病毒体颗粒的生产.pdf

摘要
申请专利号：	CN201180047873.2	申请日：	2011.09.29
公开号：	CN103154251A	公开日：	2013.06.12
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/82申请公布日:20130612\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/82申请日:20110929\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/82; A61K39/145	主分类号：	C12N15/82
申请人：	佛兰瓦克斯有限责任公司
发明人：	马里亚·迪纳罗
地址：	意大利卡塔尼亚
优先权：	2010.09.30 EP 10012574.9
专利代理机构：	北京品源专利代理有限公司 11332	代理人：	巩克栋;杨生平
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内容摘要

本发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。

权利要求书

权利要求书一种合成生产的病毒体颗粒，其包含(i)烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA)抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。
根据权利要求1所述的病毒体颗粒，其中所述流感血凝素(HA)抗原位于所述病毒体颗粒的脂双层中。
根据权利要求1或2所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由MALP‑2、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸和4‑ARM‑二酰氧基丙基半胱氨酸所组成的组，特别地为BPP‑Glyc‑Cys‑4‑arm‑PEG。
根据权利要求3所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由MALP‑2和S‑[2，3‑二(酰氧基)‑(2R)‑丙基]‑L‑半胱酰基‑羧基聚乙二醇所组成的组。
根据权利要求4所述的病毒体颗粒，其中所述所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物是S‑[2，3‑二(棕榈酰基氧基)‑(2R)‑丙基]‑L‑半胱酰基‑羧基聚乙二醇。
一种疫苗，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒，所述病毒体颗粒任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。
根据权利要求6所述的疫苗，其与适合的药学上可接受的物质佐剂组合。
根据权利要求6至7中任一项所述的疫苗，其用于鼻施用。
一种生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤：
a)在植物中重组生产流感血凝素(HA)抗原；
b)生产磷脂混合物，其包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；和
c)将所述病毒抗原与所述磷脂的混合物重组以形成所述病毒体颗粒。
根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒、根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗或通过权利要求9的方法生产的病毒体颗粒用于预防流感的用途。
根据权利要求10所述的用途，其包括向有需要的患者施用适当剂量的根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒、根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗或通过权利要求9的方法生产的病毒体颗粒。

说明书

说明书病毒体颗粒的生产
技术领域
本发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。
发明背景
流感，通常称为flu，是一种最古老和最常见的疾病。它是由不同症状像发烧、冷战、咳嗽、咽喉痛和头疼表征的一种急性呼吸道疾病。它是由呼吸道分泌物通过喷嚏或咳嗽传递的真正的接触性传染病。尽管在大部分时间里流感是一种温和的病毒感染，但其也是造成婴儿、老年人以及免疫系统受损的成人中高发病率和死亡率的原因(Cox N.J.，Annu Rev Med，2000，51：4‑7‑421)。
抗流感的疫苗基于流感病毒表面蛋白(血凝素，HA)，其是保护性抗原。现有的流感疫苗包含来自三个不同流感毒株的HA抗原，流感A H1 N1和H3N2以及流感B病毒。由于抗原性漂移的结果的季节性流感病毒的新毒株的出现需要每年修正流感疫苗组合物。抗原性漂移周期性地(平均每20年)导致大流行病并且目前2009年流感大流行病的高致病性H1N1毒株是值得注意的公共卫生问题。
疫苗接种仍然是最有效和最经济的预防流感病毒感染的方式，尤其是在面对危险的流感大流行病时。而且，全世界季节性流感疫苗产品的生产能力限于4亿个剂量，其远远不能满足在世界范围内对高危成人接种疫苗所必须的十亿个剂量(Emmanuel E.J.和Wertheimer A.，Science 2006，312：854‑855)。
流感病毒血凝素(HA)的抗体在流感疫苗的保护性能力中起到重要作用。该分子包含靶细胞受体的结合位点并且其可变球状结构域表现大部分的中和表位(Wiley D.C.，Wilson LA.和Skehel J.J.，Nature 1981，289：373‑378)。商业化的季节性流感疫苗基于失活或者活力减弱的流感病毒(Nichol K.L.和Treanor J.J.，JID，2006，194(Suppl.2)，S111‑S118)。基于亚单位疫苗方法(尤其是使用杆状病毒表达的重组HA的)已经在临床研究中被检测(Goji.A，等人，JID，2008，1998：635‑638)。
通常，花费大约6个月制造大批量的基于新出现的病毒的新疫苗，其代表开发普遍性疫苗的重要阻碍。在2009年流感大流行病的高致病性H1N1毒株的实例中，第一例于2009年3月于墨西哥被报道(参见WHO网站)而最初的相应疫苗Focetria(Novartis)和Pandemrix(Glaxo‑SmithKline)于2009年9月24日在欧洲获得EMEA的批准(参见EMEA网站)。这两者都是在鸡蛋中生产的并且由于基于鸡蛋的疫苗生产显然导致疫苗的相当低的滴度以及相应相当低的免疫原性，因此两个实例中必须加入佐剂。
因此，至今主要生产工艺仍旧包括基于鸡蛋的技术，而其不能生产将世界上所有高危成人免疫所必需数目的疫苗剂量。通常，生产一个剂量的疫苗需要一个鸡蛋。
所述工艺面临几个限制：
‑困难并且耗时的后勤，归因于所需要的大量的鸡蛋；
‑生产规模和能力的限制；
‑在大流行的禽流感和大流行的2009年流感的实例中生产来源的问题；
‑生产工艺对污染的敏感性；
‑生产工艺的复杂性和持续时间(6个月)；
‑尽管有若干纯化步骤，但是疫苗可能含有痕量的鸟类蛋白，其可能导致疫苗中所不期望的变态反应。
在2009年流感的高致病性的H1N1毒株的实例中，基于鸡蛋的疫苗生产部分导致了疫苗的相当低的滴度和相应相当低的免疫原性，使得必需加入佐剂。
当今基于细胞的技术开始与基于鸡蛋的工艺竞争。最先进的技术基于称为MDCK(马‑达二氏犬肾)的犬肾细胞系。其具有一些优点，如由于细胞可被冷冻并且储存直至生产工艺开始因而后勤工艺比较简单。该系统同样对产品的污染较不敏感并且疫苗本身不含有可能导致变态反应的残留的痕量鸡蛋蛋白。使用Vero和PER.C6细胞培养物的其他基于细胞的技术正处于开发中。抗2009年流感的高致病性的H1 1毒株的疫苗，Cel‑vapan(Baxter；在非洲绿猴肾异倍体细胞中生产，未加佐剂)，于2009年10月1日在欧洲获得EMEA的批准(参见EMEA网站)。然而，不管所用的细胞系，就大量生产而言，这些生产工艺仅具有有限的生产能力。然而大量生产适当流感抗原的快速可用性是面对流感流行或大流行的威胁时所必需的。
绿色生物技术为克服与现有的流感疫苗生产体系(鸡蛋和哺乳动物细胞培养物)有关的数量问题提供了一个机会。植物的另一个优势在于它们不具有动物病原体，这使得它们成为用于生物制药的更安全的生产有机体。
然而，在植物中生产流感抗原也不是没有缺点。使用植物材料的污染可能导致有害的变态反应并且妨碍药物批准。因此，在分离和纯化来自植物提取的流感抗原时必须非常注意。
在增强疫苗效力并由此克服可用性问题的另一个方法中，开发了免疫增强性重建流感病毒体(IRIV)。IRIV包含一种抗原或者掺入还含有磷脂混合物，一种必需的重建的功能病毒被膜，以及流感血凝素蛋白(HA)的病毒体的多种抗原的组合(参见例如WO1992/19267)。
采用例如来源于失活的甲型肝炎病毒的抗原，这些IRIV显示非常好的结果。然而在这些IRIV疫苗中，没有检测到抗HA的抗体，表明没有对HA抗原的免疫响应，因此使用“空”的IRIV，即仅使用流感血凝素蛋白，作为“独立”疫苗似乎是不可行的。因此，现有领域“空”IRIV被认为是佐剂而不是疫苗。
近来，绿色生物技术和IRIV方法的组合被公开(WO 2009/009876；WO 2009/076778)。在这些实验中，在植物中生产病毒样颗粒(VLP)并且从植物材料分离。这一新方法允许大量生产VLP颗粒。然而不幸的是，VLP显示相当低的免疫原性，使得必须另外使用有效力的佐剂。尽管已经测试若干方法以增强植物来源流感抗原的效力，但是还没有植物来源的流感疫苗获得批准。
因此，本发明所基于的技术问题是提供新的疫苗，尤其是抗流感的疫苗，其克服了与本领域中所用的方法有关的生产限制(例如就疫苗的数量、重复性和纯度而言)而同时保持疫苗的免疫原性。
现有领域没有提供也没有建议之前提及的技术问题即可以大量生产并具有高重复性和纯度以及同时高免疫原性的疫苗尤其是流感疫苗的解决方案。
本发明通过提供权利要求中表征的实施方案解决的上文的技术问题。通过使用这些实施方案，提高疫苗尤其是流感疫苗的生产能力和品质变得可能。
本发明可在疫苗和疫苗生产的所有领域尤其是流感疫苗中获得应用。
发明内容
本发明提供一种病毒体颗粒，其包含(i)在植物中重组生产的病毒抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征：
a)在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸(bisacyloxypropylcysteine)轭合物；
b)在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇；
c)在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇；
d)与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的相同的脂双层的质膜组成；
e)在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。
在特定的实施方案中，本发明涉及合成生产的病毒体颗粒，其包含(i)烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA)抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。
本发明还提供了含有根据本发明的病毒体颗粒的疫苗，任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。
本发明还提供生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤：
a)在植物中重组生产病毒抗原；
b)生产磷脂混合物，其由下列特征中的至少一个表征：
至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；
无植物甾醇；
至少一种动物甾醇；
如同在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的质膜组成；和/或
无鞘脂；
c)将流感病毒抗原与所述磷脂的混合物重建以形成所述病毒体颗粒。
本发明还提供根据本发明的病毒颗粒、根据本发明的疫苗或由根据本发明的方法生产的病毒颗粒用于预防感染性传染病的用途。
附图说明
附图显示：
图1：制备病毒体的流程的原理：
(a)植物中表达的HA流感抗原
(b)磷脂的混合物
(c)将含有HA的流感spike亚单元抗原与磷脂一起溶解于去污剂
(d)除去去污剂之后含有表面上携带流感spike蛋白包括HA的重建的膜的病毒体颗粒。
图2：梯度银染
图3：光子相关光谱(PCS)
图4：小鼠中病毒体颗粒的免疫原性
具体实施方式
本发明的一个方面涉及提供一种病毒体颗粒，其包含(i)在植物中重组生产的病毒抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征：
a)在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；
b)在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇；
c)在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇；
d)与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的相同的脂双层的质膜组成；
e)在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。
如本文所用的，术语“病毒体颗粒”是指具有脂双层的颗粒，所述脂双层含有磷脂的混合物，因此类似基本上重建的功能病毒被膜。在特定的实施方案中，所述脂双层是单膜双层(unilamellar bilayer)的形式。
如本文所用的，术语“病毒抗原”是指促进抗体生成并可导致免疫响应的任何病毒抗原。
在一个实施方案中，这样的病毒抗原是来源于正粘病毒科家族的抗原。在特定的这些实施方案中，抗原是流感来源的抗原，在一些实施方案中，流感A、B或C来源的抗原。在某些实施方案中，抗原选自流感糖蛋白。在某些实施方案中，流感抗原选自由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1‑蛋白、M2‑蛋白、NS1‑蛋白、NS2(NEP)‑蛋白、P A‑蛋白、PB1‑蛋白、PB 1‑f2‑蛋白和PB2‑蛋白组成的组一种或多种。在特定的实施方案中，病毒抗原是血凝素(HA)。在另外的实施方案中，流感血凝素选自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16组成的组，特别地是H1。
在另外的实施方案中，涵盖这些病毒抗原的缺失、插入或加入突变体(即具有缺失的、插入的或增加的氨基酸或氨基酸序列的蛋白)。同样，涵盖嵌合体(即融合蛋白或不同来源的蛋白‑络合物)、化学修饰蛋白(例如聚乙二醇化的蛋白)和修饰的蛋白(例如用另外的非天然的氨基酸)。在一个实施方案中，植物来源的抗原来自于流感血凝素。在另外的实施方案中，病毒抗原来自于选自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16组成的组的流感血凝素，特别地是H1。
在特定的实施方案中，病毒抗原，例如血凝素HA包含跨膜区或其衍生物。
在本发明的某些实施方案中，病毒抗原位于病毒体颗粒的脂双层中。
在某些实施方案中，血凝素(HA)是生物学上有活性的。
如本文所用的，术语“生物学上有活性的”是指基本上显示天然HA的全部生物学活性并且由此能够介导本发明的病毒体颗粒与它们的靶细胞经由包含唾液酸的受体吸附的HA或其衍生物。而且，这些HA组分可通过将抗流感抗体循环来识别。生物学活性是本发明的病毒体颗粒的必要特征。
不限于任何理论，本发明的病毒体颗粒的HA组分的功能可如下解释：
1)其与靶细胞上含有唾液酸(N‑乙酰神经氨酸)的受体结合以起始病毒体颗粒‑细胞相互作用；
2)其介导病毒体颗粒通过膜融合事件进入细胞质并由此最终导致其释放；和
3)其起到“识别抗原”的作用，因为大多数人类可被认为是对HA“预处理的”，原因在于事先通过疾病或接种疫苗暴露。
因此，这些病毒体颗粒的必要特征在于它们在它们的表面携带生物学上有活性的病毒糖蛋白(HA)或其衍生物，避免不期望的HA抗原在其可能被非特异性降解的细胞内胞质体(endocytosome)中的长期停留。
最重要的是抗原应当适合巨噬细胞和其他辅佐细胞的事实。为了这一目的，病毒体颗粒的颗粒性质是优点，因为其模拟了微生物的颗粒实体。
而且，因为所有人类都具有抗流感抗原HA的抗体(来自之前的流感感染或来自于疫苗接种)，因此快速形成抗体‑抗原络合物(免疫络合物)。然而这些免疫络合物不仅加速识别抗原的进入巨噬细胞还加速识别抗原进入淋巴小结，其中抗原被长期保留在滤泡树突状细胞表面的细胞外位点中。这些长期的细胞外显露当然是疫苗的优选特征，因为其多功能的免疫‑激发作用(免疫原性)。进入巨噬细胞和淋巴小结的这一过程称为调理作用。
而且，通过抗体的结合具有抗原免疫原性的另一个结果。然而，溶液中一种给定的抗原，A，将仅与在其表面呈现具有抗A特异性的抗体分子的B细胞结合，而免疫络合物可经由Fc受体粘附于任何B细胞。因为输入淋巴管中的B细胞进入淋巴结的B细胞区域的能力，经由Fc受体的这一非特异性结合是天然感染中可能的一种途经，通过所述途经所述抗原被运输至淋巴组织中的淋巴小结和其他地方(Nossal，G.J.V.，New Generation Vaccines(ed.Woodrow，G.C.和Levine，M.M.)，Marcel Dekker，Inc.，(1990)85)。该机制可能辅助经由单核细胞的运输。
因此，病毒体颗粒表面上流感抗原的存在有利于调理作用的免疫机制。
在一个实施方案中，本发明的病毒颗粒含有完整的HA，其作为550个氨基酸的单个多肽链而在植物中合成，随后通过除去精氨酸329(相应于HA[Influenza A virus(A/TW/36/04(H3N2))]的精氨酸345)而剪切为两个链HA1(36,334道尔顿)和HA2(25,750道尔顿)。
这些链可任选地通过包括HA1位点14的半胱氨酸和HA2位点137的半胱氨酸的二硫键共价连接并且所述双链单体可非共价结合以在IRIV的表面上形成三体。这些HA1或HA2肽可获得自天然或合成来源或者通过基因工程获得。
而且，大剂量纯蛋白抗原的突然使用包括激活免疫响应中的抑制通路的风险，尤其是如果使用静脉内途经时；参见Nossal，G.J.V.，New Generation Vaccines，Marcel Dekker，Inc.New York，Basle(eds.Woodrow，Levine)，(1990)85。另一方面，缓慢释放允许抗原对广泛分布的树突细胞和巨噬细胞大大过量，并且其同样确保抗原在克隆增殖的最初爆发后仍然可获得，由此允许某些方面的二次响应。因此，如病毒体颗粒所表现的抗原的缓慢释放对于疫苗来说是另一个有利特征。
如本文所用的，术语“在植物中重组生产的”是指蛋白包括糖基化蛋白通过植物宿主中的表达而重组生产。
在本发明的背景下，术语“植物宿主”是指任何适于异种蛋白的重组表达的任何植物。
在特定的实施方案中，植物表达宿主是烟草属植物、尤其是本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)。
在本发明的某些实施方案中，植物中重组生产的病毒抗原具有植物表达宿主的碳水化合物分布特征。
与在植物中产生完整的病毒样颗粒(VLP)的本领域技术相反，仅在植物中生产并纯化病毒抗原(例如HA蛋白)。之后将抗原与并非在植物中生产的磷脂的混合物一起重建。
如之前提及的，现有领域的方法通常在植物中生产整个VLP，即抗原以及磷脂混合物并且另外的蛋白具有植物来源。之后将VLP从植物产品中纯化并且通过自发的凝集而形成。尽管这样的“一步法”程序具有简单的优点，但是其也具有一些缺陷。
首先，其使得生产不含杂质的VLP实际上是不可能的。然而，与植物材料一起的杂质对于变态或其他有害身体反应的危险来源。因此，对于这些VLP组成的疫苗来说制药批准是很难的。
第二，自发凝集和颗粒形成使得任何进一步的工艺控制都是不可能的。这导致尺寸和组成上不均匀的颗粒。
第三，其不能够同时配制佐剂达到它们成为VLP的一部分的效果。相反，佐剂仅可以在颗粒形成已经发生之后被加入。
本发明克服了所有这些缺陷。
首先，其具有其产生非常纯的病毒体颗粒的优点，因为在植物中仅产生病毒抗原(例如HA蛋白)，而磷脂和颗粒的其他组分通过化学或生物化学手段从非植物来源生产。
令人惊讶地，本发明的纯的病毒体颗粒显示出与现有领域VLP相比增强的免疫原性。不限制于任何理论，假定因为纯的病毒体颗粒不含有植物糖脂并且更类似于“天然”病毒体的结构，抗原(例如HA蛋白)的重要表位没有被遮蔽并且因此本发明的病毒体颗粒导致更强的免疫响应。
其次，向病毒抗原(例如HA蛋白)有控制地加入磷脂(和其他成分)允许受控的颗粒组成。这意味着颗粒的尺寸以及它们的组成可以根据个体需要被精确地控制并且调节。而且，免疫原性可以通过精细调节颗粒的组成来改进。
如本文所用的，“磷脂的混合物”包含天然或合成的磷脂或其混合物。至少其含有选自甘油磷脂(例如磷酸卵磷脂或磷脂酰乙醇胺)和胆固醇的组的一种或多种化合物，尤其是磷酸卵磷脂和/或磷脂酰乙醇胺。
颗粒的受控凝集允许将佐剂掺入(即包埋或锚定于)颗粒自身的脂双层中。为了增强免疫原性，在一些实施方案中，所述脂双层包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物，其被锚定在脂双层中产生为疫苗接种所准备的稳定的颗粒。将二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物掺入病毒体颗粒的脂双层中的优点在于病毒体颗粒表面、抗原分布和佐剂分布之间的理想比例可以保持稳定。
在本发明的背景下，术语“二酰氧基丙基半胱氨酸”是指通式I的分子

其中
R1和R2独立地选自烷基或烯基基团，其与其所连接的‑C(＝O)‑基团一起形成酰基基团例如棕榈酰基；
Y选自‑O‑、‑NH‑、‑S‑和‑O‑CO‑，尤其是‑NH‑；并且
R3是适于掺入脂双层的聚合物部分，尤其是多肽或下列通式的聚(乙二醇)‑(CH2‑CH2‑O)m‑CH2‑CH2‑X
其中
m是选自5至700的整数，尤其是100至500的整数；并且
X选自‑O‑R4、‑N(R4)2、‑S‑R4和‑COOR4，
其中R4选自‑H、‑苯甲基、C1‑6烷基并且其中‑N(R4)2中两个残基R4可以相同或不同。
在另外的实施方案中，展示包含根据式II的二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物的病毒体颗粒：

其中
‑R1和R2可以是相同或不同的，与它们所连接的‑OC‑部分一起，形成酰基部分；L是选自NH、O、S或OCO的连接体部分；
‑R3是包含至少两个下式的聚亚烷基二醇单元的共价连接的轭合物部分：
X1‑[(CHR4)x‑O]n‑(CHR4)y‑，
其可以是相同或不同的；
其中
‑X1是氢或碳氢化合物，其可以包含一个或多个杂原子；
‑R4独立地为氢、OH、R5OR5或CO‑R6中的任一个；
‑R5独立地为氢或C1‑C6烷基中的任一个；
‑R6独立地是氢、OH、OR5或NR7R8烷基中的任一个；
‑R7和R8独立地是氢或碳氢化合物中的任一个，其可以包含一个或多个杂原
子并且其可形成环；
‑n是1至100的整数；
‑x独立地是1至10的整数；
‑y是0至10的整数。
因此，在本发明的某些实施方案中，新的病毒体颗粒包含选自包含MALP‑2(参见例如，WO 98/271 10和WO 2003/084568)、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸(参见例如，WO 2004/009125)、4‑ARM‑二酰氧基丙基半胱氨酸(特别地BPP‑Glyc‑Cys‑4‑arm‑PEG；参见例如WO 2007/059931)以及其他的二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物的组的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物，尤其是MALP‑2和S‑[2，3‑二(酰氧基)‑(2R)‑丙基]‑L‑半胱酰基‑羧基聚乙二醇，尤其是S‑[2，3‑二(棕榈酰基氧基)‑(2R)‑丙基]‑L‑半胱酰基‑羧基聚乙二醇。

MALP‑2分子和其二酰氧基丙基半胱氨酸(bisaxcyloxypropylcysteine)轭合物例如二棕榈酰氧基丙基半胱氨酸‑PEG分子已知代表巨噬细胞的强效刺激剂。MALP‑2作为佐剂的使用之前已经说明，参见例如WO 98/27110和WO 2003/084568。二棕榈酰氧基丙基半胱氨酸‑PEG分子作为佐剂的使用之前已经说明，参见例如WO 2004/009125。特别地，证明了MALP‑2分子和二酰氧基丙基半胱氨酸‑PEG分子可作为有效的粘膜佐剂而起作用，增强粘膜免疫响应例如鼓励抗原‑特异性IgA抗体的增强表达。而且，已经显示MALP‑2可活化树突细胞和B细胞，这两者均在特异性体液免疫响应的诱导中起到重要作用。
因此，在一个实施方案中，病毒体颗粒用于鼻内施用。
术语“植物甾醇”是指植物来源的固醇。有一些证据证明植物甾醇可促进动脉粥样硬化，尤其是在易感个体中。因此，在另外的实施方案中，所述脂双层不含有植物甾醇。本发明的病毒体颗粒的脂双层尤其不含有油菜甾醇、谷甾醇和豆甾醇。
术语“动物甾醇”是指动物来源的固醇，例如胆固醇。当需要建立适当的膜透性和流动性时，胆固醇是哺乳动物细胞膜的必要组分。因此，在另一个实施方案中，脂双层可包含至少一种动物甾醇例如胆固醇。
如本文所用的，术语“与所述病毒的宿主细胞质膜中发现的相同的质膜组成”是指不同界(动物、植物、真菌、原生生物、古生细菌、细菌)在其质膜组成上不同的事实。而且，存在蛋白功能以及某些表位的免疫识别可能受到特定脂双层组成的影响的指征，因为脂双层的物理性质(即流动性、极性、透性、稳定性等)很大程度上取决于它们的组成。因此，在某些实施方案中，本发明的病毒体颗粒的特殊的脂双层组成类似动物或人类脂双层的组成。在某些实施方案中，膜组成与天然流感病毒体的膜组成相似或者相同。
如本文所用的，术语“鞘脂”是指来源于脂肪族氨基醇鞘氨基醇的一类脂质。这些化合物在信号传递和细胞识别上起到重要作用。植物来源的鞘脂是质膜、液泡膜和植物细胞其他内膜的主要成分。为了消除不期望的植物来源的鞘脂和宿主免疫系统之间的相互反应，在某些实施方案中脂双层包含非植物来源的鞘脂。
发现某些复杂的哺乳动物糖鞘脂参与特定功能，例如细胞识别和发信号。所述发信号包括糖鞘脂的聚糖结构与相邻细胞上存在的相似的脂质或与蛋白之间特殊的相互反应。因此，在某些实施方案中，某些哺乳动物鞘脂可存在于本发明的病毒体颗粒中。
一般认为其他的哺乳动物鞘脂通过形成机械上稳定并且化学上有抗性的质膜脂双层的外部小叶来保护细胞表面远离有害的环境因素。然而这样的“保护性表面”减少表位暴露于宿主免疫系统的机会，而所述暴露对于免疫原性来说是必需的。因此，在一些实施方案中，本发明的病毒体颗粒的脂双层根本不含有任何鞘脂。
上文提及的本发明的病毒体颗粒的特征(即含有二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物、不含有植物甾醇、含有一些动物甾醇、具有一定的膜组成和/或含有某些鞘脂)可由本领域技术人员根据手边情况、有待接种疫苗的疾病和有待使用的抗原来组合。也就是说，例如高免疫原性的抗原可单独在包含磷酸卵磷脂脂双层的病毒体颗粒中重建，而低免疫原性的抗原可与免疫原性增强物质例如二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物、动物甾醇或某些鞘脂一起重建。在大多数实施方案中，本发明的病毒体颗粒中不存在植物来源的材料，因此植物甾醇以及植物来源的鞘脂将被避免。
在本发明的某些实施方案中，病毒体颗粒是合成生产的。
因此，在特定的实施方案中，本发明涉及合成生产的病毒体颗粒，其包含(i)在烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA)抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层包含锚定在所述脂双层中的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。
在某些实施方案中，病毒体颗粒还包含一种或多种另外的佐剂，包括但不限于脂多糖。
在本发明的背景下，术语“脂多糖”或(LPS)是指已知为脂聚糖的分子，其是由通过共价键结合的脂质和多糖组成的大分子；已发现它们位于革兰氏阴性菌的外膜中，作为内毒素起作用并在动物中引起强烈的免疫响应。因此，在一些实施方案中，脂双层病毒体颗粒可含有作为另外的免疫增强剂的LPS。
LPS，如本发明所展示的，包含三个部分：
1.O抗原(或O多糖)
2.核心寡糖
3.脂质A
脂质A通常是由多个脂肪酸修饰的磷酸化的葡糖胺双糖。这些疏水性脂肪酸链将LPS锚定在细菌膜中而其余的LPS从细胞表面突出。脂质A结构域是造成许多革兰氏阴性菌的毒性的原因。当细菌细胞通过免疫系统溶解时，含有质膜A的膜的片段释放至循环中，引起发烧、腹泻和可能的婴儿内毒素性休克(也称为感染性休克)。
核心寡糖直接与脂质A连接并且通常含有糖类例如庚糖和3‑脱氧‑D‑甘露醇辛酮糖酸(也称为KDO，酮基‑脱氧辛酮糖酸)。
当LPS含有重复的聚糖聚合物时，其被称为细菌的O抗原、O聚糖或O链。O抗原与核心寡糖连接并且包括LPS分子的最外部的结构域。株系与株系之间O链的组成不同，例如有由不同大肠杆菌菌株生产的超过160种不同O抗原结构。O抗原被暴露在细菌细胞非常外部的表面并且因此是宿主抗体识别的靶。
在本发明的另外的方面，本发明涉及含有根据本发明的病毒体颗粒的疫苗，任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。
本发明的病毒体颗粒可被用作有效疫苗(例如流感病毒)中强力活性成分，其将所期望的抗原(例如HA蛋白)主动运输至例如巨噬细胞、DC、B细胞，APS将适当地将所述抗原加工并且呈现给免疫系统，以便诱导有力并且保护性的免疫响应。
在特定的实施方案中，疫苗于适合的药学上可接受的物质佐剂组合。
在某些其他这样的实施方案中，适合的药学上可接受的物质佐剂被共同配制在病毒体颗粒中。
在某些这样的实施方案中，适合的药学上可接受的物质佐剂被加至病毒体颗粒。
如本文所用的，术语“物质佐剂”意指共同配制至和/或在免疫接种中加至活性抗原的物质，即引起所期望的免疫响应以便增强或引出或调解抗活性抗原的体液和/或细胞介导的(细胞的)免疫响应。特别地，根据本发明的佐剂也可以增强或引出先天免疫响应。
为了进一步增强新病毒体颗粒的免疫原性，可使用大范围的传统佐剂。最有力的方法(例如与弗氏完全佐剂一起施用免疫原)将下列章节中所阐述的许多不同原则进行组合：
(A)化学免疫强化
长期的研究是寻找模拟如同可用失效的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或有毒的微生物提取物例如大肠杆菌(E.coli)LPS所获得的完整免疫响应的增强作用的纯的、安全、有效、无毒的小的有机分子的基础。
(B)与白介素共施用
有一些将例如IL‑2与抗原共施用可导致比单独施用抗原和白介素更大的免疫响应增强的证据；参见Staruch，M.J.和Wood，D.D.，J.Immunol.130(1983)，2191。
(C)抗原与高免疫原性剂的共展示
如果特定的疫苗是高免疫原性的，那么这一疫苗的佐剂作用以及其同样可具有的指导对特定的免疫通路响应的表征，可溢出至对于其共施用的抗原的响应。
例如，失效的百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是有力的免疫原。如果将纯的蛋白用同一次注射施用，那么对其的响应被增强。某些免疫原(由于尚不清楚的原因)在特定方向指导响应。例如，寄生虫诸如巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)的提取物引起强力的IgE响应。与所述寄生虫提取物共施用的纯的蛋白将同样引发IgE响应；参见Nossal，G.J.V.，New Generation Vaccines，Marcel Dekker，Inc.New York，Basle(eds.Woodrow，Levine)，(1990)85。可推测，这一作用通过某种途径与由特定剂所诱导的特定淋巴因子的产生相关。所述淋巴因子例如IL‑4，指导同型转换模式。淋巴因子的多克隆活化表征一般也可成为增强免疫响应的基础。
(D)疏水锚定和免疫增强络合物
免疫增强络合物(is‑com)中表面活性剂例如皂苷或Quil A已经被用于许多实验性和兽医疫苗。它们证明若干抗原尤其是病毒膜蛋白的免疫原性。
在特定的实施方案中，物质佐剂选自所列的二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物和LPS。
在某些实施方案中，包含病毒体颗粒的疫苗用于鼻内施用。
在本发明的还有另一个方面，本发明涉及生产病毒体颗粒的方法，其包含下列步骤：
a)在植物中重组生产病毒抗原；
b)生产磷脂混合物，其由下列特征中的至少一种来表征：
(I)至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；
(ii)无植物甾醇；
(iii)至少一种动物甾醇；
(iv)如同在所述病毒的流感宿主细胞的质膜中发现的质膜组成；和/或
(v)无鞘脂；
c)将流感病毒抗原与所述磷脂的混合物重组以形成所述病毒体颗粒。
在还有另一个方面，本发明涉及根据本发明的病毒颗粒、根据本发明的疫苗或由根据本发明的方法生产的病毒颗粒用于预防感染性传染病的用途。
在某些实施方案中，本发明的用途是用于预防感染性传染病，包括向有需要的患者施用适当剂量的本发明的病毒体颗粒、本发明的疫苗或本发明的方法生产的病毒体颗粒。
实施例
实施例示例性说明本发明。
实施例1：病毒体颗粒的制备
将溶解于PBS的从本塞姆氏烟草表达并纯化的流感血凝素与粉末状溶解于含有作为去污剂的100mM OEG的PBS的鸡蛋来源的脂质(蛋黄素例如蛋黄卵磷脂)混合。脂质蛋白比例可从20∶1变化至1∶10。在我们的实验中，最佳比例是6∶1。如果使用其他的脂质(合成的或类固醇类型)，脂质蛋白比例甚至可变化更多。脂质和流感HA可任选地经受超声脉冲。之后将混合物经过0.22mm滤器并且通过SM‑2 Bio‑Bead中一系列不同通道除去去污剂。除去去污剂使得病毒体颗粒群体中溶解的组分的混合物自发组装。在SM‑2 Bio‑Bead的最后一个通道之后，病毒体颗粒群体再次经受0.22mm过滤并且终产物是取决于具体的组成具有直径80‑150nm平均尺寸的均质病毒体颗粒群。
实施例2：病毒体颗粒生成的可选择的修饰
粉末状的脂质混合物例如蛋来源的磷酸卵磷脂和磷脂酰乙醇胺溶于含有作为去污剂的100mM OEG的PBS中。脂质比例可从20∶1变化至1∶10。在我们的实例中，最佳范围是5∶1。脂质比例可从20∶1变化至1∶10。在我们的实例中，最佳比例是7∶1。如果使用其他的脂质(合成的或类固醇类型)，脂质蛋白比例甚至可变化更多。脂质和流感HA可任选地经受超声脉冲。
之后将溶液与从本塞姆氏烟草表达并纯化的溶于PBS的流感血凝素混合。脂质和流感HA可任选地经受超声脉冲。之后将混合物经过0.22mm滤器并且通过SM‑2 Bio‑Bead中一系列不同通道除去去污剂。在最后的步骤中，去污剂通过分批层析使用SM‑2 Bio‑Bead除去。除去去污剂使得病毒体颗粒群体中溶解的组分的混合物自发组装，所述病毒体颗粒群具有的直径80‑150nm平均尺寸。
为了溶解脂质和蛋白，选择的去污剂是以50mM的终浓度溶于PBS的OEG，然而，可使用20至100mM之间的浓度。可使用OEG之外的非离子型、离子型或两性离子型的去污剂。
实施例3：蔗糖梯度和银染
蔗糖梯度：通过不连续的超速离心，蔗糖梯度作为分析方法被用于基于个体组分的不同密度评估病毒体颗粒中的抗原结合。将等份的溶于PBS的病毒体颗粒制剂用于PBS中10‑60％(w/v)不连续蔗糖梯度的顶部并且在4℃于100,000g离心24h。随后分析收集到的级分的密度并且之后进行SDS PAGE和银染以确定含有HA的级分。
银染：根据制造商说明书(Invitrogen)进行SDS PAGE。根据制造商说明书(Bio‑Rad)进行银染。
实施例4：测量颗粒大小：光子相关光谱
作为起始材料从植物纯化的HA和所配制的病毒颗粒的流体半径、多分散性和统计颗粒大小分布通过光子相关光谱或动态光散射来确定。这一方法取决于布朗运动的被测定为光散射随时间的变量的尺寸依赖性速度。Malvern Zetasizer Nano(Malvern Ltd，Malvern，UK)被用于这一目的，包括用于计算来自原始数据，光密度的变化，的参数的软件。将样品充分稀释于NaCl 0.9％用于测量并且将1ml的稀释液在25℃的标准条件下分析。图3显示根据实施例1生产的病毒体颗粒的分析。
实施例5：小鼠中病毒体颗粒的免疫原性
疫苗：根据实施例1制备的两种不同的病毒体颗粒制品与游离的植物来源HA抗原的比较。
已经在小鼠模型中测试了制品的免疫原性。与游离抗原比较使用病毒体颗粒制品进行实验。用第0天和第7天两次肌肉内注射免疫小鼠。第二次面议后三周抽取血液并且分析血清抗体。将表示为平均几何滴度的结果概括于图4。
柱上的数字表示抗HA抗体滴度的范围。第28天来自游离抗原和病毒体颗粒疫苗制品的几何平均滴度(范围)分别是1393(800‑3200)和3676(3200‑6400)。因此，本发明的病毒体颗粒制剂优于游离抗原疫苗。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 103154251 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103154251 A *CN103154251A* (21)申请号 201180047873.2 (22)申请日 2011.09.29 10012574.9 2010.09.30 EP C12N 15/82(2006.01) A61K 39/145(2006.01) (71)申请人佛兰瓦克斯有限责任公司地址意大利卡塔尼亚 (72)发明人马里亚迪纳罗 (74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司 11332 代理人巩克栋杨生平 (54) 发明名称病毒体颗粒的生产 (57) 摘要本。

2、发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.04.01 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/004874 2011.09.29 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/041503 EN 2012.04.05 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 12 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图2页 (10)申请公布号 CN 103154251 A CN 。

3、103154251 A *CN103154251A* 1/1 页 2 1.一种合成生产的病毒体颗粒，其包含(i)烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA) 抗原和 (ii) 脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。 2.根据权利要求1所述的病毒体颗粒，其中所述流感血凝素(HA)抗原位于所述病毒体颗粒的脂双层中。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由 MALP-2、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸和 4-ARM- 二酰氧基丙基半胱氨酸所组成的组，特别地为 BPP-Glyc-Cys-4。

4、-arm-PEG。 4. 根据权利要求 3 所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由 MALP-2 和 S-2， 3- 二 ( 酰氧基 )-(2R)- 丙基 -L- 半胱酰基 - 羧基聚乙二醇所组成的组。 5. 根据权利要求 4 所述的病毒体颗粒，其中所述所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物是 S-2， 3- 二 ( 棕榈酰基氧基 )-(2R)- 丙基 -L- 半胱酰基 - 羧基聚乙二醇。 6.一种疫苗，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒，所述病毒体颗粒任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。 7. 根据权利要求 6 所述的疫苗，其与适合的药学上可接受。

5、的物质佐剂组合。 8. 根据权利要求 6 至 7 中任一项所述的疫苗，其用于鼻施用。 9. 一种生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤： a) 在植物中重组生产流感血凝素 (HA) 抗原； b) 生产磷脂混合物，其包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；和 c) 将所述病毒抗原与所述磷脂的混合物重组以形成所述病毒体颗粒。 10.根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒、根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗或通过权利要求 9 的方法生产的病毒体颗粒用于预防流感的用途。 11. 根据权利要求 10 所述的用途，其包括向有需要的患者施用适当剂量的根据权利要求 1 至 5 中任一。

6、项所述的病毒体颗粒、根据权利要求 6 至 8 中任一项所述的疫苗或通过权利要求 9 的方法生产的病毒体颗粒。权利要求书 CN 103154251 A 2 1/12 页 3 病毒体颗粒的生产技术领域 0001 本发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。 0002 发明背景 0003 流感，通常称为 flu，是一种最古老和最常见的疾病。它是由不同症状像发烧、冷战、咳嗽、咽喉痛和头疼表征的一种急性呼吸道疾病。它是由呼吸道分泌物通过喷嚏或咳嗽传递的真正的接触性传染病。尽管在大部分时间里流感是一种温和。

7、的病毒感染，但其也是造成婴儿、老年人以及免疫系统受损的成人中高发病率和死亡率的原因 (Cox N.J.， Annu Rev Med， 2000， 51 ： 4-7-421)。 0004 抗流感的疫苗基于流感病毒表面蛋白 ( 血凝素， HA)，其是保护性抗原。现有的流感疫苗包含来自三个不同流感毒株的 HA 抗原，流感 A H1 N1 和 H3N2 以及流感 B 病毒。由于抗原性漂移的结果的季节性流感病毒的新毒株的出现需要每年修正流感疫苗组合物。抗原性漂移周期性地 ( 平均每 20 年 ) 导致大流行病并且目前 2009 年流感大流行病的高致病性 H1N1 毒株是值得注意的公共。

8、卫生问题。 0005 疫苗接种仍然是最有效和最经济的预防流感病毒感染的方式，尤其是在面对危险的流感大流行病时。而且，全世界季节性流感疫苗产品的生产能力限于 4 亿个剂量，其远远不能满足在世界范围内对高危成人接种疫苗所必须的十亿个剂量 (Emmanuel E.J. 和 Wertheimer A.， Science 2006， 312 ： 854-855)。 0006 流感病毒血凝素 (HA) 的抗体在流感疫苗的保护性能力中起到重要作用。该分子包含靶细胞受体的结合位点并且其可变球状结构域表现大部分的中和表位 (Wiley D.C.， Wilson LA. 和 Skehel J.J.，。

9、Nature 1981， 289 ： 373-378)。商业化的季节性流感疫苗基于失活或者活力减弱的流感病毒 (Nichol K.L. 和 Treanor J.J.， JID， 2006， 194(Suppl.2)， S111-S118)。基于亚单位疫苗方法 ( 尤其是使用杆状病毒表达的重组 HA 的 ) 已经在临床研究中被检测 (Goji.A，等人， JID， 2008， 1998 ： 635-638)。 0007 通常，花费大约 6 个月制造大批量的基于新出现的病毒的新疫苗，其代表开发普遍性疫苗的重要阻碍。在 2009 年流感大流行病的高致病性 H1N1 毒株的实例中，第一例。

10、于 2009 年 3 月于墨西哥被报道 ( 参见 WHO 网站 ) 而最初的相应疫苗 Focetria(Novartis) 和 Pandemrix(Glaxo-SmithKline) 于 2009 年 9 月 24 日在欧洲获得 EMEA 的批准 ( 参见 EMEA 网站 )。这两者都是在鸡蛋中生产的并且由于基于鸡蛋的疫苗生产显然导致疫苗的相当低的滴度以及相应相当低的免疫原性，因此两个实例中必须加入佐剂。 0008 因此，至今主要生产工艺仍旧包括基于鸡蛋的技术，而其不能生产将世界上所有高危成人免疫所必需数目的疫苗剂量。通常，生产一个剂量的疫苗需要一个鸡蛋。 0009 所述工艺面临几。

11、个限制： 0010 - 困难并且耗时的后勤，归因于所需要的大量的鸡蛋； 0011 - 生产规模和能力的限制； 0012 - 在大流行的禽流感和大流行的 2009 年流感的实例中生产来源的问题；说明书 CN 103154251 A 3 2/12 页 4 0013 - 生产工艺对污染的敏感性； 0014 - 生产工艺的复杂性和持续时间 (6 个月 ) ； 0015 - 尽管有若干纯化步骤，但是疫苗可能含有痕量的鸟类蛋白，其可能导致疫苗中所不期望的变态反应。 0016 在 2009 年流感的高致病性的 H1N1 毒株的实例中，基于鸡蛋的疫苗生产部分导致了疫苗的相当低的滴度。

12、和相应相当低的免疫原性，使得必需加入佐剂。 0017 当今基于细胞的技术开始与基于鸡蛋的工艺竞争。最先进的技术基于称为 MDCK( 马 - 达二氏犬肾 ) 的犬肾细胞系。其具有一些优点，如由于细胞可被冷冻并且储存直至生产工艺开始因而后勤工艺比较简单。该系统同样对产品的污染较不敏感并且疫苗本身不含有可能导致变态反应的残留的痕量鸡蛋蛋白。使用 Vero 和 PER.C6 细胞培养物的其他基于细胞的技术正处于开发中。抗 2009 年流感的高致病性的 H1 1 毒株的疫苗， Cel-vapan(Baxter ；在非洲绿猴肾异倍体细胞中生产，未加佐剂 )，于 2009 年 10 月 1 。

13、日在欧洲获得 EMEA 的批准 ( 参见 EMEA 网站 )。然而，不管所用的细胞系，就大量生产而言，这些生产工艺仅具有有限的生产能力。然而大量生产适当流感抗原的快速可用性是面对流感流行或大流行的威胁时所必需的。 0018 绿色生物技术为克服与现有的流感疫苗生产体系 ( 鸡蛋和哺乳动物细胞培养物 ) 有关的数量问题提供了一个机会。植物的另一个优势在于它们不具有动物病原体，这使得它们成为用于生物制药的更安全的生产有机体。 0019 然而，在植物中生产流感抗原也不是没有缺点。使用植物材料的污染可能导致有害的变态反应并且妨碍药物批准。因此，在分离和纯化来自植物提取的流感抗原时。

14、必须非常注意。 0020 在增强疫苗效力并由此克服可用性问题的另一个方法中，开发了免疫增强性重建流感病毒体 (IRIV)。IRIV 包含一种抗原或者掺入还含有磷脂混合物，一种必需的重建的功能病毒被膜，以及流感血凝素蛋白 (HA) 的病毒体的多种抗原的组合 ( 参见例如 WO1992/19267)。 0021 采用例如来源于失活的甲型肝炎病毒的抗原，这些 IRIV 显示非常好的结果。然而在这些 IRIV 疫苗中，没有检测到抗 HA 的抗体，表明没有对 HA 抗原的免疫响应，因此使用 “空” 的 IRIV，即仅使用流感血凝素蛋白，作为 “独立” 疫苗似乎是不可行的。因此，。

15、现有领域 “空” IRIV 被认为是佐剂而不是疫苗。 0022 近来，绿色生物技术和 IRIV 方法的组合被公开 (WO 2009/009876 ； WO 2009/076778)。在这些实验中，在植物中生产病毒样颗粒 (VLP) 并且从植物材料分离。这一新方法允许大量生产 VLP 颗粒。然而不幸的是， VLP 显示相当低的免疫原性，使得必须另外使用有效力的佐剂。尽管已经测试若干方法以增强植物来源流感抗原的效力，但是还没有植物来源的流感疫苗获得批准。 0023 因此，本发明所基于的技术问题是提供新的疫苗，尤其是抗流感的疫苗，其克服了与本领域中。

16、所用的方法有关的生产限制 ( 例如就疫苗的数量、重复性和纯度而言 ) 而同时保持疫苗的免疫原性。 0024 现有领域没有提供也没有建议之前提及的技术问题即可以大量生产并具有高重复性和纯度以及同时高免疫原性的疫苗尤其是流感疫苗的解决方案。说明书 CN 103154251 A 4 3/12 页 5 0025 本发明通过提供权利要求中表征的实施方案解决的上文的技术问题。通过使用这些实施方案，提高疫苗尤其是流感疫苗的生产能力和品质变得可能。 0026 本发明可在疫苗和疫苗生产的所有领域尤其是流感疫苗中获得应用。发明内容 0027 本发明提供一种病毒体颗粒，其包含(i)在植物中重组。

17、生产的病毒抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征： 0028 a) 在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸 (bisacyloxypropylcysteine) 轭合物； 0029 b) 在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇； 0030 c) 在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇； 0031 d) 与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的相同的脂双层的质膜组成； 0032 e) 在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。 0033 在特定的实施方案中，本发明涉及合成生产的病毒体颗粒，其包含 (i) 烟草属植。

18、物中重组生产的流感血凝素 (HA) 抗原和 (ii) 脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。 0034 本发明还提供了含有根据本发明的病毒体颗粒的疫苗，任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。 0035 本发明还提供生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤： 0036 a) 在植物中重组生产病毒抗原； 0037 b) 生产磷脂混合物，其由下列特征中的至少一个表征： 0038 至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物； 0039 无植物甾醇； 0040 至少一种动物甾醇； 0041 如同在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的质膜组成；。

19、和 / 或 0042 无鞘脂； 0043 c) 将流感病毒抗原与所述磷脂的混合物重建以形成所述病毒体颗粒。 0044 本发明还提供根据本发明的病毒颗粒、根据本发明的疫苗或由根据本发明的方法生产的病毒颗粒用于预防感染性传染病的用途。附图说明 0045 附图显示： 0046 图 1 ：制备病毒体的流程的原理： 0047 (a) 植物中表达的 HA 流感抗原 0048 (b) 磷脂的混合物 0049 (c) 将含有 HA 的流感 spike 亚单元抗原与磷脂一起溶解于去污剂 0050 (d)除去去污剂之后含有表面上携带流感spike蛋白包括HA的重建的膜的病毒体颗粒。 0051 图。

20、 2 ：梯度银染说明书 CN 103154251 A 5 4/12 页 6 0052 图 3 ：光子相关光谱 (PCS) 0053 图 4 ：小鼠中病毒体颗粒的免疫原性具体实施方式 0054 本发明的一个方面涉及提供一种病毒体颗粒，其包含 (i) 在植物中重组生产的病毒抗原和 (ii) 脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征： 0055 a) 在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物； 0056 b) 在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇； 0057 c) 在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇； 0058 d) 与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现。

21、的相同的脂双层的质膜组成； 0059 e) 在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。 0060 如本文所用的，术语 “病毒体颗粒” 是指具有脂双层的颗粒，所述脂双层含有磷脂的混合物，因此类似基本上重建的功能病毒被膜。在特定的实施方案中，所述脂双层是单膜双层 (unilamellar bilayer) 的形式。 0061 如本文所用的，术语 “病毒抗原” 是指促进抗体生成并可导致免疫响应的任何病毒抗原。 0062 在一个实施方案中，这样的病毒抗原是来源于正粘病毒科家族的抗原。在特定的这些实施方案中，抗原是流感来源的抗原，在一些实施方案中，流感A、 B或C来源的抗原。。

22、在某些实施方案中，抗原选自流感糖蛋白。在某些实施方案中，流感抗原选自由血凝素 (HA)、神经氨酸酶 (NA)、核蛋白 (NP)、 M1- 蛋白、 M2- 蛋白、 NS1- 蛋白、 NS2(NEP)- 蛋白、 P A- 蛋白、 PB1- 蛋白、 PB 1-f2- 蛋白和 PB2- 蛋白组成的组一种或多种。在特定的实施方案中，病毒抗原是血凝素 (HA)。在另外的实施方案中，流感血凝素选自由 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 组成的组，特别地是 H1。 0063 在另外的实。

23、施方案中，涵盖这些病毒抗原的缺失、插入或加入突变体 ( 即具有缺失的、插入的或增加的氨基酸或氨基酸序列的蛋白 )。同样，涵盖嵌合体 ( 即融合蛋白或不同来源的蛋白-络合物)、化学修饰蛋白(例如聚乙二醇化的蛋白)和修饰的蛋白(例如用另外的非天然的氨基酸 )。在一个实施方案中，植物来源的抗原来自于流感血凝素。在另外的实施方案中，病毒抗原来自于选自由 H1、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 H10、 H11、 H12、 H13、 H14、 H15 和 H16 组成的组的流感血凝素，特别地是 H1。 0064 在特定的实施方案中，病毒抗原，例。

24、如血凝素 HA 包含跨膜区或其衍生物。 0065 在本发明的某些实施方案中，病毒抗原位于病毒体颗粒的脂双层中。 0066 在某些实施方案中，血凝素 (HA) 是生物学上有活性的。 0067 如本文所用的，术语 “生物学上有活性的” 是指基本上显示天然 HA 的全部生物学活性并且由此能够介导本发明的病毒体颗粒与它们的靶细胞经由包含唾液酸的受体吸附的 HA 或其衍生物。而且，这些 HA 组分可通过将抗流感抗体循环来识别。生物学活性是本发明的病毒体颗粒的必要特征。 0068 不限于任何理论，本发明的病毒体颗粒的 HA 组分的功能可如下解释： 0069 1) 其与靶细胞上含有唾液酸。

25、(N- 乙酰神经氨酸 ) 的受体结合以起始病毒体颗粒 - 细胞相互作用；说明书 CN 103154251 A 6 5/12 页 7 0070 2) 其介导病毒体颗粒通过膜融合事件进入细胞质并由此最终导致其释放；和 0071 3) 其起到 “识别抗原” 的作用，因为大多数人类可被认为是对 HA“预处理的” ，原因在于事先通过疾病或接种疫苗暴露。 0072 因此，这些病毒体颗粒的必要特征在于它们在它们的表面携带生物学上有活性的病毒糖蛋白 (HA) 或其衍生物，避免不期望的 HA 抗原在其可能被非特异性降解的细胞内胞质体 (endocytosome) 中的长期停留。 00。

26、73 最重要的是抗原应当适合巨噬细胞和其他辅佐细胞的事实。为了这一目的，病毒体颗粒的颗粒性质是优点，因为其模拟了微生物的颗粒实体。 0074 而且，因为所有人类都具有抗流感抗原HA的抗体(来自之前的流感感染或来自于疫苗接种 )，因此快速形成抗体 - 抗原络合物 ( 免疫络合物 )。然而这些免疫络合物不仅加速识别抗原的进入巨噬细胞还加速识别抗原进入淋巴小结，其中抗原被长期保留在滤泡树突状细胞表面的细胞外位点中。这些长期的细胞外显露当然是疫苗的优选特征，因为其多功能的免疫-激发作用(免疫原性)。进入巨噬细胞和淋巴小结的这一过程称为调理作用。 0075 而且，通过抗体的结合。

27、具有抗原免疫原性的另一个结果。然而，溶液中一种给定的抗原， A，将仅与在其表面呈现具有抗 A 特异性的抗体分子的 B 细胞结合，而免疫络合物可经由 Fc 受体粘附于任何 B 细胞。因为输入淋巴管中的 B 细胞进入淋巴结的 B 细胞区域的能力，经由 Fc 受体的这一非特异性结合是天然感染中可能的一种途经，通过所述途经所述抗原被运输至淋巴组织中的淋巴小结和其他地方 (Nossal， G.J.V.， New Generation Vaccines(ed.Woodrow， G.C. 和 Levine， M.M.)， Marcel Dekker， Inc.， (1990)85)。该机制。

28、可能辅助经由单核细胞的运输。 0076 因此，病毒体颗粒表面上流感抗原的存在有利于调理作用的免疫机制。 0077 在一个实施方案中，本发明的病毒颗粒含有完整的 HA，其作为 550 个氨基酸的单个多肽链而在植物中合成，随后通过除去精氨酸 329( 相应于 HAInfluenza A virus(A/ TW/36/04(H3N2) 的精氨酸 345) 而剪切为两个链 HA1(36,334 道尔顿 ) 和 HA2(25,750 道尔顿 )。 0078 这些链可任选地通过包括 HA1 位点 14 的半胱氨酸和 HA2 位点 137 的半胱氨酸的二硫键共价连接并且所述双链单体可非共价结。

29、合以在 IRIV 的表面上形成三体。这些 HA1 或 HA2 肽可获得自天然或合成来源或者通过基因工程获得。 0079 而且，大剂量纯蛋白抗原的突然使用包括激活免疫响应中的抑制通路的风险，尤其是如果使用静脉内途经时；参见 Nossal， G.J.V.， New Generation Vaccines， Marcel Dekker， Inc.New York， Basle(eds.Woodrow， Levine)， (1990)85。另一方面，缓慢释放允许抗原对广泛分布的树突细胞和巨噬细胞大大过量，并且其同样确保抗原在克隆增殖的最初爆发后仍然可获得，由此允许某些方面的二次响应。

30、。因此，如病毒体颗粒所表现的抗原的缓慢释放对于疫苗来说是另一个有利特征。 0080 如本文所用的，术语 “在植物中重组生产的” 是指蛋白包括糖基化蛋白通过植物宿主中的表达而重组生产。 0081 在本发明的背景下，术语 “植物宿主” 是指任何适于异种蛋白的重组表达的任何植物。 0082 在特定的实施方案中，植物表达宿主是烟草属植物、尤其是本塞姆氏烟草说明书 CN 103154251 A 7 6/12 页 8 (Nicotiana benthamiana)。 0083 在本发明的某些实施方案中，植物中重组生产的病毒抗原具有植物表达宿主的碳水化合物分布特征。 0084 与。

31、在植物中产生完整的病毒样颗粒 (VLP) 的本领域技术相反，仅在植物中生产并纯化病毒抗原 ( 例如 HA 蛋白 )。之后将抗原与并非在植物中生产的磷脂的混合物一起重建。 0085 如之前提及的，现有领域的方法通常在植物中生产整个 VLP，即抗原以及磷脂混合物并且另外的蛋白具有植物来源。之后将 VLP 从植物产品中纯化并且通过自发的凝集而形成。尽管这样的 “一步法” 程序具有简单的优点，但是其也具有一些缺陷。 0086 首先，其使得生产不含杂质的 VLP 实际上是不可能的。然而，与植物材料一起的杂质对于变态或其他有害身体反应的危险来源。因此，对于这些 VLP 组成的疫苗来。

32、说制药批准是很难的。 0087 第二，自发凝集和颗粒形成使得任何进一步的工艺控制都是不可能的。这导致尺寸和组成上不均匀的颗粒。 0088 第三，其不能够同时配制佐剂达到它们成为 VLP 的一部分的效果。相反，佐剂仅可以在颗粒形成已经发生之后被加入。 0089 本发明克服了所有这些缺陷。 0090 首先，其具有其产生非常纯的病毒体颗粒的优点，因为在植物中仅产生病毒抗原 ( 例如 HA 蛋白 )，而磷脂和颗粒的其他组分通过化学或生物化学手段从非植物来源生产。 0091 令人惊讶地，本发明的纯的病毒体颗粒显示出与现有领域 VLP 相比增强的免疫原性。不限制于任何理论，假定因为。

33、纯的病毒体颗粒不含有植物糖脂并且更类似于 “天然” 病毒体的结构，抗原 ( 例如 HA 蛋白 ) 的重要表位没有被遮蔽并且因此本发明的病毒体颗粒导致更强的免疫响应。 0092 其次，向病毒抗原 ( 例如 HA 蛋白 ) 有控制地加入磷脂 ( 和其他成分 ) 允许受控的颗粒组成。这意味着颗粒的尺寸以及它们的组成可以根据个体需要被精确地控制并且调节。而且，免疫原性可以通过精细调节颗粒的组成来改进。 0093 如本文所用的，“磷脂的混合物” 包含天然或合成的磷脂或其混合物。至少其含有选自甘油磷脂 ( 例如磷酸卵磷脂或磷脂酰乙醇胺 ) 和胆固醇的组的一种或多种化合物，尤其是磷酸卵磷。

34、脂和 / 或磷脂酰乙醇胺。 0094 颗粒的受控凝集允许将佐剂掺入 ( 即包埋或锚定于 ) 颗粒自身的脂双层中。为了增强免疫原性，在一些实施方案中，所述脂双层包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物，其被锚定在脂双层中产生为疫苗接种所准备的稳定的颗粒。将二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物掺入病毒体颗粒的脂双层中的优点在于病毒体颗粒表面、抗原分布和佐剂分布之间的理想比例可以保持稳定。 0095 在本发明的背景下，术语 “二酰氧基丙基半胱氨酸” 是指通式 I 的分子 0096 说明书 CN 103154251 A 8 7/12 页 9 0097 其中 0098 R1和 R2独立地选自烷。

35、基或烯基基团，其与其所连接的 -C( O)- 基团一起形成酰基基团例如棕榈酰基； 0099 Y 选自 -O-、 -NH-、 -S- 和 -O-CO-，尤其是 -NH- ；并且 0100 R3是适于掺入脂双层的聚合物部分，尤其是多肽或下列通式的聚 ( 乙二醇 )-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-X 0101 其中 0102 m 是选自 5 至 700 的整数，尤其是 100 至 500 的整数；并且 0103 X 选自 -O-R4、 -N(R4)2、 -S-R4和 -COOR4， 0104 其中 R4 选自 -H、 - 苯甲基、 C1-6烷基并且其中 -N(R4)2。

36、中两个残基 R4可以相同或不同。 0105 在另外的实施方案中，展示包含根据式 II 的二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物的病毒体颗粒： 0106 0107 其中 0108 -R1和 R2可以是相同或不同的，与它们所连接的 -OC- 部分一起，形成酰基部分； L 是选自 NH、 O、 S 或 OCO 的连接体部分； 0109 -R3是包含至少两个下式的聚亚烷基二醇单元的共价连接的轭合物部分： 0110 X1-(CHR4)x-On-(CHR4)y-， 0111 其可以是相同或不同的； 0112 其中 0113 -X1是氢或碳氢化合物，其可以包含一个或多个杂原子； 0114 -R4。

37、独立地为氢、 OH、 R5OR5或 CO-R6中的任一个； 0115 -R5独立地为氢或 C1-C6烷基中的任一个； 0116 -R6独立地是氢、 OH、 OR5或 NR7R8烷基中的任一个；说明书 CN 103154251 A 9 8/12 页 10 0117 -R7和 R8独立地是氢或碳氢化合物中的任一个，其可以包含一个或多个杂原 0118 子并且其可形成环； 0119 -n 是 1 至 100 的整数； 0120 -x 独立地是 1 至 10 的整数； 0121 -y 是 0 至 10 的整数。 0122 因此，在本发明的某些实施方案中，新的病毒体颗粒包含选自包含。

38、 MALP-2( 参见例如， WO 98/271 10 和 WO 2003/084568)、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸 ( 参见例如， WO 2004/009125)、 4-ARM- 二酰氧基丙基半胱氨酸 ( 特别地 BPP-Glyc-Cys-4-arm-PEG ；参见例如 WO 2007/059931) 以及其他的二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物的组的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物，尤其是MALP-2和S-2， 3-二(酰氧基)-(2R)-丙基-L-半胱酰基 - 羧基聚乙二醇，尤其是 S-2， 3- 二 ( 棕榈酰基氧基 )-(2R)- 丙基 -L- 半胱酰基 - 羧基。

39、聚乙二醇。 0123 0124 MALP-2 分子和其二酰氧基丙基半胱氨酸 (bisaxcyloxypropylcysteine) 轭合物例如二棕榈酰氧基丙基半胱氨酸 -PEG 分子已知代表巨噬细胞的强效刺激剂。MALP-2 作为佐剂的使用之前已经说明，参见例如 WO 98/27110 和 WO 2003/084568。二棕榈酰氧基丙基半胱氨酸 -PEG 分子作为佐剂的使用之前已经说明，参见例如 WO 2004/009125。特别地，证明了 MALP-2 分子和二酰氧基丙基半胱氨酸 -PEG 分子可作为有效的粘膜佐剂而起作用，增强粘膜免疫响应例如鼓励抗原 - 特异性 IgA 。

40、抗体的增强表达。而且，已经显示 MALP-2 可活化树突细胞和 B 细胞，这两者均在特异性体液免疫响应的诱导中起到重要作用。 0125 因此，在一个实施方案中，病毒体颗粒用于鼻内施用。 0126 术语 “植物甾醇” 是指植物来源的固醇。有一些证据证明植物甾醇可促进动脉粥样硬化，尤其是在易感个体中。因此，在另外的实施方案中，所述脂双层不含有植物甾醇。本发明的病毒体颗粒的脂双层尤其不含有油菜甾醇、谷甾醇和豆甾醇。 0127 术语 “动物甾醇” 是指动物来源的固醇，例如胆固醇。当需要建立适当的膜透性和流动性时，胆固醇是哺乳动物细胞膜的必要组分。因此，在另一个实施方案中。

41、，脂双层可包含至少一种动物甾醇例如胆固醇。 0128 如本文所用的，术语 “与所述病毒的宿主细胞质膜中发现的相同的质膜组成” 是指说明书 CN 103154251 A 10 9/12 页 11 不同界 ( 动物、植物、真菌、原生生物、古生细菌、细菌 ) 在其质膜组成上不同的事实。而且，存在蛋白功能以及某些表位的免疫识别可能受到特定脂双层组成的影响的指征，因为脂双层的物理性质 ( 即流动性、极性、透性、稳定性等 ) 很大程度上取决于它们的组成。因此，在某些实施方案中，本发明的病毒体颗粒的特殊的脂双层组成类似动物或人类脂双层的组成。在某些实施方案中，膜组成。

42、与天然流感病毒体的膜组成相似或者相同。 0129 如本文所用的，术语 “鞘脂” 是指来源于脂肪族氨基醇鞘氨基醇的一类脂质。这些化合物在信号传递和细胞识别上起到重要作用。植物来源的鞘脂是质膜、液泡膜和植物细胞其他内膜的主要成分。为了消除不期望的植物来源的鞘脂和宿主免疫系统之间的相互反应，在某些实施方案中脂双层包含非植物来源的鞘脂。 0130 发现某些复杂的哺乳动物糖鞘脂参与特定功能，例如细胞识别和发信号。所述发信号包括糖鞘脂的聚糖结构与相邻细胞上存在的相似的脂质或与蛋白之间特殊的相互反应。因此，在某些实施方案中，某些哺乳动物鞘脂可存在于本发明的病毒体颗粒中。 0131 一。

43、般认为其他的哺乳动物鞘脂通过形成机械上稳定并且化学上有抗性的质膜脂双层的外部小叶来保护细胞表面远离有害的环境因素。然而这样的 “保护性表面” 减少表位暴露于宿主免疫系统的机会，而所述暴露对于免疫原性来说是必需的。因此，在一些实施方案中，本发明的病毒体颗粒的脂双层根本不含有任何鞘脂。 0132 上文提及的本发明的病毒体颗粒的特征 ( 即含有二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物、不含有植物甾醇、含有一些动物甾醇、具有一定的膜组成和/或含有某些鞘脂)可由本领域技术人员根据手边情况、有待接种疫苗的疾病和有待使用的抗原来组合。也就是说，例如高免疫原性的抗原可单独在包含磷酸卵磷脂脂双层。

44、的病毒体颗粒中重建，而低免疫原性的抗原可与免疫原性增强物质例如二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物、动物甾醇或某些鞘脂一起重建。在大多数实施方案中，本发明的病毒体颗粒中不存在植物来源的材料，因此植物甾醇以及植物来源的鞘脂将被避免。 0133 在本发明的某些实施方案中，病毒体颗粒是合成生产的。 0134 因此，在特定的实施方案中，本发明涉及合成生产的病毒体颗粒，其包含 (i) 在烟草属植物中重组生产的流感血凝素 (HA) 抗原和 (ii) 脂双层，其中所述脂双层包含锚定在所述脂双层中的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。 0135 在某些实施方案中，病毒体颗粒还包含一种或多。

45、种另外的佐剂，包括但不限于脂多糖。 0136 在本发明的背景下，术语 “脂多糖” 或 (LPS) 是指已知为脂聚糖的分子，其是由通过共价键结合的脂质和多糖组成的大分子；已发现它们位于革兰氏阴性菌的外膜中，作为内毒素起作用并在动物中引起强烈的免疫响应。因此，在一些实施方案中，脂双层病毒体颗粒可含有作为另外的免疫增强剂的 LPS。 0137 LPS，如本发明所展示的，包含三个部分： 0138 1.O 抗原 ( 或 O 多糖 ) 0139 2. 核心寡糖 0140 3. 脂质 A 0141 脂质 A 通常是由多个脂肪酸修饰的磷酸化的葡糖胺双糖。这些疏水性脂肪酸链将 L。

46、PS 锚定在细菌膜中而其余的 LPS 从细胞表面突出。脂质 A 结构域是造成许多革兰氏阴性说明书 CN 103154251 A 11 10/12 页 12 菌的毒性的原因。当细菌细胞通过免疫系统溶解时，含有质膜 A 的膜的片段释放至循环中，引起发烧、腹泻和可能的婴儿内毒素性休克 ( 也称为感染性休克 )。 0142 核心寡糖直接与脂质 A 连接并且通常含有糖类例如庚糖和 3- 脱氧 -D- 甘露醇辛酮糖酸 ( 也称为 KDO，酮基 - 脱氧辛酮糖酸 )。 0143 当 LPS 含有重复的聚糖聚合物时，其被称为细菌的 O 抗原、 O 聚糖或 O 链。O 抗原与核心寡糖连接并且。

47、包括 LPS 分子的最外部的结构域。株系与株系之间 O 链的组成不同，例如有由不同大肠杆菌菌株生产的超过 160 种不同 O 抗原结构。O 抗原被暴露在细菌细胞非常外部的表面并且因此是宿主抗体识别的靶。 0144 在本发明的另外的方面，本发明涉及含有根据本发明的病毒体颗粒的疫苗，任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。 0145 本发明的病毒体颗粒可被用作有效疫苗 ( 例如流感病毒 ) 中强力活性成分，其将所期望的抗原 ( 例如 HA 蛋白 ) 主动运输至例如巨噬细胞、 DC、 B 细胞， APS 将适当地将所述抗原加工并且呈现给免疫系统，以便诱导有力并且保护性的免疫响应。

48、。 0146 在特定的实施方案中，疫苗于适合的药学上可接受的物质佐剂组合。 0147 在某些其他这样的实施方案中，适合的药学上可接受的物质佐剂被共同配制在病毒体颗粒中。 0148 在某些这样的实施方案中，适合的药学上可接受的物质佐剂被加至病毒体颗粒。 0149 如本文所用的，术语 “物质佐剂” 意指共同配制至和 / 或在免疫接种中加至活性抗原的物质，即引起所期望的免疫响应以便增强或引出或调解抗活性抗原的体液和 / 或细胞介导的 ( 细胞的 ) 免疫响应。特别地，根据本发明的佐剂也可以增强或引出先天免疫响应。 0150 为了进一步增强新病毒体颗粒的免疫原性，可使用大范围的传统佐剂。最有力的方法(例如与弗氏完全佐剂一起施用免疫原)将下列章节中所阐述的许多不同原则进行组合： 0151 (A) 化学免疫强化 0152 长期的研究是寻找模拟如同可用失效的结核分支杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 或有毒的微生物提取物例如大肠杆菌 (E.coli)LPS 所获得的完整免疫响应的增强作用的纯的、安全、有效、无毒的小的有机分子的基础。 0153 (B) 与白介素共施用 0154 有一些将例如 IL-2 与抗原共施用可导致比单独施用抗原和白介素更大。

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