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1、(10)申请公布号 CN 103173483 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173483 A *CN103173483A* (21)申请号 201210578742.3 (22)申请日 2012.12.28 C12N 15/81(2006.01) C12N 15/64(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/72(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 诸葛斌 张成 方慧英 诸葛健 宗红 (54) 发明名称 以产甘油假丝酵母特征 5.8S 序列为整合位 点的 p。
2、URGAP 载体构建及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种能用同源重组来克隆 的产甘油假丝酵母整合载体 pURGAP 的构建及 其 应 用。 所 构 建 的 pURGAP 载 体 包 含 有 酵 母 Candida glycerinogenes 的通过构建带有 5.8S rDNA 序 列 SEQ NO.2， 可 整 合 于 酵 母 Candida glycerinogenes特征5.8S序列SEQ NO.1位点， 所 构建的 pURGAP 载体还包含有渗透压启动子 PCgGAP、 zeocin 抗性标记和在大肠杆菌高拷贝的所有元 件。与其它整合载体相比， pURGAP 以特征 5.8S r。
3、DNA 序列为整合位点可显著提高整合载体转化 效率， 并明显增强外源蛋白表达强度。所构建的 pURGAP 可有效地将外源基因或启动子在产甘油 假丝酵母中进行整合表达， 是提高表达载体的整 合效率， 加速工业菌株产甘油假丝酵母重组改造 速度的一种重要方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103173483 A CN 103173483 A *CN103173483A* 1/1 页 2 1. 一种重组表达。
4、载体 pURGAP 的构建， 其特征在于一种能利用同源重组表达外源基因 的产甘油假丝酵母整合载体如附图 1 所示。 2.如权利要求1所述的产甘油假丝酵母整合载体以特征5.8S rDNA序列SEQ NO1为整 合位点。引物 rdna1、 rdna2 扩增 5.8S 序列 ： rdna1 ： ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC rdna2 ： ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG。 以特征 5.8S rDNA 序列 SEQ NO2 作为同源整合臂， 可提高整合载体的转化效率和表达 强度。 3. 如权利要求 1 所述所构建的 pURGAP 载体， 其特征在于包含有渗透压。
5、启动子 PCgGAP、 zeocin 抗性标记和在大肠杆菌高拷贝的所有元件。 4. 权利要求 1 所述的整合载体特征是包含渗透调控的重组整合表达载体、 克隆载体及 穿梭载体。 5. 权利要求 1 所述载体应用于渗透压调控外源基因表达、 功能基因的稳定表达或过表 达功能基因的筛选及鉴定。应用于产甘油假丝酵母高代谢工程改造。 权 利 要 求 书 CN 103173483 A 2 1/3 页 3 以产甘油假丝酵母特征 5.8S 序列为整合位点的 pURGAP 载 体构建及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种含有表达系统的整合载体以及由该整合表达载体转化工业酵母 细胞 - 产甘油假丝酵母 ； 涉。
6、及蛋白质表达基因工程领域， 尤其是利用产甘油假丝酵母作为 细胞工厂表达外源基因的研究领域， 属于微生物学， 基因工程和分子生物学领域。 背景技术 0002 产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具 有优良发酵性能的工业菌株， 曾获得国家发明二等奖， 能在55葡萄糖或15NaCl的高渗 透压培养基上正常生长繁殖， 具有耐高渗， 目标产物高产量、 高转化率、 生产强度大的特点。 C.glycerinogenes具有两个显著特性， 即耐高渗透压(超高浓醪发酵， 节省提取能耗)和葡 萄糖代谢途径完备， 是一个可基因改造、 具有的很好应用前景的潜在节。
7、能型模式菌株， 对其 进行遗传改良和途径工程改造就必须建立高效的遗传转化体系。 0003 虽然常用的实验室酵母， 如酿酒酵母 S.cerevisiae 的转化方法已经十分成熟， 但 这些方法用于工业酵母菌株的基因改造不理想， 严重阻碍采用基因工程手段对产甘油假丝 酵母代谢途径进行有目的的改造从而改进产甘油假丝酵母的性能， 其主要原因是该工业酵 母菌株的遗传背景复杂多样。因此， 这就需要根据工业酵母菌株自身的特点， 如细胞壁结 构、 生理生化特性、 遗传背景等， 建立起相应的转化体系。 0004 实现建立起相应的转化体系这一目标首先要获得有效的载体， 而构建酵母整合型 载体的一项重要工作是获得整。
8、合位点。为建立有效的产甘油假丝酵母转化系统， 本发明选 择产甘油假丝酵母 5.8S rDNA 特征序列作为同源重组整合位点， 构建适合于产甘油假丝酵 母转化的整合载体， 建立了一套高效、 简单的产甘油假丝酵母转化系统。 发明内容 0005 针对目前未见产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列在产甘油假丝酵母表达载体中应用 的现状。本发明利用产甘油假丝酵母的特征 5.8S rDNA 序列 SEQ NO1 构建产甘油假丝酵母 整合表达载体如附图 1 所示， 获得了一种能够显著提高载体转化效率的载体。 0006 本发明提供了以 C.glycerinogenes 5.8S rDNA 序列 SEQ NO1 。
9、为整合位点的重组 表达载体的构建， 构建整合表达载体的具体步骤 ： 0007 1. 产甘油假丝酵母部分核糖体 DNA(ribosome DNA， rDNA) 序列的克隆 ： 引物 rdna1、 rdna2 扩增产甘油假丝酵母特征 5.8S rDNA， 特征 5.8S rDNA 的序列见 SEQ NO1。 0008 rdna1 ： ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC 0009 rdna2 ： ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ； 序列见 SEQ NO1。 0010 2. 整合载体的构建 (pUC18 作为基本骨架 ) 如附图 2 ； 0011 (1) 将 PCR。
10、 获得的特征 5.8S rDNA 经 Sac I 和 Hind III 连到 pUC18 上， 得到克隆 载体 pUC-5.8S rDNA ； 说 明 书 CN 103173483 A 3 2/3 页 4 0012 (2) 将 PCR 获得的启动子 PCgGAP利用限制性内切酶 Sac II 和 Nco I 酶切后连接 pUC-5.8SrDNA， 得到载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP； 0013 (3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接 于载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP， 即得到载体 pURGAP ； 0014 3.。
11、 以线性化的同源整合载体转化产甘油假丝酵母， 以 zeocin 抗性平板筛选阳性 克隆子， 并用 PCR 检测转化阳性克隆子。 0015 4. 整合效果分析。对确认的阳性转化子菌落进行计数， 计算整合效率。与其它同 源整合载体相比， 以 SEQ NO2 所示的特征 5.8S rDNA 序列构建的整合载体 pURGAP 整合效率 提高至其他方法的 300。 0016 5. 本发明将构建的整合载体应用于外源基因在产甘油假丝酵母中的表达， 表达载 体 pURGAP 可效率高表达外源基因， 能够加快高表达重组菌株的获得。 0017 通过实施本发明具体的技术方案， 实现以下有益效果 ： 通过构建含有特征。
12、 5.8S rDNA 序列 SEQ NO2 的整合载体 pURGAP， 提高表达载体的整合效率， 与其它同源整合载体相 比以 SEQ NO2 所示的特征 5.8S rDNA 序列构建的整合载体 pURGAP 整合效率提高至其他方 法的 300， 并实现了外源基因在 C.glycerolgenesis 成功表达， 为进一步改造重要的工业 菌株 Candida glycerolgenesis 提供了一种有效的方法。 具体实施方案 0018 以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明， 但本发明 并不限于下述的实施例。 0019 本发明所使用的菌种 ： 产甘油假丝酵母 Candid。
13、a glycerolgenesis CCTCC M 93018、 E.coliDH5a。 0020 实施例 1 ： PCR 扩增产甘油假丝酵母 5.8S rDNA 序列 0021 以引物 rdna1、 rdna2 扩增产甘油假丝酵母 5.8S 序列 ： 0022 rdna1 ： ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC 0023 rdna2 ： ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ； 序列见 SEQ NO1。 0024 实施例 2 ： 重组整合表达载体 pURGAP 的构建 0025 构建的重组表达载体 (pUC18 作为基本骨架 ) 参见附图 2 ： 0026 (1。
14、) 将 PCR 获得的特征 5.8S rDNA 经 Sac I 和 Hind III 连到 pUC18 上， 得到克隆 载体 pUC-5.8S rDNA ； 0027 (2) 将 PCR 获得的启动子 PCgGAP利用限制性内切酶 Sac II 和 Nco I 酶切后连接 pUC-5.8SrDNA， 得到载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP； 0028 (3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接 于载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP， 即得到载体 pURGAP ； 0029 实施例 3 ： 重组表达载体的转化和筛选 0030 。
15、通过构建的重组表达载体 pURGAP 重组质粒用热击方法转化 E.coli DH5a 扩增质 粒。提取质粒， 以 HindIII 线性化。采用原生质体转化法转化 C.glycerinogenes， 以 0.7M 的 NaCl 作为渗透压稳定剂， 涂布含有 zeocin 的 YEPD 抗性再生平板 (1M 山梨醇为再生稳 定剂 )。对转化的阳性转化子菌落计数， 取三次重复的平均值， pURGAP 的转化效率可达到 说 明 书 CN 103173483 A 4 3/3 页 5 3102cell/ng质粒， 而同样条件下其它以非SEQ NO2所示的特征5.8S rDNA序列构建的整 合载体转化效率只。
16、能达到 1102cell/ng 质粒， 与其它同源整合载体相比以 SEQ NO3 所示 的特征 5.8S rDNA 序列构建的整合载体整合效率提高至其他方法的 300。 0031 实施例 4 ： 诱导外源荧光蛋白在产甘油假丝酵母中表达 0032 利用荧光基因 gfp 构建荧光蛋白表达载体 pURGAP-gfp， 构建过程参见附图 3。所 构建载体pURGAP-gfp转入宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018， 从含150ug/mL zeocin 的 YEPD 从平板上挑取阳性克隆， 利用 PCR 确定阳性转化子， 阳性转化子接种于 10mL 含有 150。
17、ug/mL zeocin 的 YEPD 液体培养基中。30培养 20h， 离心收集菌体， 转接入 10mL 含 25葡萄糖的 YEPD 液体培养基中。30培养 24h， 摇床转数 200r/min。离心后获得菌 体。 0033 利用 Olympus 荧光显微镜对所获得的菌体进行荧光分析。可以看到绿色荧光蛋白 在宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018的高表达， 与其它同源整合载体相比， 以 SEQ NO2 所示的特征 5.8S rDNA 序列构建的整合载体荧光蛋白表达强度增强明显 ( 图 4)。 说 明 书 CN 103173483 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 103173483 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173483 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103173483 A 8 。