《诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法.pdf（23页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103146645 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146645 A *CN103146645A* (21)申请号 201310081154.3 (22)申请日 2013.03.14 C12N 5/077(2010.01) C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人 深圳市博泰生物医学科技发展有限 公司 地址 518057 广东省深圳市南山区科技园中 区科技中一路万利达科技大厦 20 层 (72)发明人 赵文卓 王涵 刘韬 (74)专利代理机构 深圳中一专利商标事务所 44237 代理人 张全文 (54) 发明名称 诱导间充质干。
2、细胞成为软骨细胞的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种诱导间充质干细胞 （MSCs） 成为软骨细胞的方法， 包括的步骤有 ： 获取 MSCs 和软骨细胞 ； 将软骨细胞接种于软骨细胞培养液 中进行培养 ； 将 MSCs 接种于插入式细胞培养皿 中， 再将所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细 胞培养液中， 并将软骨细胞培养液更换成软骨细 胞诱导分化培养基后进行共同培养。该诱导方法 能使得 MSCs 与软骨细胞可以模拟体内环境而发 生协同作用， 使得诱导 MSCs 分化成软骨细胞因子 与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子的协同 作用， 从而显著缩短诱导 MSCs 分化成软骨细胞的 时间， 提高了软。
3、骨细胞增殖率， 并且同时提高了诱 导分化后细胞的 II 型胶原的表达率与表达量和 糖胺聚糖 （GAG） 的分泌量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 附图9页 (10)申请公布号 CN 103146645 A CN 103146645 A *CN103146645A* 1/2 页 2 1. 一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 包括如下步骤 ： 获取间充质干细胞和软骨细胞 ； 将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养 ； 将所述间充质干细胞接种于插入式细胞。
4、培养皿中， 再将接种有所述间充质干细胞的所 述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中， 并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细 胞诱导分化培养基后进行共同培养 ； 其中， 所述软骨细胞诱导分化培养基中含有 210-7 510-7mol/L 的甲状旁腺激素相关蛋白 1-34。 2. 根据权利要求 1 所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征在于 ： 在所 述将软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基进行共同培养的步骤中， 所述软骨细 胞诱导分化培养基还包含如下配方组分 ： 作为基础成分的 DMEM 高糖培养液 3. 根据权利要求 1 所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征在。
5、于 ： 在 将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液的步骤中， 所述软骨细胞的接种量为 0.5104 1104个 /cm2。 4. 根据权利要求 1 所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征在于 ： 在将 所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中的步骤中， 所述间充质干细胞的接种量为 2104 5104个 /cm2。 5. 根据权利要求 1 4 任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 在将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液的步骤中， 所述软骨细胞培养液以 DMEM/ F12 培养基为基础， 添加有占所述软骨细胞培养液体积百分比为 5% 15% 的胎牛血清。 6. 。
6、根据权利要求 1 4 任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 在所述将软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基进行共同培养的步骤中， 所述共同培养的条件为 37 C、 5%CO2。 7. 根据权利要求 1 4 任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 所述插入式细胞培养皿的滤膜孔径为 0.22 0.8m。 权 利 要 求 书 CN 103146645 A 2 2/2 页 3 8. 根据权利要求 1 4 任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 所述间充质干细胞为原代培养间充质干细胞或 / 和传代培养间充质干细胞。。
7、 9. 根据权利要求 1 4 任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 所述软骨细胞为原代培养软骨细胞或 / 和传代培养软骨细胞。 10.根据权利要求14任一项所述的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 其特征 在于 ： 在将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液进行培养的步骤中， 所述软骨细胞在软骨 细胞培养液进行培养 0 2 天。 权 利 要 求 书 CN 103146645 A 3 1/11 页 4 诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法 技术领域 0001 本发明属于干细胞技术领域， 具体涉及一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方 法。 背景技术 0002 目前修复软骨组。
8、织的传统方法是采用自体软骨细胞， 此法必须在关节镜下切取非 负重区的关节软骨， 对其中的软骨细胞进行扩增， 这种手术唯一的优点为无抗原性， 但造成 机体损伤很大。 另外软骨组织中绝大部分为基质， 软骨细胞数量少且难分离， 体外传代次数 有限， 一般最多培养 3 4 代， 所以难以获得大量细胞。 0003 当前， 骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞普遍采取高密度聚团诱导。该方法一般 将扩增后的细胞离心成细胞团， 再用成软骨细胞诱导培养基进行微团诱导。但是成软骨细 胞诱导需要大量的骨髓间充质干细胞， 为了获得大量的骨髓间充质干细胞， 必须在体外进 行长时间的传代培养， 而随着细胞培养时间的延长， 干细。
9、胞的多向分化潜能会出现程序性 丢失， 消化过程中使用的胰酶也会导致细胞活性的降低。 0004 间充质干细胞 （MSCs） 是成体干细胞的一种， 它具有多向分化潜能， 为类风湿性关 节炎， 骨关节炎及先天性软骨发育不良等疾病的细胞治疗开辟了一条新的途径。并且最新 研究表明， MSCs 可以作用于抑制患者自身的炎症反应， 以及缓解一些退行性疾病的症状。 0005 目前采用 MSCs 分化成软骨细胞的方法一般是将 MSCs 培养至传代的 MSCs 后， 再在 含有定向诱导为软骨细胞的因子的培养基中进行诱导培养， 将 MSCs 诱导成软骨细胞。但是 由于 MSCs 的定向诱导分化受很多不同信号通路的影。
10、响， 而且诱导培养 MSCs 的细胞微环境 变化对于 MSCs 诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响。因此。导致现有的 MSCs 分化 成软骨细胞的方法所需周期都较长， 通常需要 2-4 周， 并且诱导后 II 型胶原的表达效率较 低。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足， 提供一种诱导时间短、 诱导后 II 型 胶原的表达效率高的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法。 0007 为了实现上述发明目的， 本发明实施例的技术方案如下 ： 0008 一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 包括如下步骤 ： 0009 获取间充质干细胞和软骨细胞 ； 0010 将所述软骨细胞。
11、接种于软骨细胞培养液中进行培养 ； 0011 将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中， 再将接种有所述间充质干细 胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中， 并将所述软骨细胞培养液更换 成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养 ； 其中， 所述软骨细胞诱导分化培养基中含有 210-7 510-7mol/L 的甲状旁腺激素相关蛋白 1-34。 0012 上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法采用插入式培养皿共同培养软骨细 说 明 书 CN 103146645 A 4 2/11 页 5 胞和间充质干细胞， 使两种细胞可以模拟体内环境而发生协同作用， 利用诱导 MSCs 分化成 软骨细胞因。
12、子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子的协同作用， 从而显著的缩短了诱 导 MSCs 分化成软骨细胞的时间， 提高了软骨细胞增殖率， 并且同时提高了诱导分化后细胞 的 II 型胶原的表达率与表达量， 诱导分化后细胞的糖胺聚糖 （GAG） 的分泌也得到了明显提 高。另外， MSCs 与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长， 有效的避免两细胞间的交叉 污染， 保证两细胞的纯度， 从而利用 MSCs 的诱导和软骨细胞的增值。 附图说明 0013 图 1 是本发明实施例诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法工艺流程示意图 ； 0014 图 2 是本发明实施例 1 的步骤 S11 中分离培养的 MSCs 的。
13、流式检测结果分析图 ； 其 中， 图 2A 为传代培 MSCs 的 CD29、 CD34、 CD44 和 CD45 表达率柱状图， 图 2B 为 MSCs 的 CD29 表达率图， 图 2C 为 MSCs 的 CD34 表达率图， 图 2D 为 MSCs 的 CD44 表达率图， 图 2E 为 MSCs 的 CD45 表达率图 ； 0015 图 3 是本发明实施例 1 与对比实例 1 中 MSCs 诱导分化为软骨细胞中的阳性表达 II 型胶原细胞的流式检测图 ； 其中， 图 3A 为实施例 1 与对比实例 1 分别诱导第 5 和第 8 天 时， MSCs 诱导分化为软骨细胞中阳性表达 II 型。
14、胶原的细胞所占比率的柱状图 ； 图 3B 为实 施例 1 中的 MSCs 诱导 5 天时， 阳性表达 II 型胶原细胞表达率图 ； 图 3C 为对比实例 1 中的 MSCs 诱导 5 天时， 阳性表达 II 型胶原细胞表达率图 ； 图 3D 为实施例 1 中的 MSCs 诱导 8 天 时， 阳性表达 II 型胶原细胞表达率图 ; 图 3E 为对比实例 1 中的 MSCs 诱导 8 天时， 阳性表 达 II 型胶原细胞表达率图 ； 0016 图 4 是本发明实施例 1、 对比实例 1 中的 MSCs 分别诱导 5 天和 8 天后以及对比实 例 2 中的 MSCs 中的阳性表达 II 型胶原的细胞。
15、的荧光表达测定结果图 ； 0017 图 5 是本发明实施例 1、 对比实例 1 中的 MSCs 分别诱导 5 天和 8 天后以及对比实 例 2 中的 MSCs 不诱导进行培养 5 天和 8 天后定量统计阳性表达 II 型胶原细胞的荧光强度 与 DAPI 的荧光强度的比值柱状图 ； 其中， 图 5A 为实施例 1、 对比实例 1 和对比实例 2 在第 5 天时阳性表达 II 型胶原细胞的荧光强度与 DAPI 的荧光强度的比值柱状图， 图 5B 为实施例 1、 对比实例 1 和对比实例 2 在第 8 天时阳性表达 II 型胶原细胞的荧光强度与 DAPI 的荧光 强度的比值柱状图 ； 0018 图 。
16、6 是本发明实施例 1、 对比实例 1 中的 MSCs 诱导分化为软骨细胞增殖率图 ； 0019 图 7 是本发明实施例 1、 对比实例 1 中的 MSCs 分别诱导 5 天和 8 天后以及对比实 例 2 中的 MSCs 不诱导进行培养 5 天和 8 天后软骨细胞分泌统的 GAG 含量柱状图。 具体实施方式 0020 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明作进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不 用于限定本发明。 0021 本发明实施例提供了一种诱导时间短、 诱导后 II 型胶原的表达效率高的诱导间 充质干。
17、细胞成为软骨细胞的方法。 该诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法的工艺流程如 图 1 所示， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 103146645 A 5 3/11 页 6 0022 步骤 S01. 获取间充质干细胞和软骨细胞 ； 0023 步骤S02.接种并培养软骨细胞 ： 将步骤S01中获取的软骨细胞接种于软骨细胞培 养液中进行培养 ； 0024 步骤 S03. 采用插入式细胞培养皿将间充质干细胞与软骨细胞进行共同诱导培 养 ： 将步骤 S01 中获取的间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中， 再将接种有所述间充 质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中， 并将所述软骨细胞培养。
18、液 更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养。 0025 具体地， 上述步骤 S01 中的间充质干细胞 （MSCs） 和软骨细胞可以是原代培养细胞 或 / 和传代培养细胞。在优选实施例中， 该 MSCs 和软骨细胞均选用传代培养细胞。选用传 代培养细胞只需一次原代培养， 而在传代的过程中能产生大量所需要的软骨细胞和 MSCs， 从而能有效避免后续步骤S03繁琐操作， 缩短后续步骤S03中两细胞共同培养的时间， 同时 还能有效避免进行原代培养时对原代培养细胞来源的限制。 0026 该 MSCs 和软骨细胞可以按照现有方法获取也可以按照如下经优化后的方法获 取。其中， 该 MSCs 优选按如下方。
19、法获取 ： 0027 原代培养 MSCs 的获取 ： 从手术台取足月正常产健康产妇已离体的脐带组织， PBS 平衡液充分洗涤残留的血液， 去除脐静脉及动脉及脐带外膜， 剥离 Wharton 胶， 并将其剪碎 成小组织块， 反复用 DMEM 高糖培养液洗去血细胞， 将组织块铺在培养皿中， 组织块间隔开， 放入37、 5%CO2培养箱中贴壁后， 在培养皿中加入含515v/v%的胎牛血清 （FBS） 的DMEM 高糖培养液， 放入 37、 5%CO2的培养箱内进行培养， 时间为 10 15 天， 待细胞爬出组织， 从而获得原代培养 MSCs。 0028 传代培养 MSCs 的获取 ： 将上述细胞爬出。
20、组织并长满单层后原代培养 MSCs 进行传 代培养， 获得该传代培养 MSCs。其中， 该传代培养按照现有方法进行即可。如培养的温度 37、 5%CO2的培养箱内进行培养， 时间为 4 5 天。 0029 待MSCs经原代培养或传代培养后， 可以将MSCs采用流式细胞仪检测细胞表型。 以 进一步验证和鉴定该分离得到的细胞为 MSCs。 0030 当然， 上述 MSCs 的来源除了正常产健康产妇脐带组织之外， 还可以来源于骨髓， 脂肪， 皮肤等组织。 0031 上述步骤 S01 中的软骨细胞优选按如下方法获取 ： 0032 原代培养软骨细胞的获取 ： 0033 （1） 无菌条件下取离体的非承重组。
21、织软骨细胞， 置于 DPBS 中漂洗， 将软骨剪碎后 继续用DPBS液漂洗 ； 其中， 非承重组织可以来源于离体的耳廓， 会厌及呼吸道等处。 非承重 组织获取按本领域常规方法进行获取即可 ； 0034 （2） 吸去漂洗液， 加入 0.25% 胰蛋白酶溶液， 并置于 37、 5%CO2的培养箱内消化 ； 0035 （3） 吸出胰蛋白酶溶液， 加入 0.3%II 型胶原酶溶液， 置于 37、 5%CO2的培养箱内 继续消化， 每 1h 更换一次酶溶液 ； 0036 （4） 过筛网， 去除未被消化的组织块 ； 0037 （5） 用离心管留取各次消化液离心， 去除上清液 ； 0038 （6） 用 PB。
22、S 液洗， 再次离心， 获取原代培养软骨细胞。 0039 传代培养软骨细胞的获取 ： 说 明 书 CN 103146645 A 6 4/11 页 7 0040 将上述获取的原代培养软骨细胞用含 5% 15%FBS 的 DMEM/F12 培养液制成细胞 悬液， 调细胞悬液浓渡为 （5 8） 104个 /ml ； 将细胞悬液接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2的培养箱内培养， 获得培养至传代的软骨细胞。 0041 上述步骤 S02 中， 软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养的时间优选为 0 2 天， 如 1 天、 2 天等。将软骨细胞先进行培养是为了使得软骨细胞数量的增值， 从而缩短下 述。
23、步骤 S03 中共同培养的时间以及提高 MSCs 诱导成软骨细胞的效率。当然， 软骨细胞接种 于软骨细胞培养液中进行培养的时间为 0 天， 也即是可以不对软骨细胞进行预先培养， 而 是将软骨细胞接种于软骨细胞培养液中后， 直接与接种在插入式细胞培养皿中的间充质干 细胞进行同时培养。 0042 在优选实施例中， 该软骨细胞的接种量为 0.5104 1104个 /cm2。和 / 或在另 一优选实施例中， 用于培养该软骨细胞的软骨细胞培养液为含5%15v/v%FBS的DMEM/F12 培养液， 也即是该软骨细胞的软骨细胞培养液以 DMEM/F12 培养基为基础， 添加有占软骨细 胞培养液体积百分比为。
24、 5% 15% 的胎牛血清。 0043 在一具体实施例中， 该软骨细胞的培养可以在细胞培养多孔板中进行， 如将软骨 细胞培养液加入细胞培养多孔板中， 然后将软骨细胞接种至该软骨细胞培养液中， 并在 37、 5%CO2的条件下进行培养 2 天。其中， 细胞培养多孔板可以根据实际需要灵活选用， 如 24孔细胞培养板。 当然也可以根据实际需要而选用6孔细胞培养板、 12孔细胞培养板或96 孔细胞培养板等。 0044 上述步骤 S03 中， 将接种在插入式培养皿中的 MSCs 与经上述步骤 S02 中培养后的 软骨细胞在软骨细胞诱导分化培养基中共同培养过程中， MSCs 与软骨细胞通过插入式培养 皿而。
25、分隔开生长， 且两者通过插入式培养皿的微孔膜结构共用软骨细胞诱导分化培养基， 并使得软骨细胞诱导分化培养基中含有的诱导 MSCs 分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌 的细胞外基质作诱导因子对 MSCs 发生协同诱导的增效作用， 即使得该两种细胞能够模拟 体内环境而发生协同作用， 从而实现显著缩短诱导 MSCs 分化成软骨细胞的时间， 提高了软 骨细胞的增殖率的目的。 0045 在优选实施例中， MSCs 接种于插入式细胞培养皿中的量为 2104 5104个 / cm2。该接种量能使得该软骨细胞外基质作诱导因子与诱导 MSCs 分化成软骨细胞因子更好 的发挥协同作用， 实现进一步缩短诱导 MSCs。
26、 的时间， 提高软骨细胞的增殖率的目的。 0046 在另一优选实施例中， 该插入式细胞培养皿的微孔膜结构的孔径为 0.22 0.8m， 在更优选实施例中， 该插入式细胞培养皿的微孔膜结构的孔径为0.4m。 该优选孔 径的插入式细胞培养皿更能有效的避免两细胞间的交叉污染， 保证两细胞的纯度， 从而更 加利用 MSCs 的诱导和软骨细胞的增值。 0047 在优选实施例中， 上述软骨细胞诱导分化培养基配方是以 DMEM 高糖培养液为基 础， 以及含有如下组分 ： 0048 说 明 书 CN 103146645 A 7 5/11 页 8 0049 甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 210-7 510-7。
27、mol/L。 0050 在进一步优选实施例中， 上述软骨细胞诱导分化培养基配方如下 ： 0051 以 DEM E 高糖培养液为基础， 0052 0053 0054 甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 3.510-7mol/L。 0055 上述软骨细胞诱导分化培养基的优选实施例中， 含有的各 MSCs 定向诱导为软骨 细胞的因子以及甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 之间协调作用， 进一步缩短诱导 MSCs 成为软 骨细胞的时间， 提高 MSCs 的定向诱导效率， 提高了软骨细胞增殖率。其中， 与 TGF-2 和 TGF-1 相比， TGF-3 通过其受体激活某些特定的信号通路而启动软骨特异性基因的转 。
28、录， 从而上调型胶原和 GAG 表达与合成 ； 地塞米松作为非特异的促 MSCs 向软骨细胞分化 的因子， 可与 MSCs 膜上的糖皮质激素受体结合， 激活细胞表面受体， 和 MSCs 分泌细胞因子 协同作用， 共同促进 MSCs 向软骨细胞分化， 并可抑制 MSCs 向其他类型细胞分化 ； 甲状旁 说 明 书 CN 103146645 A 8 6/11 页 9 腺激素相关蛋白 1-34 具有促进软骨细胞分裂增生的作用， 并且刺激新生软骨细胞合成较 多细胞外基质， 另外甲状旁腺激素相关蛋白具有抑制软骨细胞向成熟肥大型软骨细胞的分 化， 阻碍软骨细胞凋亡的作用。 0056 在优选实施例中， 将上。
29、述 MSCs 和软骨细胞共同培养是在 37、 5%CO2的环境中培 养。为了培养基的营养和功能成分稳定， 优选在在共同培养的过程中， 每 2 天更换一次培养 基。培养的时间可以灵活调整， 如 5 天、 8 天等。 0057 由上所述， 上述诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法采用插入式培养皿共同培 养软骨细胞和 MSCs， MSCs 与软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长， 且两者通过插入式 培养皿的微孔膜结构共用软骨细胞诱导分化培养基， 并使得软骨细胞诱导分化培养基中含 有的诱导 MSCs 分化成软骨细胞因子与软骨细胞分泌的细胞外基质作诱导因子如 TGF-1、 IGF、 MMP 及 CDMP 。
30、等对 MSCs 发生协同诱导的增效作用， 即使得该两种细胞能够模拟体内环 境而发生协同作用， 从而显著的缩短了诱导 MSCs 分化成软骨细胞的时间， 提高了软骨细胞 增殖率， 并且同时提高了诱导分化后细胞的 II 型胶原的表达率与表达量， 诱导分化后细胞 的糖胺聚糖 （GAG） 的分泌也得到了明显提高， 具体请参见下文的图 2 至图 7。另外， MSCs 与 软骨细胞通过插入式培养皿而分隔开生长， 有效的避免两细胞间的交叉污染， 保证两细胞 的纯度， 从而利用 MSCs 的诱导和软骨细胞的增值。因此， 上述诱导间充质干细胞成为软骨 细胞的方法有效克服了现有诱导 MSCs 分化成软骨细胞的方法诱。
31、导时间长， 诱导后 II 型胶 原的表达效率较低的不足。 0058 现以具体的诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法为例， 对本发明进行进一步详 细说明。 0059 实施例 1 0060 诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 包括如下步骤 ： 0061 步骤 S11. 脐带 MSCs 的分离和培养 ： 0062 从手术台取足月正常产健康产妇已脱离的脐带组织， PBS 平衡液充分洗涤残留的 血液， 去除脐静脉及动脉及脐带外膜， 剥离 Wharton 胶， 并将其剪碎至 lmm3人小组织块， 反 复用 DMEM 培养基洗去血细胞， 将组织块铺在 6cm 直径的培养皿中， 组织块间隔约 1cm， 放入 。
32、37、 5%CO2培养箱中贴壁1h。 在培养皿中加入1ml含10%FBS的DMEM， 小心放入37、 5%CO2 的培养箱内进行培养。在细胞爬出组织并长满单层后进行传代培养。 0063 步骤 S12. 软骨细胞的分离及培养 ： 0064 （1） 无菌条件下取非承重组织软骨细胞， 置于 PBS 中漂洗 2 次， 并用眼科剪将软骨 剪碎至 1mm3大小， 继续用 PBS 液漂洗 2 次 ； 0065 （2） 吸去漂洗液， 加入 0.25% 胰蛋白酶溶液， 并置于 37、 5 CO2的培养箱内消化 30min ； 0066 （3） 吸出胰蛋白酶溶液， 加入 0.3%II 型胶原酶溶液， 置于 37、。
33、 5 CO2的培养箱 内继续消化 3h， 每 1h 更换一次酶溶液 ； 0067 （4） 过 120 目筛网， 去除未被消化的组织块 ； 0068 （5） 用离心管留取各次消化液离心 2000rpm*10min， 去除上清液 ； 0069 （6） 用 PBS 液洗 1 次， 以同样方式再次离心 ； 0070 （7） 用含 10%FBS 的 DMEM 制成细胞悬液， 调细胞悬液浓渡为 7.5*104; 将细胞悬液 说 明 书 CN 103146645 A 9 7/11 页 10 接种于培养瓶中， 置于 37、 5%CO2的培养箱内培养。 0071 步骤 S13. 以 MSCs 与软骨细胞共培养诱。
34、导 MSCs 分化为软骨细胞 ： 0072 （1） 将步骤S12获取的培养至传代的软骨细胞以1104/cm2接种于24孔细胞培养 板中， 在软骨细胞培养液中培养 2 天 ； 其中， 该软骨细胞培养液为含 10v/v%FBS 的 DMEM/F12 培养基 ； 0073 （2） 将 MSCs 以 2.5104/cm2接种于 0.4m 孔径的插入式培养皿中， 并将插入式 培养皿置于已培养软骨细胞的培养孔中 ； 0074 （3） 将培养基更换为软骨细胞诱导分化培养基， 并在 37、 5%CO2的培养箱内下进 行共同培养， 并每2天更换一次培养基 ； 其中， 软骨细胞诱导分化培养基以DMEM高糖培养液 。
35、为基础， 在该 DMEM 高糖培养液中含有如下组分 ： 0075 0076 甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 3.510-7mol/L。 0077 实施例 2 0078 诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 包括如下步骤 ： 0079 步骤 S21.MSCs 的分离并获取原代培养 MSCs ： 0080 从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织， PBS 平衡液充分洗涤残留的血液， 去除 脐静脉及动脉及脐带外膜， 剥离Wharton胶， 并将其剪碎至lmm3人小组织块， 反复用DMEM培 养基洗去血细胞， 将组织块铺在 6cm 直径的培养皿中， 组织块间隔约 1cm， 放入 37、 5%CO2 培养。
36、箱中贴壁 1h。在培养皿中加入 1ml 含 10%FBS 的 DMEM， 小心放入 37、 5%CO2的培养箱 内进行培养， 待细胞爬出组织后获得原代培养 MSCs ； 0081 步骤 S22. 软骨细胞的分离并获取原代培养软骨细胞 ： 0082 （1） 无菌条件下取非承重组织软骨细胞， 置于 PBS 中漂洗 2 次， 并用眼科剪将软骨 剪碎至 1mm3大小， 继续用 PBS 液漂洗 2 次 ； 0083 （2） 吸去漂洗液， 加入 0.25% 胰蛋白酶溶液， 并置于 37、 5 CO2的培养箱内消化 30min ； 0084 （3） 吸出胰蛋白酶溶液， 加入 0.3%II 型胶原酶溶液， 置。
37、于 37、 5 CO2的培养箱 说 明 书 CN 103146645 A 10 8/11 页 11 内继续消化 3h， 每 1h 更换一次酶溶液 ； 0085 （4） 过 120 目筛网， 去除未被消化的组织块 ； 0086 （5） 用离心管留取各次消化液离心 2000rpm*10min， 去除上清液 ； 0087 （6） 用 PBS 液洗 1 次， 以同样方式再次离心， 获取原代培养软骨细胞 ； 0088 步骤 S23. 以 MSCs 与软骨细胞共培养诱导 MSCs 分化为软骨细胞 ： 0089 （1） 将步骤 S22 获取的原代培养软骨细胞以 1104/cm2接种于 48 孔细胞培养板 中。
38、， 在软骨细胞培养液中培养 1 天 ； 其中， 该软骨细胞培养液为含 15%FBS 的 DMEM/F12 培养 基 ； 0090 （2） 将 MSCs 以 5104/cm2接种于 0.22m 孔径的插入式培养皿中， 并将插入式培 养皿置于已培养软骨细胞的培养孔中 ； 0091 （3） 将培养基更换为软骨细胞诱导分化培养基， 并在 37、 5%CO2的培养箱内下进 行共同培养， 并每2天更换一次培养基 ； 其中， 软骨细胞诱导分化培养基以DMEM高糖培养液 为基础， 在该 DMEM 高糖培养液中含有如下组分 ： 0092 0093 0094 甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 510-7mol/L。。
39、 0095 实施例 3 0096 诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法， 包括如下步骤 ： 0097 步骤 S31.MSCs 的分离并获取原代培养 MSCs ： 0098 从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织， PBS 平衡液充分洗涤残留的血液， 去除 脐静脉及动脉及脐带外膜， 剥离Wharton胶， 并将其剪碎至lmm3人小组织块， 反复用DMEM培 养基洗去血细胞， 将组织块铺在 6cm 直径的培养皿中， 组织块间隔约 1cm， 放入 37、 5%CO2 培养箱中贴壁 1h。在培养皿中加入 1ml 含 10%FBS 的 DMEM， 小心放入 37、 5%CO2的培养箱 内进行培养， 待细胞爬。
40、出组织后获得原代培养 MSCs ； 0099 步骤 S32. 软骨细胞的分离并获取原代培养软骨细胞 ： 0100 （1） 无菌条件下取非承重组织软骨细胞， 置于 PBS 中漂洗 2 次， 并用眼科剪将软骨 说 明 书 CN 103146645 A 11 9/11 页 12 剪碎至 1mm3大小， 继续用 PBS 液漂洗 2 次 ； 0101 （2） 吸去漂洗液， 加入 0.25% 胰蛋白酶溶液， 并置于 37、 5 CO2的培养箱内消化 30min ； 0102 （3） 吸出胰蛋白酶溶液， 加入 0.3%II 型胶原酶溶液， 置于 37、 5 CO2的培养箱 内继续消化 3h， 每 1h 更换。
41、一次酶溶液 ； 0103 （4） 过 120 目筛网， 去除未被消化的组织块 ； 0104 （5） 用离心管留取各次消化液离心 2000rpm*10min， 去除上清液 ； 0105 （6） 用 PBS 液洗 1 次， 以同样方式再次离心， 获取原代培养软骨细胞 ； 0106 步骤 S33. 以 MSCs 与软骨细胞共培养诱导 MSCs 分化为软骨细胞 ： 0107 （1） 将步骤 S22 获取的原代培养软骨细胞以 1104/cm2接种于 96 孔细胞培养板 中 ； 0108 （2） 将 MSCs 以 5104/cm2接种于 0.22m 孔径的插入式培养皿中， 并将插入式培 养皿置于 6 孔细。
42、胞培养板的培养孔中 ； 0109 （3） 向6孔细胞培养板的培养孔中加入软骨细胞诱导分化培养基， 并在37、 5%CO2 的培养箱内下进行共同培养， 并每 2 天更换一次培养基 ； 其中， 软骨细胞诱导分化培养基以 DMEM 高糖培养液为基础， 在该 DMEM 高糖培养液中含有如下组分 ： 0110 0111 甲状旁腺激素相关蛋白 1-34 2.510-7mol/L。 0112 对比实例 1 0113 传统方法诱导 MSCs 分化为软骨细胞 ： 0114 步骤 1 ： 取培养至传代的 MSCs， 细胞数调整为 5105/ml， 接种在 T25 培养瓶中， 用 含 10%FBS 的 DMEM 高。
43、糖培养液进行培养 ； 0115 步骤 2 ： 待细胞贴壁后， 用 DMEM 高糖培养液润洗细胞表面残留的培养基， 将配置好 的软骨细胞诱导分化培养液小心的加入培养瓶中， 每瓶5ml， 放入37、 5%CO2的培养箱内进 行培养。 0116 其中， 步骤 2 中所用到的软骨细胞诱导分化培养液的配方如下 ： 说 明 书 CN 103146645 A 12 10/11 页 13 0117 以 DMEM 高糖培养液为基础， 含有 10% 胎牛血清， 100g/ml 青霉素， l00g/ml 链霉素， 抗坏血酸 50ug/ml、 100nmol/L 地塞米松、 100g/ml 丙酮酸盐、 40g/ml 。
44、脯氨酸、 50mg/ml ITS+Premix 和 TGF-310ng/ml。 0118 对比实例 2 0119 直接取培养至传代的 MSCs 在以 DMEM 高糖培养液为基础， 含有 10v/v% 胎牛血清， 100g/ml 青霉素， l00g/ml 链霉素的条件下培养后进行下述检测分析。 0120 实施例 1 与对比实例 1、 2 的检测分析结果 ： 0121 1. 上述实施例 1 的步骤 S11 分离培养的 MSCs 的流式检测结果 ： 0122 将上述实施例 1 的步骤 S11 分离培养的 MSCs 采用流式细胞仪检测传代培养后 的 MSCs 细胞表型 ： 常规流式方法测定 MSCs 。
45、特异性表达标记， 该流式细胞检测所需试剂为 ： CollagenII（abcam ab79127） 、 CD44、 CD45、 CD29、 CD34、 CD271。检测的结果如图 2 所示， 其中， 图 2A 为传代培养 MSCs 的 CD29、 CD34、 CD44 和 CD45 表达率柱状图， 图 2B 为 MSCs 的 CD29 表达率图， 图 2C 为 MSCs 的 CD34 表达率图， 图 2D 为 MSCs 的 CD44 表达率图， 图 2E 为 MSCs 的 CD45 表达率图。由该图 2 可看出， MSCs 分离纯化后， 其特异性标记物 CD44 表达率 为 98.25%， C。
46、D29 表达率为 95.75%， 两者的表达量均明显大于 90% ； 其造血细胞标记 CD34 和 CD45 表达率分别为 2.93% 和 2.13%， 两者表达呈阴性。由此证明了实施例 1 的步骤 S11 分 离纯化的 MSCs 此为间充质干细胞。 0123 2.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原细 胞的流式检测 ： 0124 将实施例 1 与对比实例 1 中的 MSCs 诱导分化为软骨细胞中的阳性表达 II 型胶原 细胞进行流式检测。具体的是将实施例 1 与对比实例 1 中的 MSCs 分别诱导 5 天和 8 天后， 按照常规流式方法分别测定实施例 1 。
47、与对比实例 1 中阳性表达 II 型胶原的细胞所占比率， 测定结果如图 3 所示。其中， 图 3A 为实施例 1 与对比实例 1 分别诱导第 5 和第 8 天时， MSCs 诱导分化为软骨细胞中阳性表达 II 型胶原的细胞所占比率的柱状图 ； 图 3B 为实施例 1 中 的 MSCs 诱导 5 天时， 阳性表达 II 型胶原细胞表达率图 ； 图 3C 为对比实例 1 中的 MSCs 诱导 5 天时， 阳性表达 II 型胶原细胞表达率图 ； 图 3D 为实施例 1 中的 MSCs 诱导 8 天时， 阳性表 达 II 型胶原细胞表达率图 ; 图 3E 为对比实例 1 中的 MSCs 诱导 8 天时。
48、， 阳性表达 II 型胶 原细胞表达率图。由该图 3 可知， 采用上述实施例 1 诱导的软骨细胞中， 阳性表达 II 型胶 原细胞的表达率与表达量高于传统方法中的阳性表达 II 型胶原细胞。具体地， 上述实施例 方法诱导第 5 天时， II 型胶原阳性表达率为 58.13%， 而对比实例 1 中的 II 型胶原阳性表达 率为 43.27% ； 诱导第 8 天时， II 型胶原阳性表达率为 92.23%， 而对比实例 1 中的 II 型胶原 阳性表达率为 72.57%。 0125 3.实施例1与对比实例1中的MSCs诱导分化为软骨细胞中阳性表达II型胶原细 胞以及对比实例 2 中的阳性表达 II 型胶原细胞进行免疫荧光染色测定 ： 0126 测定方法为 ： 将实施例 1、 对比实例 1 中的 MSCs 分别诱导 5 天和 8 天后， 对比实例 2 中的 MSCs 不诱导， 按照现有免疫荧光染色测定方法分别对实施例 1、 对比实例 1 和对比实 例 2 中的阳性表达 II 型胶原的细胞的荧光表达测定， 测定结果如图 4 所示。其中， 图 4A 为 对比实例 2 第 5 天和第 8 天时的阳性表达 II 型胶原细胞的免疫荧光染色测定图， 图 4B 为。