胃癌的生物标志物.pdf

本发明提供了通过检测BCL6B基因的抑制表达来诊断个体的胃癌和确定个体的胃癌预后的方法，在某些情况下，所述BCL6B基因的抑制表达是由于该基因的基因组序列中甲基化水平提高。还提供了用于所述方法的试剂盒和装置。此外，本发明提供了通过提高BCL6B基因表达或活性来治疗胃癌的方法。

权利要求书用于检测个体胃癌的试剂盒，包含(1)能提供BCL6B蛋白或BCL6BmRNA的平均量的标准对照，以及(2)能特异性且定量鉴定BCL6B蛋白或BCL6B mRNA的试剂。
如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂包括能特异性结合BCL6B蛋白的抗体。
如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂包括能够与BCL6BmRNA杂交的多核苷酸探针。
如权利要求3所述的试剂盒，其中所述多核苷酸探针具有SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列。
如权利要求1‑4中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂包含可检测的部分。
如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂包括能在扩增反应中特异性扩增SEQ ID NO:10或11或其互补物的至少一个区段的两个寡核苷酸引物。
如权利要求1所述的试剂盒，其还包括说明书手册。
如权利要求1所述的试剂盒，还包括用于处理获自所述个体的样品从而分离蛋白或mRNA的试剂。
如权利要求8所述的试剂盒，其中所述样品是胃粘膜样品。
如权利要求1所述的试剂盒，用于在不同时间点进行多次检测。
用于检测个体胃癌的试剂盒，包含(1)能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂，以及(2)指示物，在用所述试剂处理来自进行胃癌检测的个体的样品之后，所述指示物能确定含CpG的基因组序列中的至少一个CpG是甲基化的还是非甲基化的，其中所述含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少一个区段且包含至少一个CpG。
如权利要求11所述的试剂盒，其中当所述含CpG的基因组序列包含两个或更多个CpG并且所有CpG中的至少50%是甲基化的时，指示所述个体患有胃癌。
如权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少15个连续核苷酸区段、或至少20个连续核苷酸区段、或至少50个连续核苷酸区段、或SEQ ID NO:9、18、19或20的全长。
如权利要求11所述的试剂盒，其中当所述含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:19并且所有CpG中的至少5个是甲基化的时，指示所述个体患有胃癌。
如权利要求11所述的试剂盒，还包括用于处理获自所述个体的样品从而分离基因组DNA的试剂。
如权利要求15所述的试剂盒，其中所述样品是胃粘膜样品。
如权利要求11所述的试剂盒，用于在不同时间点进行多次检测。
如权利要求11所述的试剂盒，其中所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是优先切割甲基化DNA的酶、优先切割非甲基化DNA的酶或重亚硫酸盐，例如重亚硫酸钠。
如权利要求18所述的试剂盒，其中所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是重亚硫酸盐，所述指示物包括能特异性地扩增含CpG的基因组序列的两个寡核苷酸引物，所述基因组序列中的甲基化的C在重亚硫酸盐处理之后保持不变；并且所述指示物任选地包括能特异性地扩增含CpG的基因组序列的两个寡核苷酸引物，所述基因组序列中的非甲基化的C由于重亚硫酸盐处理而改变为U。
如权利要求18所述的试剂盒，其中所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是重亚硫酸盐，所述指示物包括限制性酶和两个寡核苷酸引物，其中所述限制性酶能切割含CpG的基因组序列中的CpG位点，所述基因组序列中的甲基化的C在重亚硫酸盐处理之后保持不变；并且所述两个寡核苷酸引物能特异性地扩增含CpG的基因组序列。
用于抑制胃癌细胞生长的药物组合物，包括有效量的包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列的多肽或有效量的包含编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列的核酸，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
有效量的包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的多肽或有效量的包含编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列的核酸在制备用于抑制胃癌细胞生长的药物中的用途。
如权利要求21所述的药物组合物或权利要求22所述的用途，其中所述核酸是包含与所述编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达盒。
如权利要求23所述的药物组合物或用途，其中所述启动子是上皮细胞特异性启动子。
如权利要求21或23所述的药物组合物或权利要求22或23所述的用途，其中所述核酸包含SEQ ID NO:10或11所示的核苷酸序列。
分离的核酸，其具有与SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20或以上的互补物的约20‑100个连续核苷酸的区段一致性为至少95%或一致性为100%的核苷酸序列。
如权利要求26所述的核酸，其与可检测的部分缀合。

说明书胃癌的生物标志物
发明背景
胃癌(gastric cancer)，也称为胃癌(stomach cancer)，是世界范围内第四常见的癌症，每年诊断出约1,000,000个病例。胃癌是一种具有高死亡率的疾病(每年约有800,000人死亡)，这使得它成为继肺癌之后世界范围内癌症死亡的第二常见的原因。在男性中和在发展中国家(包括很多亚洲国家)中胃癌的发生明显更高。
在胃癌早期，通常没有临床症状或仅表现出非特异性的症状，因而在疾病到达晚期之前在很多病例中无法作出诊断。这通常导致较差的预后：在诊断为胃癌的个体的80‑90%中发生转移，早期诊断出的那些个体中的65%具有6个月的存活率，而晚期诊断出的那些个体中仅有少于15%具有6个月的存活率。
由于胃癌的普遍性及其对患者预期寿命的严重影响，因此需要诊断、监测和治疗胃癌的新方法。本发明满足该需求和其它相关的需求。
发明概述
一方面，本发明提供了检测个体胃癌的方法。所述方法包括以下步骤：(a)测量取自所述个体的样品中BCL6B的表达水平；以及(b)将在步骤(a)中所获得的表达水平与标准对照进行比较。当与标准对照比较时，检测到BCL6B表达水平的下降指示个体可能患有胃癌。通常，本方法中所用的样品是胃粘膜样品，例如包括胃上皮细胞的胃粘膜样品。
在一些实施方案中，BCL6B的表达水平是BCL6B蛋白水平。在其它实施方案中，BCL6B的表达水平是BCL6B mRNA水平。当测量BCL6B蛋白水平时，步骤(a)可以包括利用能特异性结合BCL6B蛋白的抗体进行免疫测定。例如可以使用Western印迹分析。在其它情况下，步骤(a)可以包括质谱测量或基于杂交的测定，例如与微阵列、荧光探针或分子信标的杂交。
在一些实施方案中，步骤(a)可以包括扩增反应，诸如聚合酶链式反应(PCR)，尤其是逆转录酶‑PCR(RT‑PCR)。在一些情况下，检测步骤包括多核苷酸杂交测定，例如Southern印迹分析、Northern印迹分析或原位杂交测定。在一些情况下，在多核苷酸杂交测定中使用多核苷酸探针，使其与SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20或以上的互补物杂交。任选地，多核苷酸探针包括或具有与其连接的可检测的部分。
在某些实施方案中，当测试胃癌的个体最初被指示患有胃癌时，所述方法还可以包括在一段时间之后利用来自所述个体的相同类型样品(即，通过相同或相似的方式从胃的任何组织类型或解剖学位置收集的样品)重复步骤(a)。当与最初的步骤(a)的BCL6B(蛋白或mRNA)的表达水平的量相比，在所述一段时间之后时观察到BCL6B表达水平增加时，指示胃癌的改善，而降低指示胃癌的恶化。
在第二方面，本发明提供了检测个体胃癌的方法。所述方法包括以下步骤：(a)用能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂处理取自所述个体的样品；以及(b)在步骤(a)的处理之后，分析(诸如测序)含CpG的基因组序列以确定至少一个CpG是甲基化的还是非甲基化的，所述含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少一个区段(达到SEQ ID NO:9、18、19或20的全长以及包括SEQ ID NO:9、18、19或20的全长)并且包含至少一个CpG二核苷酸对。含CpG的基因组序列中一个甲基化CpG的存在指示个体可能患有胃癌。
在一些实施方案中，含CpG的基因组序列含有两个或更多个CpG，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个CpG对，并且当所有CpG中的至少50%为甲基化的时，指示个体可能患有胃癌。含CpG的基因组序列的长度可以变化，但是其长度应当足以包括至少一个CpG。通常，含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少15个连续核苷酸的区段，并且可以是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少20、30、50、100、200或更多个连续核苷酸的区段，或者甚至是SEQ ID NO:9、18、19或20的全长。在一个实例中，含CpG的基因组序列是BCL6B启动子序列‑95至+95bp(相对于转录起始位点)(SEQ ID NO:18)的区段。在另一实例中，含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:19，其含有9个CpG位点。当所有CpG中的至少5个是甲基化的时，指示个体患有胃癌。
通常，样品是胃粘膜样品或包含上皮细胞的胃组织样品。请求保护的方法还可以包括一些重复步骤。例如，当所检测的个体被指示患有胃癌时，可以在一段时间之后利用来自所述个体的相同类型样品(即通过相同或相似的方式从胃的任何组织类型或解剖学位置收集的样品)重复步骤(a)和(b)。与从最初的步骤(b)确定的甲基化CpG的数量相比，在一段时间之后的甲基化CpG数量的增加指示胃癌的恶化，而减少指示胃癌的改善。
在一些实施方案中，能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是优先切割甲基化DNA的酶、优先切割非甲基化DNA的酶或重亚硫酸盐。在其它实施方案中，步骤(b)包括扩增反应和/或对DNA分子进行测序的过程。
在第三方面，本发明提供了用于检测个体胃癌的试剂盒。所述试剂盒含有(1)能提供BCL6B蛋白或BCL6B mRNA的平均量的标准对照；以及(2)能特异性且定量鉴定BCL6B蛋白或BCL6B mRNA的试剂。在一些情况下，试剂可以是能特异性结合BCL6B蛋白的抗体，或者试剂可以是能与BCL6B mRNA杂交的多核苷酸探针。例如，多核苷酸探针具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。通常，试剂包括可检测的部分。在一些情况下，所述试剂盒可以包括一些其它组分，例如能在扩增反应中特异性扩增SEQ ID NO:10或11或上述序列的互补物的至少一个区段的两个寡核苷酸引物。在一些情况下，所述试剂盒还可以包括说明书手册。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于处理获自所述个体的样品从而分离蛋白或mRNA的试剂。在一些实施方案中，所述样品是胃粘膜样品。在一些实施方案中，所述试剂盒用于在不同时间点进行多次检测。
在第四方面，本发明提供了抑制胃癌细胞生长的方法。所述方法包括以下步骤：将胃癌细胞与有效量的(1)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的多肽；(2)包含编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列的核酸；或(3)去甲基化试剂(诸如5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷，5‑Aza)接触。在一些情况下，核酸是包含与编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列(如包含SEQ ID NO:10或11所示的核苷酸序列的核酸)可操作地连接的启动子的表达盒。任选地，启动子是上皮细胞特异性启动子。抑制胃癌细胞生长的方法可以在体外进行(例如，当胃癌细胞处于细胞培养物中时)、离体进行(例如，当胃癌细胞取自患者，然后在细胞培养物中保持时)或体内进行(例如，当胃癌细胞处于患者体内时)。
在第五方面，本发明提供了来源于BCL6B基因的cDNA或基因组序列的分离的核酸，其可以用作检测或扩增BCL6B序列的探针或引物。所述核酸可以具有与SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20的约20‑100个连续核苷酸的区段一致性为至少95%、任选100%的核苷酸序列，或者所述核酸可以具有为所述区段的互补物的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸与可检测的部分缀合。
此外，本发明提供了检测胃癌的试剂盒。所述试剂盒包含：(1)能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂，以及(2)指示物，在用所述试剂处理来自进行胃癌检测的个体的样品之后，所述指示物能确定含CpG的基因组序列中的至少一个CpG是甲基化的还是非甲基化的。含CpG的基因组序列是SEQ ID NO:9、18、19或20的至少一个区段且包含至少一个CpG。在一些实施方案中，当所述含CpG的基因组序列包含两个或更多个CpG并且所有CpG中的至少50%是甲基化的时，指示所述个体患有胃癌。在一些实施方案中，所述含CpG的基因组序列是SEQID NO:9、18、19或20的至少15个连续核苷酸区段、或至少20个连续核苷酸区段、或至少50个连续核苷酸区段、或SEQ ID NO:9、18、19或20的全长。在一些实施方案中，当所述含CpG的基因组序列是SEQ IDNO:19并且所有CpG中的至少5个是甲基化的时，指示所述个体患有胃癌。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于处理获自所述个体的样品从而分离基因组DNA的试剂。在一些实施方案中，所述样品是胃粘膜样品。在一些实施方案中，试剂盒用于在不同时间点进行多次检测。在一些实施方案中，所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是优先切割甲基化DNA的酶、优先切割非甲基化DNA的酶或重亚硫酸盐，例如重亚硫酸钠。在一些实施方案中，所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是重亚硫酸盐，所述指示物包括能特异性地扩增含CpG的基因组序列的两个寡核苷酸引物，所述基因组序列中的甲基化的C在重亚硫酸盐处理之后保持不变；并且所述指示物任选地包括能特异性地扩增含CpG的基因组序列的两个寡核苷酸引物，所述基因组序列中的非甲基化的C由于重亚硫酸盐处理而改变为U。在一些实施方案中，所述能差异性地修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂是重亚硫酸盐，所述指示物包括限制性酶和两个寡核苷酸引物，其中所述限制性酶能切割含CpG的基因组序列中的CpG位点，所述基因组序列中的甲基化的C在重亚硫酸盐处理之后保持不变；并且所述两个寡核苷酸引物能特异性地扩增含CpG的基因组序列。
本发明还提供了用于抑制胃癌细胞生长的组合物。所述组合物含有有效量的(1)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的多肽(例如，由SEQID NO:17所示的氨基酸序列组成的多肽)或(2)包含编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列的核酸(例如，包含SEQ ID NO:10或11的多核苷酸序列的核酸序列)以及药学可接受的载体。因此，本发明提供了包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列的多肽(例如，由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的多肽)或包含编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列的核酸(例如，包含SEQ ID NO:10或11的多核苷酸序列的核酸序列)在制备用于抑制胃癌细胞生长的药物中的用途。在组合物或用途的一些实施方案中，所述核酸是包含与所述编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达盒。在组合物或用途的一些实施方案中，所述启动子是上皮细胞特异性启动子。在药物组合物或用途的一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:10或11所示的核苷酸序列。
此外，本发明提供了包含SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20的区段或SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20的互补物的区段的多核苷酸序列或由SEQ ID NO:9、10、11、12、18、19或20的区段或SEQID NO:9、10、11、12、18、19或20的互补物的区段组成的多核苷酸序列在制备用于检测胃癌的试剂盒中的用途。所述区段通常为SEQ IDNO:9、10、11、12、18、19或20的约20‑100个连续核苷酸。
附图说明
图1显示了一个实施方案中的BCL6BCpG岛。
图2显示了一个实施方案的细胞系中的BCL6B mRNA表达。
图3显示了在一个实施方案中去甲基化试剂对BCL6B表达的影响。
图4显示了在一个实施方案中胃癌细胞和邻近的正常组织的配对样品中BCL6B的相对蛋白表达水平。
图5显示了在一个实施方案的MTS测定中细胞的外源BCL6B表达。
图6显示了在一个实施方案的集落形成测定中BCL6B表达对转染的细胞的影响。
图7显示了在一个实施方案中裸鼠中BCL6B表达的生长抑制效应。
图8显示了在一个实施方案中通过BGS获得的GC细胞系中BCL6B基因组序列(SEQ ID NO:19)的甲基化状态。
图9显示了在一个实施方案中原发GC和正常胃组织样品中BCL6B基因组序列(SEQ ID NO:19)的甲基化状态。
图10显示了一个实施方案中胃癌患者存活的Kaplan‑Meier分析。定义
本文所用的术语“BCL6B基因”或“BCL6B蛋白”指任何天然存在的变体或突变体、种间同系物或直系同源物、或人BCL6B基因或BCL6B蛋白的人工变体。人BCL6B基因位于染色体17p13.1(Sakashita et al.,Biochem Biophys Res Commun,291,567‑573,2002)。人野生型BCL6B基因的cDNA序列如GenBank登录号NM 181844.3所示(本文作为SEQID NO:11提供)，其编码480个氨基酸的BCL6B蛋白(本文作为SEQ IDNO:17提供)，该蛋白是一种转录阻遏蛋白。本申请含义内的BCL6B蛋白通常与人野生型BCL6B蛋白具有至少80%或90%或95%或更高的序列一致性。
在本文中，术语“胃癌(gastric cancer)”和“胃癌(stomach cancer)”具有相同的含义，并且指胃部或胃细胞的癌症。这类癌症可以是发生在胃内膜(粘膜或或胃上皮)中的腺癌，还可以位于胃的幽门部、体部或贲门部(下部、体部和上部)。“胃癌细胞”是具有胃癌特征的胃上皮细胞，并且包括癌前细胞，所述癌前细胞处于向癌细胞的转变的早期或有倾向转变成癌细胞。这类细胞可以表现出癌细胞的一种或多种表型性状特征。
在本文中，术语“或”通常的含义包括“和/或”，除非文中内容明确表明并非如此。
本文所用的术语“基因表达”用于指DNA转录形成编码具体蛋白(例如，人BCL6B蛋白)的RNA分子，或指由多核苷酸序列所编码的蛋白的翻译。换句话而言，本文中的术语“基因表达”包括由目的基因(例如，人BCL6B基因)所编码的mRNA水平和蛋白水平两者。
在本文中，术语“生物样品”或“样品”包括诸如活检和尸检样品的组织切片、以及采集用于组织学目的的冷冻切片、或所述任何样品的加工后形式。生物样品包括血液或血液成分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰或唾液、淋巴组织和舌组织、培养的细胞(例如，原代培养物、移植组织和转化的细胞)、粪便、尿液、胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，所述真核生物可以是哺乳动物、可以是灵长类动物，并可以是人类个体。
在本文中，术语“活检”是指移除用于诊断或预后评价的组织样品的过程以及指组织样本本身。本领域内已知的任何活检技术都可以应用于本发明的诊断和预后方法。所应用的活检技术将取决于待评价的组织类型(例如，舌、结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、胃组织等)以及其它因素。代表性的活检技术包括但不限于，切除活检、切口活检、穿刺活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包括结肠镜检查术。本领域技术人员对于多种活检技术是公知的，并能用最少的试验在它们之间作出选择并实施它们。
在本文中，术语“分离的”核酸分子表示与通常与所述分离的核酸分子相联的其它核酸分子分开的核酸分子。因此，“分离的”核酸分子包括但不限于，不含分离的核酸所来源的生物基因组中天然存在于所述核酸的一端或两端的核苷酸序列的核酸分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将这种分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)，用于方便操控或用于产生融合的核酸分子。此外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。例如，在核酸文库(例如，cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)中的数百至数百万其它核酸分子内存在的核酸分子不是“分离的”核酸。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还隐含地包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)、互补序列以及明确指明的序列。具体地，可以通过产生一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer etal.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka etal.,J. Biol.Chem.260:2605‑2608(1985);以及Rossolini etal.,Mol.Cell.Probes 8:91‑98(1994))。术语核酸与基因、cDNA以及基因编码的mRNA可交换使用。
术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA区段。其包含编码区前后的参与基因产物转录/翻译和转录/翻译调控的区域(前导区和尾区)，以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文可互换使用，并且是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的这些术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及随后经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ‑羧基谷氨酸和O‑磷酸丝氨酸。为了本申请的目的，氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基相连的碳链，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。为了本申请的目的，氨基酸模拟物是指这样的化合物，所述化合物具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能。
氨基酸可以包括具有非天然存在的D‑手性的氨基酸(如WO 01/12654中所公开的)，这可以提高包含一个或多个这种D‑氨基酸的多肽的稳定性(例如，半衰期)、生物利用度和其它特性。在一些情况下，治疗性多肽的一个或多个氨基酸具有D‑手性，并可能全部氨基酸都具有D‑手性。
在本文中，可以通过公知的三字母符号或通过IUPAC‑IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及氨基酸。同样，可以通过核苷酸的公认的单字母代码来提及核苷酸。
当描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列时，本文所用的术语“一致的”或“一致性”百分比是指：当利用下述序列比较算法之一或通过人工比对和肉眼检查进行测定，在比较窗或指定区域为最大对应性进行比较和比对时，得出的相同的两个或更多个序列或子序列，或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(例如，本发明方法中所用的变体BCL6B蛋白(例如，用于治疗胃癌)与参照序列(例如野生型人BCL6B蛋白)具有至少80%的序列一致性，优选85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性)。这样的序列被称为“基本上一致的”。关于多核苷酸序列，该定义还指测试序列的互补物。优选地，一致性存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地，存在于长度为75‑100个氨基酸或核苷酸的区域上。
为了序列比较，通常将一条序列作为与测试序列进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如果需要的话，指定子序列坐标，然后指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。对于核酸和蛋白的序列比较，使用下文论述的BLAST和BLAST 2.0算法和默认参数。
本文使用的“比较窗”包括具有选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150个连续位置数中任一连续位置数的区段，其中在某一序列与具有相同连续位置数的参照序列进行最优比对后，可以将这两条序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以通过下述来进行用于比较的序列最优比对：例如Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch,J. Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法、这些算法的计算机实施(威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group),575Science Dr.,Madison,WI)、或者人工比对和肉眼检查(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel etal.,eds.1995补充))。
适于确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法分别在Altschul etal.,(1990)J.Mol.Biol.215:403‑410和Altschul etal.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389‑3402中描述。通过国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information)网站ncbi.nlm.nih.gov可公开获得用于运行BLAST分析的软件。该算法首先涉及通过鉴定询问序列中长度为W的短字符来鉴定高评分序列对(HSP)，当询问序列中长度为W的短字符与数据库序列中相同长度的字符比对时，其能匹配或符合某正值的阈值评分T。T被称为相邻字符评分阈值(Altschul etal.,同上)。这些初始的相邻字符命中作为启动检索的基础，用于发现含有它们的更长HSP。然后，在可以增加累加比对评分的前提下，将字符命中在两个方向沿每一序列延伸。对于核苷酸序列，可以利用参数M(匹配残基对的奖励评分;一直大于0)以及N(错配残基的惩罚评分;一直小于0)来计算累加评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累加评分。当出现以下情况时停止每一方向的字符命中延伸：累加比对评分从其最大实现值下降X量时；由于一个或多个负评分残基比对的累积而使累加评分达到零或零以下时；或者到达任一序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为28、期望值(E)为10、M=1、N=‑2和双链比较作为默认参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认参数(参见，Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法还执行两条序列间的相似性的统计分析(参见，例如,Karlin and Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873‑5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一项测定结果是最小和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸比较中，最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001时，则认为所述测试核酸与参照序列是相似的。
如下文所述，两条核酸序列或多肽基本一致的指示是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸所编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，例如，如果一条多肽与另一多肽的差异仅在于保守型取代，那么两条肽通常是基本一致的。如下文所述，两条核酸序列基本一致的另一指示是两个分子或其互补物能在严紧条件下彼此杂交。两条核酸序列基本一致的另一指示是可以使用相同的引物来扩增所述序列。
在本文中，术语“严紧的杂交条件”和“高严紧性”是指探针与其靶标子序列(通常处于复杂的核酸混合物中)杂交而不与其它序列杂交的条件。严紧的条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会不同。较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。核酸杂交的广泛指导见于Tssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology‑‑Hybridization with Nucleic Probes (生物化学和分子生物学技术‑核酸探针的杂交),"Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (杂交原理和核酸测定策略的概述)"(1993)，并且容易被本领域技术人员所理解。通常，将严紧的条件选择为比限定的离子强度、pH下具体序列的热熔点(Tm)低约5‑10℃。Tm是平衡时与靶标互补的探针中的50%与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列是过量存在的，所以在Tm下，在平衡时，50%的探针被占据)。添加例如甲酰胺的去稳定剂也可以实现严紧的条件。对于选择性杂交或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选为10倍于背景的杂交。示例性的严紧杂交条件可以如下：50%甲酰胺，5×SSC和1%SDS，42℃下孵育，或5×SSC，1%SDS，65℃下孵育，在65℃下0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。
对于在严紧的条件下不彼此杂交的核酸，如果它们编码的多肽是基本上相同的，则所述核酸仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这些情况下，所述核酸通常在中等严紧的杂交条件下杂交。示例性的“中等严紧的杂交条件”包括：在37℃下、40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中杂交，以及在45℃下1×SSC中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域技术人员会容易地认识到，其它杂交和洗涤条件可以用于提供相似严紧性的条件。用于确定杂交参数的其它指导在很多参考文献中提供，例如，Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel,etal.。
“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许具体多核苷酸在宿主细胞中转录的一系列指定的核酸元件。表达盒可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括与启动子可操作地连接的待转录的多核苷酸。在此背景下，“可操作地连接”表示将两个或更多个遗传元件(诸如多核苷酸编码序列和启动子)置于允许元件发挥合适的生物功能(诸如启动子指导编码序列转录)的相对位置。可以存在于表达盒中的其它元件包括能增强转录(例如，增强子)和终止转录(例如，终止子)的元件，以及赋予表达盒所产生的重组蛋白某种结合亲和力或抗原性的元件。
本文所用的术语“重亚硫酸盐”包括能够通过化学方式将胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U)而不会化学修饰甲基化胞嘧啶，并因而能用来基于DNA的甲基化状态差异性地修饰DNA序列的所有类型的重亚硫酸盐，例如重亚硫酸纳。
本文所用的能“差异性地修饰”甲基化DNA或非甲基化DNA的试剂包括在一过程中能与甲基化和非甲基化DNA发生差异性反应的任何试剂，通过该过程，从甲基化和非甲基化DNA产生有区别的产物或在量上有区别的结果(例如，结合或沉淀的程度)，进而允许鉴定DNA甲基化状态。这样的过程可以包括但不限于，化学反应(诸如通过重亚硫酸盐的非甲基化C→U的转化)、酶处理(诸如通过甲基化依赖性核酸内切酶的切割)、结合和沉淀。因此，优先切割甲基化DNA的酶是当DNA为甲基化的时能以明显更高的效率切割DNA分子的酶，而优先切割非甲基化DNA的酶则在DNA是非甲基化的时表现出显著更高的效率。在本发明的背景下，“差异性地修饰”甲基化或非甲基化DNA的试剂还指在其与DNA序列结合中或DNA序列的沉淀中根据这些DNA序列的甲基化状态而能表现出差异性能力的任何试剂。所述试剂中的一类由甲基化DNA结合蛋白组成。
本文所用的“含CpG的基因组序列”是指位于个体基因组中限定位置的DNA序列区段。通常，“含CpG的基因组序列”的长度为至少15个连续核苷酸，且含有至少一个CpG对。在一些情况下，其长度可以为至少18、20、25、30、50、80、100、150、200、250或300个连续核苷酸，且含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个CpG对。对于给定位置处(例如，人BCL6B基因组序列区域(诸如含有启动子和外显子1的区域))内的任一“含CpG的基因组序列”，核苷酸序列变异可以存在于个体之间，以及甚至存在于同一个体的等位基因之间。此外，“含CpG的基因组序列”可以包括转录成或不转录成蛋白产物的核苷酸序列，并且核苷酸序列可以为蛋白编码序列、非蛋白编码序列(例如转录启动子)或以上的组合。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”(本文可互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的基本四多肽链结构的抗原结合蛋白，所述链例如通过链间二硫键来稳定，所述抗原结合蛋白具有特异地结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。
术语“抗体”还指可以用于免疫结合测定中的抗体抗原结合片段和表位结合片段，例如，Fab片段。有很多良好表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键的C端消化抗体，从而产生Fab二聚体F(ab)'2，所述Fab自身是通过二硫键与VH‑CH1连接的轻链。F(ab)'2可以在温和的条件下被还原，从而破坏铰链区的二硫键，进而将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体在本质上是具有一部分铰链区的Fab(对于其它抗体片段的更详细的描述，参见例如，Fundamental Immunology,Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。尽管根据完整抗体的消化来定义不同的抗体片段，但本领域技术人员应当理解的是，可以通过化学方法从头合成片段或通过利用重组DNA技术合成片段。因此，术语抗体还包括通过整个抗体的修饰所产生的抗体片段或利用重组DNA技术合成的抗体片段。
当在描述具体分子与蛋白或肽的结合关系的上下文中使用时，短语“特异性地结合”是指能在蛋白和其它生物制剂的混杂群体中确定蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的结合测定条件下，指定的结合试剂(例如，抗体)与特定蛋白的结合至少为背景的二倍，并且基本上不以显著的量与样品中存在的其它蛋白结合。在这种条件下，抗体的特异性结合可能需要选择对特定蛋白具有特异性的抗体，或对某一蛋白具有特异性而不对该蛋白的相似“姐妹”蛋白具有特异性的抗体。多种免疫测定模式可用于选择能与特定的蛋白或以特定的形式发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常被用于选择能与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(对于可用于确定特异性免疫反应性的免疫模式和条件的描述，参见例如，Harlow & Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(1988))。通常，特异性或选择性结合反应为背景信号或噪音的至少两倍，更通常超过背景的10至100倍。另一方面，当涉及一条多核苷酸序列与另一多核苷酸序列形成双链复合物时，术语“特异性地结合”描述基于Watson‑Crick碱基配对的“多核苷酸杂交”，正如在术语“多核苷酸杂交方法”的定义中所述。
本申请中所用的“增加”或“降低”是指与比较对照在量上可检测出的正向或负向改变，所述比较对照例如是建立的标准对照(诸如非癌性胃组织中的BCL6B mRNA或蛋白的平均表达水平)。增加是通常为对照值的至少10%或至少20%或50%或100%的正向改变，并且可以高达对照值的至少2倍、至少5倍或甚至10倍。同样，减少是通常为对照值的至少10%或至少20%、30%或50%或者甚至高达至少80%或90%的负向改变。指示与比较基准的量的改变或差异的其它术语在本申请中以上述相同的方式使用，诸如“多于”、“少于”、“高于”和“低于”。相比之下，术语“基本相同的”或“基本没有变化的”指示与标准对照值在量上具有极小改变或没有改变，改变通常在标准对照的±10%以内，或±5%、±2%以内，或者甚至与标准对照具有更小的改变。
本文所用的“多核苷酸杂交方法”是指在合适的杂交条件下，基于预先确定的多核苷酸序列与已知序列的多核苷酸探针形成Watson‑Crick碱基配对的能力，来检测预先确定的多核苷酸序列的存在和/或量的方法。这类杂交方法的实例包括Southern印迹、Northern印迹和原位杂交。
本文所用的“引物”是指可以在扩增方法(如聚合酶链式反应(PCR))中使用来基于对应于目的基因(例如，人BCL6B的cDNA或基因组序列或其一部分)的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的至少一条PCR引物对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。确定引物合适长度中涉及的因素是本领域技术人员熟知的。具体实施方案中所用的引物如本文的表1所示，其中标明了它们的具体应用。在本文中，术语“引物对”表示与靶DNA分子的相反链杂交或与位于待扩增的核苷酸序列侧翼的靶DNA区域杂交的引物对。在本文中，术语“引物位点”表示与引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
“标记”、“可检测的标记”或“可检测的部分”是可通过分光光度计、光化学、生物化学、化学或其它物理方式进行检测的组成部分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、或可被制成可检测的(例如，通过将放射性成分并入肽中)或用于检测抗体与肽发生特异性反应的半抗原和蛋白。通常，将可检测的标记与具有确定的结合特性的探针或分子(例如，具有已知结合特异性的多肽或多核苷酸)连接，以允许容易地检测探针(以及其结合靶标)的存在。
本文所用的“标准对照”是指存在于建立的正常无疾病组织样品(例如，正常的胃上皮组织样品)中的预定量或浓度的多核苷酸序列或多肽(例如，BCL6B mRNA或蛋白)。标准对照值适合用于本发明方法，作为用于比较测试样品中所存在的BCL6B mRNA或蛋白的量的基础。作为标准对照的建立样品提供了对于不患有常规定义的任何胃病尤其是胃癌的平均、健康的人的胃上皮组织样品(例如，胃粘膜)中通常的BCL6B mRNA或蛋白平均量。标准对照值可以根据样品的性质以及其它因素而变化，所述其它因素例如建立该对照值所基于的个体的性别、年龄、种族。
当描述不患有常规定义的任何胃病(尤其是胃癌)的健康人时，术语“平均”是指能代表随机选择的不患有任何胃病(尤其是胃癌)的健康人群的人的胃组织(例如上皮组织或胃粘膜)中的某些特性，尤其是人BCL6BmRNA或BCL6B蛋白的量。所选择的人群应当包括足够数量的人，使得这些个体的胃粘膜的BCL6B mRNA或蛋白的平均量能以合理的准确性反映一般的健康人群中BCL6B mRNA/蛋白的对应量。此外，所选择的人群通常与胃组织样品被用于测试胃癌指示的个体具有相似的年龄。而且，还应考虑诸如性别、种族、病史等其它因素，并优选实现测试个体与所选的建立“平均”值的个体组在特征上的密切匹配。
本申请中所用的术语“量(amount)”是指样品中存在的目的多核苷酸或目的多肽(例如，人BCL6B mRNA或蛋白)的量。所述量可以以绝对方式来表示，即样品中多核苷酸或多肽的总量，或以相对形式来表示，即样品中多核苷酸或多肽的浓度。
本申请中所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述能实现消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟相关疾病状态的任何症状的发生或复发的行为。换句话说，“治疗”疾病状态包括对该疾病状态的治疗性干预和预防性干预。
本文所用的术语“有效量”是指在量上足以产生期望效应的给定物质的量。例如，有效量的编码BCL6B mRNA的多核苷酸是能实现BCL6B蛋白表达的水平或生物活性增加，使得在为治疗性目的给予多核苷酸的患者中胃癌症状被减轻、逆转、消除、预防或延迟发生的所述多核苷酸的量。足以实现这点的量被定义为“治疗有效剂量”。剂量范围根据所给予的治疗剂的性质以及诸如给药途径和患者疾病状态的严重程度等其它因素而改变。
本文所用的术语“个体”或“需要治疗的个体”包括由于具有患胃癌风险或实际患有胃癌而寻求医疗帮助的个体。个体还包括寻求治疗方案改进的当前正经历治疗的个体。需要治疗的个体包括表现出胃癌症状或具有患有胃癌或其症状的风险的个体。例如，需要治疗的个体包括具有胃癌遗传倾向或家族史的个体、过去已忍受相关症状的个体、已暴露于触发物质或事件的个体以及忍受慢性或急性疾病状态症状的个体。“需要治疗的个体”可以处于生命的任何年龄。
BCL6B蛋白的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”分别指利用BCL6B蛋白结合或信号转导的体外和体内测定鉴定出的抑制性分子、激活性分子或调节性分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及其同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。例如，抑制剂是能部分或完全阻断碳水化合物结合，降低BCL6B蛋白活性、阻止BCL6B蛋白活性、延迟激活BCL6B蛋白、使BCL6B蛋白失活、使BCL6B蛋白去敏感或下调BCL6B蛋白活性的试剂。在一些情况下，抑制剂直接或间接与BCL6B蛋白结合，例如中和抗体。本文所用的抑制剂与失活剂和拮抗剂同义。例如，激活剂是能刺激BCL6B蛋白活性、增加BCL6B蛋白活性、促进BCL6B蛋白活性、增强BCL6B蛋白激活、使BCL6B蛋白活性敏感化或上调BCL6B蛋白活性的试剂。调节剂包括BCL6B蛋白配体或结合伴侣，包括经修饰的天然存在的配体和以合成方式设计的配体、抗体和抗体片段、拮抗剂、激动剂、包括诸如含碳水化合物的分子的小分子、siRNA、RNA适体等。
发明的详细描述
I.引言
由于胃癌在其早期发展阶段缺乏明确症状的性质，胃癌患者通常面临严酷的预后。因而，胃癌的早期检测对提高患者存活率是至关重要的。
本发明人首次发现胃癌细胞中BCL6B蛋白的表达受到抑制。这种BCL6B蛋白的抑制表达是由于BCL6B基因组序列，尤其是该基因的启动子区内的甲基化增加，导致BCL6B mRNA的转录减少。该发现为检测、监测和治疗胃癌提供了重要的手段。
II.一般方法
本发明的实践利用分子生物学领域的常规技术。公开了本发明使用的一般方法的基础教科书包括Sambrook and Russell,Molecular Cloning，ALaboratory Manual(第3版.2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:ALaboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel etal.,eds.,1994))。
对于核酸，以千碱基对(kb)或碱基对(bp)给出大小。核酸大小是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、从测序的核酸或从公开的DNA序列得到的估计值。对于蛋白，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出大小。蛋白大小是从凝胶电泳、从测序的蛋白、从导出的氨基酸序列或从公开的蛋白序列估算的。
例如，可以按照Van Devanter et.al.,Nucleic Acids Res.12:6159‑6168(1984)中的描述，根据Beaucage and Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859‑1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯法、利用自动化合成仪来通过化学方法合成不能商购的寡核苷酸。利用任何本领域公认的策略(例如天然丙烯酰胺凝胶电泳或Pearson and Reanier,J.Chrom.255:137‑149(1983)中所描述的阴离子交换高效液相色谱(HPLC))进行寡核苷酸的纯化。
可以利用例如Wallace etal.,Gene16:21‑26(1981)中所述的对双链模板进行测序的链终止法验证本发明所用的目的序列，例如，人BCL6B基因的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸(例如，引物)。
III.组织样品的获得和BCL6B mRNA或DNA的分析
本发明涉及测量BCL6B mRNA的量或分析人胃组织(尤其是胃上皮样品)中的BCL6B基因组DNA的甲基化模式，将其作为检测胃癌的存在、评估发展成胃癌的风险和/或监测胃癌的进展或治疗功效的手段。因此，实施本发明的第一步是从测试个体获得胃上皮组织样品并从所述样品提取mRNA或DNA。
A.胃组织样品的获取和制备
从待利用本发明的方法检测或监测胃癌的人获得胃组织样品。按照医院或诊所通常遵循的标准步骤(例如在内窥镜检查期间)进行从个体的胃上皮组织样品的收集。收集合适量的胃上皮，并且可以在进一步制备之间按照标准程序进行保存。
可以利用例如胃粘膜进行本发明的患者胃上皮样品中的BCL6BmRNA或DNA的分析。制备用于提取核酸的组织样品的方法是本领域技术人员公知的。例如，应当首先处理个体的胃粘膜样品来破坏细胞膜，以便释放细胞内含有的核酸。
B.RNA的提取和定量
有很多用于从生物样品提取mRNA的方法。可以遵循mRNA制备的一般方法(例如，如Sambrook and Russell,Molecular CLoning:ALaboratory Manual 3d ed.,2001中所描述的)。还可以使用各种商购的试剂或试剂盒从测试个体的生物样品获得mRNA，例如Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)、Oligotex Direct mRNA试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)、RNeasy Mini 试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)和Series 9600TM(Promega,Madison,WI)。还可以使用这些方法中的多种的组合。
从RNA制备物消除所有DNA污染是必要的。因此，应当小心处理样品、用DNA酶进行彻底的处理，并在扩增和定量步骤中使用合适的阴性对照。
1.基于PCR的mRNA水平定量测定
从样品提取出mRNA后，就可以对人BCL6B mRNA的量进行定量。测定mRNA水平的优选方法是基于扩增的方法，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)，尤其是逆转录‑聚合酶链式反应(RT‑PCR)。
在扩增步骤之前，必须合成人BCL6B mRNA的DNA拷贝(cDNA)。通过逆转录实现这点，可以作为单独的步骤进行逆转录或以均相(homogeneous)逆转录‑聚合酶链式反应(RT‑PCR)进行，均相逆转录‑聚合酶链式反应是用于扩增RNA的一种改良的聚合酶链式反应。适于核糖核酸PCR扩增的方法如以下所述：Romero and Rotbart，Diagnostic Molecular Biology:Principles and Applications pp.401‑406;Persing etal.,eds.,Mayo Foundation,Rochester,MN,1993;Egger etal.,J.Clin.Microbiol.33:1442‑1447,1995；以及美国专利第5,075,212号。
PCR的一般方法是本领域公知的，并且因而在本文没有详细描述。对于PCR方法、步骤和设计引物的原理的综述，参见例如，Innis,etal.,PCR Protocols:AGuideto Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR试剂和流程还可以从供应商获得，例如Roche MolecularSystems。
最通常的情况下，利用热稳定酶以自动化过程来实施PCR。在该过程中，使反应混合物的温度自动地通过变性区、引物退火区和延伸反应区进行循环。特别适用于该目的的仪器是可商购获得的。
尽管在实施本发明中通常使用靶mRNA的PCR扩增，但本领域技术人员应当认识到，可以通过任何已知的方法来实现母体血液样品中这些mRNA种类的扩增，例如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增和半保留序列复制或基于核酸序列的扩增(NASBA)，这些方法中的每一种都能提供充分的扩增。最近研发的支链DNA技术也可以用于定量地测定母体血液中mRNA标志物的量。对于用于临床样品中核酸序列的直接定量的支链DNA信号扩增的综述，参见Nolte,Adv.Clin.Chem.33:201‑235,1998。
2.其它定量方法
还可以利用本领域技术人员公知的其它标准技术检测BCL6BmRNA。尽管在检测步骤之前通常进行扩增步骤，但是本发明方法不是一定需要扩增。例如，无论事先是否进行扩增步骤，都可以通过大小分级(例如，凝胶电泳)来鉴定mRNA。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中运行样品并按照公知的技术用溴化乙锭进行标记(参见例如，Sambrook andRussell,同上)之后，与标准对照具有相同大小的条带的存在指示靶mRNA的存在，然后基于条带的强度将所述靶mRNA的量与对照进行比较。或者，BCL6B mRNA的特异性寡核苷酸探针可用于检测该mRNA的存在，并基于探针提供的信号强度通过与标准对照比较来指示mRNA的量。
序列特异性探针杂交是检测包含其它种类核酸的特定核酸的公知方法。在足够严紧的杂交条件下，探针只与基本上互补的序列特异性杂交。可以放松杂交条件的严紧性，以允许不同量的序列错配。
本领域中公知很多杂交模式，包括但不限于液相、固相或混合相杂交测定。下面的文章提供了多种杂交测定模式的综述：Singer et al.,Biotechniques 4:230,1986;Haase etal.,Methods inVirology,pp.189‑226,1984;Wilkinson,In situ Hybridization,Wilkinson ed.,IRL Press,Oxford University Press,Oxford;以及Hames and Higgins eds.,Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach,IRL Press,1987。
按照公知的技术检测杂交复合物。可以通过常用于检测杂交核酸存在的数种方法中的任一种标记能够与靶核酸(即mRNA或扩增的DNA)特异性杂交的核酸探针。一种常用的检测方法是利用用3H、125I、35S、14C或32P等标记的探针的放射自显影技术。放射性同位素的选择取决于研究参数选择，例如合成方便性、稳定性和所选同位素的半衰期。其它标记包括化合物(例如，生物素和地高辛)，其与用荧光团、化学发光试剂和酶标记的抗配体或抗体结合。或者，探针可以与诸如荧光团、化学发光试剂和酶的标记直接缀合。标记的选择取决于所需的敏感度、与探针缀合的方便性、稳定性需要和可利用的仪器。
可以利用公知的技术合成和标记实施本发明所需的探针和引物。例如，可以按照Van Devanter et.al.,NucleicAcids Res.12:6159‑6168,1984中所描述的，根据Beaucage and Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859‑1862,1981首次描述的固相亚磷酰胺三酯法、利用自动化合成仪来通过化学方法合成用作探针和引物的寡核苷酸。例如，可以通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或Pearson and Reanier,J. Chrom.255:137‑149,1983中所描述的阴离子交换HPLC进行寡核苷酸的纯化。
C.BCL6B基因组序列中甲基化的检测
研究含有一个或多个CpG(胞嘧啶‑鸟嘌呤二核苷酸)对的BCL6B基因组序列区段的甲基化状态，以提供关于测试个体是否患有胃癌、个体是否有风险发展成胃癌或个体的胃癌是恶化还是改善的指示。
通常，对于甲基化模式所分析的BCL6B基因组序列区段包括5'非翻译区(诸如启动子区)并包括一个或多个CpG核苷酸对。例如，SEQ ID NO:9、18或19或其一部分可用于确定序列内有多少CpG对是甲基化的以及有多少CpG对是非甲基化的。被分析的序列应当足够长，而能含有至少1个CpG二核苷酸对，且该CpG位点处的甲基化检测通常足以指示胃癌细胞的存在。被分析的序列的长度通常为至少15或20个连续核苷酸，并且可以更长，具有至少25、30、50、100、200、300、400或更多个连续核苷酸。序列内存在至少1个，通常为2个或更多个，常常为3、4、5、6、7、8、9或更多个CpG核苷酸对。在分析多个(2个或更多个)CpG位点的甲基化状态的情况下，当所分析的基因组序列内至少50%的CpG对被证实为甲基化的时，所测试的个体被认为患有胃癌或发展成胃癌的风险增加。举例来说，图8和图9中所示的SEQ ID NO:19(即BCL6B基因组序列区段(相对于转录起始位点的‑72至+49))含有9个CpG对。如这些图中所示，在建立的胃癌细胞系和获自胃癌的样品中，发现该区域内的大多数CpG对是甲基化的，而非癌胃上皮细胞显示非常少的甲基化CpG位点(如果存在的话)。为了确定BCL6B基因组序列的甲基化模式，进行重亚硫酸盐处理，随后进行DNA测序是非常有用的，因为重亚硫酸盐将非甲基化胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而保持甲基化胞嘧啶不变，从而允许通过DNA测序过程进行直接鉴定。任选地，在重亚硫酸盐转化之后且DNA测序之前，包括诸如PCR的扩增过程。1.DNA提取和处理
从生物样品提取DNA的方法是公知的，且在分子生物学领域内常规实施，参见例如，Sambrook and Russell,同上。应当消除RNA污染以避免对DNA分析的干扰。然后，用能以甲基化差异性方式修饰DNA的试剂处理DNA，即在处理之后能从甲基化胞嘧啶(C)残基和非甲基化C残基产生不同的且可区别的化学结构。通常，这种试剂能与DNA分子内的非甲基化C残基反应，将每个非甲基化C残基转化为尿嘧啶(U)残基，而甲基化C残基保持不变。这种非甲基化C→U的转化允许基于核酸的一级序列的改变进行甲基化状态的检测和比较。适用于该目的的示例性试剂是重亚硫酸盐，诸如重亚硫酸纳。使用用于DNA化学修饰的重亚硫酸盐的方法是本领域内公知的(参见例如，Herman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821‑9826,1996)。
正如本领域技术人员所认识到的，本文未提及的但具有在化学上(或通过任何其它机制)差异性地修饰甲基化和非甲基化DNA的相同特性的任何其它试剂都可以用于实施本发明。例如，还可以通过甲基化敏感的限制性酶来实现DNA的甲基化特异性修饰，其中的一些酶通常切割非甲基化DNA片段但不切割甲基化DNA片段，而其它(例如，甲基化依赖性核酸内切酶McrBC)切割含甲基化胞嘧啶的DNA，但不切割非甲基化DNA。此外，化学修饰和限制性酶处理的组合可用于实施本发明，例如，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶分析(COBRA)(Xiong et al.1997 NucleicAcids Res.25(12):2532‑2534)。其它可利用的检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用Southern印迹或PCR分析的甲基化敏感的限制性核酸内切酶(MSRE)、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS‑PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms‑SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS‑SSCA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS‑DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS‑MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS‑DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或Southern印迹分析。示例性的甲基化敏感的DNA切割试剂例如限制性酶，包括AatII、AciI、AclI、AgeI、AscI、Asp718、AvaI、BbrP1、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、EagI‑HFTM、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI‑HFTM、NruI、Nt.BsmAI、PaeR7I、PspXI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SalI‑HFTM、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI或TspMI。
2.任选的扩增和序列分析
在以甲基化差异性方式修饰DNA之后，对处理的DNA进行基于序列的分析，以便可以确定BCL6B基因组序列的甲基化状态。在甲基化特异修饰之后且序列分析之前，任选地进行扩增反应。多种多核苷酸扩增方法是成熟的，且经常地用于研究中。例如，用于多核苷酸序列扩增的聚合酶链式反应(PCR)的一般方法是本领域内已知的，因而在本文没有详细描述。对于PCR方法、步骤和设计引物的原理的综述，参见例如，Innis,et al.,PCR Protocols:AGuideto Methodsand Applications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR试剂和流程还可以从供应商获得，例如RocheMolecular Systems。
尽管在实施本发明中通常使用PCR扩增，但是本领域技术人员应当认识到，可以通过任何已知的方法实现相关基因组序列的扩增，例如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增和半保留序列复制或基于核酸序列的扩增(NASBA)，这些中的每一种都能提供充分的扩增。
用于测定多核苷酸序列的技术也是成熟的，且在相关研究领域中广泛实施。例如，多核苷酸测序的基本原理和一般技术在多种关于分子生物学和重组遗传学的研究报道和论文中有描述，例如，Wallace et al.,同上;Sambrook and Russell,同上,以及Ausubel et al.,同上。研究实验室中常规实施的手动或自动DNA测序方法都可以用于实施本发明。在实施本发明方法中，适于检测多核苷酸序列中的改变(例如，C→U)的其它手段包括但不限于质谱测量、引物延伸、多核苷酸杂交、实时PCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解分析、异源双螺旋分析、焦磷酸测序和电泳。
IV.多肽的定量
A.获得样品
实施本发明的第一步骤是从要测试、评价或监测胃癌、发展成胃癌风险或疾病状态严重程度/进展的个体获得胃上皮的样品。应当从对照组(未患任何胃病、尤其是肿瘤的正常个体)和测试组(例如，要测试是否可能存在胃癌的个体)采集相同类型的样品。正如上面的章节中所陈述的，为了该目的，通常遵循医院和诊所中常规使用的标准程序。
为了检测测试个体中胃癌的存在或评价发展成胃癌的风险，可以采集个体患者的胃粘膜样品，并测量人BCL6B蛋白的水平，然后与标准对照进行比较。如果与对照水平比较时，观察到人BCL6B蛋白水平的降低，则认为测试个体患有胃癌或发展成胃癌的风险增加。为了监测胃癌患者的疾病进展或评价治疗功效，可以在不同的时间点采集个体患者的胃上皮样品，从而可以测量人BCL6B蛋白的水平来提供指示疾病状态的信息。例如，当患者的BCL6B蛋白水平显示出随时间大体上增加的趋势时，认为患者的胃癌的严重程度正在改善或认为患者接受的治疗是有效的。患者BCL6B蛋白水平未发生改变或甚至持续降低的趋势指示疾病的恶化和给予患者的治疗无效。通常，在患者中观察到更低的BCL6B蛋白水平指示患者所患胃癌的更严重的形式和疾病更差的预后，例如表现为较短预期寿命、更高的转移率、对治疗的抗性等。
B.制备用于BCL6B蛋白检测的样品
来自个体的胃组织样品适用于本发明，且可以通过公知的方法和前面的章节中所讨论的方法获得。在本发明的某些应用中，胃粘膜可以是优选的样品类型。
C.测定人BCL6B蛋白的水平
可以利用多种免疫学测定来检测任何具体种类的蛋白，如BCL6B蛋白。在一些实施方案中，可以通过用对多肽具有特异性结合亲和力的抗体从测试样品捕获所述多肽来进行夹心测定。然后，可以用对多肽具有特异性结合亲和力的标记抗体来检测它。可以利用微流式装置(例如微阵列蛋白芯片)来实施所述免疫学测定。还可以通过凝胶电泳(诸如二维凝胶电泳)和利用特异性抗体的Western印迹分析来检测目的蛋白(例如，人BCL6B蛋白)。或者，可以通过利用合适的抗体的标准免疫组织学技术来检测指定蛋白(例如，人BCL6B蛋白)。单克隆抗体和多克隆抗体(包括具有期望的结合特异性的抗体片段)可用于多肽的特异性检测。可以通过已知技术来产生这类抗体及它们的对具体蛋白(例如，人BCL6B蛋白)具有特异性结合亲和力的结合片段。
对于实施本发明中BCL6B蛋白水平的测定，还可以利用其它方法。例如，基于质谱测量技术已开发出多种技术来快速和精确定量靶蛋白(甚至在大量样品中)。这些方法涉及高精密仪器，例如利用多反应监测(MRM)技术的三级四极(triple Q)仪器、基质辅助激光解吸电离/电离飞行时间串联质谱仪(MALDI TOF/TOF)、利用选择性离子检测(SIM)模式的离子阱仪器以及基于电喷雾离子化(ESI)的QTOP质谱仪。参见例如，Pan et al.,JProteome Res.2009February;8(2):787797。
V.建立标准对照
为了建立用于实施本发明方法的标准对照，首先选择未患有常规定义的任何胃病(尤其是任何形式的肿瘤，例如胃癌)的一组健康人。为了利用本发明的方法筛查和/或监测胃癌，如果可以的话，这些个体符合合适的参数。任选地，所述个体为相同的性别、相似的年龄或相似的种族背景。
通过成熟的、常规使用的方法来确认所选个体的健康状态，所述方法包括但不限于个体的一般身体检查以及它们的医疗史的一般回顾。
此外，所选的健康个体组必须具有合理的样本大小，使得获自所述组的胃组织样品的人BCL6B mRNA或BCL6B蛋白的平均量/浓度能够合理代表一般健康人群中的正常或平均水平。优选地，选择的组包括至少10个人。
一旦基于所选健康对照组的每个个体中的个体值建立出BCL6B mRNA或BCL6B蛋白的平均值，该平均值或中值或代表值或特征被视为标准对照。在相同的过程中还确定标准差。在一些情况下，可以为具有不同特征(诸如年龄、性别或种族背景)的单独定义的组建立单独的标准对照。
VI.胃癌的治疗
通过证明BCL6B蛋白的抑制表达与胃癌的相关性，本发明还提供了治疗胃癌患者的方法：通过增加BCL6B蛋白表达或生物活性。本文所用的胃癌治疗包括减轻、逆转、缓解或消除胃癌的一种或多种症状，以及预防或延迟一种或多种相关症状的发生。
A.增加BCL6B表达或活性
1.编码BCL6B蛋白的核酸
可以通过使用编码功能性BCL6B蛋白的核酸来实现BCL6B基因表达的增强。所述核酸可以是在有利条件下能翻译成活性形式的BCL6B蛋白的单链核酸(诸如mRNA)或双链核酸(诸如DNA)。
在一个实施方案中，以表达盒的形式提供BCL6B编码核酸，所述表达盒通常为重组产生的，并具有与编码BCL6B蛋白的多核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些情况下，启动子是在所有或多数组织类型中指导基因表达的通用启动子。在其它情况下，启动子是特异性地在上皮细胞、尤其是胃上皮细胞中指导基因表达的启动子。给予所述核酸能增加靶组织(例如胃上皮)中的BCL6B蛋白表达。由于已知人BCL6B基因序列为GenBank登录号NM 181844.3，并且在本文作为SEQ ID NO:11提供，所以可以从所述序列、物种同系物和这些序列的变体获得合适的BCL6B编码核酸。
2.BCL6B蛋白
通过将有效量的活性BCL6B蛋白直接给予患有胃癌且表现出受抑制的BCL6B蛋白表达或活性的患者，也可以有效治疗该疾病。例如，可以通过将重组产生的具有生物活性的BCL6B蛋白给予胃癌患者来实现这点。递送基于蛋白或多肽的治疗剂的制剂和方法是本领域内公知的。
3.BCL6B蛋白的激活剂
可以用能激活BCL6B蛋白表达或增强BCL6B蛋白活性的试剂来实现BCL6B蛋白活性的增加。例如，去甲基化试剂(例如，5‑Aza)可能能够通过去除由BCL6B基因的启动子区的甲基化所引起的BCL6B基因表达的抑制来激活BCL6B基因表达。其它激活剂可以包括BCL6B启动子和/或增强子的特异性转录激活剂。可以利用本文实施例中所描述的BCL6B表达测定来筛选和鉴定这类激活剂。
BCL6B蛋白的激动剂(诸如激活抗体)是另一种BCL6B蛋白激活剂。这类激活剂通过增强BCL6B蛋白的生物活性，通常(但并非必须)通过与BCL6B蛋白和/或其相互作用蛋白的直接结合来发挥作用。这类激动剂的初步筛选可以起始于用能鉴定与BCL6B蛋白发生物理相互作用的分子的结合测定。
B.药物组合物
1.制剂
本发明的化合物可用于药物组合物或药物的制备。可以将药物组合物或药物给予个体用于治疗胃癌。
本发明所用的化合物(例如，BCL6B蛋白、编码BCL6B蛋白的核酸、BCL6B基因表达的激活剂)可用于制备包含有效量的所述化合物的药物组合物或药物，所述有效量的化合物与适于应用的赋形剂或载体组合或混合。
用于增强BCL6B表达的示例性药物组合物包含(i)包含本文所述的编码人BCL6B蛋白的多核苷酸序列的表达盒，和(ii)药学上可接受的赋形剂或载体。术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”在本文可同义使用。对于本文所述的治疗方法中的使用，可以提供治疗有效剂量的表达盒。
可以通过脂质体给予BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸，所述脂质体的作用是将缀合物靶向于特定的组织，以及增加组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、起泡剂、胶束、不溶性单层、液态晶体、磷脂分散剂、片状层等。在这些制剂中，将待递送的蛋白或核酸作为脂质体的一部分，所述待递送的蛋白或核酸是单独的或与能结合例如所靶向的细胞(例如，皮肤细胞)中广泛存在的受体的分子或其它治疗性或免疫原性组合物联合。因此，用本发明的蛋白或核酸填充的脂质体可被引导至治疗位点，然后在该治疗位点，所述脂质体递送所选的蛋白或核酸组合物。用于本发明中的脂质体由标准囊泡形成脂质形成，所述囊泡形成脂质通常包括中性和带负电的磷脂和甾醇(例如胆固醇)。通常考虑以下因素来指导脂质的选择，例如，脂质体尺寸、血流中脂质体的酸不稳定性和稳定性。可获得用于制备脂质体的多种方法，如在例如Szoka etal.(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467,美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所描述的。
可以利用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂、通过标准技术制备用于本发明中的药物组合物或药物。合适的药物载体在本文和E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中有描述。可以将本发明的化合物和药剂及它们的生理学上可接受的盐及溶剂化物制备用于通过任何合适的途径进行给药，包括吸入给药、局部给药、经鼻给药、经口给药、肠胃外给药或直肠给药。
用于局部给药的典型剂型包括乳膏、软膏、喷雾、洗液和膏药。然而，药物组合物可以被配制成用于任何类型的给药，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鼻内注射、大脑内注射、气管内注射、动脉内注射、腹膜内注射、膀胱内注射、胸膜内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射。还考虑通过吸入(例如，气雾剂)给药或口服给药、直肠给药或阴道给药的剂型。
2.给药途径
用于局部施加于例如皮肤和眼部的合适剂型优选本领域内公知的水性溶液、软膏、乳膏或凝胶。这种剂型可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
用于经皮施加的合适剂型包括伴随载体的有效量的本发明的化合物或药剂。优选的载体包括用于辅助通过宿主皮肤的可吸收的、药学上可接受的溶剂。例如，经皮装置采用绷带的形式，所述绷带包括支持构件、含有化合物和任选载体的贮存器，任选的速率控制屏障以及将所述装置固定于皮肤的部件，所述速率控制屏障能以受控和预定的速率在长的时间段内将化合物递送至宿主皮肤。还可以使用基质经皮剂型。
对于口服给药，药物组合物或药物可以采用例如用药学上可接受的赋形剂通过常规方式制备的片剂或胶囊的形式。优选的是包含以下的片剂和明胶胶囊：活性成分(即BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸)，以及(a)稀释剂或填充剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素(例如，乙基纤维素、微晶纤维素)、糖胶、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙，(b)润滑剂，例如，硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、醋酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂还可以包含(c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基纤维素；如果需要还可以包含(d)崩解剂，例如，淀粉(例如，马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐(酯)、琼脂、褐藻酸或其钠盐、或起泡混合物，(e)润湿剂，例如，月桂基硫酸钠和/或(f)吸收剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。
还可以根据本领域内已知的方法用薄膜包被片剂或用肠衣包被片剂。用于口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者可以将它们提供为干的产品，用于在使用前用水或其它合适介质复原。可以用药学上可接受的添加剂、通过常规方式制备这种液体制剂，所述添加剂例如，悬浮剂，例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食脂肪；乳化剂，例如，卵磷脂或阿拉伯树胶；非水性介质，例如，杏仁油、油酯、乙醇或分级的植物油；以及防腐剂，例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。视情况，所述制剂还可以含有缓冲盐、芳香剂、着色剂和/或甜味剂。需要时，口服给药的制剂可以被适当配制以实现活性化合物的控释。
本发明的化合物和药剂可以配制成通过注射的肠胃外给药，例如通过弹丸注射或连续输注。可以以单位剂量形式提供用于注射的剂型，例如，添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器。可注射的组合物优选是水性等渗溶液或悬浮液，并且优选由脂肪乳剂或悬浮液制备栓剂。组合物可以是无菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。或者，活性成分可以为粉末形式，在使用前用合适的介质(例如，无菌无热原的水)复原。此外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。分别按照常规的混合、粒化或包被方法来制备组合物，且组合物含有约0.1至75%，优选约1至50%的活性成分。
为了通过吸入给药，可以用合适的推进剂从加压包或或喷雾器中以气雾剂喷雾的方式方便地递送活性成分(例如，BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸)，所述推进剂例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压气雾剂而言，可以通过提供阀来递送既定的量，从而确定剂量单位。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊或明胶盒可以被制备成含有化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(例如，乳糖或淀粉)。
还可以将本发明的化合物和药剂配制在直肠组合物中，例如，栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基质，例如，可可油或其它甘油酯。
此外，可以将活性成分配制成贮库制剂。这种长效剂型可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或肌肉内注射来给药。因此，例如，活性成分可以与合适的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者可以被配制成难溶的衍生物，例如，难溶性盐。
本发明的药物组合物或药物包含(i)有效量的本文所述的能提高BCL6B蛋白水平或活性的化合物，和(ii)另一种治疗剂。当与本发明的化合物一起使用时，所述治疗剂可以单独使用、依次使用或与一种或多种其它这类治疗剂(例如，第一治疗剂、第二治疗剂和本发明的化合物)联合使用。可以通过相同或不同的给药途径进行给药或可以在同一药物制剂中进行给药。
3.剂量
可以以能预防、治疗或控制本文所述的胃癌的治疗有效剂量给予个体药物组合物或药物。以足以引起个体中有效的治疗反应的量给予药物组合物或药物。
所给予的活性剂的剂量取决于个体的体重、年龄、个体状况、待治疗的区域的表面积或体积以及给药形式。剂量大小还由具体个体中具体化合物的给药所伴随的任何不良反应的存在、性质和程度来决定。例如，每种BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸都可能具有独特的剂量。用于口服给予约50至70kg的哺乳动物的单位剂量可以含有约5至500mg的活性成分。通常，本发明的活性化合物的剂量是足以实现期望效应的剂量。最佳给药方案可以从个体体内的药剂累积的测量值来计算。通常，可以每天、每周或每月一次或多次地给予剂量。本领域技术人员能够容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。
为了实现期望的治疗效应，可以以治疗有效的每日剂量分多日给予化合物或药剂。因此，能治疗个体中本文所述的相关疾病状态或疾病的化合物的治疗有效给药需要周期性(例如，每日)给药，持续3天至两周或更长的时间。通常，药剂的给药持续至少连续3天，通常至少连续5天，更通常至少连续10天，有时连续20、30、40或更多天。尽管连续的每日给药是达到治疗有效剂量的优选途径，但是，即使没有每天给予药剂也能实现治疗有利效应，只要足够频繁地重复给药以维持个体中药剂的治疗有效浓度。例如，可以每隔一天、每三天给予药剂，或者如果使用更高的剂量范围并且能被个体所耐受，则每周给予一次。
所述化合物或药剂的最佳剂量、毒性或治疗功效可以随个体化合物或药剂的相对效力而不同，并且可以通过利用细胞培养物或实验动物的标准药学方法来测定，例如，通过测定LD50(导致50%的群体死亡的剂量)和ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)。毒性效应和治疗效应的剂量比是治疗指数，且可以表示为比值LD50/ED50。优选表现出大的治疗指数的药剂。尽管可以使用表现出毒副作用的药剂，但是应当考虑设计能将这类药剂靶向于受累组织位点的递送系统，从而使对正常细胞的潜在破坏最小化，进而降低副作用。
例如，从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定人类中使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选位于包括ED50但具有较小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂量形式和给药途径。对于本发明方法中所用的任何药剂，首先可以从细胞培养测定估算治疗有效剂量。可以以动物模型制定剂量，以实现包括细胞培养所测定的IC50(能实现症状的最大抑制的一半的药剂浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地确定人类可用的剂量。例如，可以通过高效液相色谱(HPLC)测量血浆中的水平。通常，对于典型的个体，药剂的剂量当量为约1ng/kg至100mg/g。
提供了本文所述的BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸的示例性剂量。当玻璃体内给药时，BCL6B编码核酸(例如表达盒)的剂量可以为0.1‑0.5mg/眼(例如，5‑30mg/kg)。可以以5‑1000mg口服给予小的有机化合物激活剂，或以10‑500mg/ml静脉内输注小的有机化合物激活剂。可以按照以下量通过静脉内注射或输注给予单克隆抗体激活剂：50‑500mg/ml(120分钟的时间内)；1‑500mg/kg(60分钟的时间内)；或1‑100mg/kg(弹丸注射)，每周5次。可以以10‑500mg皮下给予BCL6B蛋白或肽激活剂；以0.1‑500mg/kg每天两次或约50mg每周一次或25mg每周两次静脉内给予BCL6B蛋白或肽激活剂。
可以单独给予本发明的药物组合物，或可以将其与至少一种其它治疗性化合物联合给药。示例性的有利的治疗性化合物包括全身和局部抗炎药、止疼药、抗组织胺药、麻醉化合物等。其它治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，BCL6B蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药、或者甚至在同一组合物中进行给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(诸如BCL6B蛋白或编码BCL6B蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药，这取决于个体的具体症状和特征。
可以在治疗过程中，根据症状的严重程度、复发的频率和对治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。本领域技术人员通常参与这种治疗方案的调整。
VII.试剂盒和装置
本发明提供了用于实施本文所述方法来评价个体中BCL6B mRNA或BCL6B蛋白水平的组合物和试剂盒，其可用于多种目的，例如检测或诊断患者中胃癌的存在、确定发展成胃癌的风险以及监测胃癌的进展。
用于实施测定BCL6B mRNA水平的试剂盒通常包括至少一种可用于与BCL6B编码序列或其互补序列的至少一个区段特异性杂交的寡核苷酸。任选地，用可检测的部分标记所述寡核苷酸。在一些情况下，所述试剂盒可以包括至少两个能在通过PCR(尤其是通过RT‑PCR)扩增BCL6B DNA或mRNA的至少一个区段中使用的寡核苷酸引物。
用于实施测定BCL6B蛋白水平的试剂盒通常包括至少一种可用于与BCL6B蛋白的氨基酸序列特异性结合的抗体。任选地，用可检测的部分标记所述抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些情况下，所述试剂盒可以包括至少两种不同的抗体，一种用于与BCL6B蛋白特异性结合(即一抗)，另一种用于一抗的检测(即二抗)，所述二抗通常与可检测的部分连接。
通常，所述试剂盒还包括合适的标准对照。标准对照指示未患胃癌的健康个体的胃上皮的BCL6B蛋白或BCL6B mRNA的平均值。在一些情况下，可以以设定值的方式提供所述标准对照。此外，本发明的试剂盒可以提供说明书手册，用于指导使用者分析测试样品和评价测试个体中胃癌的存在、风险或状态。
在另一方面，还可以以一种装置或包括一种或多种这种装置的系统来实施本发明，所述装置或系统能实施本文所述的所有或部分方法步骤。例如，在一些情况下，在收到从为了检测胃癌、评价发展成胃癌的风险或监测疾病状态进展的受试个体采集的胃组织样品(例如，胃粘膜样品)之后，所述装置或系统执行以下步骤：(a)测定样品中BCL6B mRNA或BCL6B蛋白的量或浓度；(b)将所述量或浓度与标准对照值进行比较；以及(c)提供指示个体中是否存在胃癌或个体是否有发展成胃癌的风险、或个体胃癌疾病状态是否有变化(即，恶化或改善)的结果。在其它情况下，在进行步骤(a)且将来自(a)的量或浓度输入装置之后，本发明的装置或系统执行步骤(b)和(c)的任务。优选地，所述装置或系统是部分或完全自动化的。
实施例
仅通过说明而非限制的方式提供以下实施例。本领域技术人员应当认识到，可以改变或修改各种非关键性参数来产生基本相同或相似的结果。
材料和方法
人胃样本
组织样品
在未进行任何治疗干预的12名胃癌患者于香港中文大学威尔斯亲王医院进行内窥镜检查期间，从这些患者获得来自胃原发瘤和邻近非肿瘤部分的配对活检样本。这些样品用于BCL6B基因表达水平的比较。
检查已确认患有胃腺癌的两个患者队列，以评价胃癌(GC)患者中BCL6B甲基化状态的临床显著性。第一队列(队列I)包括在广州中山大学第一附属医院诊断的208名患者，而第二队列(队列II)的101名成员在香港中文大学威尔斯亲王医院得到诊断。队列II用于进一步验证队列I中的发现。队列I包括127名男性和81名女性，平均年龄为57.2±12.7岁，而队列II包括55名男性和46名女性，平均年龄为65.6±12.9岁。还确定了其它临床病理学特征，如幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染、TNM期和分化状态。利用快速尿素酶试验(RUT)，发现在队列I中，43名患者感染幽门螺旋杆菌，98名患者为幽门螺旋杆菌感染阴性，而在队列II中，30名患者为阳性，32名患者为阴性。在队列I中，TNM I期、II期、III期和IV期的患者数为30、31、62和72，而在队列II中，四期的数量分别为15、17、29和28。在队列I中，有122名患者具有低分化的GC，57名患者具有发展为中度或高度分化的GC，而在队列II中的数量分别为39和31。部分信息并不是完整的。所有的肿瘤组织都获自进行手术时的患者。此外，将20份正常胃粘膜样品作为对照，它们也获自香港中文大学威尔斯亲王医院。
将样本在液氮中快速冷冻，并保存于–80℃用于分子学分析。剩余的组织样本在10%福尔马林中固定，并包埋于石蜡中，用于常规的组织学检查。所有个体都提供了获得研究样本的知情同意书。研究方案获得香港中文大学道德规范委员会的批准。
肿瘤细胞系
本研究中使用了9种胃癌细胞系(AGS、BGC823、Kato III、MGC803、MKN28、MKN45、SNU1、SNU16和SNU719)。将细胞系维持在含有10%胎牛血清(Gibco BRL)的RPMI‑1640培养基(Gibco BRL,Rockville,MD)中。所有这些细胞系都在95%空气和5%CO2的培养箱中37℃下培养。每2‑4天更新培养基。使用0.25%胰酶‑EDTA溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以1:3‑1:4的比例将细胞传代。 
BCL6B基因的生物信息学分析
使用加州大学圣克鲁兹分校(UCSC)的基因组生物信息学(网址：genome.ucsc.edu)的在线数据库获得BCL6B基因的相关信息。
通过CpG岛搜索工具(网址：cpgislands.usc.edu;Takai and Jones,In Silico Biol.,3(3),235‑240,2003)来预测BCL6B基因启动子区的CpG岛。CpG岛被定义为大于500bp、GC含量高于55%且观察到的/预期的CpG比高于0.65的DNA区(Takai and Jones,PNAS,99(6),3740‑3745,2002)。以上方法和和工具对于本领域技术人员是显而易见的。
基因表达分析
RNA分离
使用Qiazol试剂(Qiagen,Valencia,CA,USA)分离总RNA。首先，将约5‑10×106细胞或30mg组织在1mL Qiazol试剂中匀浆，并在室温下孵育10分钟。向每个样品加入0.2mL氯仿。将混合物剧烈振荡15秒，在室温下再静置3分钟。将样品在4℃、以12,000g离心20分钟，样品分为两层。将含RNA的上层水相转移到新管中，与0.7ml异丙醇混合，在室温下孵育10分钟，并然后在4℃、以12,000g离心10分钟。弃去上清后，用1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀两次；风干5分钟，并用不含RNA酶的水重新溶解RNA。通过用不含RNA酶的DNA酶I的消化(GE Healthcare,Buckinghamshire,England)去除DNA污染。通过使用NanoDrop ND‑1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)测量260nm/280nm的吸光度来测定总RNA的质量和获得量。纯化的RNA保存在‑80℃直至使用。
cDNA合成
使用MultiScribe逆转录酶试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)来合成cDNA。反应混合物含有1×逆转录酶缓冲液、1×dNTP、1×随机引物(试剂盒提供)、2.5U/μL逆转录酶、1U/μL RNA酶抑制剂和2μg总RNA。将混合物在25℃下孵育10分钟，然后37℃下孵育120分钟，然后85℃下孵育5分钟来使酶失活。cDNA保存在‑80℃直至其它应用。
半定量逆转录PCR(RT‑PCR)
以总体积25μL的反应进行半定量RT‑PCR，所述反应含有GeneAmp1×PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、2.5mM MgCl2、200μM每种dNTP、200nM每种引物、0.5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)和30‑50ng cDNA。PCR程序的开始为95℃持续10分钟的初始变性，然后是32–35个扩增循环(94℃持续30秒、58℃持续30秒和72℃持续30秒)，在72℃下进行10分钟的最终延伸。在紫外光下观察PCR条带并照相。用作为内参的管家基因β–肌动蛋白的表达将靶基因的表达标准化。用于扩增转录本的所有引物列在表1中。
蛋白提取
使用CytoBuster蛋白提取试剂(Merck Chemicals，Nottingham，UK)制备蛋白。将细胞以3000g离心10分钟。然后以100μL/106个细胞将沉淀重悬于CytoBuster。将混合物在室温下孵育5分钟。然后将管在4℃、以15,000g离心10分钟，并将上清转移到新管中。
十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)和Western印迹
利用5%的上层胶和10%的下层胶使40μg蛋白分离。SDS‑PAGE后，利用半干转膜仪在15V下运行40分钟，将蛋白转移到平衡过的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)。将膜在溶解于TBS/T溶液(Tris缓冲盐溶液(Invitrogen)+0.1%Tween 20(Sigma‑Aldrich))的5%脱脂奶中室温下振荡封闭1小时。
封闭后，将膜在稀释于5%脱脂奶的一抗中4℃下振荡孵育过夜。与二抗在室温下孵育1小时后，通过加强化学发光(ECL，Amersham Corporation，Arlington.Heights，IL，USA)检测蛋白。
DNA甲基化分析
基因组DNA提取
使用DNA小型试剂盒(Qiagen)，按照试剂盒实验方案从GC细胞系和组织样品分离基因组DNA。将约25mg样品在1.5mL微离心管中的180μL QIAamp ATL缓冲液和20μL蛋白酶K中56℃下裂解1小时。加入4μLRNA酶A(100mg/ml，QIAgen)，并用漩涡脉冲混合15秒，然后室温下孵育2分钟。然后，将200μL AL缓冲液加到裂解液，将样品在70℃下孵育10分钟。添加200μL无水乙醇后，用漩涡脉冲将溶液混合15秒。然后，按照生产商说明，使用QIAamp柱纯化裂解液。将基因组DNA稀释在200μL不含DNA酶的水中。通过使用NanoDrop ND‑1000(NanoDrop)测量260nm/280nm处的吸光度来测定DNA的质量和获得量。重亚硫酸钠转化
按照Tao etal.,Hum.Mol.Genet.,11(18):2091‑2101,2002所述，用偏亚硫酸氢钠修饰基因组DNA。简单而言，将溶解于30μL TE缓冲液(Sigma‑Aldrich)中的5μg基因组DNA与3.3μL的3mM NaOH混合至终浓度0.3mM，并在37℃下孵育15分钟。变性的DNA与333μL重亚硫酸盐溶液混合，并在55℃下避光处理4小时。重亚硫酸盐溶液被制备为2.4M偏亚硫酸氢钠(pH 5.0–5.2)(Sigma‑Aldrich)和0.5mM氢醌(Sigma‑Aldrich)。使用Qiaex II试剂盒(Qiagen)，按照试剂盒提供的实验方案，将处理过的DNA脱盐和纯化。然后，用0.3M NaOH在37℃下将DNA处理15分钟，并用3M醋酸铵和3体积的乙醇进行沉淀。将回收的DNA溶解于100μL TE缓冲液中(pH 8.0)并保存在‑20℃。使用5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷(“5‑Aza”)的脱甲基处理
以每个100mm皿1×105的密度接种细胞，并使细胞生长24小时。然后，用2μM 5‑氮杂‑2'‑脱氧胞苷(“5‑Aza”)(Sigma‑Aldrich)处理细胞5天。每天补充5‑Aza。使用半定量RT‑PCR评价BCL6B的基因表达。
甲基化特异性PCR(MSP)
设计甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物来评价GC细胞系中的甲基化状态。PCR混合物含有1×PCR缓冲液II(Applied Biosystems)、2mM MgCl2、200μM每种dNTP、600nM每种引物、0.5U AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems)和20ng重亚硫酸盐处理过的DNA。PCR程序为95℃持续10分钟，然后是38个扩增循环(94℃持续30秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒)，在72℃下最终延伸5分钟。在紫外灯下观察MSP条带并照相。
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶分析(COBRA)
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶分析是在重亚硫酸纳修饰后，通过利用限制性酶切位点对甲基化DNA和非甲基化DNA进行半定量的技术。利用2μL重亚硫酸盐处理的DNA的PCR扩增产生了190bp的PCR产物，其包括相对于转录起始位点的‑95至+95bp的BBCL6B启动子区(SEQID NO:18)。该区域包含9个CpG二核苷酸和1个BstUI限制性位点。用BstUI(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化PCR产物，所述BstUI在其识别序列中的CpG位点中仅具有C。BstUI切割序列5’‑CGCG‑3’，该序列被保留在重亚硫酸盐处理的甲基化DNA中，但在非甲基化DNA中则没有。DNA消化物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行分离并用溴化乙锭染色。COBRA用于描述GC细胞系、正常胃和GC样品中的甲基化状态。重亚硫酸盐基因组测序(BGS)
用COBRA中的引物扩增重亚硫酸盐处理的DNA。将PCR产物克隆入pCR4‑Topo载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)，随机选择7至8个克隆并进行测序。通过SeqScape软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行测序分析。
生物学功能分析
BCL6B的克隆和表达载体的构建
通过PCR克隆产生BCL6B基因表达载体的全长cDNA。将来自人胃的总RNA (Ambion，Austin，TX，USA)逆转录成cDNA。通过PCR扩增对应于BCL6B开放读码框(ORF)的序列。按照生产商的指导(Invitrogen)，将PCR产物亚克隆入pCDNA3.1TOPO TA表达载体。简单而言，将1μL PCR产物连接到含有240mM NaCl和12mM MgCl2的总体积2.5μL中的0.5μLTOPO载体。在室温下使混合反应孵育30分钟，然后进行热休克转化。
使用JM109化学感受态大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))细胞(Promega，Madison，WI，USA)进行热休克转化。将JM109感受态细胞(50μL)在冰上解冻，并将2μL连接产物添加到细胞。冰上孵育20分钟后，将细胞在42℃水浴中热休克45秒并不进行摇动，然后立即将管转移到冰上静置5分钟。向细胞添加S.O.C.培养基(250μL)，将管在振荡孵育器中以220rpm在37℃下振荡1小时。孵育后，将150μL细胞接种在含0.1mg/ml氨苄青霉素的Luria‑Bertani(LB)琼脂平板上并于37℃下孵育过夜。
通过PCR鉴定细菌集落。将阳性集落培养在含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。通过测序检查插入DNA。使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)分离具有非突变靶基因的质粒。简单而言，将细菌在1mL含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃下以250rpm振荡培养过夜。然后，再将0.5mL细菌培养物接种于100mL含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下以250rpm振荡生长16小时。通过4℃下6000g离心15分钟收集细菌沉淀。将沉淀重悬于10mL缓冲液P1。用10mL缓冲液P2将细菌蛋白、染色体和质粒DNA变性。将管颠倒6次，然后在室温下静置5分钟。用10mL缓冲液P3中和混合物，然后在室温下孵育10分钟。通过用QIA滤芯进行过滤来清除细胞裂解液中的碎片。将过滤后的裂解液通过重力流动施加到试剂盒中提供的树脂柱，质粒DNA与树脂柱结合。用30mL QC缓冲液通过重力流动洗涤柱，从而去除质粒制备中的所有污染物和来自细菌菌株的糖类。用15mL缓冲液QF洗脱质粒DNA。通过异丙醇沉淀将DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤DNA沉淀。将DNA沉淀风干，并用1mL不含DNA酶的水溶解。
BCL6B基因转染
将细胞以1×104‑2.5×104细胞/孔接种于不含抗生素的24孔板中，孵育约24小时，直至细胞密度达到约90%汇合。然后，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用0.8μg BCL6B和对照载体(pCDNA3.1)分别转染细胞。将稀释于50μL Opti‑MEM(Invitrogen)的Lipofectamine 2000(2.0μL)在室温下孵育5分钟。然后，将稀释于50μLOpti‑MEM的质粒DNA与Lipofectamine混合物混合。在5%CO2培养箱中37℃下孵育24‑48小时后，收获细胞，用于转基因表达的测试。对于稳定细胞系，以1∶10的比例将细胞传代至含有合适浓度的新霉素(G418)(Invitrogen)的新鲜生长培养基中。选择14‑21天之后收获稳定的转染细胞，用于功能测定。
集落形成测定
转染后两天，以1：20的比例将细胞随后分到含有RPMI1640的6孔板中，RPMI1640含有10%FBS和500μg/mL新霉素(G418)。选择14‑18天后，用70%乙醇固定细胞10分钟，并用0.5%结晶紫溶液染色10分钟。对每个集落大于50个细胞的集落进行计数。以三个独立三平行样品进行实验。
细胞活力测定
使用CellTiter 96AQueousOne溶液细胞增殖测定试剂盒(Promega)进行MTS测定，MTS测定是3‑(4,5‑二甲基噻唑‑2‑基)‑5‑(3‑羧基甲氧基苯)‑2‑(4‑磺苯基)‑2H‑四唑测定的简称。用胰酶消化转染的细胞并进行计数。将细胞以5,000个细胞/100μL稀释于RPMI1640培养基中。在96孔板中的每个孔中接种100μL细胞。在5%CO2培养箱中于37℃孵育平板。48小时后，将20μL MTS试剂添加到培养基中。将培养物在CO2培养箱中37℃下孵育30分钟‑2小时。转染后48小时，在490nm处测量样品的吸光度。该实验重复3次。
膜联蛋白V凋亡测定
膜联蛋白V是可以结合已发生凋亡但还未失去膜的完整性的细胞膜的蛋白。使用膜联蛋白V和7‑氨基‑放射菌素(7‑AAD)双染评价凋亡细胞的比例。简单而言，将用1×PBS洗涤的细胞重悬于100μL冰冷的膜联蛋白结合缓冲液中(10mM HEPES、140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4)，该缓冲液中含有5μL偶联了Alexa Fluor 488的膜联蛋白V(Invitrogen)和2μL7‑AAD染色液(50μg/mL)。室温下孵育15分钟后，将细胞与另外的400μL冰冷的膜联蛋白结合缓冲液混合，并使用流式细胞仪进行分析。
体内肿瘤发生
分别将用pCDNA3.1‑BCL6B转染的或仅用pCDNA3.1转染的BGC823细胞(0.1mL PBS中的1×107细胞)皮下注射到5周龄雄性Balb/c裸鼠的背部左侧。可观察到肿瘤之后，每两天测量肿瘤大小，持续3周。通过测量肿瘤的最长径和最短径并按照下述公式计算估计肿瘤体积(mm3)：体积=(最短径)2×(最长径)×0.5。动物的饲养和所有实验操作得到香港中文大学动物伦理学委员会的批准。3周后，处死小鼠，将肿瘤称重并固定在福尔马林中用于组织学分析。
免疫组化
在脱石蜡后的配对石蜡切片上进行免疫组化(IHC)。用配制于PBS的3%H2O2对切片进行过氧化物酶淬灭。然后将切片用水洗涤，并用正常的山羊血清预封闭10分钟。在一抗反应中，在室温下用抗BCL6B抗体(Abcam)孵育切片1小时。然后，将切片用生物素化的二抗(1:400)孵育45分钟。在PBS洗涤步骤之后，施加卵白素‑生物素复合物(Strept ABComplex;DAKO,CA)。
统计学分析
进行Mann‑Whitney U检验来分析肿瘤和邻近非肿瘤组织之间BCL6B蛋白表达的差异。进行独立样品t检验来分析对照和BCL6B过表达细胞在集落形成、MTS测定、膜联蛋白V和7‑AAD双染测定以及裸鼠肿瘤重量中的统计学显著差异。卡方检验用于分析患者特征。Kaplan‑Meier存活曲线和对数秩检验用于评价对应于BCL6B甲基化状态的整体存活数据。通过变量重复测量分析(ANOVA)确定用BCL6B表达载体和对照载体稳定转染的两组小鼠之间肿瘤生长速率的差异。当P小于0.05时，认为数据是统计学显著的；当P小于0.01时，认为数据是统计学非常显著的。
结果
BCL6B基因的数据挖掘
BCL6B
BCL6B是B‑细胞CLL/淋巴瘤6(BCL6)的同系物，并且作用为序列特异性转录阻遏蛋白。利用加州大学圣克鲁兹分校(UCSC)的基因组生物信息学数据库，本发明人获得了BCL6B基因位于染色体17p13.1的信息。BCL6B编码具有480个氨基酸的转录阻遏蛋白。
BCL6B CpG岛
利用CpG岛搜索工具，跨越启动子区和第一外显子鉴定出CpG岛：GC含量为63%；观察到的/预期的CpG比为0.668；在902bp的区(SEQ IDNO:20)中有58个CpG位点。按照CpG岛分析结果，设计MSP引物和COBRA/BGS引物(图1和表1)。图1显示了BCL6B的启动子区和第一外显子的一部分。将转录起始位点标记为TSS。还给出了COBRA/BGS区和COBR/BGS区内的9个CpG位点。
BCL6B基因表达
BCL6B在大多数人体组织中表达
为了确定BCL6B的表达谱，在人正常组织中检测BCL6B的表达水平。利用半定量RT‑PCR，本发明人发现BCL6B在大多数人体组织中均表达，尤其在诸如肝脏、脾脏、胰腺、胃、小肠、结肠和直肠的消化器官。
癌细胞系中BCL6B受表观遗传学上的抑制
为了表征BCL6B在GC中的表观遗传学效应，检测了9种GC细胞系中的BCL6B基因的表达水平和甲基化状态。图2显示了GC细胞系中的BCL6B mRNA表达和启动子甲基化。通过RT‑PCR来确定细胞系中BCL6B的mRNA表达。进行β‑肌动蛋白的扩增作为RNA质量的内参。进行MSP和COBRA来检测甲基化状态。(M:通过甲基化引物扩增的条带，U:通过非甲基化引物扩增的条带)
BCL6B基因在9种(100%)细胞系中降低或沉默，但在正常胃组织中明显表达(图2)。
为了评价BCL6B的沉默或下调是否与启动子区的甲基化状态匹配，利用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行MSP和COBRA。MSP扩增子覆盖相对于转录起始位点的‑59bp~+48bp的区域(该区域的DNA序列如SEQ ID NO:9所示)。在8种GC细胞系(AGS、BGC823、KatoIII、MGC803、MKN28、MKN45、SNU1和SNU719)中检测到完全或部分的甲基化。除SNU16细胞系之外的GC细胞系中的甲基化状态与BCL6B表达水平良好匹配，在SNU16细胞系中，BCL6B被沉默，当没有检测到甲基化。SNU16中BCL6B基因可能由其它机制沉默，例如组蛋白修饰或上游转录调控。
在去甲基化处理之后，BCL6B表达能够恢复
为了证实BCL6B表达受启动子甲基化的抑制，使用5‑Aza在药理学上干扰AGS、MKN28、NCI87和SNU719的甲基化细胞系中的启动子甲基化。图3显示了通过RT‑PCR测定的5‑Aza去甲基化处理的GC细胞系中的BCL6B基因表达。如图3所示，5‑Aza处理能够恢复所有这些细胞系中BCL6B的表达，说明启动子甲基化对GC细胞系中BCL6B的表观遗传学抑制起到贡献。
在配对的癌症样品和邻近的正常样品中的BCL6B表达
为了评价原发肿瘤中BCL6B基因的临床显著性，本发明人利用免疫组化(IHC)比较了12对GC活检样品及与其邻近的非肿瘤组织中BCL6B的表达水平。从1(阳性染色细胞少于20%)到3(阳性染色细胞多于50%)对BCL6B染色的程度进行评分，并由两位独立的研究者以盲法的形式进行评分，两位研究者的评价的相关性很好。我们发现，与邻近的非肿瘤组织相比，原发肿瘤样本中的BCL6B蛋白被显著下调(P<0.001，图4A和4B)。
功能测定
BCL6B对细胞增殖的抑制
通过细胞活力测定和集落形成测定，检测不表达BCL6B的细胞系(AGS和BGC823)中BCL6B对细胞生长的体外生物学效应。利用MTS测定测量细胞活力。这些GC细胞系中BCL6B的异位表达导致细胞活力显著下降(图5)。通过集落形成测定进一步证实对GC细胞生长的抑制效应。BCL6B转染的细胞中所形成的集落显著少于和小于(在大小上)空载体转染的细胞(下降至载体对照的22%‑44%，P<0.01)(图6)。集落形成和MTS测定两者有力地证实了BCL6B能够体外抑制GC细胞的细胞生长。BCL6B对细胞凋亡的诱导
为了检测凋亡对所观察到的BCL6B转染细胞的生长抑制的贡献，利用膜联蛋白V和7‑AAD双染、通过流式细胞术测定细胞凋亡。
结果表明，与对照载体转染的AGS细胞相比，BCL6B转染的AGS细胞中的早期凋亡细胞(13.14%±0.65%相比于6.58%±0.52%,P<0.001)和晚期凋亡细胞(5.82%±0.63%相比于4.30%±0.16%,P<0.05)的数量均增加。与对照载体转染的细胞相比，BCL6B转染的BGC823细胞中的早期凋亡细胞(15.99%±0.15%相比于10.42%±0.63%,P<0.001)和晚期凋亡细胞(6.86%±0.42%相比于4.53%±0.62%,P<0.01)的比例均显著增加。
体内肿瘤抑制
将BGC823/BCL6B或对照细胞系BGC823/载体随机注射入裸鼠的背侧，以比较体内肿瘤生长模式。
稳定转染了BCL6B或空载体的BGC823的体内肿瘤生长曲线如图7A所示。BCL6B转染的裸鼠中的肿瘤体积显著小于与载体对照小鼠(P<0.0001)。在实验结束时，分离肿瘤并称重。BCL6B转染的裸鼠中的平均肿瘤重量显著低于载体对照小鼠(P<0.05)(图7B)，这表明BCL6B在胃癌发生中起到肿瘤抑制物的作用。
GC患者中的甲基化状态
BCL6B表达在原发瘤及其邻近的非肿瘤组织中显著不同，并表明与癌细胞系中甲基化状态的相关性。
利用BGS评价GC细胞系中的甲基化状态
进行BGS以评价4种GC细胞系(AGS、BGC823、Kato III和SNU16)的甲基化状态。BGS结果与MSP和COBRA的结果一致(图8)。
GC组织和正常胃组织中的甲基化状态
通过COBRA研究来自两个独立队列和20个正常胃活检样本的309例原发胃癌中的BCL6B甲基化状态。在169个肿瘤组织(309中的169，55%)中检测到异常的甲基化。而20个正常胃活检样本未显示出甲基化(图9A)，这指示BCL6B甲基化是肿瘤特异性的。一些样品的详细BGS分析还证实了：BCL6B启动子在原发GC中被频繁地甲基化，而在正常的胃组织中则没有(图9B)。
BCL6B甲基化和临床特征之间的关联
为了评价BCL6B在胃肿瘤中的临床应用，本发明人分析了BCL6B甲基化和临床特征之间的相关性，所述临床特征包括两队列中的患者年龄、性别、肿瘤分期、幽门螺旋杆菌感染状态、劳伦型、肿瘤分化和存活数据。在队列I中，BCL6B甲基化和诸如年龄、幽门螺旋杆菌感染状态、组织分型或病理分期的临床病理学特征之间没有相关性，但发现在队列II中，BCL6B甲基化仅与劳伦型相关。
在队列I的单变量Cox回归分析中，BCL6B甲基化与癌症相关死亡风险的显著增加相关(RR：1.60；95%置信区间：1.07‑2.39；p=0.023)。肿瘤分期(P<0.0001)也是结果的显著预测因素。在对潜在的混杂因素进行调整之后，多变量Cox回归分析表明：BCL6B甲基化是GC患者较差存活的预测因素(RR：2.14；95%置信区间：1.36‑3.36；P=0.001)。多变量分析揭示：肿瘤TNM分期是总体存活的另一独立预测因素。与IV期肿瘤相比，I‑III期患者具有显著较好的存活。如Kaplan‑Meier存活曲线所示，BCL6B甲基化的胃癌患者相比其他患者具有显著更短的存活(P=0.021,对数秩检验)(图10A)。
队列II用于进一步验证队列I中的发现。相似地，队列II的单变量Cox回归分析指示：BCL6B甲基化与癌症相关死亡风险的显著增加相关(RR：1.92；95%置信区间：1.13‑3.25；p=0.016)。肿瘤分期(P<0.006)也是结果的显著预测因素。在多变量Cox回归分析中，显示出BCL6B甲基化与存活的相关性为边界值(P=0.055)。如Kaplan‑Meier存活曲线所示，BCL6B甲基化的胃癌患者相比其他患者具有显著更短的存活(P=0.012,对数秩检验)(图10B)。
将本申请中引用的所有专利、专利申请以及其它出版物(包括GenBank登录号)的全文通过引用并入本文，并用于所有目的。
表1.本研究中所用的引物的DNA序列