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1、(10)申请公布号 CN 102978136 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978136 A *CN102978136A* (21)申请号 201210475050.6 (22)申请日 2012.11.21 CCTCC NO:M2012336 2012.09.07 C12N 1/20(2006.01) A01G 1/00(2006.01) C12R 1/41(2006.01) (71)申请人 中盈长江国际新能源投资有限公司 地址 430223 湖北省武汉市东湖新技术开发 区江夏大道特一号 (72)发明人 李江川 李万里 张继泰 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利。
2、代理有限 公司 42102 代理人 乔宇 (54) 发明名称 中慢生根瘤菌 KDRM024 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一个从刺槐根瘤中分离的、 有ACC 脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤 菌 KDRM024 及其应用。该中慢生根瘤菌 KDRM024 菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编 号为 CCTCCNO ： M2012336。本发明所述的中慢生 根瘤菌 KDRM024 有 ACC 脱氨酶， 能将 ACC 分解成 -酮丁酸和NH3， 降低植物细胞合成乙烯的水平， 减轻乙烯对根瘤菌侵染的抑制作用， 提高根瘤菌 与刺槐的结瘤率和共生固氮的水平， 为刺槐在不 施肥的贫瘠。
3、荒地上生长提供高水平的氮素， 促进 刺槐苗生长， 增加刺槐成材的生物量， 从而用低成 本的接种投入让刺槐成材高产， 在刺槐育苗造林 上发挥作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 中慢生根瘤菌 KDRM024， 其特征在于 ： 它已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编 号为 CCTCC NO ： M 2012336。 2. 根据权利要求 1 所述的中慢生根瘤菌 KDRM。
4、024 在刺槐育苗造林中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102978136 A 2 1/6 页 3 中慢生根瘤菌 KDRM024 及其应用 技术领域 0001 本发明属于应用微生物学领域， 具体涉及一个从刺槐根瘤中分离的、 有 ACC 脱氨 酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌 KDRM024 及其应用。该菌株已保藏于中国 典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 保藏号为 CCTCC NO ： M 2012336， 菌株名为中慢生根瘤菌 KDRM024。 背景技术 0002 自然界中有些原核微生物能合成固氮酶， 在常温常压下， 将空气中的 N2还原成 NH3。由固氮微生物固定的氮素约占。
5、地表化合态氮的 65% 70， 其中以根瘤菌与豆科植 物共生体系固氮能力最强， 占生物固氮量的 65% 以上。 0003 利用根瘤菌与豆科植物共生固氮提高土壤肥力和农作物产量是世界农业的经典 经验。如用豆科植物作绿肥， 让豆科与非豆科作物轮作、 间作和套作。通过接种根瘤菌提高 豆科作物的共生固氮效率和产量及土壤肥力已有 100 多年历史， 广泛为各农业大国所用， 是当今发展可持续农业的重要措施之一。 20世纪80年代以来， 我国粮食作物的种植面积不 断扩大， 豆科作物和豆科绿肥的种植面积不断减少， 化肥尤其是氮肥用量不断增加。 由于高 水平化合态氮阻遏根瘤菌结瘤固氮， 接种根瘤菌的结瘤固氮效应。
6、在施用大量氮肥的农田里 急剧下降， 根瘤菌接种事业的发展随之被遏制。进入 21 世纪， 中国实施西部大开发战略和 退耕还林还草工程， 为扩大豆科树种、 牧草的种植面积和加强与之相匹配的根瘤菌接种技 术应用提供了契机。 0004 刺槐 （Robinia pseudoacacia L.） 又称洋槐， 是落叶乔木， 高 10 25 米， 木质 坚硬， 有弹性， 抗磨损， 是良好矿柱、 枕木、 建筑用材。刺槐原产美国东部， 引种入欧洲后， 于 十九世纪末再从欧洲引入中国。刺槐生长快， 分布越来越广， 一方面得益于刺槐适应性强， 能在酸性土、 中性土和含盐量 0.3以下的盐碱土中生长， 有一定的耐旱能力。
7、 ； 另一方面刺 槐是豆科植物， 可以与根瘤菌共生固氮而获取生长所必需的氮素， 从而适于在贫瘠的土地 生长。种植刺槐的生态效应， 如保持水土、 改良土壤等， 也非常显著。因此， 刺槐成为全世界 最重要的速生造林先锋树种之一， 也是我国退耕还林工程的先锋树种。 0005 随着全球石油、 煤炭和天然气等矿物能源的日益枯竭， 开发利用可再生的生物质 能源以取代矿物能源越来越为世界各国政府所关注。 目前， 中国经济快速增长， 矿物能源消 耗量急剧增长， 能源短缺问题十分突出， 生物质能源等可再生能源的开发和利用已成为实 现可持续发展的关键。生物质能源的开发和利用的基点在于原料生产， 原料成本占总成本 。
8、的 60% 80%， 原料成本决定产品的市场竞争力和利润。 0006 林木是生物质能源的重要原料。刺槐凭借其热值高， 生长速度快和耐瘠抗逆等特 点， 成为重要的生物质能源树种。在贫瘠荒地上， 用少施肥、 低成本的投入产出高的成材生 物量是目前我国刺槐能源林生产的瓶颈问题。用高效结瘤固氮的根瘤菌接种刺槐苗， 通过 共生固氮使树苗在贫瘠的土地上获得氮素成材， 可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。 目前， 一方面， 在技术上， 现代刺槐造林通过大规模苗圃育苗提高造林效率， 为刺槐苗人工 说 明 书 CN 102978136 A 3 2/6 页 4 接种根瘤菌创造了便利条件。 另一方面， 限于技术和管。
9、理上的制约， 我国的大规模造林还没 有向林业发达国家那样实施以氮素为主的大规模施肥 , 但不施肥反而为刺槐与根瘤菌的 共生固氮创造了没有氮阻遏的条件， 有利于提高共生固氮的效率。 0007 刺槐适应贫瘠土壤能力强的一个因素是它能与多个属种的遗传多样的根瘤菌共 生固氮。 已发现能与刺槐结瘤的主要是中慢生根瘤菌属 （Mesorhizobium） 的根瘤菌， 还有中 华根瘤菌属 （Sinorhizobium） 、 根瘤菌属 （Rhizobium） 和慢生根瘤菌属 （Bradyrhizobium） 等属的根瘤菌。根瘤菌与刺槐结瘤固氮的能力高低不一， 利用接种根瘤菌促进刺槐生长需 要选择高效的根瘤菌菌株。
10、。通常筛选优良根瘤菌菌株是通过从多个大且饱满的刺槐根瘤 中分离多个根瘤菌菌株， 逐一接种刺槐苗， 培养 2 个月或更长时间后， 检测刺槐苗根部的结 瘤数和苗的生物量 ； 而要从数量较多的菌株中筛选出高效结瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰运 气， 筛选过程费时费力。 0008 根瘤菌侵染豆科植物的根会引发植物产生植物激素乙烯及合成乙烯的前体 1- 氨基环丙烷 -1 羧酸 （ACC） ， 而乙烯会抑制根瘤菌结瘤和固氮。近年来的研究发现有 些根瘤菌有 ACC 脱氨酶。ACC 脱氨酶能催化 ACC 脱氨基反应， 生成 - 酮丁酸和 NH3。根 瘤菌侵染根时， 根细胞合成 ACC 并释放部分 ACC 到细胞外。。
11、有 ACC 脱氨酶的根瘤菌能 吸收并降解植物细胞释放的 ACC， 使根细胞中的 ACC 不断释放而减少， 根细胞合成乙烯 的量就相应减少， 从而降低了乙烯对根瘤菌侵染结瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的 ACC 脱氨酶结构基因 （acdS）敲除， 根瘤菌的结瘤能力会显著降低 （Uchiumi 等， Journal of Bacteriology 2004, 186:2439-2448） ； 相反， 如果向原本没有acdS的根瘤菌导入acdS， 那根瘤菌工程菌的结瘤率、 占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株 （Ma 等， Applied and Environmental Microbiology 20。
12、04, 70:5891-5897 ； Conforte 等， Journal of General and Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等， Systematic and Applied Microbiology 2008, 31:141-150; Nascimento 等， Letters in Applied Microbiology 2012, 55:15-21） 。这表明有 ACC 脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力， 能高效结瘤。根瘤菌调控 ACC脱氨酶的机制比较复杂。 研究已发现很多有acdS的中慢生根瘤菌属的根瘤菌在自。
13、由培 养状态下不表达acdS， 没有 ACC 脱氨酶活性， 但在根瘤中会高水平地表达acdS， 发挥 ACC 脱 氨酶的作用 （Ma 等， Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ； Nukui 等， Applied and Environmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ； Nascimento 等， FEMS Microbiology Letters 2012, 336:26-37） 。因此， 筛选有 ACC 脱氨酶的根瘤菌时， 如果检测自由培养状态 下根瘤菌的 ACC 脱氨酶活性， 对很多根瘤菌尤其是中。
14、慢生根瘤菌会失效， 而用聚合酶链式 反应 （PCR） 检测根瘤菌有无acdS基因会更有效。 发明内容 0009 本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足而提供一个从刺槐根瘤中 分离的、 有 ACC 脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌 KDRM024 及其应用。 0010 本发明实现上述技术目的所采用的技术方案如下 ： 先用常规方法从刺槐根瘤中分离和纯化根瘤菌， 再从根瘤菌基因组中扩增acdS基因， 对扩增出的目标片段测序确定菌株有无acdS基因和 ACC 脱氨酶， 再用有 ACC 脱氨酶的根瘤 菌菌株接种刺槐幼苗， 在接种 3 个月后检测结瘤数、 植株的株高、 地径和干重， 选。
15、出能高效 说 明 书 CN 102978136 A 4 3/6 页 5 结瘤、 显著促进刺槐苗生长和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。 另一方面， 扩增 有 ACC 脱氨酶根瘤菌的 16S rRNA 基因并测序， 通过序列比对和系统发育分析 16S rRNA 基 因序列确定菌株的分类归属 ； 同时对筛选出的有 ACC 脱氨酶的根瘤菌与同属根瘤菌中已知 有 ACC 脱氨酶菌株的acdS基因序列进行系统发育分析， 结合菌株 16S rRNA 基因和acdS基 因的系统发育地位， 最终确定得到新的有 ACC 脱氨酶的根瘤菌株系。 0011 本发明提供的中慢生根瘤菌 KDRM024 于 2012。
16、 年 9 月 7 日保藏于中国典型培养物 保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2012336， 保藏地址为中国， 武汉， 武汉大学， 分类命名 为中慢生根瘤菌 KDRM024 Mesorhizobium sp. KDRM024。 0012 所述的中慢生根瘤菌 KDRM024 是从在湖北省武汉市江夏区安山人工种植刺槐的 根瘤中分离到的。 0013 所述的中慢生根瘤菌 KDRM024 的细胞呈杆状， 革兰氏染色阴性， 在 YMA 培养基上 生长形成典型的根瘤菌菌落 ： 圆形、 乳白色、 隆起、 边缘整齐不蔓延、 表面光滑且因有丰富的 胞外多糖而粘稠、 较湿润、 稍透明 ； 细胞的生长需。
17、氧， 在 28C 和中性 pH 条件下生长较快， 在 YMA 培养基上生长 3 5 天形成菌落的直径可达 1 2 mm。 0014 所述的中慢生根瘤菌 KDRM024 的 16S rRNA 基因序列 （见 SEQ ID NO:1）与中 慢生根瘤菌属典型种百脉根中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhizobium loti ATCC 700743 的 16S rRNA 基因序列一致性为 98.1%， 与机会中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhizobium opportunistum WSM2075 的 16S rRNA 基因序列一致性为 99.8%， 在系统发育树上与后者的 亲缘关系也最近， 处在同一节。
18、点分出的分支上 （图 1） 。因此， 菌株 KDRM024 属于中慢生根瘤 菌属， 可能属于机会中慢生根瘤菌种。 0015 所述的中慢生根瘤菌 KDRM024 有 ACC 脱氨酶。它的acdS基因部分序列 （见 SEQ ID NO:2） 与Mesorhizobium opportunistum WSM2075 的acdS的相应序列的一致性 为 86.1%， 与从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的紫穗槐中慢生根瘤菌Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123 的两个拷贝acdS中的一个acdS的相应序列 （可在 GenBank 登录号 AGSN01000010的序列中检索到） 。
19、的一致性为98.8%， 与前者在系统发育树上处在不同的分支 上， 与后者处在同一节点分出的分支上 （图 2） 。这表明菌株 KDRM024 与典型的机会中慢生 根瘤菌不同， 它的祖先在进化中可能是通过水平转移的方式从其他种的根瘤菌获得了acdS 基因。 0016 上述中慢生根瘤菌 KDRM024 的 16S rRNA 基因和acdS基因的分析结果结合表明 KDRM024 的基因型不同于已知的中慢生根瘤菌。 0017 所述中慢生根瘤菌 KDRM024 能在刺槐根上高效结瘤固氮， 促进刺槐苗生长和成 材。 0018 本发明的有益效果 ： 本发明所述的中慢生根瘤菌KDRM024有ACC脱氨酶， 能将。
20、ACC分解成-酮丁酸和NH3， 降低植物细胞合成乙烯的水平， 减轻乙烯对根瘤菌侵染的抑制作用， 提高根瘤菌与刺槐的 结瘤率和共生固氮的水平， 为刺槐在不施肥的贫瘠荒地上生长提供高水平的氮素， 促进刺 槐苗生长， 增加刺槐成材的生物量， 从而用低成本的接种投入让刺槐成材高产， 在刺槐育苗 造林上发挥作用。 说 明 书 CN 102978136 A 5 4/6 页 6 附图说明 0019 图 1 为中慢生根瘤菌菌株 KDRM024（） 与中慢生根瘤菌属 （Mesorhizobium） 现有 25 个种的典型菌株的 16S rRNA 基因的系统发育树。图中指示中慢生根瘤菌属典型种百 脉根中慢生根瘤菌。
21、典型菌株Mesorhizobium loti ATCC 700743， 指示机会中慢生根瘤菌 典型菌株Mesorhizobium opportunistum WSM2075， 菌株名后括号内是 16S rRNA 基因核苷 酸序列在 GenBank 数据库中的登录号。 0020 图 2 为中慢生根瘤菌菌株 KDRM024（）和中慢生根瘤菌属 （Mesorhizobium） 中有 ACC 脱氨酶菌株的acdS基因的系统发育树。图中指示紫穗槐中慢生根瘤 菌Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123， 指 示 机 会 中 慢 生 根 瘤 菌Mesorhizobium oppor。
22、tunistum WSM2075， 菌株名后括号内是acdS基因核苷酸序列在 GenBank 数据库中的 登录号。 具体实施方式 0021 1. 根瘤菌的分离、 纯化和保存 从在湖北省武汉市江夏区安山人工种植的刺槐中选择健壮刺槐根上大且饱满的根瘤， 用剪刀小心将根瘤连部分根剪下， 将同一刺槐根部获得的 5 15 个根瘤放入装有干燥变 色硅胶并覆有脱脂棉的小管中。然后将采集的根瘤用无菌水充分浸泡吸胀后， 用 95% 的酒 精浸泡 30 s, 接着用 0.1%的升汞表面灭菌5 min， 再用无菌水冲洗 6次， 将每个根瘤编号 后分别放入一个无菌的2-ml离心管中， 用无菌的研磨棒将根瘤研碎， 用移。
23、液器加入1 ml无 菌水并吸排 3 次悬浮匀浆液， 将悬浮液系列稀释 10 倍， 100 倍和 1000 倍， 然后分别吸取 100 l 悬浮液涂布在 YMA 固体培养基 （每升含 1 g 酵母粉 , 10 g 甘露醇 , 0.5 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4, 0.1 g NaCl, 1.0 g CaCO3, pH 6.8, 15 g 琼脂粉） 上， 将培养平板放在 28C 暗 培养。培养 3 5 天后挑取有典型根瘤菌菌落形态 （圆形、 乳白色、 隆起、 边缘整齐不蔓延、 表面光滑且因有丰富的胞外多糖而粘稠、 较湿润、 稍透明） 的菌落， 在 YMA 平板上划线培养， 重复 3。
24、 次划线纯化菌落。将纯化的单菌落在无菌水中悬浮， 经革兰氏染色后镜检， 选出革兰 氏染色阴性、 细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。所述纯化的根瘤菌菌 株可接种在 TY 培养液 （每升含 5 g 胰蛋白胨 , 3 g 酵母粉 , 0.33 g CaCl2, pH 6.8） 中培 养至对数后期或稳定期， 与 30%（v/v） 的甘油溶液等体积混匀， 冷冻于 -80C 长期保存。 0022 2. 根瘤菌acdS基因的扩增和鉴定 将根瘤菌菌株接种到 TY 培养液中培养至对数后期或稳定期的 100 l 菌液移至 1.5-ml离心管中， 8000 rpm离心5 min， 吸去上清液， 用0.。
25、5 ml灭菌双蒸水清洗2次， 用100 l灭菌双蒸水重新悬浮菌体， 取1 l 菌悬液进行PCR扩增 ； 模板是菌体经PCR预变性反 应加热裂解后释放的DNA ； 引物是acdSf3 ： 5 -ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3 和acdSr3 ： 5 -GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3 ， 使用浓度为 0.4 M。反应体系用天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司生产的 2Taq PCR MasterMix。PCR 扩增在 Bio-Rad S1000 型 PCR 仪上 进行。扩增程序为 94C 预变性 4 min ； 94C 变性 45 s， 5。
26、3C 退火 45 s， 72C 延伸 1 min， 35 个循环 ； 72C 延伸 7 min。扩增产物用 1%（w/v） 的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 然后送至 英潍捷基 （上海） 生物技术有限公司用引物 acdSf3 和 acdSr3 进行测序。 0023 从菌株 KDRM024 扩增得到的 DNA 片段在去除引物后的序列见 SEQ ID NO: 2。将 说 明 书 CN 102978136 A 6 5/6 页 7 序列 SEQ ID NO: 2 在 NCBI 数据库中进行 BLAST 检索， 结果显示 SEQ ID NO: 2 与中慢生根 瘤菌属根瘤菌的acdS相似， 其中 ： 相似度最高。
27、的是从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的紫 穗槐中慢生根瘤菌Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123 菌株的两个拷贝acdS中的一个 acdS的相应序列 （GenBank 登录号 AGSN01000010） ， 二者间的一致性为 98.8%。这表明扩增 得到的序列是acdS序列， 菌株 KDRM024 有 ACC 脱氨酶。 0024 3. 用有 ACC 脱氨酶的根瘤菌接种刺槐苗和检测接种效应 选直径约 0.8 1 cm 的刺槐根， 剪成 8 10 cm 的根段， 将根段插入苗床的育苗基 质中， 在25 28C， 相对湿度75 85%的温室中培养， 每周浇水一次， 在约5周。
28、后刺槐出 苗约 5 8 cm 时进行接种。具体为 ： 先将有 ACC 脱氨酶的根瘤菌在 YMA 固体培养基上生 长的新鲜菌落接种至 TY 培养液中， 在 28C 和 200 rpm 培养 48 72 h 至稳定期 ； 培养时 每个 500-ml 锥形瓶装 100 ml 培养液， 培养后每毫升约含 5109个细菌细胞。然后将菌液 用自来水稀释 500 倍后浇灌苗床。对照幼苗用等量的自来水代替进行浇灌。接种 3 个月后 检测刺槐苗的结瘤数、 株高、 地径和干重。其中 ： 菌株 KDRM024 的结果如表 1 所示。 0025 表 1 根瘤菌 KDRM024 接种刺槐苗的效应 结瘤数 株高 (cm)。
29、 地径 (mm) 地上部干重 (g)干重增加 (%) 不接种的对照刺槐苗3653.406.350 接种的刺槐苗471115.5815.24140% 从表 1 可以看出 ： 接种刺槐后， 根瘤菌 KDRM024 与刺槐共生可形成较多的根瘤， 通过还 原空气中的 N2为刺槐生长提供氮素， 能显著促进刺槐苗生长， 增加生物量。 0026 4. 细菌 16S rRNA 基因的扩增和鉴定 将菌株接种到 TY 培养液中培养至对数后期或稳定期的 100 l 菌液移至 1.5-ml 离心管中， 8000 rpm 离心 5 min， 吸去上清液， 用 0.5 ml 灭菌双蒸水清洗 2 次， 用 100 l 灭菌。
30、双蒸水重新悬浮菌体， 取 1 l 菌悬液进行 PCR ； 模板是菌体经 PCR 预变性 反 应 加 热 裂 解 后 释 放 的 DNA ； 引 物 是 27F ： 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 和 1492R ： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3， 使用浓度为0.25 M。 反应体系用天根生化科技(北京)有 限公司生产的 2Taq PCR MasterMix。PCR 扩增在 Bio-Rad S1000 型 PCR 仪上进行。扩增 程序为 94C 预变性 3 min ； 94C 变性 55 s， 50C 退火 50 s， 72C 延伸 1 min， 35 个循环。
31、 ； 72C 延伸 10 min。扩增产物用 1%（w/v） 的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 然后送至英潍捷基 （上海） 生物技术有限公司用相应扩增引物进行测序。 0027 从菌株KDRM024扩增得到的DNA片段在去除引物后的序列见SEQ ID NO: 1。 将序 列 SEQ ID NO: 1 在 NCBI 数据库中进行 BLAST 检索， 结果显示 SEQ ID NO: 1 与中慢生根瘤 菌属根瘤菌的 16S rRNA 基因序列相似， 其中 ： 与中慢生根瘤菌属典型种百脉根中慢生根瘤 菌典型菌株Mesorhizobium loti ATCC 700743的16S rRNA基因序列一致性为98.。
32、1%， 与机 会中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhizobium opportunistum WSM2075 的 16S rRNA 基因序列 一致性为 99.8%。这表明扩增得到的序列是 16S rRNA 基因序列， 菌株 KDRM024 属于中慢生 根瘤菌属。 0028 5. 根瘤菌 16S rRNA 基因的系统发育分析 将菌株 KDRM024 的 16S rRNA 基因序列 SEQ ID NO: 1 与中慢生根瘤菌属现有 25 个种 的各种典型菌株 （见 the List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, http:/ww。
33、w.bacterio.cict.fr） 的16S rRNA基因序列一起进行系统发育分析。 分析时以根 说 明 书 CN 102978136 A 7 6/6 页 8 瘤菌属典型种豆根瘤菌典型菌株Rhizobium leguminosarum USDA 2370的16S rRNA基因序 列为外群。 用MEGA 5.0软件对16S rRNA基因序列进行系统发育分析， 用MEGA 5.0软件整合 的 MUSCLE 程序以默认参数运行序列联配， 用 Neighbor-joining 法以 Kimura 2-parameter 模型构建系统发育树 ； 树分支节点扩展值用 Bootstrap 方法重复 10。
34、00 次计算。 0029 所述分析构建的系统发育树见图 1。图 1 显示菌株 KDRM024 的 16S rRNA 基因与机 会中慢生根瘤菌典型菌株Mesorhizobium opportunistum WSM2075 的 16S rRNA 基因处在 同一节点分出的分支上， 表明菌株 KDRM024 属于中慢生根瘤菌属， 可能属于机会中慢生根 瘤菌种。 0030 6. 根瘤菌acdS基因的系统发育分析 将菌株 KDRM024 的acdS基因序列 SEQ ID NO: 2 与中慢生根瘤菌属中已发现有acdS 的 7 个菌株的acdS基因序列一起进行系统发育分析。分析时以豆根瘤菌Rhizobium。
35、 leguminosarum bv. viciae 3841 的acdS基因序列为外群。用 MEGA 5.0 软件对acdS基 因序列进行系统发育分析， 用MEGA 5.0软件整合的MUSCLE程序以默认参数运行序列联配， 用 Neighbor-joining 法以 Kimura 2-parameter 模型构建系统发育树 ； 树分支节点扩展值 用 Bootstrap 方法重复 1000 次计算。 0031 所述分析构建的系统发育树见图 2。图 2 显示菌株 KDRM024 的acdS与从豆科牧 草Biserrula pelecinus根瘤中分离的机会中慢生根瘤菌Mesorhizobium o。
36、pportunistum WSM2075 的acdS处在系统发育树上的不同分支， 与从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的 紫穗槐中慢生根瘤菌Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123 的两个拷贝acdS中的一个 acdS（GenBank 登录号 AGSN01000010） 处在系统发育树上同一节点分出的分支上。这表明 KDRM024 与典型的机会中慢生根瘤菌不同， 它的祖先在进化中可能是通过水平转移的方式 从其他种的根瘤菌获得了acdS基因。 说 明 书 CN 102978136 A 8 1/2 页 9 序列表 110 中盈长江国际新能源投资有限公司 120 中慢生根瘤菌 。
37、KDRM024 及其应用 160 2 210 1 211 1309 bp 212 DNA 213 中慢生根瘤菌 （Mesorhizobium） 400 1 gcagacgggt gagtaacgcg tgggaatcta cccatctcta cggaacaact ccgggaaact 60 ggagctaata ccgtatacgt ccttttggag aaagatttat cggagatgga tgagcccgcg 120 ttggattagc tagttggtgg ggtaatggcc taccaaggcg acgatccata gctggtctga 180 gaggatgatc ag。
38、ccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 240 ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat gccgcgtgag tgatgaaggc 300 cctagggttg taaagctctt tcaacggtga agataatgac ggtaaccgta gaagaagccc 360 cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggg gctagcgttg ttcggaatta 420 ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggatact 。
39、taagtcaggg gtgaaatccc ggggctcaac 480 cccggaactg cctttgatac tgggtatctc gagtccggaa gaggtgagtg gaattccgag 540 tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggt 600 ccggtactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 660 tccacgccgt aaacgatgga agctagccgt tggcaagttt acttgtcgg。
40、t ggcgcagcta 720 acgcattaag cttcccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 780 gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac 840 cagcccttga catcccggtc gcggtttcca gagatggata ccttcagttc ggctggaccg 900 gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 960 aac。
41、gagcgca accctcgccc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggggactgc 1020 cggtgataag ccgagaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggctg 1080 ggctacacac gtgctacaat ggtggtgaca gtgggcagcg agaccgcgag gtcgagctaa 1140 tctccaaaag ccatctcagt tcggattgca ctctgcaact cgagtgcatg aagttggaat 1200 cgctagtaat cgcggatc。
42、ag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1260 cccgtcacac catgggagtt ggttttaccc gaaggcgctg tgctaaccg 1309 210 1 211 629 bp 序 列 表 CN 102978136 A 9 2/2 页 10 212 DNA 213 中慢生根瘤菌 （Mesorhizobium） 400 2 gcggatggtc gccgcggtcg ccgccaagat cggcatgaaa tgcctcctgg tacaggagag 60 ctgtgttccg catgaggatg ccgtctac。
43、ga ccgggtcggc aacattctct tgagccgcat 120 catgggagca gaggtgcgct tggtcgacga gggctttgac atcggcatcc gccgcagttg 180 ggaaaaagcg ctctatgagg tcaaggcaag gggcggcaca ccctatgcga taccagccgg 240 ggcgtctgtt cacgaaaagg gcggcctcgg ctatgtgggg tttgcggagg aggtgcgcgc 300 ccaagagaaa cagcttgggt ttgccttcga ctacatcatc gtttgc。
44、acgg tcacgggctc 360 gacgcatgct ggcatgctgg ttggatttgc caaggacggt cgacagcgca acgtgatcgg 420 tatcgatgct tctgccacgc ccgccagaac caaggcgcag gtgcttagca ttgcccaaca 480 tacagcgacg ctcgtcgatc tcggaacgga acttgtcgag gatgacgtcg tgttgctcga 540 ggagtacgct ggcccgtgtt atggcattcc gtccgagggg acgaaggaag ccatccgcct 600 gtgtgcgcag ctcgagggca tgattaccg 629 序 列 表 CN 102978136 A 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102978136 A 11 2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102978136 A 12 。