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1、(10)申请公布号 CN 103146675 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146675 A *CN103146675A* (21)申请号 201310070064.4 (22)申请日 2013.03.06 C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253 号 (72)发明人 余旭亚 邓涛 游金坤 (54) 发明名称 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种以赤石脂为载体的固定化 脂。
2、肪酶的制备方法， 首先对赤石脂分别进行羟基 化和硅烷化处理， 然后将处理好的赤石脂载体加 入到肪酶溶液中， 经摇床振荡吸附固定后， 用海藻 酸盐凝胶对吸附了脂肪酶的赤石脂进行包埋， 最 后冷冻干燥得到赤石脂固定化脂肪酶。本方法采 用的赤石脂具有原料易得， 价格低廉的特点， 同时 也具有很好的物理吸附性和表面化学活性， 经过 改性以及包埋处理后， 能显著提升载体的稳定性， 制得的固定化酶酶活力回收率高， 稳定性好， 而且 本发明的工艺简单， 操作成本低， 有望推动酶法制 备生物柴油的工业化进程。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家。
3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103146675 A CN 103146675 A *CN103146675A* 1/1 页 2 1. 一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 按每克赤石脂加入 6-8ml 盐酸的比例， 将赤石脂浸渍于 盐酸溶液中， 并于 35-40振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 烘干 ； （2）赤石脂载体的硅烷化处理 ： 按每克羟基化处理的赤石脂添加 2-4ml 石油醚和 0.02-0.04 mL 硅烷化试剂的比例， 在羟基化处。
4、理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化试剂， 充 分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 3-5h， 待反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水 乙醇洗涤 3-5 次， 烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 按给酶量为 40-90mg/g 的比例向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石 脂， 密封， 在 20-40下振荡固定 1-5h 后， 抽滤， 滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 按每克赤石脂固定化酶添加 10-20ml 海藻酸盐溶液的比 例， 在赤石脂固定化酶中加入质量百分比浓度为 1-3% 的海藻酸盐溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将。
5、溶液逐滴打入到质量百分比浓度为 1-2% 的氯化钙溶液中， 并在 4下 固化 1-3h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到固定化脂肪酶。 2. 根据权利要求 1 所述以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 其特征在于 ： 盐 酸浓度为 1-3mol/L。 3. 根据权利要求 1 所述以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 其特征在于 ： 硅烷化试剂为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、 3- 氨丙基三乙氧基硅烷、 N-(- 氨乙 基 )- 氨丙基三乙氧基硅烷中的一种。 4. 根据权利要求 1 所述以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 其特征在于 ： 脂肪酶溶液为脂肪酶和 pH 值。
6、为 3-8 的缓冲液混合制得的溶液， 其中缓冲液是浓度为 0.02-0.05mol/L 的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。 5. 根据权利要求 1 所述以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 其特征在于 ： 海 藻酸盐溶液为海藻酸钠或者海藻酸钙溶液。 权 利 要 求 书 CN 103146675 A 2 1/6 页 3 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及固定化脂肪酶技术领域， 特别涉及以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的 制备方法。 背景技术 0002 脂肪酶 （lipase， EC3.1.1.3） 是一类特殊的酰基水解酶， 能够在油 - 水界面上催 化酯水解、。
7、 酯合成、 酯交换等化学反应及高聚物合成和立体异构拆分等有机合成反应， 并且 在强烈脱水和有机体系中能保持高活性、 高稳定性和高区域、 立体选择性， 因此被广泛应用 于油脂水解、 油脂改性、 皮革加工、 造纸工业、 洗涤剂工业、 制药工业、 食品加工、 生物能源 等方面有着很大的应用潜力， 是目前被广泛研究的一种酶催化剂。然而， 在实际使用过程 中， 游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、 催化反应不稳定、 与产物分离困难或分离 成本高等缺点。另外， 脂肪酶酶制剂一般是通过微生物发酵产生， 或者是从动物、 植物体内 提取的， 分离纯化成本高， 导致酶的生产价格较高， 加上游离酶很难重复利用，。
8、 导致酶制剂 的使用成本提高， 从而限制了游离酶在工业生产中大规模的应用。 0003 固定化酶指经物理或化学方法处理后， 使酶变成不易随水流失即运动受限制， 而 又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比， 固定化酶的优点有 ： 可多次使用， 且酶的稳定 性提高 ； 反应完成后， 固定化酶易与底物和产物分离， 而且酶活力降低较少， 这样就降低了 生产成本 ； 反应条件易于控制， 有利于自动化生产。固定化酶通常所用的载体有活性炭、 硅 藻土、 高岭土、 大孔树脂、 层状硅酸盐、 改性硅胶、 氧化铝、 壳聚糖、 纤维素、 聚乙烯醇、 聚乙烯 丙烯胶、 卡拉胶、 海藻酸纳、 磁性淀粉微球、 分子筛以及复。
9、合二氧化硅等。 0004 酶的固定化方法常用的是 ： 吸附法、 共价结合法、 交联法和包埋法。 在此基础上还 出现了上述方法的结合法等。吸附法制备的固定化酶， 酶的活性中心不易被破坏而且酶高 级结构变化较少， 能较好的保持酶的催化活力， 但酶与载体之间的结合力较弱， 酶容易从载 体上脱落下来， 而包埋法采用的凝胶聚合物的网格可以阻止酶的泄漏， 同时能让基质渗入 和产物扩散出来， 通过吸附 - 包埋法制备固定化酶不仅可以有效保持酶活力， 还能提升酶 的稳定性。 0005 酶固定化研究中， 良好的载体是固定化酶成功的关键。 所以在酶固定化领域， 作为 固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。 。
10、0006 赤石脂为硅酸盐类矿物多水高岭石族多水高岭石， 主要成分为水化硅酸铝， 尚 含相当多的氧化铁等物质， 其组成如下 ： 硅 42.93%、 铝 36.58%、 氧化铁及锰 4.85%、 镁及钙 0.94%、 水分 14.75%。赤石脂与高岭土极其相似， 具有很强吸附能力。 0007 由于目前赤石脂作为一种传统中药材， 主要在中医中使用， 而利用其作为固定化 载体国内外还没人研究， 所以利用赤石脂作为固定化载体固定脂肪酶具有较大的理论和实 践意义 ； 而本方法研究的目的是开发赤石脂的应用领域， 并可以增强赤石脂在工业、 医学、 环境保护等领域的应用。 说 明 书 CN 103146675 。
11、A 3 2/6 页 4 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 该方法工 艺简单， 操作成本低、 稳定性好， 具有较高催化活力以及酶活回收率。 0009 为了解决上述技术问题， 本发明通过下述技术方案得以解决 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 按每克赤石脂加入 6-8ml 盐酸的比例， 将赤石脂浸渍于 盐酸溶液中， 并于 35-40振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 烘干 ； （2）赤石脂载体的硅烷化处理 ： 按每克羟基化处理的赤石脂添加 2-4ml 石油醚和 0.02-0.04 mL 硅烷化试剂的比例， 在羟基化处理的赤石脂中加入石油。
12、醚和硅烷化试剂， 充 分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 3-5 h， 待反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水 乙醇洗涤 3-5 次， 烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 按给酶量为 40-90mg/g 的比例 （即每克赤石脂给酶量为 40-90mg） 向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂， 密封， 在 20-40下振荡固定 1-5h 后， 抽滤， 滤渣用缓 冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 按每克赤石脂固定化酶加入 10-20ml 海藻酸盐溶液的比 例， 向其中加入质量百分比浓度为 1-3% 的海藻酸盐溶液， 充分搅拌均匀。用 5 号针。
13、头的注 射器将溶液逐滴打入到质量百分比浓度为1-2%的氯化钙溶液中， 并在4下固化1-3h， 抽 滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到固定化脂肪酶。 0010 本发明步骤 （1） 中盐酸浓度为 1-3mol/L。 0011 本发明步骤 （2） 中硅烷化试剂为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、 3- 氨丙基三 乙氧基硅烷、 N-(- 氨乙基 )- 氨丙基三乙氧基硅烷中的一种。 0012 本发明步骤 （3） 中脂肪酶溶液为脂肪酶和 pH 值为 3-8 的缓冲液混合制得的溶液， 其中缓冲液是浓度为 0.02-0.05mol/L 的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。缓冲液按常 规方法配制， 磷酸盐缓冲。
14、溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液配制而成， 醋酸盐缓冲 溶液由醋酸溶液和醋酸钠溶液配制而成。 0013 本发明步骤 （4） 中所述海藻酸盐溶液为海藻酸钠或者海藻酸钙溶液。 0014 本发明中固定化脂肪酶的评价方法如下 ： 1、 脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化法。向锥形瓶中加入 4ml 橄榄油乳化液和 5ml 磷 酸缓冲液， 40水浴中预热 5min， 并设立空白组。加入固定化脂肪酶， 混匀， 40水浴震荡 15min。反应结束后， 各锥形瓶中加入 15ml 的 95乙醇终止反应。待测样品加入酚酞指示 剂后， 用 0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液准确滴定至粉红色。由滴定消耗氢氧化钠的量计算。
15、 出游离酶及固定化酶的酶活。 0015 以在 pH 为 7 的缓冲液、 温度为 40的条件下， 1min 水解产生 1mol 脂肪酸所需 的酶量定义为一个活力单位 (U)， 酶活力的计算公式如下 ： 式中 ： c- 标准 NaOH 溶液浓度 (mol/L) ； V- 样品和空白样样品消耗标准 NaOH 溶液的体积差 (mL) ； t- 反应时间 (h) ； m- 酶的用量 (g)。 说 明 书 CN 103146675 A 4 3/6 页 5 0016 2、 固定化酶酶活回收率计算公式如下 ： 本发明具有的优点和技术效果 ： （1） 脂肪酶催化活力高 赤石脂具有发达的孔状结构和较大的比表面积，。
16、 能使脂肪酶分子很好的吸附在载体 上， 赤石脂经过改性剂修饰后形成的疏水性表面有利于脂肪酶蛋白活性中心构想的正确折 叠， 而且改性赤石脂表面丰富的活性基团通过疏水作用力、 氢键以及范德华力等作用力与 酶蛋白分子充分固定， 显著增强酶活性中心的刚性， 减少了反应过程中酶蛋白构象的变化， 疏水性载体表面也有利于疏水性酯类底物与酶活性中心的充分接触和富集， 减少了反应过 程中的传质阻力， 从而使酶催化活力得到显著增强 ； （2） 脂肪酶稳定性好 通过海藻酸钠包裹吸附了脂肪酶的赤石脂， 能有效改善吸附过程中酶与载体结合力较 弱， 酶容易脱落的情况， 而且形成的凝胶聚合物网格具有较好的机械强度， 可防止。
17、酶体的机 械损伤， 有效的提升了固定化酶的稳定性 ； （3） 本发明采用的固定化酶制备方法， 制备方法简单、 条件温和， 不需要特殊的设备， 后 处理工艺简单， 适合于工业上大规模生产。 附图说明 0017 图 1 为本发明中赤石脂固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性比较图 ； 图 2 为本发明中赤石脂固定化脂肪酶的操作稳定性结果示意图。 具体实施方式 0018 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明， 但本发明保护范围并不局 限于此。 0019 实施例 1 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取10g赤石脂， 将其浸渍于70m。
18、l 1mol/L的盐酸溶液中， 并于 35振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 取 10g 羟基化处理的赤石脂， 向其中加入 20ml 石油醚 和 0.2ml 甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 4h， 反 应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤 3 次， 110烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 800mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 5、 离子浓度为 0.02mol/L 的 醋酸盐缓冲液中， 然后向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂 10g， 密封， 在 30下振荡固定 2h 。
19、后， 抽滤， 滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 10g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 150ml 质量百分比浓 度为 1% 的海藻酸钠溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分 比浓度为 1% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 2h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到 固定化脂肪酶。 0020 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 2808U/g， 制得的固定化酶的酶活回收率为 78%。 说 明 书 CN 103146675 A 5 4/6 页 6 0021 本实施例制得的固定化脂肪酶与游离脂肪。
20、酶的热稳定性比较实验如下 ： 分别取 1g 的游离脂肪酶和固定化脂肪酶， 分别放在 10， 20， 30， 40， 50， 60 保存 1h， 测定酶活的变化 ； 结果如图 1 所示， 固定化酶和游离酶对不同温度具有不同的耐受 性， 经过改性赤石脂吸附 - 海藻酸钠包埋固定化后， 固定化脂肪酶显示出比游离脂肪酶更 好的热稳定性， 脂肪酶的活性中心被更好的保护， 不容易被破坏， 提高了酶的热稳定性。 0022 本实施例制得的固定化脂肪酶的使用稳定性实验如下 ： 将赤石脂固定化脂肪酶重复用于橄榄油乳化液的水解反应， 观察其相对酶活力随重复 使用次数的变化 ； 结果如图2所示， 赤石脂固定化脂肪酶的。
21、操作稳定性良好， 经10个批次的 重复使用， 其相对酶活仍可达初始值的 60以上。 0023 实施例 2 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取10g赤石脂， 将其浸渍于80ml 1mol/L的盐酸溶液中， 并于 35振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 取 10g 羟基化处理的赤石脂， 向其中加入 20ml 石油醚 和 0.4ml 3- 氨丙基三乙氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 4h， 反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤 4 次， 110烘。
22、干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 300mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 3、 离子浓度为 0.03mol/L 的 醋酸盐缓冲液中， 然后向酶液中加入硅烷化赤石脂 5g， 密封， 在 30下振荡固定 3h 后， 抽 滤， 滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 5g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 75ml 质量百分比浓度 为 1% 的海藻酸钙溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比 浓度为 1% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 3h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到固 定。
23、化脂肪酶。 0024 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 1809U/g， 制得的固定化酶的酶活回收率为 67%。 0025 实施例 3 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取10g赤石脂， 将其浸渍于70ml 3mol/L的盐酸溶液中， 并于 40振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 取 10g 羟基化处理的赤石脂， 向其中加入 40ml 石油醚 和 0.2ml 甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 4h， 反 应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚。
24、和无水乙醇洗涤 3 次， 110烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 800mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 7、 离子浓度为 0.04mol/L 的 磷酸盐缓冲液中， 然后向酶液中加入硅烷化赤石脂 10g， 密封， 在 40下振荡固定 1h 后， 抽 滤， 滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 10g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 100ml 质量百分比浓 度为 1% 的海藻酸钠溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分 比浓度为 2% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 1h， 抽滤， 充。
25、分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到 固定化脂肪酶。 0026 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 2232U/g， 制得的固定化酶的酶活力回收率为 62%。 0027 实施例 4 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： 说 明 书 CN 103146675 A 6 5/6 页 7 （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取10g赤石脂， 将其浸渍于60ml 2mol/L的盐酸溶液中， 并于 35振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 取 10g 羟基化处理的赤石脂， 向其中加入 30ml 石油醚 和 0.3ml N-(- 氨乙基 。
26、)- 氨丙基三乙氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反 应 4h， 反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤 5 次， 110烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 450mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 8、 离子浓度为 0.05mol/L 的 磷酸盐缓冲液中， 然后向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂 5g， 密封， 在 20下振荡固定 5h 后， 抽滤， 滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 5g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 100ml 质量百分比浓 度为 3% 的海藻酸钙溶液， 充分搅拌均匀， 用。
27、 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分 比浓度为 2% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 2h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到 固定化脂肪酶。 0028 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 2835U/g， 制得的固定化酶的酶活力回收率为 70%。 0029 实施例 5 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取10g赤石脂， 将其浸渍于80ml 1mol/L的盐酸溶液中， 并于 40振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 取10g羟基化处理的赤石脂， 向其中加入25m。
28、l石油醚和 0.35ml 3- 氨丙基三乙氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 5h， 反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤 3 次， 110烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 900mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 5、 离子浓度为 0.04mol/L 的 醋酸盐缓冲液中， 然后向酶液中加入硅烷化赤石脂 15g， 密封， 在 40下振荡固定 2h 后， 抽 滤， 滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 15g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 300ml 质量百分比浓 度 1.5% 的海藻酸。
29、钠溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分 比浓度为 1.5% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 3h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得 到固定化脂肪酶。 0030 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 2025U/g， 制得的固定化酶的酶活力回收率为 75%。 0031 实施例 6 ： 以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法， 方法如下 ： （1） 赤石脂载体的羟基化处理 ： 取 10g 赤石脂， 将其浸渍于 65ml 2.5mol/L 的盐酸溶液 中， 并于 38振荡反应过夜， 然后用去离子水洗涤至中性， 110烘干 ； （2） 赤石脂载体的硅烷化处理 ： 。
30、取 10g 羟基化处理的赤石脂， 向其中加入 35ml 石油醚 和 0.25ml 甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷， 充分混匀后， 常温下放置于摇床中反应 3h， 反应结束后， 过滤， 滤渣分别用石油醚和无水乙醇洗涤 3 次， 110烘干 ； （3） 脂肪酶的固定化 ： 将 400mg 脂肪酶溶于 200ml pH 值为 6、 离子浓度为 0.03mol/L 的 磷酸盐缓冲液中， 然后向酶液中加入硅烷化赤石脂 10g， 密封， 在 35下振荡固定 4h 后， 抽 滤， 滤渣用磷酸缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来， 冷冻干燥后备用 ； （4） 赤石脂固定化酶的包埋 ： 取 10g 赤石脂固定化酶， 向其中加入 180ml 质量百分比浓 说 明 书 CN 103146675 A 7 6/6 页 8 度 2% 的海藻酸钠溶液， 充分搅拌均匀， 用 5 号针头的注射器将溶液逐滴打入到质量百分比 浓度为 2% 的氯化钙溶液中， 并在 4下固化 2.5h， 抽滤， 充分洗涤， 然后冷冻干燥， 即得到 固定化脂肪酶。 0032 采用橄榄油乳化法测定酶活力为 1296U/g， 制得的固定化酶的酶活力回收率为 72%。 说 明 书 CN 103146675 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146675 A 9 。