蓝萼甲素的脂肪酸衍生物及其制备方法和应用 技术领域 本发明涉及蓝萼甲素 (GLA) 衍生物， 特别涉及蓝萼甲素的脂肪酸衍生物。本发明 还涉及所述蓝萼甲素的脂肪酸衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。
背景技术 唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布， 全世界约有 150 种， 我国 约有 90 种 25 个变种。其中约有 30 种民间作为药用， 作为清热解毒、 抗癌消炎、 健脾、 活血、 杭菌药来使用。 人们对该属植物的 - 菇类成分作了研究， 已从中提取了百余种药类成分。 经 药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、 抗肿瘤、 杭炎活性作用。
蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物， 分布在我国的东北、 华北， 朝鲜 . 日本， 原苏 联远东地区， 吉林省资源尤其丰富。 蓝萼香茶菜具有健胃、 清热解毒、 活血、 抗菌消炎和抗癌 活性， 用于胃炎、 肝炎初起、 感冒发热、 乳腺炎、 关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管 有一定的作用， 而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。
1981 年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素 (glaucocalyxinA) 和蓝萼乙 素 (glaucocalyxinB)， 从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧 -16 一贝壳 杉烯 (ent-15-oxo-l6-kaurene) 骨架， 而蓝萼乙素是蓝萼甲素的 14 一乙酰化物， 把两者分 别乙酰化， 得到相同的乙酰化物， 从而证实了两者的相互关系。 随后赵全成也从吉林产蓝萼 香茶菜中分得这两种二萜。
1988 年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外， 还分得蓝萼丙素 (glaucocalyxinC)， 结构为对映 -7p， 14a， 15a- 三羟基 -16- 贝壳杉 -3- 酮。Dongsa kimls， 除了从中分出蓝萼甲素、 蓝萼乙素和蓝萼丙素， 还分出了两种新二萜 glaucocalyxinD 和 glaucocalyxinE 并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、 最主要的 1H 一核磁共振、 13C 一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素， 另外王先荣等从安徽产王枣子 〔 lsodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕 中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定， 结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、 茎。不同采集期以 7-8 月份含量高， 9 月末含量下降。张 元桐等也采用反相 HPLC 测定蓝萼甲素含量， 测得蓝萼甲素含量为 1.03 ％， 平均回收率为 99.2％。
从蓝萼甲素体内外实验结果来看， 其具有较强的抗肿瘤作用， 且抗瘤谱较广， 能抑 制 Lewis 肺癌、 5180 实体型以及 HCA 实体型等实体瘤的生长， 明显增加荷腹水型 5180 腹水 型和荷 HCA 腹水型小鼠的生命延长率， 其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。
科研人员用 MTT 法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的 14 个已知对映 - 贝壳杉烯类 二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、 人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究， 其 中具有 α- 亚甲基环戊酮结构的化合物对上述 3 种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制 活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素 (GLA) 和乙素 (GLB) 结构中具有
α- 亚甲基环戊酮， 因而显示出较强的生物活性。
对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛 选及构效关系研究表明， 应用化学手段破坏分子中 α- 亚甲基环戊酮结构单元， 会显著降 低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。
由于蓝萼甲素为对映 - 贝壳杉烯类二萜化合物， 其化合物极性小， 易溶于氯仿等 非极性溶剂， 在水中不溶， 因此不适合直接作为药物进行给药 ； 蓝萼甲素体外具有明显的抗 癌作用， 但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快， 半衰期短， 尚 不能直接作为药物使用。 发明内容 鉴于蓝萼甲素 (GLA) 特别是其 α- 亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好 的抑制作用， 然而由于其极性小、 半衰期短等特点， 其不适于直接作为药物进行给药， 故现 在需要以蓝萼甲素 (GLA) 为先导化合物， 通过对先导化合物的结构改造， 来获得蓝萼甲素 的衍生物， 从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢， 而由原形排出体外， 从而提高药物 的安全性， 增加药效。
本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、 结构改良的蓝 萼甲素的脂肪酸衍生物， 从而解决 GLA 极性小、 不易溶于水、 半衰期短、 在体内消除过快等 缺陷， 从而作为治疗癌症的药物使用。
本发明的目的之二在于提供所述蓝萼甲素的脂肪酸衍生物的制备方法， 避免单纯 的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷， 并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药 效较低、 无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
本发明所公开的蓝萼甲素的脂肪酸衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质， 具 有贝壳杉烷型结构、 羰基和羟基， 是蓝萼甲素与脂肪酸的酯化物， 其分子结构的通式如下 ：
其中， R1 为或 -OH， R2 为或 -OH ；其中， R3 为 C1 ～ C6 的直链或支链烷基。 在一个优选实施例中， 所述 R1 为 所述 R2 为 所述 R3为 -CH3， 所述衍生物分子结构如下 ：
在一个优选实施例中， 所述 R1 为所述 R2 为所述 R3为 -CH2CH3， 所述衍生物分子结构如下 ：
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R1 为且 所 述 R2 为 -OH， 所 述 R3为 -CH2CH2CH3， 所述衍生物分子结构如下 ：
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R1 为 -OH 且 所 述 R2 为所 述 R3为 -CH2CH2CH3， 所述衍生物分子结构如下 ：
上述蓝萼甲素的脂肪酸衍生物由于具有 GLA 的 α- 亚甲基环戊酮结构， 故其对肿 瘤细胞株活性具有良好的抑制作用， 另一方面， 上述多肽类 GLA 进行了结构修饰， 解决了极 性小、 半衰期短等缺陷特点， 适于作为治疗癌症的药物使用。
上述蓝萼甲素的脂肪酸衍生物是按照以下方法进行制备的， 其包含用于制备作为 先导化合物的蓝萼甲素的步骤 1 ～ 4 以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤 5。
所述步骤 1 为提取步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 1.1 ： 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目 ；
步骤 1.2 ： 将所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物 ；
步骤 1.3 ： 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 1.4 ： 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
所述步骤 2 为溶剂处理步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ；
步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体 ；
步骤 2.3 ： 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物 ；
步骤 2.4 ： 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 2.5 ： 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ；
步骤 2.6 ： 将步骤 2.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
所述步骤 3 为树脂处理步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液 ；
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中， 起观察树脂的颜色， 在 树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中 性；
步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压回 流， 直至溶剂干， 得到固体残留物。
所述步骤 3 为重结晶步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 4.1 ： 将上述残留物与 30℃～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混 合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -23℃～ -13℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到浅黄色针状结晶 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ；
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -23℃～ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 每次 12 ～ 24 小时， 得到中间产物蓝萼 甲素 ； 所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
所述步骤 5 为衍生化步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 90 ～ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素与 4 ～ 6ml 的 C2 ～ C7 的 直链羧酸或支链羧酸的酸酐 - 吡啶溶液混合， 在室温条件下搅拌反应 8 ～ 10 小时， 进行酰 化反应 ；
所述 C2 ～ C7 的直链羧酸或支链羧酸的酸酐 - 吡啶溶液中， C2 ～ C7 的直链羧酸 或支链羧酸的酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.9 ～ 1 ∶ 1.1 ；
步骤 5.2 ： 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 15 ～ 25ml 水稀释， 随后采用 15 ～ 25ml 乙酸乙酯萃取 2 ～ 4 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥， 将所得有机 相加热至 30℃～ 40℃减压浓缩， 得到酰化的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.2 的粗产品， 将分离所得产品 溶于 15 ～ 25ml 甲醇， 过滤并将所得滤液加热至 30℃～ 40℃， 随后减压浓缩至干， 得到蓝萼 甲素的脂肪酸衍生物。
经上述制备过程所得的蓝萼甲素的脂肪酸衍生物， 由于具有 α- 亚甲基环戊酮结 构， 故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用， 可用于治疗癌症， 特别用于治疗胃癌、 肝癌、 肺 癌、 宫颈癌、 结肠癌、 肾癌。
本发明同时公开了所述蓝萼甲素的脂肪酸衍生物在治疗癌症中的应用， 特别是在 治疗胃癌、 肝癌、 肺癌、 宫颈癌、 结肠癌、 肾癌中的应用。
本发明所公开的前述任一结构的蓝萼甲素的脂肪酸衍生物可以采用药剂学上的 常规药物载体制成任何一种剂型， 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝 胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注射剂、 脂质 体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
附图说明
图 1 为蓝萼甲素与乙酸酐的反应方程式。 图 2a 为图 1 所示反应所得蓝萼甲素与乙酸酐的衍生物的 HPLC 图。 图 2b 为图 1 所示反应所得蓝萼甲素与乙酸酐的衍生物的 HNMR 图。 图 3 为蓝萼甲素与丙酸酐的反应方程式。 图 4 为图 3 所示反应所得蓝萼甲素与丙酸酐的衍生物的 HPLC 图。 图 5 为蓝萼甲素与正丁酸酐的反应方程式。 图 6 为图 5 所示反应所得蓝萼甲素与正丁酸酐的衍生物的 HPLC 图。具体实施方式
根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容， 本发明的技术方案具体如以下 实施例所述。
本发明所公开的制备方式是在吡啶存在的条件下， 将经提取处理后的蓝萼甲素与 C2 ～ C7 的直链羧酸或支链羧酸的酸酐反应， 从而制备得到本发明所公开的蓝萼甲素的脂 肪酸衍生物， 该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实施例所述 制备过程， 所采用的各种化学试剂如无特别标注， 则为分析纯。 实施例 1 ： 蓝萼甲素的制备
采用香茶菜药材 ( 地上部分 ) 作为原料， 通过提取、 溶剂处理、 树脂处理和重结晶 等步骤， 制备得到蓝萼甲素 (GLA)， 其具体过程如下 ：
步骤 1 为提取步骤， 其进一步包括 ：
步骤 1.1 ： 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目 ；
步骤 1.2 ： 将所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物 ；
步骤 1.3 ： 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 1.4 ： 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
步骤 2 为溶剂处理步骤， 其进一步包括 ：
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ；
步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体 ；
步骤 2.3 ： 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物 ；
步骤 2.4 ： 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 2.5 ： 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ；
步骤 2.6 ： 将步骤 2.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
步骤 3 为树脂处理步骤， 其进一步包括 ：
步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液 ；
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中， 起观察树脂的颜色， 在 树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中 性；
步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压回 流， 直至溶剂干， 得到固体残留物。
步骤 4 为重结晶步骤， 其进一步包括 ：
步骤 4.1 ： 将上述残留物与 30℃～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混 合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -23℃～ -13℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到浅黄色针状结晶 ； 所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ；
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -23℃～ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 每次 12 ～ 24 小时， 得到中间产物蓝萼 甲素 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 2 ： 衍生化
按照图 1 所示的反应方程式， 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素， 采用乙酸酐进行 衍生化， 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基， 得到蓝萼甲素的乙酸酯， 所述衍生化步骤 5 进 一步包括 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 90 ～ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素与 4 ～ 6ml 的乙酸酐 - 吡 啶溶液混合， 在室温条件下搅拌反应 8 ～ 10 小时， 进行酰化反应 ；
所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.9 ～ 1 ∶ 1.1 ；
步骤 5.2 ： 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 15 ～ 25ml 水稀释， 随后采用 15 ～ 25ml 乙酸乙酯萃取 2 ～ 4 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥， 将所得有机 相加热至 30℃～ 40℃减压浓缩， 得到酰化的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.2 的粗产品， 采用体积比为 10 ∶ 1 的氯仿 - 丙酮混合溶液作为展开剂， 待产物展开后， 采用紫外灯在 254nm 下检视， 刮 下样品分布带， 分离得到产物， 将分离所得产品溶于 15 ～ 25ml 甲醇， 过滤并将所得滤液加 热至 30℃～ 40℃， 随后减压浓缩至干， 得到蓝萼甲素的乙酸酯。
实施例 3 ： 衍生化
按照图 3 所示的反应方程式， 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素， 采用丙酸酐进行 衍生化， 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基， 得到蓝萼甲素的丙酸酯， 所述衍生化步骤 5 进 一步包括 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 90 ～ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素与 4 ～ 6ml 的丙酸酐 - 吡 啶溶液混合， 在室温条件下搅拌反应 8 ～ 10 小时， 进行酰化反应 ；
所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.9 ～ 1 ∶ 1.1 ；
步骤 5.2 ： 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 15 ～ 25ml 水稀释， 随后采用 15 ～ 25ml 乙酸乙酯萃取 2 ～ 4 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥， 将所得有机 相加热至 30℃～ 40℃减压浓缩， 得到酰化的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.2 的粗产品， 采用体积比为 10 ∶ 1 的氯仿 - 丙酮混合溶液作为展开剂， 待产物展开后， 采用紫外灯在 254nm 下检视， 刮 下样品分布带， 分离得到产物， 将分离所得产品溶于 15 ～ 25ml 甲醇， 过滤并将所得滤液加 热至 30℃～ 40℃， 随后减压浓缩至干， 得到蓝萼甲素的丙酸酯。
实施例 4 ： 衍生化
按照图 5 所示的反应方程式， 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素， 采用正丁酸酐进 行衍生化， 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基， 得到蓝萼甲素的正丁酸酯， 所述衍生化步骤 5 进一步包括 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 90 ～ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素与 4 ～ 6ml 的正丁酸 酐 - 吡啶溶液混合， 在室温条件下搅拌反应 8 ～ 10 小时， 进行酰化反应 ；
所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.9 ～ 1 ∶ 1.1 ；
步骤 5.2 ： 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 15 ～ 25ml 水稀释， 随后采用 15 ～ 25ml 乙酸乙酯萃取 2 ～ 4 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥， 将所得有机 相加热至 30℃～ 40℃减压浓缩， 得到酰化的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.2 的粗产品， 采用体积比为 10 ∶ 1 的氯仿 - 丙酮混合溶液作为展开剂， 待产物展开后， 采用紫外灯在 254nm 下检视， 刮 下样品分布带， 分离得到产物， 将分离所得产品溶于 15 ～ 25ml 甲醇， 过滤并将所得滤液加 热至 30℃～ 40℃， 随后减压浓缩至干， 得到蓝萼甲素的正丁酸酯。
实施例 5 ：
采用以下技术参数改进实施例 1。
步骤 1.1 中采用粉碎至 30 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 8 混合所得粉碎物与 95％ 乙醇， 加热回流的温度为 83℃， 加热回流的时间为 1.7 小时。
重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.1 中， 加热减压浓缩的温度为 58℃。
步骤 2.2 中， 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水， 搅拌后静置的时间为 8 小时。
步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯， 溶解的温度为 15℃， 静置的时间为 2.5 小时。
重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.6 中， 加热减压浓缩的温度为 38℃。步骤 3.1 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95％乙醇。
步骤 3.2 中， 采用 250ml 的 95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤 3.3 中， 加热减压回流的温度为 58℃。
步骤 4.1 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合残留物与 33℃的极性溶剂， 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 33℃， 静置析晶的温度 为 -18℃。
步骤 4.2 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合所得晶体与 33℃的极性溶剂， 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 2 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 33℃， 静置析晶的温度 为 -18℃， 静置析晶的时间为 16 小时。
重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 6 ：
采用以下技术参数改进实施例 1。
步骤 1.1 中采用粉碎至 40 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 12 混合所得粉碎物与 95％ 乙醇， 加热回流的温度为 87℃， 加热回流的时间为 1.3 小时。
重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.1 中， 加热减压浓缩的温度为 62℃。
步骤 2.2 中， 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水， 搅拌后静置的时间为 10 小 时。
步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯， 溶解的温度为 25℃， 静置的时间为 1.5 小时。
重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.6 中， 加热减压浓缩的温度为 42℃。
步骤 3.1 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95％乙醇。
步骤 3.2 中， 采用 350ml 的 95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤 3.3 中， 加热减压回流的温度为 62℃。
步骤 4.1 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合残留物与 37℃的极性溶剂， 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 37℃， 静置析晶的温度 为 -18℃。
步骤 4.2 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合所得晶体与 37℃的极性溶剂， 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 3 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 37℃， 静置析晶的温度 为 -18℃， 静置析晶的时间为 20 小时。
重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 7 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 92mg、 乙酸酐 - 吡啶溶液 4.5ml、 搅拌反应的 时间为 8.5 小时， 所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。步骤 5.2 中， 采用 16ml 水稀释， 采用 16ml 乙酸乙酯萃取 2 次， 减压浓缩的温度为 步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 16ml 甲醇， 所得滤液在 31℃条件下减压浓缩至31℃。
干。 实施例 8 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 96mg、 乙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的时 间为 8.5 小时， 所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。
步骤 5.2 中， 采用 18ml 水稀释， 采用 18ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 33℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 18ml 甲醇， 所得滤液在 33℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 9 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 100mg、 乙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的 时间为 9 小时， 所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.0。
步骤 5.2 中， 采用 20ml 水稀释， 采用 20ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 20ml 甲醇， 所得滤液在 35℃条件下减压浓缩至35℃。
干。 实施例 10 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 104mg、 乙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的 时间为 9.5 小时， 所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 22ml 水稀释， 采用 22ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 37℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 22ml 甲醇， 所得滤液在 37℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 11 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 108mg、 乙酸酐 - 吡啶溶液 5.5ml、 搅拌反应 的时间为 9.5 小时， 所述乙酸酐 - 吡啶溶液中， 乙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 24ml 水稀释， 采用 24ml 乙酸乙酯萃取 4 次， 减压浓缩的温度为 39℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 24ml 甲醇， 所得滤液在 39℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 12 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 92mg、 丙酸酐 - 吡啶溶液 4.5ml、 搅拌反应的
时间为 8.5 小时， 所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。
步骤 5.2 中， 采用 16ml 水稀释， 采用 16ml 乙酸乙酯萃取 2 次， 减压浓缩的温度为 31℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 16ml 甲醇， 所得滤液在 31℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 13 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 96mg、 丙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的时 间为 8.5 小时， 所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。
步骤 5.2 中， 采用 18ml 水稀释， 采用 18ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 33℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 18ml 甲醇， 所得滤液在 33℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 14 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。 步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 100mg、 丙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的 时间为 9 小时， 所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.0。
步骤 5.2 中， 采用 20ml 水稀释， 采用 20ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 35℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 20ml 甲醇， 所得滤液在 35℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 15 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 104mg、 丙酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的 时间为 9.5 小时， 所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 22ml 水稀释， 采用 22ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 37℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 22ml 甲醇， 所得滤液在 37℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 16 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 108mg、 丙酸酐 - 吡啶溶液 5.5ml、 搅拌反应 的时间为 9.5 小时， 所述丙酸酐 - 吡啶溶液中， 丙酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 24ml 水稀释， 采用 24ml 乙酸乙酯萃取 4 次， 减压浓缩的温度为 39℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 24ml 甲醇， 所得滤液在 39℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 17 ：
采用以下技术参数改进实施例 4。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 92mg、 正丁酸酐 - 吡啶溶液 4.5ml、 搅拌反应 的时间为 8.5 小时， 所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。
步骤 5.2 中， 采用 16ml 水稀释， 采用 16ml 乙酸乙酯萃取 2 次， 减压浓缩的温度为 31℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 16ml 甲醇， 所得滤液在 31℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 18 ：
采用以下技术参数改进实施例 4。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 96mg、 正丁酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应的 时间为 8.5 小时， 所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 0.95。
步骤 5.2 中， 采用 18ml 水稀释， 采用 18ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 33℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 18ml 甲醇， 所得滤液在 33℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 19 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 100mg、 正丁酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应 的时间为 9 小时， 所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.0。
步骤 5.2 中， 采用 20ml 水稀释， 采用 20ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 35℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 20ml 甲醇， 所得滤液在 35℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 20 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 104mg、 正丁酸酐 - 吡啶溶液 5ml、 搅拌反应 的时间为 9.5 小时， 所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 22ml 水稀释， 采用 22ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 减压浓缩的温度为 37℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 22ml 甲醇， 所得滤液在 37℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 21 ：
采用以下技术参数改进实施例 3。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 108mg、 正丁酸酐 - 吡啶溶液 5.5ml、 搅拌反 应的时间为 9.5 小时， 所述正丁酸酐 - 吡啶溶液中， 正丁酸酐与吡啶的体积比为 1 ∶ 1.05。
步骤 5.2 中， 采用 24ml 水稀释， 采用 24ml 乙酸乙酯萃取 4 次， 减压浓缩的温度为 39℃。
步骤 5.3 中， 将分离所得产品溶于 24ml 甲醇， 所得滤液在 39℃条件下减压浓缩至 干。
实施例 22 ：根据实施例 5 ～ 6 制备得到蓝萼甲素， 并将所得蓝萼甲素按照实施例 7 ～ 11 进行 衍生化， 特别是根据实施例 9， 制备得到蓝萼甲素的乙酸酯。
采用高效液相色谱 (HPLC) 和核磁共振 (HNMR) 检测上述蓝萼甲素与乙酸酐的衍生 物结构， 所得 HPLC 谱图和 HNMR 谱图分别如图 2a 和图 2b 所示。经 HPLC 和 HNMR 检测表明， 上述蓝萼甲素与乙酸酐的衍生物结构如下。
实施例 23 ：
根据实施例 5 ～ 6 制备得到蓝萼甲素， 并将所得蓝萼甲素按照实施例 12 ～ 16 进 行衍生化， 特别是根据实施例 14， 制备得到蓝萼甲素的丙酸酯。
采用高效液相色谱 (HPLC) 检测上述蓝萼甲素与丙酸酐的衍生物结构， 所得 HPLC 谱图如图 4 所示。经 HPLC 检测表明， 上述蓝萼甲素与丙酸酐的衍生物结构如下。
实施例 24 ：
根据实施例 5 ～ 6 制备得到蓝萼甲素， 并将所得蓝萼甲素按照实施例 17 ～ 21 进 行衍生化， 特别是根据实施例 19， 制备得到蓝萼甲素的正丁酸酯。
采用高效液相色谱 (HPLC) 检测上述蓝萼甲素与正丁酸酐的衍生物结构， 所得 HPLC 谱图如图 6 所示。经 HPLC 检测表明， 上述蓝萼甲素与正丁酸酐的衍生物结构如下。
实施例 25 ： 蓝萼甲素的脂肪酸衍生物制剂的制备
按照上述实施例制备得到具有实施例 22 的分子式结构的蓝萼甲素与乙酸的衍生 物， 或按照上述实施例制备具有实施例 23 的分子式结构的蓝萼甲素的丙酸衍生物， 或按照 上述实施例制备具有实施例 24 的分子式结构的蓝萼甲素的正丁酸衍生物。
将所得蓝萼甲素的脂肪酸衍生物， 采用药剂学上的常规药物载体， 并采用药剂学 上的常规制备方法， 制备成药剂学上的常规剂型， 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾 剂、 凝胶剂、 凝胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻 干注射剂、 脂质体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
实施例 26 ： 蓝萼甲素的脂肪酸衍生物针对人胃癌 AGS 细胞、 SMMC-7721 人肝癌细 胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿 瘤细胞的生长抑制作用的药效学实验
1、 药物与试剂 ：
受试样品， F-12 培养基， 10 ％灭活胎牛血清 (FBS)， 二甲基亚砜 (DMSO)， 噻唑盐 (MTT)， 阿霉素 ( 阳性药 )
2、 仪器 ：
培养箱， 超静工作台， 多功能倒置显微镜， 离心机， 自动酶标仪， 96 孔培养板。
3、 细胞株 ：
人胃癌 AGS 细胞、 SMMC-7721 人肝癌细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤 细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿瘤细胞
4、 样品配制 ：
取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的乙酸衍生物、 蓝萼甲素的丙酸衍生物、 蓝萼甲素的正丁酸衍生物， 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 得到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液， 随后震荡溶解， 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
5、 实验方法 ：
将上述肿瘤细胞培养于含 10％ FBS 的 F-12 培养基中。 取对数生长期的肿瘤细胞， 按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种于 96 孔细胞培养 板上， 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液， 实验组加入不同浓度 的受试物， 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细胞活力。每孔中加 入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl， 培养 4 小时后吸去培养液， 加 DMSO150μl， 摇床振 荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解， 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
6、 实验结果 ：
蓝萼甲素的脂肪酸衍生物对人胃癌 AGS 细胞、 SMMC-7721 人肝癌细胞、 A-549 肺癌 肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿瘤细胞增殖的影 响如下表所示
注： GLA-AC 表示蓝萼甲素的乙酸衍生物 ；
GLA- 丙酸酯表示蓝萼甲素的丙酸衍生物 ；
GLA- 正丁酸酯表示蓝萼甲素的正丁酸衍生物。
实施例 27 ： 蓝萼甲素的脂肪酸衍生物制剂的应用
根据实施例 26， 按照实施例 7 ～ 11 制备得到具有实施例 22 的分子式结构的蓝萼 甲素的乙酸衍生物， 或按照实施例 12 ～ 16 制备得到具有实施例 23 的分子式结构的蓝萼甲 素的丙酸衍生物， 或按照实施例 17 ～ 21 制备得到具有实施例 24 的分子式结构的蓝萼甲素 的正丁酸衍生物， 用于癌症的治疗， 特别是在治疗胃癌、 肝癌、 肺癌、 宫颈癌、 结肠癌、 肾癌中 的应用。
上述内容为本发明的具体实施例的例举， 对于其中未详尽描述的试剂、 设备、 操作 方法等， 应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、 设备、 操作方法等来予以实施。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用， 仅为本发明技术方案的列 举， 并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。 采用等同技术手段、 等同试剂等对本发 明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书 及说明书所公开的范围。