的5’端DNA序列标有下划线，并且标明相应载体。所有的载体都共有所示的同一序列。pAGN‑755和pAGN‑750共有相同的序列。
图7表示由表5中截短的启动子所产生的事件的液体菌丝培养物的GUS染色。
发明详述
通过引用，将所提到的所有参考文献并入本文。
除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语都与本发明所属技术领域普通技术人员所理解的具有相同的含义。除非另有说明，否则本文所用或所包括的技术都是本领域技术人员熟知的标准技术。材料、方法以及实施例仅是说明性的而非限制性的。
根据本发明，提供了允许调控子实体组织中目的同源(cognate)蛋白或核苷酸序列的转录和积累的核苷酸序列。因此，本发明的组合物包含新的与编码双孢蘑菇凝集素蛋白的核苷酸序列天然相关的真菌调控元件的核苷酸序列。
在一实施方案中，所述调控元件驱动真菌组织中的转录，或更具体而言，实现目的蛋白或转录本在真菌子实体组织中的表达，其中所述调控元件包含选自以下的核苷酸序列：a)与编码凝集素蛋白的DNA天然相关且调控所述DNA的表达的序列；b)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列；或c)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的功能片段的序列。
其他实施方案涉及包含上述核苷酸序列的表达盒、转化载体、真菌、细菌以及真菌和细菌细胞。本发明还涉及在植物、真菌以及细菌组织和它们的细胞中使用所述序列的方法。
提供了利用本文所公开的调控序列在真菌中表达分离的核苷酸序列的方法。所述方法包括用转化载体转化真菌细胞，所述转化载体包含可操作地连接于本发明的一个或多个调控序列的分离的核苷酸序列，并由转化的真菌细胞再生稳定转化的真菌。以这种方式，调控序列可用于控制子实体组织中内源以及外源产物的表达。
可选地，可能期望抑制真菌组织中天然DNA序列的表达，以实现期望的表型。在这种情况下，这种抑制可能通过例如以下实现，转化真菌以包含可操作地连接于反义核苷酸序列、发夹、RNA干扰或其他核酸分子的启动子，从而使得所述分子的表达干扰天然DNA序列的mRNA的翻译或抑制其在真菌细胞子集中表达。
在所述调控元件调控下的将是目的序列，其会提供对真菌表型的修饰。这种修饰包括调控内源产物的产生，如量、相对分布等，或调控外源表达产物的产生以在真菌中提供新功能或新产物。这类启动子可用于多种应用，如产生具有期望性状的转基因真菌，包括例如改变含量、蛋白质量、细胞生长或营养质量，或优选用于产生异源蛋白。
″子实体组织”启动子意指能有效转录可操作地连接的核苷酸序列并由此实现目的蛋白或核苷酸序列在所述组织中高水平积累的表达，所述组织在此是子实体组织细胞。组织可以指具体组织的细胞。
″调控元件″意指负责连接的核酸分子的表达的序列，包括但不限于启动子、终止子、增强子、内含子等。
″启动子″意指能调控与其连接的序列转录的DNA的调控区。其通常包含能指导RNA聚合酶II在具体编码序列的适当转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。
启动子还可以包含通常位于TATA盒上游或5′的其他识别序列，称为上游启动子元件，其影响转录启动速率并且还包括影响连接的核苷酸序列时空表达的元件。应当认识到，已经鉴定了本文所公开的启动子区的核苷酸序列后，分离和鉴定具体启动子区上游5’区的其他调控元件属于现有技术。因此，本文所公开的启动子区可以包含上游调控元件，如负责核酸分子的组织和时序表达的上游调控元件，并且可以包括增强子、转录调控蛋白的DNA应答元件、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、激活序列等。
以相同的方式，可以鉴定、分离并与其他核心启动子一起使用使这类表达成为可能的启动子元件，以确保子实体组织中的表达。核心启动子表示启动转录所需的最小序列，如称为TATA盒的序列，其对于编码蛋白的基因中的启动子是常见的。因此，SB‑LEG的上游启动子可以任选地与其他来源的其自身或核心启动子联合使用。启动子对于其所存在的细胞而言可以是天然的或非天然的。
本发明的分离的启动子序列可以经修饰以提供分离的核苷酸序列的一系列的表达水平。可以利用小于完整的启动子区并且保留在子实体组织中实现表达的能力。应当认识到，可以通过启动子序列的特定部分的缺失调控mRNA的表达水平。因此，启动子可以经修饰为弱启动子或强启动子。通常，″弱启动子″意指驱动编码序列低水平表达的启动子。″低水平″意指约1/10,000转录本至约1/100,000转录本至约1/500,000转录本的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平或以约1/10转录本至约1/100转录本至约1/1,000转录本表达。通常，会用分离的启动子序列的至少约20个核苷酸驱动核苷酸序列的表达。
应当认识到，为了增加转录水平，增强子可以与本发明的启动子区组合使用。增强子是发挥增强启动子区表达功能的核苷酸序列。增强子在本领域中是已知的，并且包括SV40增强子区、35S增强子元件等。
本发明的启动子可以分离自其天然编码区的5′区或5′非翻译区(5′UTR)。同样，终止子可以分离自位于其各自终止密码子侧翼的3′区。
术语″分离的″指诸如核酸或蛋白的材料，其：(1)基本上或实质上不含如在天然存在的环境所发现的通常伴随其或与其相互作用的组分，或(2)如果所述材料处于其天然环境中，则所述材料被蓄意的人为干预而改变为组合物和/或被置于除所述材料天然基因座之外的细胞中的基因座。分离启动子区的方法在本领域中是熟知的。一种方法是利用与Genome Walker Kit.TM.(Clonetech)联合使用的引物和基因组DNA。
双孢蘑菇凝集素启动子显示于SEQ ID NO:1中，其功能截短物显示于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中。最小核心启动子的长度为45个核苷酸，全长启动子的长度为约135‑180个核苷酸。160在长度上是818个碱基对核苷酸。凝集素启动子分离自双孢蘑菇凝集素编码区。
本发明的调控区可以分离自任何植物、动物或真菌，但是优选是丝状真菌，包括但不限于金钱菌属(Flammulina)、伞菌属(Agaricus)、香菇属(Lentinula)以及侧耳属(Pleurotus)的真菌。预期分离自真菌物种的启动子能够在另一真菌物种中表达。
根据熟知的技术，基于与本文所示序列编码区的序列同源性，可以从其他真菌中分离调控序列。在这些技术中，可以用全部或部分已知的编码序列作为与存在于来自选定生物体的克隆的基因组DNA片段群(即基因组文库)中的其他序列选择性杂交的探针。在本领域中容易获得用于核酸序列杂交的方法。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology‑Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″,Elsevier,New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel et al.,Eds.,Greene Publishing and Wiley‑Interscience,New York(1995)中。
本发明的组合物还包括调控序列的功能变体。功能变体包括例如具有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入的本发明的天然调控序列。本发明的功能变体可以由定点诱变、诱导突变产生，或可以作为等位基因变体存在(多态性)。
本文所用″功能片段″是较大调控元件的一个或多个缺失所形成的调控序列变体。例如，可以缺失启动子的5′部分，其直至转录起始位点附近的TATA盒，而不丧失启动子活性，这在Opsahl‑Sorteberg et al.,″Identification of a 49‑bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleurone cell specific expression″Gene 341:49‑58(2004)中有描述。这类片段应当保持启动子活性，特别是在选定组织中驱动表达的能力。可以利用RNA印迹分析、利用转录融合物时采用报道物活性测量等测量活性。参阅例如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
功能片段可以通过以下方式获得：使用限制酶切割本文所公开的天然存在的调控元件核苷酸序列；由天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或可以通过使用PCR技术获得。特别是参阅Mullis et al.(1987)Methods Enzymol.155:335‑350,and Erlich,ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press,New York)。
例如，除去部分DNA序列的常规方式是，联合使用外切核酸酶与DNA扩增来产生双链DNA克隆的单向巢式缺失。用于此目的的商业试剂盒以商品名Exo‑Size.TM.(New England Biolabs,Beverly,Mass.)销售。简而言之，这种方法必须将外切核酸酶III与DNA孵育，以按3′到5′的方向渐进性除去DNA模板中5′突出端、粘末端或缺口处的核苷酸。然而，外切核酸酶III不能除去3′、4碱基突出端处的核苷酸。用这种酶定时消化克隆，产生单向巢式缺失。
可以用全部启动子序列或其部分作为能与相应启动子序列特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这类探针包括独特的且优选长度至少为约10个核苷酸、最优选产长度为至少约20个核苷酸的序列。这类探针可以用于从选定的生物体利用熟知的聚合酶链式反应(PCR)方法扩增相应的启动子序列。这种技术可以用于从期望的生物体分离其他启动子序列或用作确定生物体中启动子序列存在的诊断测定。实例包括平板接种的DNA文库的杂交筛选(斑块或集落；参见例如Innis et al.(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,eds.,Academic Press)。用于分离本发明启动子的引物显示于下文中。
在提到终止子序列时，意指发挥聚腺苷酸化信号功能并发出转录结束信号的核苷酸序列。保留这种活性的功能片段落入本发明的范围内。
本发明公开的调控元件以及其变体和片段，当与分离的目的核苷酸序列可操作地连接时，可以用于任何真菌的基因操作，所述核苷酸序列的表达受到控制，从而实现期望的表型应答。
″可操作地连接″意指调控区与另一序列之间的功能连接，其中调控序列启动并介导对应于所述另一序列的DNA序列的转录。
本发明的调控元件可以以本领域技术人员已知的若干方式中的任一方式可操作地连接于分离的目的核苷酸序列。利用U.S.Pat.No.6,187,994所述的位点特异性整合，可以将分离的目的核苷酸序列插入基因组中在本发明启动子3′的位点。术语″目的核苷酸序列″指可以是RNA分子以及DNA分子并且可以是编码期望的多肽或蛋白的分子的核酸分子(其可以称为多核苷酸)，但是也可以指不构成完整基因以及不必编码多肽或蛋白的核酸分子。例如，当用于同源重组方法中时，可将启动子置于具有靶向真菌染色体的区域但是可能不编码蛋白的序列的构建体中。如果需要，可以针对真菌翻译优化目的核苷酸序列，通过优化真菌所用的密码子和真菌的翻译起始位点周围的序列。也可以避免导致潜在的mRNA不稳定的序列。
本发明的调控元件可以与分离的目的核苷酸序列一起在表达盒中可操作地连接，用于在期望的真菌或植物或动物中表达。提供了具有多个用于插入在调控元件的转录控制下的目的核苷酸序列的限制位点的这类表达盒。可选地，通过提供真菌中一种或多种内源产物特别是酶或辅因子的表达降低实现特定结果。这种下调可以通过本领域技术人员已知的许多不同方法实现，包括反义、共抑制、利用发夹形成或其他方法，并且在下文做了讨论。辅因子的引入或输出也允许控制组成。应当认识到，可以以其天然或其他编码序列使用调控元件来增加或降低转化的真菌、植物、种子或动物细胞中可操作地连接的序列的表达。
用于本发明目的的目的基因的一般类别包括，例如与信息有关的基因，如锌指；与通讯有关的基因如激酶；以及与管家有关的基因，如热休克蛋白。转基因的更具体类别包括，编码农艺重要特性、昆虫抗性、疾病抗性除草剂抗性以及其他特征的基因。转基因还有的其他类别包括，诱导外源产物如酶、辅因子以及激素表达的基因。其他的类别还包括编码抗体、次级代谢物、治疗化合物、生物大分子、医用酶的那些基因；或赋予或有助于增值性状的基因。实例包括诸如凝集素的次级代谢物，诸如疫苗的治疗化合物，诸如干扰素、内皮抑素或胰岛素的生物大分子，诸如血栓溶解酶或脑苷酶的医用酶，以及赋予害虫、疾病或除草剂抗性的基因，如杀虫化合物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)。
应当认识到，任何目的核苷酸序列，包括天然编码序列，都可以可操作地连接于本发明的调控元件并在真菌中表达。
增加或抑制蛋白的方式对本领域技术人员而言是熟知的，并包括但不限于：转基因表达、反义抑制、共抑制、RNA干扰、利用转录因子和/或阻抑物的基因激活或抑制；诱变，包括但不限于转座子标记；定向和位点特异性诱变、染色体工程(参见Nobrega et.al.,Nature 431:988‑993(04))、同源重组、TILLING(定向诱导基因组局部突变技术，Targeting Induced Local Lesions In Genomes)以及操作蛋白表达的生物合成竞争。用于基因沉默的许多技术对于本领域技术人员而言是熟知的，包括但不限于敲除(如通过插入转座元件如Mu,Vicki Chandler,The Maize Handbook ch.118(Springer‑Verlag 1994)或其他遗传因子如FRT、Lox或其他位点特异性整合位点；RNA干扰(Napoli et al.(1990)Plant Cell 2:279‑289;U.S.Pat.No.5,034,323,Sharp(1999)Genes Dev.13:139‑141,Zamore et al.(2000)Cell101:25‑33；以及Montgomery et al.(1998)PNAS USA 95:15502‑15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton et al.(2000)Plant Cell 12:691‑705，和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2:109‑113)；靶‑RNA‑特异性核酶(Haseloff et al.(1988)Nature 334:585‑591)；发夹结构(Smith et al.(2000)Nature 407:319‑320;WO 99/53050；和WO 98/53083);MicroRNA(Aukerman&Sakai(2003)Plant Cell 15:2730‑2741)；核酶(Steinecke et al.(1992)EMBO J.11:1525，和Perriman et al.(1993)Antisense Res.Dev.3:253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(如WO 03/076574和WO 99/25853)；锌指靶向分子(如WO 01/52620;WO 03/048345；和WO 00/42219)；以及其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的组合。
可操作地连接于本文所公开的调控元件的核苷酸序列可以是靶基因的反义序列。(参阅例如Sheehy et al.(1988)PNAS USA 85:8805‑8809；和U.S.Pat.Nos.5,107,065;5,453,566；和5,759,829)。″反义DNA核苷酸序列″意指采用与所述核苷酸序列的5′‑到‑3′正常方向相反方向的序列。当被送递到细胞时，反义DNA序列的表达阻止靶基因DNA核苷酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码与靶基因的DNA核苷酸序列的转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补且能与之杂交的RNA转录本。在这种情况下，靶基因所编码的天然蛋白的产生受到抑制，从而实现期望的表型应答。因此，本文所公开的调控序列可以可操作地连接于反义DNA序列，以减低或抑制真菌天然蛋白的表达。
如所指出的，影响真菌中蛋白表达的其他潜在方法包括，传统的共抑制，即通过表达转化所引入的结构相同的基因或基因片段，抑制内源基因的表达(Goring,D.R.,Thomson,L.,Rothstein,S.J.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1770‑1774 co‑suppression;Taylor(1997)Plant Cell 9:1245;Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12):340‑344;Flavell(1994)PNAS USA91:3490‑3496;Finnegan et al.(1994)Bio/Technology 12:883‑888；以及Neuhuber et al.(1994)Mol.Gen.Genet.244:230‑241))。在一实例中，共抑制可以通过以下实现：将启动子连接于DNA节段，从而使得所述节段的转录本在有义方向产生，且其中所述转录本与目的内源基因的转录本具有至少65%的序列相同性，从而抑制所述真菌细胞中内源基因的表达。(参见U.S.Pat.No.5,283,184)。靶向共抑制的内源基因可以是编码在目的真菌物种中积累的任何蛋白的基因。
下调的其他方法是本领域已知的，并且可以同样应用于本发明。这些方法包括通过剪接的发夹RNA′s和也称为RNA干扰和启动子沉默的相似方法沉默靶基因(参见Smith et al.(2000)Nature 407:319‑320,Waterhouse and Helliwell(2003))Nat.Rev.Genet.4:29‑38;Waterhouse et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13959‑13964;Chuang and Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4985‑4990;Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129:1723‑1731；和Patent Application WO 99/53050;WO 99/49029;WO 99/61631;WO 00/49035和U.S.Pat.No.6,506,559。
对于mRNA干扰，将表达盒设计为在内源miRNA基因上建模的RNA分子。miRNA基因编码形成发夹结构的RNA，所述发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22‑核苷酸序列。miRNA分子高效抑制内源基因的表达，且它们诱导的RNA干扰被下一代真菌继承。
本发明的调控区也可以与另一启动子联合使用。在一实施方案中，真菌选择标记和目的基因可以功能性连接于同一启动子。在另一实施方案中，选择标记和目的基因可以功能性连接于不同的启动子。还在另一实施方案中，表达载体可以含有2个或更多个可以连接于同一启动子或不同启动子的目的基因。例如，本文所述的SB‑LEG启动子可以用于驱动目的基因和选择标记，或针对一个或另一个使用不同的启动子。这些其他启动子元件可以是这样的启动子元件，其是组成型的或足以使启动子依赖性基因表达细胞类型特异性地、组织特异性地或时间或发育阶段特异性地或外部信号或试剂可诱导地可控。这类元件可以位于基因的5′或3′区。尽管其他启动子可以是目的结构基因的内源启动子，但是启动子也可以是外源调控序列。用于控制产物蛋白和选择基因表达的启动子元件可以是任何兼容的启动子。这些可以是具有真菌活性的真菌基因启动子，诸如例如gpd启动子，或来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒的启动子，如胭脂碱合酶、章鱼碱合酶以及甘露碱合酶启动子(Velten,J.and Schell,J.(1985)″Selection‑expression plasmid vectors for use in genetic transformation of higher plants″Nucleic Acids Res.13:6981‑6998;Depicker et al.,(1982)Mol.and Appl.Genet.1:561‑573Shaw et al.(1984)Nucleic Acids Research vol.12,No.20 pp.7831‑7846)；或病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子(Guilley et al.(1982)″Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA:detection of promoter sequences,and characterization of transcripts″Cell30:763‑773;Odell et al.(1985)″Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter″Nature 313:810‑812,玄参花叶病毒FLt启动子(Maiti et al.(1997)″Promoter/leader deletion analysis and plant expression vectors with the figwort mosaic virus(FMV)full length transcript(FLt)promoter containing single or double enhancer domains″Transgenic Res.6:143‑156)或TMV的包被蛋白启动子(Grdzelishvili et al.,2000)″Mapping of the tobacco mosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters in vivo″Virology 275:177‑192)。
表达盒也可以在分离的目的核苷酸序列的3′端包括在真菌中发挥功能的转录和翻译终止区。终止区可以是本发明的启动子核苷酸序列天然的终止区，可以是目的DNA序列天然的终止区，或可以来源于另一来源。因此，任何常见的终止区都可以与本发明的启动子联合使用，并且可从根癌农杆菌的Ti质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见：Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141‑144;Proudfoot(1991)Cell 64:671‑674;Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141‑149;Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261‑1272;Munroe et al.(1990)Gene 91:151‑158;Ballas et al.1989)Nucleic Acids Res.17:7891‑7903;Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15:9627‑9639。
表达盒还含有5′前导序列。这类前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域中是已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区),Elroy‑Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126‑6130；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus))，Allison et al.(1986);MDMV前导序列(Maize dwarf mosaic virus),Virology 154:9‑20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP),Macejak et al.(1991)Nature 353:90‑94；来自苜蓿花叶病病毒(Alfalfa mosaic virus)包被蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4),Jobling et al.(1987)Nature 325:622‑625)；烟草花叶病病毒(Tobacco mosaic virus)前导序列(TMV),Gallie et al.(1989)Molecular Biology of RNA,pages237‑256；以及玉米枯黄斑点病毒(Maize chlorotic mottle virus)前导序列(MCMV),Lommel et al.(1991)Virology 81:382‑385。还参见Della‑Cioppa et al.(1987)Plant Physiology84:965‑968。盒也可以含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，如内含子。
在期望分离的核苷酸序列的表达的产物定向特定细胞器特别是质体、淀粉体或定向内质网或分泌在细胞表面或细胞外的情况下，表达盒还可以包含转运肽的编码序列。这类转运肽在本领域中是熟知的，并且包括但不限于：酰基载体蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶等。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，从而在适当的方向上，并且如果合适，在适当的编码框中提供DNA序列。为此目的，可以使用连接物或接头来连接DNA片段，或可以包括其他操作以提供常规限制位点、除去多余的DNA、除去限制位点等。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制消化以及再取代，如转换和颠换。
可以将报道基因包括于转化载体中。本领域已知的合适的报道基因的实例可以见于例如：Jefferson et al.(1991)in Plant Molecular Biology Manual,ed.Gelvin et al.(Kluwer Academic Publishers),pp.1‑33;DeWet et al.(1987)Mol.Cell.Biol.7:725‑737;Goff et al.(1990)EMBO J.9:2517‑2522;Kain et al.(1995)Bio Techniques 19:650‑655；以及Chiu et al.(1996)Current Biology6:325‑330。
用于选择转化的细胞或组织的选择标记基因可以包括于转化载体中。这些可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因的实例包括但不限于：编码针对以下的抗性的基因：氯霉素Herrera Estrella et al.(1983)EMBO J.2:987‑992；甲氨蝶呤，Herrera Estrella et al.(1983)Nature303:209‑213;Meijer et al.(1991)Plant Mol.Biol.16:807‑820；潮霉素，Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.5:103‑108;Zhijian et al.(1995)Plant Science 108:219‑227；链霉素，Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86‑91；壮观霉素，Bretagne‑Sagnard et al.(1996)Transgenic Res.5:131‑137；博来霉素，Hille et al.(1990)Plant Mol.Biol.7:171‑176；磺酰胺，Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:127‑136；溴苯腈，Stalker et al.(1988)Science242:419‑423；草甘膦，Shaw et al.(1986)Science 233:478‑481；草丁磷,DeBlock et al.(1987)EMBO J.6:2513‑2518，包括玉米“优化”的″pat″基因，Gordon‑Kamm(1990)The Plant Cell 2:603;Uchimiya et al.(1993)Bio/Technology 11:835；以及Anzai et al.(1989)Mol.Gen.Gen.219:492)。
此外，当本发明的启动子与编码可检测蛋白的核苷酸序列连接时，可以在真菌中追踪连接的序列的表达，从而提供有用的筛选或评分标记。可以检测连接的蛋白的表达，而无需破坏组织。作为实例而非限制，启动子可以与可检测的标记连接，包括β‑葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种显色底物已知的酶(Jefferson et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8447‑8451)；氯霉素乙酰转移酶；碱性磷酸酶；R‑基因座基因，其编码调控组织中花青素色素(红色)产生的产物(Dellaporta et al.,in Chromosome Structure and Function,Kluwer Academic Publishers,Appels and Gustafson eds.,pp.263‑282(1988);Ludwig et al.(1990)Science247:449)；p‑内酰胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.75:3737(1978))，其编码各种显色底物已知的酶(如PADAC，显色头孢霉素)；xylE基因(Zukowsky et al.,Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.80:1101(1983))，其编码可以转变显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α‑淀粉酶基因(Ikuta et al.,Biotech.8:241(1990))；酪氨酸酶基因(Katz et al.,J.Gen.Microbiol.129:2703(1983))，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，其转而浓缩形成易于检测的化合物黑色素；绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen et al.,Plant J.8(5):777‑84(1995))；lux基因，其编码荧光素酶，荧光素酶的存在可以利用例如X‑射线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、微光摄影机(low‑light video camera)、光子计数摄像机或多孔发光检测仪(multiwell luminometry)来检测(Teeri et al.(1989)EMBO J.8:343)；DS‑RED EXPRESS(Matz et al.(1999)Nature Biotech.17:969‑973,Bevis et al.(2002)Nature Biotech20:83‑87,Haas et al.(1996)Curr.Biol.6:315‑324)；已经为了更亮的荧光而被改造的海葵(Zoanthus sp.)黄色荧光蛋白(ZsYellow)(Matz et al.(1999)Nature Biotech.17:969‑973，可获得自BD Biosciences Clontech,Palo Alto,Calif.,USA,catalog no.632443)；以及青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943‑54和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129:913‑42)。
如本文所指出的，本发明提供了能在调控元件的控制下表达目的基因的载体。通常，载体在真菌细胞中应当是功能性的。一般而言，优选在E.coli中是功能性的载体(如产生用于引发抗体的蛋白、DNA序列分析、构建插入物、获得大量核酸)。用于在E.coli中克隆和表达的载体和方法讨论于Sambrook et al.(同上)。包含在表达盒中可操作地连接于分离的核苷酸序列的本发明的调控序列的转化载体也可以含有至少一个其他待共转化到生物体中的基因的核苷酸序列。可选地，可以将其他序列提供于另一转化载体上。在真菌中是功能性的载体可以是来源于农杆菌(Agrobacterium)的二元质粒。这类载体能转化真菌细胞。这些载体含有整合到宿主染色体所需的左右边界序列。至少，待在本发明调控元件控制下表达的基因位于这些边界序列之间。在一实施方案中，还包括选择标记和报道基因。
包含在表达盒中可操作地连接于分离的目的核苷酸序列的本发明的具体调控序列的转化载体可以用于转化任何真菌。以此方式，可以获得遗传学修饰的真菌、真菌细胞、真菌组织等。转化方案可以变化，这取决于细胞类型。转化真菌细胞的合适方法包括显微注射Crossway et al.(1986)Biotechniques 4:320‑334；电穿孔，Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602‑5606；农杆菌介导的转化，参见例如Townsend et al.U.S.Pat.No.5,563,055;Romaine et al US Pat No.7,700,439，直接基因转移，Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717‑2722；以及弹道粒子加速，参见例如Sanford et al.U.S.Pat.No.4,945,050。
依照常规方法可以使已经转化的细胞生长成真菌。随后可以用相同的转化菌株或不同的菌株繁殖这些真菌。接着可以鉴定组成型表达期望的表型特征的所得真菌。可以生长两代或更多代以确保期望的表型特征的组成型表达得到稳定维持和遗传。
下述实施例意图进一步说明本发明，无论如何并非限制本发明。本文的实施例和讨论具体涉及双孢蘑菇，然而本文的教导同样适用于任何其他真菌，优选产生肉质子实体的丝状真菌。
实施例
实施例1.从双孢蘑菇鉴定高表达凝集素基因序列
利用总可溶蛋白的2‑D蛋白谱，确定凝集素基因在双孢蘑菇子实体中高表达。所选的子实体(商业中间杂交菌株)接近成熟，但是无外露的菌褶。将新近收获的子实体组织在液氮中冷冻，利用研钵及研杵研磨，用冷丙酮与20%三氯乙酸盐和0.2%二硫苏糖醇提取，并提交至Alphalyse Inc.(Palo Alto,CA)，用于2‑D蛋白谱。所得的凝胶图像显示于图1中。
图1.双孢蘑菇子实体蛋白的2‑D凝胶分析
根据制造商的推荐，利用Invitrogen的IPG drystrips进行一维等电聚焦并利用NuPAGE预制凝胶系统进行二维分离来在2‑D SDS PAGE上实施蛋白分离。数字标记用于MS和MS/MS分析而切除的蛋白斑点。
电泳后，基于2‑D凝胶图像上的染色强度，几个蛋白被鉴定为高度丰富。蛋白#4、#6以及#7(图1)最丰富，因此，选择其用于其他分析，包括Alphalyse Inc所进行的肽作图和测序分析。将所得的蛋白#4、#6和#7的肽图谱和部分肽序列信息针对Alphalyse Inc所制作的蛋白数据库进行blast搜索，并显示匹配双孢蘑菇凝集素基因的cDNA序列(U14936,Crenshaw et al.1996)。3个蛋白共享相同的氨基酸序列。所观察到的凝集素蛋白分离成3个不同的蛋白斑点，可能反映了翻译后修饰的变化，如糖基化。
实施例2：包含启动子的凝集素基因的5’上游DNA区的分离和序列测定
利用基因组步移(APAgeneTM Gold Genome Walking Kit,BIO S&T Inc.Montreal,QC,Canada)进行凝集素基因的基因组5’上游DNA区的分离。根据凝集素cDNA序列设计下述引物：凝集素‑F1(5’‑TTCGTTCAACGGGACGGAAGAAGCCTTT‑3’)和凝集素‑F2(5’‑TCTGGTAGACGCGAATGCTGATGGTGTA‑3’)(Crenshaw et al.,1995)，并用于基因组步移。利用AquaGenomic Kit(MultiTarget Pharmaceuticals LLC,Salt Lake City,Utah)提取双孢蘑菇的基因组DNA，并用作根据APAgeneTMGold Genome Walking Kit提供的方案进行基因组步移PCR的模板。简而言之，将4份15‑μl PCR反应混合物的等分试样添加于标有A、B、C和D的PCR管，对于管A和B利用3x APAgene Gold缓冲液I，对于管C和D利用APAgeneTMGold缓冲液II。15μl初级PCR混合物含有5μl 3x APAgeneTMGold缓冲液、0.3μl 50x PCR退火增强剂、0.4μl 40mM dNTPs、0.7μl 20pmol/μl凝集素‑F1、1μl基因组DNA(～100ng)、0.2μl(1U)Taq DNA聚合酶(Platinum Taq,Invitrogen,Carlsbad,CA)以及7.4μl水。PCR程序由以下组成：94℃下1个循环4min，随后25个循环94℃ 30sec、63℃ 10sec，以0.1℃/sec斜升至66℃，并68℃ 3min，最后一个循环68℃ 10min。PCR扩增后，将0.3μl(1.5U)Taq聚合酶添加于每一管中，并将1μl 15x简并随机标记(DRT)引物A、B、C和D分别添加于A、B、C和D管中。将反应混合物涡旋并进行第二PCR程序，第二PCR程序由以下组成：94℃ 2min，随后94℃ 30sec一个循环，25℃ 10sec，以0.1℃/sec斜升至65℃，68℃ 6min，然后94℃ 30sec 20个循环，55℃ 30sec，68℃ 2min和50sec，以及最后一个循环68℃ 30min。第二次PCR扩增后，将来自A、B、C和D管的的0.5μl PCR产物分别转移至标有A1、B1、C1和D1的管。将1μl 10x DRT引物消化缓冲液的等分试样添加于具有0.5μl消化酶和8μl水的每一管中。涡旋消化混合物，并于37℃孵育30min。然后于95℃将消化混合物中的酶热失活5min。消化反应后，利用巢式PCR扩增凝集素基因上游的5’基因组。对于巢式PCR，将15μl反应混合物添加于标有A2、B2、C2和D2的4个管中的每一管，A2和B2管利用3x APAgeneTM Gold缓冲液I，对于C2和D2管利用APAgeneTM Gold缓冲液II。用于巢式PCR的15μl反应混合物含有5μl 3x APAgeneTM Gold缓冲液(I或II)、0.3μl 50x PCR退火增强剂、0.3μl 40mM dNTPs、0.4μl 20pmol/μl凝集素‑F2引物、0.4μl通用标记引物、0.5μl来自A1、B1、C1或D1的消化的PCR产物、0.3μl Taq DNA聚合酶(Invitrogen)以及7.8μl水。扩增推断的凝集素基因的巢式PCR程序由以下组成：94℃ 4min一个循环，然后30个循环，94℃ 30sec、62℃ 10sec、以0.1℃/sec斜升至65℃，之后68℃ 2min和30sec，最后一个循环68℃ 10min。利用凝胶电泳，在1%的琼脂糖凝胶上，在1x TBE(1xTRIS/BORATE/EDTA、54g Tris碱、27.5g硼酸、20ml 0.5M EDTA(pH 8.0)，1000ml)上分离PCR产物。反应A2、C2和D2的PCR产物的大小范围为约400bp至约600bp。利用Quick Gel Extraction Kit(Invitrogen)，从琼脂糖凝胶中回收扩增子。
利用TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)、遵循制造商的方案，将凝集素基因上游推断的5’基因组DNA区的PCR扩增产物克隆到pCR2.1 TOPO载体中。简而言之，将从琼脂糖凝胶中回收的4μl PCR产物添加于6μl pCR2.1连接反应中。在室温下连接5min后，用3μl每一种反应混合物转化ONE‑SHOT DH5α化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化的细胞铺平板，并在LB(Growcells,Irvine,CA)琼脂板中选择，所述琼脂板含有50μg/ml卡那霉素与涂抹于表面上的40μl 40mg/ml X‑gal(MP Biomedicals,Solon,Ohio)。于37℃避光过夜孵育后，挑选白色菌落用于质粒DNA制备。将质粒DNA用EcoRI消化，并在1x TBE(如上文所述)中利用1%琼脂糖凝胶分离，以鉴定具有正确的插入大小的克隆。含有A2反应的PCR产物的克隆称为pAGN‑743，来自C2反应的称为pAGN‑744，以及来自D2的称为pAGN‑745。
通过利用M13R反向引物对pAGN‑743、pAGN‑744和pAGN745中的插入物进行测序，测定凝集素基因启动子的核苷酸序列。pAGN‑743、pAGN‑744和pAGN‑745克隆的插入序列间的比对表明3个PCR产物重叠。pAGN745克隆(pAGN‑745‑1、‑2和‑3)含有凝集素基因上游最长的5’基因组DNA区。利用来自pAGN‑745克隆的序列信息，产生凝集素基因上游5’基因组DNA区的共有序列。共有序列与凝集素基因5’端cDNA序列的重叠证实，基因组步移所产生的DNA片段代表凝集素基因的启动子区。基因组步移所产生的基因组DNA序列与凝集素cDNA序列(U14936,Crenshaw et al.1996)之间的比对揭示了凝集素mRNA5’UTR中的内含子。用“所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列”进行的凝集素基因上游5’基因组DNA区共有序列的核苷酸blast搜索(blastn)未能表现出与任何已知序列的相同性，这表明分离的序列是新启动子。
实施例3：证明凝集素启动子在双孢蘑菇中指导GUS报道基因表达的能力
构建二元载体pAGN‑750(图2)以检测凝集素启动子(称为pLctn)驱动β‑葡萄糖醛酸酶(GUS)报道基因在双孢蘑菇中表达的能力。利用引物Lctn‑BglII(5’‑AGCTTAGATCTGAACACGCG TCGTTTACCTCC‑3’)和Lctn‑NcoI(5’‑GTAAGTCCATGGTCTGCTCAACGTTATGAGTTAGTTG‑3’)，从pAGN‑745扩增pLctn。将限制酶位点BglII和NcoI并入引物中来利于克隆。用BglII/NcoI消化PCR产物，并用消化的产物取代GUS表达载体pAGN‑030中的BglII‑NcoI片段，以产生pAGN‑750。利用测序证实pAGN‑750中的序列。遵循Chen et al.(2000)所述的转化方法，将pAGN‑750引入根癌农杆菌并随后引入双孢蘑菇。针对营养菌丝和生殖子实体中GUS表达(Sean R.Gallagher,1991的GUS方案)，分析pAGN‑750所产生的转基因事件。为了测定菌丝中GUS表达，使转基因事件的菌丝在滤纸上于含有30μg/ml潮霉素B的SM琼脂板中建群10‑14天。基于在滤纸上暴露于染色缓冲液的菌丝菌落中存在的绿色强度，评估菌丝中GUS表达(图3)。该研究的结果表明，在双孢蘑菇营养生长阶段，pLctn驱动GUS表达。还评估了子实体组织中的GUS表达。用转基因事件的菌丝接种生长培养基，用于产生蘑菇。在潮霉素上转化并选择转基因系后，将培养物转移到液体培养基(2%麦芽提取物培养液(Difco)，并于室温下维持于此，暂停子实体培养基接种。液体培养基培养物与灭菌的黑麦/小米颗粒混合物(50:50)在灭菌的250ml塑料容器中混合，并且转基因双孢蘑菇菌丝在室温下在颗粒基质上建群约2周。将完全建群的颗粒用3cm深的泥炭腐殖质套管混合物(peat humus casing mixture)覆盖，并当菌丝出现于套管的顶部时，将培养物转移到18℃培养箱。给培养物频繁施水，以维持生物体优选的湿润生长环境。在孢子形成之前，收获成熟的子实体，且直接置于‑80℃用于储存或未来分析，或对于gus表达系，简单储存于4℃，然后利用GUS可视染色或MUG定量测定进行分析。
为了使gus基因表达可视，将每一子实体的3‑mm厚的切片浸入GUS染色缓冲液中。根据组织中显色强度的可视评估，记录子实体中的GUS表达(表1)。该研究结果(表1，图3)表明，pLctn可以指导双孢蘑菇生殖子实体中GUS高水平积累。对于pAGN‑750构建体，观察到不同的独立转基因事件间染色强度水平的变化。这种变化可以由转基因整合到不同的染色体位置所致的序列环境差异和/或事件间转基因拷贝数量的差异来解释，这对于转化到双孢蘑菇中的其他启动子/转基因组合而言常观察到，并且常报道于其他植物、动物和真菌系统中(Peach C.and Velten J.1991;Siegal M.L.and Hartl D.L.1998;Butaye et al.2005)。选择5个事件的子实体，以利用MUG(4‑甲基伞型基葡糖苷酸)测定(Gallagher,S.R.1991)定量测量GUS活性。为了提取用于MUG测定的总可溶蛋白，将100mg子实体组织与3个玻璃珠(直径3.5mm)一起添加于含有300ul PBS缓冲液(1X PBS:8g NaCl,0.2gKCl,1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，1000ml,pH7.4)的试管中，并以400次击打/min用Geno/Grinder(SPEX SamplePrep 2000 Geno/Grinder,SPEX SamplePrep LLC,Metuchen,NJ)均质化3min。遵循制造商BCA Protein Assay Kit(Thermos Scientific,Rockford,IL)的用法说明，定量可溶性提取物中的蛋白浓度。子实体组织中GUS活性定量，表示为MUG读数/μg从组织提取的总可溶蛋白。MUG测定数据(表2)证实了子实体中GUS表达的定性分析结果。结果显示于图3中。
表1.子实体组织中GUS积累的可视评分
事件*Gus表达水平**事件Gus表达水平**750‑1A0.5750‑13A2.5750‑2A0.5750‑14A2.5750‑3A3.5750‑15B0.5750‑4A2750‑16A3.5750‑5A2750‑17A0.5750‑6A1.5750‑18B2750‑7A3750‑19B4750‑8A4750‑20C2750‑9A2.5750‑21A1.5750‑10A1750‑22A4750‑11C4750‑23A1.5750‑12A2.5750‑24A4
*:A、B以及C分别表示子事件的实体A、B以及C
**：于RT下将子实体切片浸入GUS染色缓冲液6小时，并通过在水中2次漂洗终止酶反应，并转移至50%乙醇溶液。评定量表：1=浅蓝色；2=中等程度的蓝色；3=暗蓝色；4=深暗蓝色
表2.子实体中GUS活性的定量测量。

*：于37C下15min后，添加150ul NaCO2终止MUG反应。
图4.对于pAGN‑750的独立转基因事件子实体切片的GUS染色。
样品1=750‑22B；样品2=750‑16A；样品3=750‑6B；样品4=750‑11C；样品5=750‑7A；样品6=750‑13A；样品7=750‑8A；样品8=750‑23A
实施例4：证明凝集素启动子在双孢蘑菇中指导牛胰蛋白酶抑制剂(抑肽酶)表达的能力
构建二元载体pAGN‑755(图5)，以检测pLctn影响抑肽酶靶基因表达的能力。通过利用从pAGN‑750释放的BglII‑NcoI‑pLctn片段取代抑肽酶表达载体pAGN‑021中的BglII‑NcoI启动子片段，合成构建体pAGN‑755。通过测序证实pAGN‑755中的pLctn序列。在Chen et al.(2000)所述的转化程序后，将pAGN‑755引入根癌农杆菌，然后引入双孢蘑菇。按之前所述产生利用pAGN‑755所产生的一组转基因事件的子实体。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹分析子实体组织中的抑肽酶表达。观察到抑肽酶的高表达，高达200mg/kg新鲜子实体组织(表3，图4)。
表3：pAGN‑755事件中的抑肽酶表达
代表性事件表达(mg/kg)755‑B10‑30414.20755‑B10‑31454.69755‑B10‑32536.40755‑B10‑33235.37755‑B10‑34824.54755‑B10‑35217.27755‑B10‑35415.13755‑B10‑36042.99755‑B10‑363A139.65755‑B10‑363B205.32755‑B10‑36411.33755‑B10‑380129.22755‑B10‑38122.05755‑B10‑38626.78755‑B10‑3888.21755‑B10‑39418.96
实施例5：凝集素启动子活性必须的DNA序列的测定
利用缺失分析确定启动子活性所需的凝集素基因上游5’基因组DNA区的最小区。设计并合成下述PCR引物，以便评估该序列的个体节段影响基因表达的能力：Lctn‑BglII‑2,5’‑AGCTTAGATCTGTCCTGGCACTAGTCACAG‑3’,Lctn‑BglII‑4,5’‑AGCTTAGATCTTTGTAGCGCTTGATGC‑3’,Lctn‑BglII‑6,5′‑AGCTTAGATCTTATAATTAGCACATACCC‑3′,Lctn‑BglII‑7,5’‑AGCTTAGATCT CGTCTTCATAGATATGGCCAAGCATC‑3’,Lctn‑BglII‑8,5’‑AGCTTAGATCT TGCTACTTGTAGATAAGTTTATCTACACC‑3’,Lctn‑BglII‑9,5’‑AGCTTAGATCTGATATATAACGATGTCCGATACTTGTG‑3’，以及Lctn‑BglII‑10，5’‑AGCTTAGATCTCTTGACTGCGATTCACCTGCTCC‑3’。启动子分析所用的引物对以及预期大小列于表4中。BglII‑NcoI消化的PCR产物用于取代pAGN‑774中凝集素基因上游的全长5′基因组DNA区。如表4和图6所述，所得的载体称为pAGN‑1279、pAGN‑1280、pAGN‑1281、pAGN‑1282、pAGN‑1283、pAGN‑1304以及pAGN‑1305。
表4：用于pLctn缺失分析的引物和预期启动子大小
引物A引物B启动子的预期长度载体Gus表达Lctn‑BglII‑2Lctn‑NcoI474bppAGN‑1279强Lctn‑BglII‑4Lctn‑NcoI369bppAGN‑1280强Lctn‑BglII‑6Lctn‑NcoI280bppAGN‑1281强Lctn‑BglII‑7Lctn‑NcoI230bppAGN‑1282强Lctn‑BglII‑8Lctn‑NcoI180bppAGN‑1283强Lctn‑BglII‑9Lctn‑NcoI135bppAGN‑1304弱Lctn‑BglII‑10Lctn‑NcoI85bppAGN‑1305弱
图6表示所评估的凝集素启动子序列。每一载体中的5’端DNA序列标有下划线，并且确定了对应的载体。所有的载体共享呈现的相同的3’序列。pAGN‑755和pAGN‑750共享相同的序列。
按以前所述，将并入凝集素基因5′区的片段的构建体转化到根癌农杆菌中，随后转化到双孢蘑菇中。将3个截短的启动子序列所驱动的GUS表达与用存在于pAGN‑774中的凝集素基因上游的全长5′基因组DNA区所获得的GUS表达进行比较。序列显示于表5中。
表5：凝集素启动子分子所用的每一载体的DNA序列


图7表示由截短的启动子所产生的事件的菌丝GUS染色。pAGN‑1304和pAGN‑1305所产生的蘑菇子实体在GUS染色中也表现出非常弱的GUS表达或无GUS表达(数据未显示)。
数据表明，如pAGN‑1283、pAGN‑1304和pAGN‑1305GUS表达数据所证明的，最小的完全强度凝集素启动子介于135bp至180bp。
参考文献
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培养基
选择培养基(SM)琼脂
500ml10g麦芽提取物1.05g MOPS(或1.15 MOPS钠盐)1.5%琼脂(7.5g)添加水至500mlpH至7.0&BTV
高压灭菌
选择培养基(SM)
500ml10g麦芽提取物1.05g MOPS(or 1.15 MOPS钠盐)1.5%琼脂(7.5g)添加水至500mlpH至7.0&BTV高压灭菌50μg/ml潮霉素B(500μl 50mg/ml)200μM头孢噻肟(500μl 100mg/ml)100μg/ml羟羧氧酰胺菌素(任选)
GUS染色溶液
100ml2ml 0.5M EDTA(pH 8.0)1.38g NaH2PO4100μl Triton X‑100添加水至100ml用NaOH将pH调整至7.00.05g x‑gluc的2ml DMF溶液