一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210451128.0	申请日：	2012.11.12
公开号：	CN102994423A	公开日：	2013.03.27
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 1/20申请公布日:20130327\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20121112\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; A23K3/02; C12R1/25(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	北京和美科健生物技术有限责任公司
发明人：	于洁; 高鹏飞
地址：	100176 北京市大兴区经济技术开发区宏达北路12号B幢三区二层208室
优先权：
专利代理机构：	北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129	代理人：	李正清
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内容摘要

一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌。技术方案是：其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（L.plantarum Ps-8）已于2011年10月28日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.5359。本发明还公开了其应用方法。

权利要求书

权利要求书一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Ps‑8），是从130株植物乳杆菌中筛选出的具有降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1含量的特性；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5359。
如权利要求1所述所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体制备方法如下：
原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至2‑3cm；
菌株活化：将冷冻保存的L.plantarum Ps‑8接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18‑22h，如此传代培养2‑3次得到所述的活化L.plantarum Ps‑8菌种；
菌粉的制备，将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉碎制成菌粉，使其活菌数达到1×1010cfu/g。
青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在65%‑70%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中（180×260cm），将上述制备的菌液以1×105cfu/g的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵；
青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵20‑30天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。
提供一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌（L.plantarum Ps‑8）及其应用。

说明书

说明书一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株青贮用乳酸菌，具体是一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类结构和理化性质相似的真菌次级代谢物，分别为B1、B2、G1、G2、M1和M2等，在所有黄曲霉毒素中，B1的毒性最强且化学性质最稳定，它具有很强的致癌性、致突变性和致畸形，是国际上认可的A类致癌物。黄曲霉毒素中毒（Aflatoxicosis）主要表现在动物采食量降低、生长速度缓慢、组织器官受损以及影响原始细胞的发育和胎儿的分化。
我国饲料工业起步相对较晚，对霉菌毒素的防控欠缺，霉菌毒素是影响饲料养殖业发展的重要因素，饲料的质量安全不仅关系到畜禽动物的生命和经济效率，更关键的是直接影响到人们的身体健康和生命安全。尤其是饲料中黄曲霉毒素的危害，更应引起人们的高度警惕和重视。因此掌握黄曲霉毒素的防治措施，对保障粮油食品质量安全和确保动物性食品安全尤为重要。目前，生物去除黄曲霉毒素由于效率高、无毒副作用越来越受到关注。
乳酸菌是近年来正在推广的青贮微生物添加剂，一些研究表明乳酸菌的代谢产物乳酸、醋酸、苯乳酸、丙酸和蛋白类等物质具有抑制黄曲霉生长和产毒素的能力，乳酸菌在生长过程中形成的代谢物可以抑制毒素合成或将毒素转化成无毒性的物质，乳酸菌还可通过细胞壁成分吸附黄曲霉毒素，达到去除真菌毒素的目的。所以乳酸菌在降低饲料中黄曲霉毒素具有广阔的发展前景。
本发明针对上述课题，从分离自自然发酵饲料的130株植物乳杆菌中，筛选出一株具有抑制霉菌、降低黄曲霉毒素、改善青贮饲料品质的植物乳杆菌（L.plantarum Ps‑8）。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌及其应用。
本发明是通过下述技术方案实现的。
一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（L.plantarum Ps‑8）已于2011年10月28日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.5359。
所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体制备方法如下：
原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至2‑3cm。
菌株活化：将冷冻保存的L.plantarum Ps‑8接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18‑22h，如此传代培养2‑3次得到所述的活化L.plantarum Ps‑8菌种。
菌粉的制备：将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉碎制成菌粉，使其活菌数达到1×1010cfu/g。
青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在65%‑70%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中（180×260cm），将上述制备的菌粉以1×105cfu/g的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵20‑30天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。
本发明提供的植物乳杆菌具有下述的积极效果：
本发明L.plantarum Ps‑8在青贮饲料中具有抑制霉菌生长的特性。
本发明L.plantarum Ps‑8添加到青贮饲料中可以降低饲料中黄曲霉毒素B1的含量、提高青贮饲料的品质。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素B1的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（L.plantarum Ps‑8）已于2011年10月28日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.5359。
所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体制备方法如下：
原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至2‑3cm。
菌株活化：将冷冻保存的L.plantarum Ps‑8接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18‑22h，如此传代培养2‑3次得到所述的活化L.plantarum Ps‑8菌种。
菌粉的制备：将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉碎制成菌粉，使其活菌数达到1×1010cfu/g。
青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在65%‑70%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中（180×260cm），将上述制备的菌粉以1×105cfu/g的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵20‑30天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。
L.plantarum Ps‑8在青贮玉米饲料中抑制霉菌的特性的检验方法如下：
将菌粉加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。以1×105cfu/g的接种量接种到玉米原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。分别在发酵3、7、10、15、30天时，称取10g青贮饲料，加入90ml灭菌水，充分震荡，再用灭菌水以十倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取适当的稀释液100μL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar），30℃恒温培养箱中厌氧培养48h后，对霉菌进行计数。青贮发酵过程中的霉菌动态变化见表1。
表1青贮玉米发酵过程中的霉菌数量动态变化

由实验结果可知，添加L.plantarum Ps‑8的青贮玉米和对照组相比，霉菌数量明显减少，10天时对照组中霉菌数量为2.10lg cfu/g，而试验组中未检测到霉菌，这表明添加L.plantarum Ps‑8后，可以有效的抑制霉菌的生长。
L.plantarum Ps‑8降低青贮玉米中黄曲霉毒素B1的含量测定。
将菌粉加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。以1×105cfu/g的接种量接种到玉米原料中，以1×105cfu/g的接种量接种到玉米原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机包装后，置于储藏室进行发酵。发酵30天即发酵成熟后，称取10g青贮饲料，加入90ml灭菌水，充分震荡后取汁液进行pH值、有机酸和氨态氮的测定。再取适量青贮饲料置于65℃烘箱中风干至恒重，并将其粉碎后，称取1g左右采用酶联免疫测试盒来测定黄曲霉毒素B1的含量。
表2玉米青贮饲料发酵30天时的发酵特性（注：ND,未检出）

由表3可知，同对照组相比，添加乳酸菌的青贮玉米饲料中的乳酸、醋酸含量均有增加，且无丙酸，氨态氮含量减少，黄曲霉毒素B1的含量显著降低，饲料的品质得到很大改善。

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1、(10)申请公布号 CN 102994423 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994423 A *CN102994423A* (21)申请号 201210451128.0 (22)申请日 2012.11.12 CGMCC No. 5359 2011.10.28 C12N 1/20(2006.01) A23K 3/02(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (71)申请人北京和美科健生物技术有限责任公司地址 100176 北京市大兴区经济技术开发区宏达北路 12 号 B 幢三区二层 208 室 (72)发明人于洁高鹏飞 (74)专利代理机构。

2、北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 代理人李正清 (54) 发明名称一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌及其应用 (57) 摘要一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌。技术方案是：其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（L.plantarum Ps-8）已于 2011 年 10 月 28 日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号： CGMCC No.5359。本发明还公开了其应用方法。 (83)生物保。

3、藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Ps-8），是从 130 株植物乳杆菌中筛选出的具有降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 含量的特性；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号： CGMCC No.5359。 2. 如权利要求 1 所述所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体。

4、制备方法如下：原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至 2-3cm ；菌株活化：将冷冻保存的 L.plantarum Ps-8 接种于 MRS 液体培养基中，在温度 37下培养 18-22h，如此传代培养 2-3 次得到所述的活化 L.plantarum Ps-8 菌种；菌粉的制备，将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉碎制成菌粉，使其活菌数达到 11010cfu/g。青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在 65%-70%，称取 100g 原料装入真空包装塑料袋中（180260cm），将上述制备的菌液以1105cfu/g的接种量接。

5、种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵；青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵 20-30 天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。 3. 提供一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌（L.plantarum Ps-8）及其应用。权利要求书 CN 102994423 A 2 1/3 页 3 一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌及其应用技术领域 0001 本发明涉及一株青贮用乳酸菌，具体是一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲。

6、料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌及其应用。背景技术 0002 黄曲霉毒素 (Aflatoxin， AFT) 是一类结构和理化性质相似的真菌次级代谢物，分别为 B1、 B2、 G1、 G2、 M1 和 M2 等，在所有黄曲霉毒素中， B1 的毒性最强且化学性质最稳定，它具有很强的致癌性、致突变性和致畸形，是国际上认可的 A 类致癌物。黄曲霉毒素中毒（Aflatoxicosis）主要表现在动物采食量降低、生长速度缓慢、组织器官受损以及影响原始细胞的发育和胎儿的分化。 0003 我国饲料工业起步相对较晚，对霉菌毒素的防控欠缺，霉菌毒素是影响饲料养殖业发展。

7、的重要因素，饲料的质量安全不仅关系到畜禽动物的生命和经济效率，更关键的是直接影响到人们的身体健康和生命安全。尤其是饲料中黄曲霉毒素的危害，更应引起人们的高度警惕和重视。因此掌握黄曲霉毒素的防治措施，对保障粮油食品质量安全和确保动物性食品安全尤为重要。目前，生物去除黄曲霉毒素由于效率高、无毒副作用越来越受到关注。 0004 乳酸菌是近年来正在推广的青贮微生物添加剂，一些研究表明乳酸菌的代谢产物乳酸、醋酸、苯乳酸、丙酸和蛋白类等物质具有抑制黄曲霉生长和产毒素的能力，乳酸菌在生长过程中形成的代谢物可以抑制毒素合成或将毒素转化成无毒性的物质，乳酸菌还可通过细胞壁。

8、成分吸附黄曲霉毒素，达到去除真菌毒素的目的。所以乳酸菌在降低饲料中黄曲霉毒素具有广阔的发展前景。 0005 本发明针对上述课题，从分离自自然发酵饲料的 130 株植物乳杆菌中，筛选出一株具有抑制霉菌、降低黄曲霉毒素、改善青贮饲料品质的植物乳杆菌（L.plantarum Ps-8）。发明内容 0006 本发明的目的在于提供一株可抑制青贮饲料中霉菌生长、降解黄曲霉毒素以及改善青贮饲料品质的降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌及其应用。 0007 本发明是通过下述技术方案实现的。 0008 一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳。

9、杆菌（L.plantarum Ps-8）已于 2011 年 10 月 28 日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号： CGMCC No.5359。 0009 所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体制备方法如下： 0010 原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至 2-3cm。 0011 菌株活化：将冷冻保存的 L.plantarum Ps-8 接种于 MRS 液体培养基中，在温度 37下培养 18-22h，如此传代培养 2-3 次得到所述的活化 L.plantarum Ps-。

10、8 菌种。 0012 菌粉的制备：将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉碎制成菌粉，使其活菌数达到说明书 CN 102994423 A 3 2/3 页 4 11010cfu/g。 0013 青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在 65%-70%，称取 100g 原料装入真空包装塑料袋中（180260cm），将上述制备的菌粉以1105cfu/g的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。 0014 青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵 20-30 天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。 0015 本发明提供的植物乳。

11、杆菌具有下述的积极效果： 0016 本发明 L.plantarum Ps-8 在青贮饲料中具有抑制霉菌生长的特性。 0017 本发明L.plantarum Ps-8添加到青贮饲料中可以降低饲料中黄曲霉毒素B1的含量、提高青贮饲料的品质。具体实施方式 0018 下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。 0019 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 0020 一株降低青贮饲料中黄曲霉毒素 B1 的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌（L.plantarum Ps-8）已于 2011 年 10 月。

12、28 日，在地址为中国北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号： CGMCC No.5359。 0021 所述乳酸菌在青贮饲料中的应用，具体制备方法如下： 0022 原料准备：将原料刈割后，保证原料清洁、无霉烂变质，切断至 2-3cm。 0023 菌株活化：将冷冻保存的 L.plantarum Ps-8 接种于 MRS 液体培养基中，在温度 37下培养 18-22h，如此传代培养 2-3 次得到所述的活化 L.plantarum Ps-8 菌种。 0024 菌粉的制备：将上述活化的菌种接种发酵、干燥、粉。

13、碎制成菌粉，使其活菌数达到 11010cfu/g。 0025 青贮饲料的调制：原料的水分含量控制在 65%-70%，称取 100g 原料装入真空包装塑料袋中（180260cm），将上述制备的菌粉以1105cfu/g的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。 0026 青贮饲料的品质检测：青贮饲料发酵 20-30 天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行霉菌计数和黄曲霉毒素检测。 0027 L.plantarum Ps-8 在青贮玉米饲料中抑制霉菌的特性的检验方法如下： 0028 将菌粉加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数。

14、在 1108cfu/ mL。以 1105cfu/g 的接种量接种到玉米原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。分别在发酵3、 7、 10、 15、 30天时，称取10g 青贮饲料，加入 90ml 灭菌水，充分震荡，再用灭菌水以十倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取适当的稀释液 100L 涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar）， 30恒温培养箱中厌氧培养 48h 后，对霉菌进行计数。青贮发酵过程中的霉菌动态变化见表 1。 0029 表 1 青贮玉米发酵过程中的霉菌数量动态变化说明。

15、书 CN 102994423 A 4 3/3 页 5 0030 0031 由实验结果可知，添加 L.plantarum Ps-8 的青贮玉米和对照组相比，霉菌数量明显减少， 10天时对照组中霉菌数量为2.10lg cfu/g，而试验组中未检测到霉菌，这表明添加 L.plantarum Ps-8 后，可以有效的抑制霉菌的生长。 0032 L.plantarum Ps-8 降低青贮玉米中黄曲霉毒素 B1 的含量测定。 0033 将菌粉加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在 1108cfu/ mL。以 1105cfu/g 的接种量接种到玉米原料中，以 1105cfu。

16、/g 的接种量接种到玉米原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机包装后，置于储藏室进行发酵。发酵 30 天即发酵成熟后，称取 10g 青贮饲料，加入 90ml 灭菌水，充分震荡后取汁液进行 pH 值、有机酸和氨态氮的测定。再取适量青贮饲料置于 65烘箱中风干至恒重，并将其粉碎后，称取 1g 左右采用酶联免疫测试盒来测定黄曲霉毒素 B1 的含量。 0034 表 2 玉米青贮饲料发酵 30 天时的发酵特性（注： ND, 未检出） 0035 0036 由表 3 可知，同对照组相比，添加乳酸菌的青贮玉米饲料中的乳酸、醋酸含量均有增加，且无丙酸，氨态氮含量减少，黄曲霉毒素 B1 的含量显著降低，饲料的品质得到很大改善。说明书 CN 102994423 A 5 。

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