《一种LACTOBACILLUSCASEIZHANG（CGMCC1697）的检测方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种LACTOBACILLUSCASEIZHANG（CGMCC1697）的检测方法.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102978290 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978290 A *CN102978290A* (21)申请号 201210559154.5 (22)申请日 2012.12.21 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (71)申请人 内蒙古农业大学 地址 010018 内蒙古自治区呼和浩特市昭乌 达路 306 号 (72)发明人 张和平 张家超 陈永福 (74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人。
2、 向华 (54) 发明名称 一 种 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 的检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于检测 Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697） 的检测方法的设计， 应 用该方法可以对样品中的 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 进行检测， 可准确， 快速的完 成发酵乳制品， 发酵食品以及人体肠道中益生菌 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 定性 和定量测定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 。
3、序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种定性定量检测 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的方法， 包括如下步骤 ：（1） 从检测 样品中提取 DNA, 制备用于进一步扩增的模板 DNA ；（2） PCR 扩增， 以 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的全基因组序列为依据， 设计如下引物序列 ： LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact， 利用设计。
4、的引物通过 PCR 扩增模板 DNA ；（3） 通过琼脂糖凝胶电泳 来检测 PCR 扩增产物， 定性检测样品中的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ；（4） 通过 q-PCR 检 测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量。 2. 权利要求 1 所述的一种定性定量检测 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的方法， 其特征 在于， 包括如下步骤 ： （1） 从检测样品中提取 DNA, 制备用于进一步扩增的模板 DNA 采用液氮冻融-CTAB法 ： 取1.0g样品洗涤处理， 将洗脱的菌体于1.5mL离心管中， 立即 置于液氮中完全冻结，。
5、 取出后放入 65水浴中融化 5min， 反复冻融 3 次， 加 0.1mL 10%SDS 和 10.0L 10mg/mL 蛋白酶 K， 于 37恒温摇床中 200r/min 摇动 2h， 室温下 12000g 离心 10min， 收集上清液转移至另一离心管中， 上清液与等体积的氯仿于 12000g 离心 10min， 吸 取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提 2 次， 经 0.1 倍体积的醋酸钠， 1 倍体积的冰 异丙醇沉淀总 DNA， 然后 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 回溶备用 ； （2） PCR 扩增 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的特异性片段 扩增引物具体。
6、序列为 ； LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact; 扩增体系 ： 反 应 体 系 50L ： 10PCR Buffer 5L， 25mmo1/L Mg2+ 1.0L， 2.5mmol/L dNTPs 4L， 5mmol/L 上下游引物各 2L， DNA 模板 100ng 左右， 5U/L Taq 酶 0.5uL， dd H2O 补足 至 50L ； 扩增条件 ： 95变性 5min ； 循环 30 次 ： 95变性 1min， 65退火 45s， 72延伸 1min， 然后 72延 伸 7min， 4保存。 （3） 琼脂。
7、糖凝胶电泳对 PCR 扩增产物进行检测 将 PCR 产物于 1% 琼脂糖凝胶中以 5V/cm 的电压， 电泳 20-30min， EB 染色， 紫外拍照， 检 测扩增效果 ； 其中设置以含有目的扩增片段的质粒 DNA 作为模板的阳性对照， 以灭菌水作 为模板的阴性对照， 根据在 336bp 处是否出现预期性特征条带， 定性确定样品中是否含有 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ； （4） Q-PCR 检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量 首先应用已知数量的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 通过 Q-PCR 扩增制作标准曲线，。
8、 然 后以标准曲线为依据， 用上述特异性引物定量检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的 数量 ； Q-PCR 扩增体系 ： 反应体系 20L ： 10PCR mix 10L， 10mmol/L 上下游引物各 0.4L， DNA 模板 100ng 左右， dd H2O 补足至 20L ； Q-PCR 扩增条件 ： 95变性 20s ； 循环 40 次 ： 95变性 5s， 65退火 30s， 72延伸 35s。 权 利 要 求 书 CN 102978290 A 2 2/2 页 3 3. 权利要求 1 或 2 所述的一种定性定量检测 L.casei Zhang （CGM。
9、CC 1697） 的方法， 其 特征在于检测样品是发酵的酸奶样品， 或服用 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 发酵酸奶样品的志愿者粪便。 4. 一种用于权利要求 1 所述的检测方法的特异性引物， 引物序列如下 ： LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。 权 利 要 求 书 CN 102978290 A 3 1/8 页 4 一种 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 的检测方 法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于检测 Lactobacil。
10、lus casei Zhang （CGMCC 1697） 的检测方法 的设计， 应用该方法可以对肠道中的 Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697） 进行检测， 可准确， 快速的完成发酵乳制品， 发酵食品以及人体肠道中益生菌 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 定性和定量测定。 技术背景 0002 Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697） 是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源 库保藏的243株分离自自然发酵酸马奶中的乳杆菌中优选的1株具有优良益生特性的乳杆 菌。 该菌株在消化系统中具有优异。
11、的耐受胃酸、 胆盐和牛磺胆酸钠水解能力。 其具有乳杆菌 共同的特性， 即为革兰氏阳性、 过氧化氢酶试验阴性、 硝酸盐还原试验阴性、 不液化明胶、 无 运动性、 能在 pH4.5 的 BLB 液体培养基中生长发育。L.casei Zhang （CGMCC 1697） 属同型乳 酸发酵乳杆菌， 葡萄糖发酵不产气， 经EMP途径只产生乳酸， 且产生L-乳酸。 能够利用核糖、 葡萄糖、 甘露糖、 甘露醇、 果糖、 半乳糖、 蔗糖、 麦芽糖、 蕈糖、 山梨醇以及七叶苷、 水杨苷和甘 露醇产酸， 而不从阿拉伯糖、 木糖、 蜜二糖、 棉子糖产酸， 不代谢乳糖或弱发酵乳糖， 不发酵 鼠李糖。 Lactobac。
12、illus casei Zhang （CGMCC 1697） 菌株已经在申请号为200610127362.2、 200710129939.8 的中国专利申请中公开， 在此将上述专利文献公开的全部内容引入作为参 考。 0003 进一步经 16S rDNA 序列分析， 表明 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 与 L.casei 标 准菌株 ATCC 334 的同源性为 100%。 0004 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 具有较强的抗人工胃液消化能力， 在 pH 值为 3.0 和 pH 值为 4.0 的人工胃液中持续消化 3h 后其活菌数量不受影响， 人工胃。
13、液消化后进入人工 肠液消化 24h 后， 仍保持较高数量的活菌。L.casei Zhang（CGMCC 1697） 对胆盐具有极强 的耐受性， 能够耐受介质中胆盐的最大浓度为 1.6g/100mL。L.casei Zhang（CGMCC 1697） 在生长过程中可以分解培养介质中的牛磺胆酸钠释放出游离胆酸， 对介质中胆固醇的脱除 量为 74.41mg/L， 胆固醇降低率为 49.61%。用 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 饲喂高脂血症 模型大鼠， 可显著降低血清总胆固醇 (TC)、 甘油三酯 (TG) 和 LDL-C 浓度， HDL-C 浓度显著升 高。研究表明 L.cas。
14、ei Zhang（CGMCC 1697） 通过菌体对胆固醇的吸收吸附及减少肝肠循 环中的胆酸来达到降血脂的功效。 0005 给小鼠灌服 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ， L.casei Zhang（CGMCC 1697） 菌株能 够在小鼠肠道内定殖， 并对病原菌具有拮抗作用。小鼠灌服 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 可以显著增加小鼠血清中 IgG 含量和肠粘膜 SIgA 含量， 可以显著提高小鼠外周血中 CD3+、 CD4+、 CD8+ 的比例， 优化了 CD4+/CD8+ 比值 , 显著上调血清中 IFN- 和 IL-12 含量， 下调 IL-1 和。
15、 TNF- 水平。这些结果说明了 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 对小鼠的细胞免 疫、 体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。 动物实验表明L.casei Zhang （CGMCC 1697） 说 明 书 CN 102978290 A 4 2/8 页 5 具有显著抑制肝癌细胞 H22 细胞株具有显著的抑制作用。 0006 2007 年， 通过代谢调控的手段， 完成了益生乳酸菌 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 高密度发酵的小试和中试。 200L发酵罐9次发酵发酵液中菌体密度平均可达2.91010cfu/ ml， 发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌。
16、数 2.651011cfu/g 的菌粉， 能够满 足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求， 已达到国际水平。 0007 为进一步研究 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 在高密度发酵过程 中的生长和代 谢机制， 采用荧光定量 PCR（quantitative PCR， q-PCR) 技术研究了发酵过程中一些关键 基因的表达变化。分别于不同生长阶段和不同发酵条件下采集 25 组样品提取 RNA， 对涉及 糖代谢和酸耐受能力的 16 个关键酶基因进行 real-time PCR 实验分析， 包括葡萄糖激酶 (gk)， - 葡萄糖苷 PTS E II(pts)， 磷酸 - 丝氨酸结合蛋。
17、白磷酸化酶 (psh-p)， 代谢调节 蛋白 CcpA(ccpa)， 磷酸果糖激酶 (pfk)， 果糖二磷酸醛缩酶 (pba)， 磷酸甘油酸激酶 (pgk)， 烯醇化酶 (enolase)， 丙酮酸激酶 (pk)， 乳酸脱氢酶 (ldh)， NAD 依赖型醇脱氢酶 (nad)、 F1F0-ATPase(atp)， Malolactic enzyme(mal)， citrate lyase(cit) ； 大分子修复蛋白基 因 ： Groel， dnak。这些关键酶基因在发酵过程中的表达变化情况的研究为后续从分子水平 深入研究乳酸菌的生长代谢调控机制奠定了良好的基础。 同时也为乳酸菌高密度发酵剂的。
18、 开发奠定了理论基础。 0008 10 年前， 当人类基因组计划顺利完成时， 整个科学界都为之轰动“生命密码” 已经被破译， 人类对自己的认识将愈发深刻。当科学家以为人类所有问题都将迎刃而解的 时候， 更多的事实却悄悄的指向了一个被我们忽视的领域肠道菌群。正常的人体内存 在大量的共生菌群， 这些细菌大部分寄生在人的肠道中， 超过 1000 万亿个， 是人体细胞总 数的 10 倍， 其微生物基因数量约为 300 万个， 大约是人类基因组基因数量的 100 多倍， 如 此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境， 同时形成了与人体密不可分的互惠共生关 系。经研究发现， 肠道菌群的组成影响着每个人的健。
19、康， 如肠道菌群结构紊乱与糖尿病、 肥 胖症、 高血压等代谢类疾病有关。同时也发现不同的人具有不同的肠道菌群组成结构， 饮 食、 药物以及环境因素可以影响个体肠道菌群的组成。同样， 不同肠道微生物结构和组成， 也影响着宿主的营养物质加工、 能量平衡、 免疫功能、 胃肠道发育及其他多种重要的生理活 动。 0009 但是随着研究的深入， 服用益生菌后， 益生菌在体内的定植研究成为难点， 怎样锚 定目的菌种， 怎样对目的菌种进行定量研究从而确定其体内定植数量是学者一直探索的问 题。传统肠道菌群的研究是建立在纯培养技术之上的， 但这些方法耗时费力， 操作复杂， 而 且受到培养条件约束， 并不能全面客观。
20、的反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的飞 速发展为肠道菌群研的究提供了全新的方法和思维， 特别是荧光定量 PCR 技术 （Q-PCR） ， 提 供了基于非培养的微生物定性定量研究技术。 0010 本发明以 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的全基因组序列中一段特异性片段为依 据， 设计了针对该菌株的特异性引物， 使用该引物对目的菌株进行 PCR 扩增和 Q-PCR 定量， 可以快速准确的完成 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的定性定量研究。 0011 采用本发明的PCR和Q-PCR方法， 能够对检测样品， 例如包含益生菌的乳制品或食 物、 人体的消化道。
21、排泄物中所包含的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 进行准确的定性和定量 研究。对 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的定性定量检测， 意义重大。益生菌 L.casei Zhang 说 明 书 CN 102978290 A 5 3/8 页 6 （CGMCC 1697） 后续将应用于新型益生发酵乳制品以及益生菌饮品的生产， 应用该技术可以 快速精确的定性定量检测出上述食品中该益生菌的数量， 为工业生产以及后续产品质量的 检测提供重要保证和技术指导。此外， 只有在对 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 进行准确定 量的基础上， 才能够更有针对性。
22、地深入了解适宜 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 体内定植的 条件， 从而更进一步地开发出具有相对更为优良的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 体内定植 率的产品， 更好地发挥 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的作用。 发明内容 0012 本发明的目的是提供一种快速定性定量测定 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的方 法。 0013 本发明以 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的全基因组序列中一段特异性片段为依 据， 设计了针对该菌株的特异性引物， 使用该引物对目的菌株进行 PCR 扩增分析和荧光定 。
23、量 PCR(Q-PCR 定量 ) 分析， 可以快速准确的完成 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的定性定量 研究， 特别是发酵乳制品， 发酵食品以及人体肠道中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的定性 定量测定。 0014 本发明的定性定量检测 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 方法主要包括如下步骤 ： （1） 从检测样品中提取 DNA, 制备用于进一步扩增的模板 DNA， 其中提取 DNA 的方法和常 用试剂是本领域技术人员公知的， 例如可采用 CTAB 法等来提取获得模板 DNA。 （2） PCR 扩 增。以 L.casei Zhang。
24、（CGMCC 1697）的全基因组序列为依据， 设计如下引物序列 ： LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。利用设计的引物通过 PCR 扩增 步骤 1 中提取得到的模板 DNA。 （3） 通过琼脂糖凝胶电泳来检测 PCR 扩增产物， 定性检测样 品中的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 。 （4） 通过荧光定量 PCR 检测样品中 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的数量。荧光定量 PCR 包括应用已知数量的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 进行 Q-PCR 扩增。
25、制作标准曲线， 然后以标准曲线为依据， 用上述特异性引物通过荧光定量 PCR 检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量。 0015 本发明的定性定量检测 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的方法可用于检测发酵乳 制品或粪便样品中的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ， 具体检测步骤如下 ： 0016 1. 发酵乳制品 （或者粪便） 样品中宏基因组 DNA 的提取 ： 0017 采用液氮冻融-CTAB法 ： 取1.0g样品洗涤处理， 将洗脱的菌体于1.5mL离心管中， 立即置于液氮中完全冻结， 取出后放入 65水浴中融化 （约 5。
26、min） ， 反复冻融 3 次， 加 0.1mL 10%SDS和10.0L 10mg/mL蛋白酶K， 于37恒温摇床中200r/min摇动2h， 室温下12000g 离心10min， 收集上清液转移至另一离心管中。 上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min （为了使沉淀、 水相和有机相分层） ， 吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提 2 次， 经 0.1 倍体积的醋酸钠， 1 倍体积的冰异丙醇沉淀总 DNA， 然后 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 回溶 备用。 0018 2.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 特异性引物特异性的测定 0019 以 L.casei 。
27、Zhang（CGMCC 1697）的全基因组序列为依据， 设计如下引物序列 LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。 在 设 计 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 特异性引物后， 我们对该引物的特异性进行了验证， 挑选了再分类学地位上 说 明 书 CN 102978290 A 6 4/8 页 7 与 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 同源性较高的已知菌种， 如 ： Bacteroides fragilis JCM 11019T,Bifidobacterium animalis DSM 。
28、10140,B.breve ATCC 15700T,B.Longum ATCC 15697,Clostridium coccoides JCM 1395T,Enterococcus faecalis ATCC 19433T,E. faecium ATCC 19434T,Escherichia coli JCM 1649T Lactobacillus acidophilus ATCC 4356T,L.brevis ATCC 14869T,L.buchneri ATCC 4005T,L.crispatus JCM 1185T,L. fermentum ATCC 14931T,L.gallinaru。
29、m JCM 2011T,L.gasseri DSM 20243T,L.johnsonii JCM 2012T,L.plantarum ATCC 14917T,L.reuteri JCM 1112T,L.rhamnosus ATCC 7469T， L.casei ATCC 393T进行了扩增对比分析。扩增结果表明， 该引物只能扩增出 L.casei Zhang （CGMCC 1697） ， 不能扩增出上述同源性较高的对比菌株， 该对比扩增实验表明所设计 的引物特异性良好。 0020 3.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 特异性引物灵敏度检测 0021 应用设计的 L.casei。
30、 Zhang（CGMCC 1697）特异性引物对已知数量的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 进行定量扩增， 扩增结果显示， 当 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数 量在 4.5 Log10 CFU 到 9.5 Log10 CFU 时， 该菌株定量结果线性关系良好并可以被准确定 量， 所述引物检测的灵敏度比较高。 0022 4.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的特异性片段的扩增 0023 扩增引物 ： 以 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的全基因组序列为依据， 采用本实验 室自主设计的上述引物进行特异性片段的扩增，。
31、 该引物序列及扩增片段的具体信息见图1。 0024 扩增体系 ： 0025 反应体系50L ： 10PCR Buffer 5L， 25mmo1/L Mg2+ 1.0L， 2.5mmol/L dNTPs 4L， 5mmol/L 上下游引物各 2L， DNA 模板 100ng 左右， 5U/L Taq 酶 (Promega)0.5uL， dd H2O 补足至 50L。 0026 扩增条件 ： 0027 95变性 5min ； 循环 30 次 ： 95变性 1min， 65退火 45s， 72延伸 1min， 然后 72延伸 7min， 4保存。 0028 5. 琼脂糖凝胶电泳检测 0029 将 P。
32、CR 产物于 1% 琼脂糖凝胶中以 5V/cm 的电压， 电泳 20-30min， EB 染色， 紫外拍 照， 检测扩增效果 ； 其中设置以含有目的扩增片段的质粒 DNA 作为模板的阳性对照， 以灭菌 水作为模板的阴性对照， 根据在 336bp 处是否出现预期性特征条带， 定性确定样品中是否 含有 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 。 0030 6. 采用荧光定量 PCR 检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量 0031 首先应用已知数量的 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 通过荧光定量 PCR 扩增制作标 准曲线， 然后以。
33、标准曲线为依据， 用上述特异性引物定量检测样品中 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 的数量。 0032 Q-PCR 扩增体系 ： 0033 反应体系 20L ： 10PCR mix 10L， 10mmol/L 上下游引物各 0.4L， DNA 模板 100ng 左右， dd H2O 补足至 20L。 0034 Q-PCR 扩增条件 ： 0035 95变性 20s ； 循环 40 次 ： 95变性 5s， 65退火 30s， 72延伸 35s。 说 明 书 CN 102978290 A 7 5/8 页 8 0036 本发明的有益效果是， 可以在不进行 Lactobacillu。
34、s casei Zhang（CGMCC 1697） 菌培养的基础上， 简便、 快速、 准确地定性定量检测样品中 Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697） 菌， 所述方法检测特异性高， 能够区分 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 菌和同源性较高的其他菌株， 检测的灵敏度高， 能够对样品中包含的微量菌株进行检 测。 附图说明 0037 图 1 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 株特异性引物和扩增的目的基 因信息 ； 0038 图 2 人粪便样品和发酵乳制品样品中宏基因组 DNA 。
35、电泳图 ； 0039 样品 1 ： 发酵乳制品样品， 样品 2 ： 粪便样品 2， M ： -DNA/HindIII Markers 0040 图 3 4 个样品中 Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697） 的特异性扩增条带 ； 0041 条带 1 为样品 1 发酵乳制品样品， 条带 2 为阳性对照， 条带 3 为阴性对照， 条带 4 为样品 2 粪便样品 0042 图 4 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 的 Q-PCR 扩增标准曲线， 样品在 标准曲线上所处的位置。 具体实施方式 0043 下面结合附图和实施例对。
36、本发明作进一步描述， 以下实施例仅具有说明性， 本发 明并不受这些实施例的限制。 0044 1. 发酵乳制品 （或者粪便） 样品中宏基因组 DNA 的提取 ： 0045 采用液氮冻融-CTAB法 ： 取1.0g样品洗涤处理， 将洗脱的菌体于1.5mL离心管中， 立即置于液氮中完全冻结， 取出后放入65 水浴中融化 （约5min） ， 反复冻融3次， 加0.1mL 10%SDS和10.0L 10mg/mL蛋白酶K， 于37恒温摇床中200r/min摇动2h， 室温下12000g 离心10min， 收集上清液转移至另一离心管中。 上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min （为了使沉淀、 水。
37、相和有机相分层） ， 吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提 2 次， 经 0.1 倍体积的醋酸钠， 1 倍体积的冰异丙醇沉淀总 DNA， 然后 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 回溶 备用。 0046 2.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 特异性引物特异性检测 0047 以 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的全基因组序列为依据， 设计如下引物序列 LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。在设计 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 特异性引物后我们对该引物的特异性进行。
38、了验证。验证方法为 ： 挑选再分类学地位 上与 L.casei Zhang（CGMCC 1697）同源性较高的已知菌种， 如 ： Bacteroides fragilis JCM 11019T,Bifidobacterium animalis DSM 10140,B.breve ATCC 15700T,B.Longum ATCC 15697,Clostridium coccoides JCM 1395T,Enterococcus faecalis ATCC 19433T,E. faecium ATCC 19434T,Escherichia coli JCM 1649T Lactobacillu。
39、s acidophilus ATCC 4356T,L.brevis ATCC 14869T,L.buchneri ATCC 4005T,L.crispatus JCM 1185T,L. fermentum ATCC 14931T,L.gallinarum JCM 2011T,L.gasseri DSM 20243T,L.johnsonii JCM 2012T,L.plantarum ATCC 14917T,L.reuteri JCM 1112T,L.rhamnosus ATCC 7469T， 说 明 书 CN 102978290 A 8 6/8 页 9 L.casei ATCC 393T， 利。
40、用所设计的引物通过 PCR 分别扩增检测 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 菌株和上述对比菌株， 扩增检测结果表明， 该引物只能扩增出 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ， 不能扩增出其他菌株， 所以该引物特异性良好。 0048 3.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 特异性引物灵敏度检测 0049 应用所设计的上述针对 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的特异性 引物对已知数量 的 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 进行定量扩增， 扩增结果显示， 当 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的。
41、数量在4.5 Log10 CFU到9.5 Log10 CFU时， 该菌株定量结果线性关系良好并可以 被准确定量。 0050 4.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的特异性片段的扩增 0051 扩增引物 ： 以 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的全基因组序列为依据， 采用本实验 室自主设计的引物前序列， 该引物序列及扩增片段的具体信息见图1。 引物具体序列为 ： LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。 0052 扩增体系 ： 0053 反应体系50L ： 10PCR Buffer 5L。
42、， 25mmo1/L Mg2+ 1.0L， 2.5mmol/L dNTPs 4L， 5mmol/L 上下游引物各 2L， DNA 模板 100ng 左右， 5U/L Taq 酶 (Promega)0.5uL， dd H2O 补足至 50L。 0054 扩增条件 ： 0055 95变性 5min ； 循环 30 次 ： 95变性 1min， 65退火 45s， 72延伸 1min， 然后 72延伸 7min， 4保存。 0056 5. 琼脂糖凝胶电泳 0057 将 PCR 产物于 1% 琼脂糖凝胶中以 5V/cm 的电压， 电泳 20-30min， EB 染色， 紫外拍 照， 检测扩增效果。其中。
43、设置以含有目的扩增片段的质粒 DNA 作为模板的阳性对照， 以灭菌 水作为模板的阴性对照， 根据在 336bp 处是否出现预期性特征条带， 确定样品中是否含有 L.casei Zhang（CGMCC 1697） ； 0058 6.Q-PCR 检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量 0059 首先应用已知数量的 L.casei Zhang（CGMCC 1697）通过 Q-PCR 扩增制作标准 曲线， 然后以标准曲线为依据， 用上述特异性引物定量检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量。 0060 Q-PCR 扩增体系 ： 0061 反。
44、应体系 20L ： 10PCR mix 10L， 10mmol/L 上下游引物各 0.4L， DNA 模板 100ng 左右， dd H2O 补足至 20L。 0062 Q-PCR 扩增条件 ： 0063 95变性 20s ； 循环 40 次 ： 95变性 5s， 65退火 30s， 72延伸 35s。 0064 应用实施例 1 ： L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的定性检测 （注） 0065 1. 发酵乳制品 （或者粪便） 样品中宏基因组 DNA 的提取 ： 0066 采集 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 发酵的酸奶样品作为样品。
45、 1， 采 集服用 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 发酵酸奶样品的志愿者粪便作为样品 2。 采用液氮冻融-CTAB法 ： 取1.0g样品洗涤处理， 将洗脱的菌体于1.5mL离心管中， 立即置 于液氮中完全冻结， 取出后放入65水浴中融化 （约5min） ， 反复冻融3次， 加0.1mL 10%SDS 说 明 书 CN 102978290 A 9 7/8 页 10 和 10.0L 10mg/mL 蛋白酶 K， 于 37恒温摇床中 200r/min 摇动 2h， 室温下 10303g 离心 10min， 收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿。
46、于 10303g 离心 10min （为 了使沉淀、 水相和有机相分层） ， 吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提 2 次， 经 0.1 倍体积的醋酸钠， 1 倍体积的冰异丙醇沉淀总 DNA， 然后 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次， 回溶备 用。将提取的基因组 DNA 的一部分进行电泳， 电泳图见图 2。图 2 中泳道 1 为发酵乳制品样 品， 泳道 2 为粪便样品 2， 电泳条带清晰。 0067 2.L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的特异性片段的 PCR 扩增 0068 扩增体系 ： 0069 反应体系50L ： 10PCR Buffer 5L， 25mmo1/L M。
47、g2+ 1.0L， 2.5mmol/L dNTPs 4L， 5mmol/L 上下游引物各 2L， DNA 模板 100ng 左右， 5U/L Taq 酶 (Promega)0.5uL， dd H2O 补足至 50L。 0070 扩增条件 ： 0071 95变性 5min ； 循环 30 次 ： 95变性 1min， 65退火 45s， 72延伸 1min， 然后 72延伸 7min， 4保存。 0072 扩增引物序列为 ： LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ； LcZ R:ccgacgtaccagctcact。 0073 3. 琼脂糖凝胶电泳 0074 将 PCR 产物。
48、于 1% 琼脂糖凝胶中以 5V/cm 的电压， 电泳 20-30min， EB 染色， 紫外拍 照， 检测扩增效果。其中设置以含有目的扩增片段的质粒 DNA 作为模板的阳性对照， 以灭菌 水作为模板的阴性对照， 根据在 336bp 处是否出现预期性特征条带， 确定样品中是否含有 L.casei Zhang （CGMCC 1697） 。扩增效果见图 3。样品 1 为检测的未知样品， 样品 2 为含有 目的扩增片段的质粒DNA作为模板的阳性对照， 样品3为以灭菌水作为模板的阴性对照， 样 品 4 为检测的未知样品。从图中可以看出， 阳性对照可以扩增出条带清晰明亮的目的条带， 而阴性对照无相应扩增产。
49、物。样品 1 和样品 2 均扩增出与阳性对照大小相同的目的片段， 但是我们可以看出， 样品 1 的扩增条带较样品 2 明显清晰明亮。由此可以推断样品 1 中含 有的 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697） 菌数要多于样品 2。 0075 应用实施例 2 ： L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的定量检测 0076 通过 Q-PCR 检测样品中 L.casei Zhang（CGMCC 1697） 的数量。 0077 1. 发酵乳制品 （或者粪便） 样品中宏基因组 DNA 的提取 ： 0078 采集本实验室用 Lactobacillus casei Zhang（CGMCC 1697。