H7N9亚型流感病毒RRTPCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310122445.2	申请日：	2013.04.10
公开号：	CN103160617A	公开日：	2013.06.19
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	发明专利申请公开后的驳回IPC(主分类):C12Q1/70申请公开日:20130619\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/70申请日:20130410\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/70; C12Q1/68; C12N15/11; C12N15/44; G01N21/64	主分类号：	C12Q1/70
申请人：	中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
发明人：	舒跃龙; 赵翔; 王大燕; 高荣保; 李晓丹
地址：	102206 北京市昌平区昌百路155号
优先权：
专利代理机构：	北京凯特来知识产权代理有限公司 11260	代理人：	郑立明;赵镇勇
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内容摘要

本发明公开了一种流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)检测引物和探针及检测流感病毒的方法及H7N9亚型流感病毒标准品，包括H7N9亚型流感病毒特异性引物和探针3种共9条寡核苷酸引物和探针序列，同时包括待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型流感病毒。操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。

权利要求书

权利要求书一种H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
根据权利要求1所述的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括长度为18～31bp的寡核苷酸片段。
根据权利要求2所述的流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针，其特征在于：
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列：
第一套：
引物序列：5’AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’；
探针序列：5’FAM‑AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG‑BHQ1‑3’；
第二套：
引物序列：5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’；
探针序列：5’FAM‑ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA‑BHQ1‑3’；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
引物序列：5’TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’；
探针序列：5’FAM‑AGACAATCCCCGACCGAATGACCC‑BHQ1‑3’。
根据权利要求3所述的流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针，其特征在于，所述探针序列两端的标记FAM、BHQ1为荧光素标记。
一种应用权利要求1至4中任一项所述的流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT‑PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT‑PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
根据权利要求5所述的检测流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：
禽H7N9亚型流感病毒、内部基因变异的禽H7N9亚型流感病毒、人感染H7N9亚型流感病毒、人感染内部基因变异的H7N9亚型流感病毒。
一种H7N9亚型流感病毒标准品，其特征在于，含有H7和N9亚型的全长基因，用于权利要求5或6所述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。
根据权利要求7所述的H7N9亚型流感病毒标准品，其特征在于，进一步用于H7和N9的RNA体外转录和蛋白质体外合成。

说明书

说明书H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品
技术领域
本发明涉及一种rRT‑PCR检测技术及其标准品的制备，尤其涉及一种H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。
背景技术
流感病毒基因组由8条（甲、乙型）或者7条（丙型）负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同分为甲型、乙型、丙型。其中A型流感病毒根据血凝素（HA）基因分为HA1‑16亚型，根据神经氨酸酶基因（NA）分为NA1‑9亚型。H7N9亚型流感病毒是A型流感病毒的一种，禽类是其天然宿主，亚洲、北美洲等地区多个国家的禽类养殖场中检测到过H7N9禽流感病毒。
动物实验表明，H7N9亚型流感病毒能够感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的风险，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测H7N9亚型流感病毒及其重配变异株。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
本发明的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT‑PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT‑PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
本发明的流感病毒标准品，含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述检测流感病毒的方法的阳性对照品。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品，由于包括针对H7N9亚型流感病毒HA基因和NA基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT‑PCR法检测H7N9亚型流感病毒及其变异株，操作简单、应用方便。
具体实施方式
本发明的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR(real‑time RT‑PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针：
H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针、H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针；
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒HA基因相对保守区；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针针对H7N9亚型流感病毒NA基因相对保守区。
所述引物和探针包括长度为18～31bp的寡核苷酸片段。
所述H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针包括以下两套引物/探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列：
第一套：
引物序列：5’AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’；
探针序列：5’FAM‑AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG‑BHQ1‑3’；
第二套：
引物序列：5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’；
探针序列：5’FAM‑ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA‑BHQ1‑3’；
所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
引物序列：5’TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’；
探针序列：5’FAM‑AGACAATCCCCGACCGAATGACCC‑BHQ1‑3’。
所述探针序列两端的标记FAM、BHQ1为荧光素标记。
本发明的应用上述的H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；
然后，利用一步法或两步法rRT‑PCR试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据Ct值判断rRT‑PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：
禽H7N9亚型流感病毒、内部基因变异的禽H7N9亚型流感病毒、人感染H7N9亚型流感病毒、人感染内部基因变异的H7N9亚型流感病毒。
本发明的流感病毒标准品，其较佳的具体实施方式是：
含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。
进一步用于H7和N9的RNA体外转录和蛋白质体外合成。
本发明中的引物和探针序列（5’→3’）及其检测的靶片段如下：

具体实施例：
包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明流感病毒rRT‑PCR检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明：
实施例一：H7N9亚型流感病毒rRT‑PCR寡核苷酸引物的设计与合成：
从GenBank流感数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html）中下载H7亚型流感病毒的所有HA序列、N9亚型流感病毒的所有NA序列，使用MEGA5.1进行比对，选择相对保守区设计引物和探针；引物和探针设计中同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①引物和探针长度在18～31bp之间；②Tm值在42～59℃之间；③GC%在25～75%之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90%；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4。最佳Tm值设定在59℃，最佳引物和探针长度为18‑25bp。
实施例二：本发明检测未知病毒的应用举例：
1.病毒RNA的提取：
取病毒采样液200μL，加入500μL裂解液，按RNeasy Mini Kit（Qiagen公司，catalog#74104）说明书提取病毒RNA50μL。
2.rRT‑PCR反应
1)体系配置：使用Ag Path‑IDTM One‑step RT‑PCR kit（#4387424）反应液

2)rRT‑PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT‑PCR，反应程序如下

3.结果判断：
阴阳对照结果成立的情况下判断结果，要求阴性对照没有Ct值或者为0，阳性参照有Ct值20～30之间。一般情况下Ct小于38的可以判断为阳性。
本发明提供了3套用于甄别H7N9亚型流感病毒的特异性寡核苷酸引物及探针序列。本发明并提供了rRT‑PCR的检测体系及其在H7N9亚型流感病毒快速检测中的应用。
检测评价：
特异性评价：选取国内近三年流行季节性流感病毒H1N1亚型,H3N2亚型，乙型流感，腺病毒，副流感病毒，以及HA1‑16亚型,NA1‑9亚型禽流感病毒RNA进行检测，结果表明对H7N9亚型基因检测为阳性，对其他病毒/基因检测均为阴性。
本发明可以将rRT‑PCR技术应用于H7N9亚型流感病毒的甄别。为H7N9亚型流感病毒的实验室诊断提供了快速有效的检测技术，为H7N9亚型流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 103160617 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103160617 A *CN103160617A* (21)申请号 201310122445.2 (22)申请日 2013.04.10 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/44(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所地址 102206 北京市昌平区昌百路 155 号 (72)发明人舒跃龙赵翔王大燕高荣保李晓丹 (74。

2、)专利代理机构北京凯特来知识产权代理有限公司 11260 代理人郑立明赵镇勇 (54) 发明名称 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品 (57) 摘要本发明公开了一种流感病毒 rRT-PCR(real-time RT-PCR) 检测引物和探针及检测流感病毒的方法及 H7N9 亚型流感病毒标准品，包括 H7N9 亚型流感病毒特异性引物和探针 3 种共 9 条寡核苷酸引物和探针序列，同时包括待检样本的处理、 rRT-PCR 反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型。

3、流感病毒。操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页 (10)申请公布号 CN 103160617 A CN 103160617 A *CN103160617A* 1/1 页 2 1. 一种 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针，其特征在于，包括以下一种或多种引物和探针： H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针、 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异。

4、性引物和探针；所述 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因相对保守区；所述 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因相对保守区。 2. 根据权利要求 1 所述的 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括长度为 18 31bp 的寡核苷酸片段。 3. 根据权利要求 2 所述的流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针，其特征在于：所述 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针包括以下两套引物 / 探针组合，共计四条。

5、引物序列和二条探针序列：第一套：引物序列： 5 AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3 、 5 GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3 ；探针序列： 5 FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3 ；第二套：引物序列： 5 TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3 、 5 TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3 ；探针序列： 5 FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3 ；所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针。

6、序列：引物序列： 5 TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3 、 5 ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3 ；探针序列： 5 FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3 。 4.根据权利要求3所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，其特征在于，所述探针序列两端的标记 FAM、 BHQ1 为荧光素标记。 5.一种应用权利要求1至4中任一项所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤：首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒 RNA ；然后，利用一步法或两步法。

7、 rRT-PCR 试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增；之后，根据 Ct 值判断 rRT-PCR 检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。 6. 根据权利要求 5 所述的检测流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：禽 H7N9 亚型流感病毒、内部基因变异的禽 H7N9 亚型流感病毒、人感染 H7N9 亚型流感病毒、人感染内部基因变异的 H7N9 亚型流感病毒。 7.一种H7N9亚型流感病毒标准品，其特征在于，含有H7和N9亚型的全长基因，用于权利要求 5 或 6 所述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。 8. 根据权利要求 7 所述的 H7。

8、N9 亚型流感病毒标准品，其特征在于，进一步用于 H7 和 N9 的 RNA 体外转录和蛋白质体外合成。权利要求书 CN 103160617 A 2 1/4 页 3 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品技术领域 0001 本发明涉及一种rRT-PCR检测技术及其标准品的制备，尤其涉及一种H7N9亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。背景技术 0002 流感病毒基因组由 8 条（甲、乙型）或者 7 条（丙型）负链 RNA 节段构成。根据病毒的核蛋白（NP）和基。

9、质蛋白（M）不同分为甲型、乙型、丙型。其中 A 型流感病毒根据血凝素（HA）基因分为 HA1-16 亚型，根据神经氨酸酶基因（NA）分为 NA1-9 亚型。H7N9 亚型流感病毒是 A 型流感病毒的一种，禽类是其天然宿主，亚洲、北美洲等地区多个国家的禽类养殖场中检测到过 H7N9 禽流感病毒。 0003 动物实验表明， H7N9 亚型流感病毒能够感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的风险，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测 H7N9 亚型流感病毒及其重配变异株。发明内容 0004 本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的H7N9亚型流感病。

10、毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 0006 本发明的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针： 0007 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针、 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异性引物和探针； 0008 所述 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因相对保守区； 0009 所述 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因相对保守区。 0。

11、010 本发明的应用上述的 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针检测流感病毒的方法，包括步骤： 0011 首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒 RNA ； 0012 然后，利用一步法或两步法 rRT-PCR 试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增； 0013 之后，根据 Ct 值判断 rRT-PCR 检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。 0014 本发明的流感病毒标准品，含有H7和N9亚型的全长基因，用于上述检测流感病毒的方法的阳性对照品。 0015 由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检。

12、测引物和探针及检测流感病毒的方法及流感病毒标准品，由于包括针对 H7N9 亚说明书 CN 103160617 A 3 2/4 页 4 型流感病毒 HA 基因和 NA 基因相对保守区引物和探针，可以通过 rRT-PCR 法检测 H7N9 亚型流感病毒及其变异株，操作简单、应用方便。具体实施方式 0016 本发明的H7N9亚型流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针： 0017 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针、 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异性引物和探针；。

13、 0018 所述 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因相对保守区； 0019 所述 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因特异性引物和探针针对 H7N9 亚型流感病毒 NA 基因相对保守区。 0020 所述引物和探针包括长度为 18 31bp 的寡核苷酸片段。 0021 所述 H7N9 亚型流感病毒 HA 基因特异性引物和探针包括以下两套引物 / 探针组合，共计四条引物序列和二条探针序列： 0022 第一套： 0023 引物序列： 5 AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3 、 5 GGTCTTTCCTTGTATTTT。

14、TGTATGACTTAG 3 ； 0024 探针序列： 5 FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3 ； 0025 第二套： 0026 引物序列： 5 TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3 、 5 TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3 ； 0027 探针序列： 5 FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3 ； 0028 所述H7N9亚型流感病毒NA基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列： 0029 引物序列： 5 TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3 、 5 。

15、ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3 ； 0030 探针序列： 5 FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3 。 0031 所述探针序列两端的标记 FAM、 BHQ1 为荧光素标记。 0032 本发明的应用上述的 H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 检测引物和探针检测流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式包括步骤： 0033 首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒 RNA ； 0034 然后，利用一步法或两步法 rRT-PCR 试剂加入所述引物和探针进行核酸扩增； 0035 之后，根据 Ct 值判断 rRT-PCR 检测。

16、结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。 0036 所述流感病毒包括以下一种或多种病毒： 0037 禽 H7N9 亚型流感病毒、内部基因变异的禽 H7N9 亚型流感病毒、人感染 H7N9 亚型流感病毒、人感染内部基因变异的 H7N9 亚型流感病毒。 0038 本发明的流感病毒标准品，其较佳的具体实施方式是： 0039 含有 H7 和 N9 亚型的全长基因，用于上述的检测流感病毒的方法的阳性对照品。 0040 进一步用于 H7 和 N9 的 RNA 体外转录和蛋白质体外合成。 0041 本发明中的引物和探针序列（5 3 ）及其检测的靶片段如下：说明书 CN 103160。

17、617 A 4 3/4 页 5 0042 0043 0044 具体实施例： 0045 包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明流感病毒 rRT-PCR 检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明： 0046 实施例一： H7N9 亚型流感病毒 rRT-PCR 寡核苷酸引物的设计与合成： 0047 从 GenBank 流感数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU. html）中下载 H7 亚型流感病毒的所有 HA 序列、 N9 亚型流感病毒的所有 NA 序列，使用 MEGA5.1 进行比对。

18、，选择相对保守区设计引物和探针；引物和探针设计中同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：引物和探针长度在1831bp之间； Tm值在4259之间； GC%在2575%之间； polyN4bp ； Hairpin 4bp ；覆盖率 90% ；进行 BLAST 筛选，特异性分数 L0.4。最佳 Tm 值设定在 59，最佳引物和探针长度为 18-25bp。 0048 实施例二：本发明检测未知病毒的应用举例： 0049 1. 病毒 RNA 的提取： 0050 取病毒采样液 200L，加入 500L 裂解液，按 RNea。

19、sy Mini Kit（Qiagen 公司， catalog#74104）说明书提取病毒 RNA50L。 0051 2.rRT-PCR 反应 0052 1) 体系配置：使用 Ag Path-IDTM One-step RT-PCR kit（#4387424）反应液说明书 CN 103160617 A 5 4/4 页 6 0053 0054 2)rRT-PCR ：将加好上述反应体系的反应管放于 PCR 仪进行 rRT-PCR，反应程序如下 0055 0056 3. 结果判断： 0057 阴阳对照结果成立的情况下判断结果，要求阴性对照没有 Ct 值或者为 0，阳性参照有。

20、 Ct 值 20 30 之间。一般情况下 Ct 小于 38 的可以判断为阳性。 0058 本发明提供了 3 套用于甄别 H7N9 亚型流感病毒的特异性寡核苷酸引物及探针序列。本发明并提供了 rRT-PCR 的检测体系及其在 H7N9 亚型流感病毒快速检测中的应用。 0059 检测评价： 0060 特异性评价：选取国内近三年流行季节性流感病毒 H1N1 亚型 ,H3N2 亚型，乙型流感，腺病毒，副流感病毒，以及 HA1-16 亚型 ,NA1-9 亚型禽流感病毒 RNA 进行检测，结果表明对 H7N9 亚型基因检测为阳性，对其他病毒 / 基因检测均为阴性。 0061 本发明可以将 rRT-PCR 技术应用于 H7N9 亚型流感病毒的甄别。为 H7N9 亚型流感病毒的实验室诊断提供了快速有效的检测技术，为 H7N9 亚型流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。 0062 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。说明书 CN 103160617 A 6 。

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