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1、10申请公布号CN102002498A43申请公布日20110406CN102002498ACN102002498A21申请号201010125912322申请日20100312C12N15/113201001C12N15/82200601C12N1/21200601A01H5/00200601C12R1/1920060171申请人华南师范大学地址510631广东省广州市天河区中山大道西55号72发明人阳成伟杨浪74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人林丽明54发明名称一种韧皮部特异性启动子及其应用57摘要本发明公开一种韧皮部特异性启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。
2、，该韧皮部特异性基因，能够使得外源目的基因在韧皮部专一性的表达，从而针对性的防治从韧皮部入侵的害虫和病原微生物的危害，降低对害虫及病原微生物的选择压以及由此可能对环境产生的副作用，减轻由于表达抗虫、抗病基因而给转基因植物带来的代谢负担等方面产生积极作用。另外，在双价或多价抗虫、抗病基因工程中使用与组成型启动子不同的韧皮部组织特异性启动子可以避免启动子之间同源序列的相互作用而导致基因沉默。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表2页附图4页CN102002509A1/1页21一种韧皮部特异性启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2一种重组。
3、表达载体，其特征在于该表达载体中包含权利要求1所述韧皮部特异性启动子。3根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于该载体是包含有权利要求1所述韧皮部特异性启动子的植物双元表达载体。4一种重组微生物，其特征在于该重组微生物是将权利要求2所述重组表达载体转化大肠杆菌细胞制备而得。5权利要求1所述韧皮部特异性启动子在植物生长或植物抗病育种中的应用。权利要求书CN102002498ACN102002509A1/7页3一种韧皮部特异性启动子及其应用技术领域0001本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及基因启动子的组织特异性表达，尤其涉及一种韧皮部特异性启动子及其应用。背景技术0002维管束是植物有关运。
4、输水份和内部物质以及细胞增殖的重要场所，韧皮部和木质部是维管束的组成部分。0003韧皮部PHLOEM是植物体内重要的具输导功能的一种复合组织，它不仅仅涉及运输养料有机氮、无机盐、碳水化合物等，还包括种类繁多的MRNA、蛋白质和其它大分子、信号分子等在植物体内的远距离运输，因而韧皮部的功能涉及到养料分配、信号转导、系统防御等等。0004关于韧皮部特异启动子的克隆研究已有报道，主要是来自维管束植物、植物病毒和植物病原菌等。如拟南芥蔗糖HATSUC2基因专一在光合成叶片韧皮部的伴胞中表达STADLERSAUER，BOTACTA，109299306，1996；STADLERETAL，PLANTJ，41。
5、31933，2005。ATSUC2启动子和GFP融合研究表明在伴胞中产生的GFP蛋白可以通过胞间连丝进入相邻的筛管分子并在韧皮部内迁移IMLAUETAL，PLANTCELL，11309322，1999。南瓜韧皮部特异启动子DENP驱动的外源基因在马铃薯的韧皮部特异而高效表达TIANETAL，JOURNALOFAGRICULAUALBIOTECHNOLOGY，44555558，2006。0005蚜虫等刺吸式昆虫以取食植物韧皮部汁液为生，不少病毒亦通过韧皮部进行感染，对农作物造成了巨大的损害。目前，利用基因工程技术把一些外源基因如抗虫基因导入到植物中已获得了很大的成功，0006然而，目前在转基因植。
6、物中驱动外源基因表达的启动子主要还是组成型表达的启动子，如CAMV35S，UBIQUITIN等。这些启动子使得外源基因在植物体各个部位平均表达，不能专一地在某些昆虫或病原菌等侵害的组织器官表达。而在非侵害部位表达对植物本身是一种额外负担和能源及养分的浪费。0007GLPS是一类与小麦萌发素GERMIN结构类似、位于胞外基质的可溶性糖蛋白，属于CUPINS小桶蛋白家族，它们几乎存在于所有的被子植物包括禾本科植物、裸子植物和苔藓中。通过分析GLPS家族成员之间的遗传进化关系，可以把GLPS分为5个主要的亚家族。GLPS的功能主要归纳为以下三点酶OXO、SOD、ADPPASE，结构蛋白和受体。GLP。
7、S在植物不同的生长发育阶段如花期诱导、胚胎发生、次生木质部的形成过程中都会表达并表现出重要的生物学功能，已经成为国内外研究的热点。近年来，随着对GLPS研究的不断深入，人们逐渐认识到它不仅调节了植物特定的生长发育过程，同时也参与植物对生物及非生物胁迫的抗性反应，具有十分重要的生物学意义。发明内容0008本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可使得外源基因在韧皮组织中说明书CN102002498ACN102002509A2/7页4特异、高效表达的韧皮部特异性启动子。0009本发明的另一个目的在于提供含有上述韧皮部特异性启动子的重组表达载体。0010本发明的另一个目的在于提供由上述重组表达载。
8、体转化大肠杆菌制备而得的重组微生物。0011本发明的另一个目的在于提供上述韧皮部特异性启动子在植物生长或植物抗病育种中的应用。0012本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的0013本发明人首次分离克隆得到一种类萌发素基因启动子，将该启动子克隆到双元载体中并转化农杆菌感受态细胞，接着由农杆菌介导转化拟南芥，对获得的转基因植株的T0和T1代进行组织化学染色以及石蜡切片分析，结果表明本发明的类萌发素基因启动子能够驱使GUS报告基因在韧皮部专一性表达，由此说明本发明得到一种韧皮部特异性启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，并命名为ATGLP15。0014将本发明的韧皮部特异性启动子与外源目的基。
9、因连接后，插入双元载体中构建重组表达载体，将该重组表达载体转化入植物或者植物细胞中，则可实现外源目的基因在韧皮部的特异性表达。0015上述双元载体可以为任意一种本领域技术人员常用的植物双元载体，如PBI101，PBI121等。0016上述外源目的基因可以来自同源植物，外源植物、真菌、藻类、细菌、病毒或动物基因，也可以是人工设计、合成的DNA序列。这些序列可以是一段编码有功能的蛋白质或其一部分的正义序列或一段反义序列。0017上述将重组表达载体转化植物或植物细胞，所用的转化方法可以为任何一种适合于植物或植物细胞的转化方法，如使用农杆菌介导侵染法，电击法，基因枪轰击法，花粉管导入法，细胞和原生质体。
10、显微注射法等。被转化后的细胞在适合的条件下就可再生成完整的转基因植株。0018上述欲转化的植物可以是完整的植物、植物器官例如叶、花瓣、茎、根或种子或植物组织例如表皮、韧皮部、薄壁组织或木质部，所述欲转化的植物或者植物细胞，其RNA聚合酶要能与本发明的韧皮部特异性启动子序列相结合。0019本发明的韧皮部特异性启动子的核苷酸序列的全部或者部分片段，与外源目的基因编码区的核苷酸序列相融合产生杂合基因构建体，所述杂合基因构建体的制备，可采用本领域技术人员所熟知的常用方法，如可将韧皮部特异性启动子的序列连接在目的基因编码区的核苷酸序列的5端或“上游区”。0020本发明所述的“目的基因编码区的核苷酸序列”。
11、是指任何能在MRNA水平表达的核苷酸序列。所表达的MRNA可以被翻译成蛋白或不被翻译成蛋白。0021本发明的韧皮部特异性启动子，其核苷酸序列与现有的植物启动子如PIN2启动子或者DENP启动子等都不具有同源性，而且本发明的韧皮部特异性启动子不是组成型表达的启动子，而是在植物的韧皮部专一性表达。因此，利用本发明的韧皮部特异性启动子可以使得有助于植物发育生长的基因，或者抗虫、抗病基因在韧皮组织中特异、高效表达，能够更有效、更经济的发挥目的基因的作用。0022与现有技术相比，本发明具有如下有益效果说明书CN102002498ACN102002509A3/7页500231维管束是植物有关运输水份和内部。
12、物质以及细胞增殖的重要场所，同时也是导致植物全株感染的迁移位置，本发明提供的韧皮部特异性启动子，可将参与运输水份或内部物质或细胞增殖的基因导入植物，并在维管束中特异性表达，从而使得植物调节水份或内部物质的运输或细胞增殖；00242维管束是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和转移的位置，当植物病毒感染植物时，植物病毒迁移长距离，从一片叶子移至其上面的叶子，因此，维管束也是导致植物全株感染的迁移位置。本发明提供的韧皮部特异性启动子将参与真菌或植物病毒增殖或迁移的基因导入植物，并在维管束中特异性表达，使得植物得到保护植物而免于真菌或植物病毒的感染；00253本发明的韧皮部特异性基因，能够使得外源目的基因在。
13、韧皮部专一性的表达，从而针对性的防治从韧皮部入侵的害虫和病原微生物的危害，降低对害虫及病原微生物的选择压以及由此可能对环境产生的副作用，减轻由于表达抗虫、抗病基因而给转基因植物带来的代谢负担等方面产生积极作用。另外，在双价或多价抗虫、抗病基因工程中使用与组成型启动子不同的韧皮部组织特异性启动子可以避免启动子之间同源序列的相互作用而导致基因沉默。附图说明0026图1为韧皮部特异性启动子的PCR电泳结果图；0027图2为韧皮部特异性启动子融合GUS基因载体PBI101的构建流程图；0028图3为韧皮部特异性启动子的酶切鉴定图；0029图4为ATGLP15基因启动子在转基因拟南芥中的组织化学定位图；。
14、0030图5为ATGLP15基因启动子在转基因拟南芥中的石蜡切片图；0031图6为韧皮部特异性启动子驱动的GUS报告基因在转基因烟草中的组织化学定位和石蜡切片图。具体实施方式0032下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。0033实施例1韧皮部特异性启动子的获得00341拟南芥的培养0035拟南芥种子放在15ML离心管中，先用75酒精消毒12MIN，再用1的次氯酸钠消毒35MIN，无菌水冲洗5次后，用枪头点播在灭菌的MS固体培养基15蔗糖，08琼脂，PH58上，避光，4春化2D后，转到光照培养间，温度22/18日/夜，16H/8H光周期，白炽灯光照培养。0。
15、0362采用本领域常规的TRIZOL法提取拟南芥RNA。00373RTPCR检测003831逆转录反应CDNA合成0039用MMLV反转录酶进行逆转录反应，反应体系和反应条件参考相关试剂盒说明即可。说明书CN102002498ACN102002509A4/7页6004032目的基因的RTPCR扩增0041设计带酶切位点的引物进行ATGLP15启动子的扩增，引物序列如下0042P1，其核苷酸序列如SEQIDNO2所示；0043P2，其核苷酸序列如SEQIDNO3所示。0044PCR反应体系DDH2O154L、10TAQBUFFER2L、10MMDNTPMIX05L、P110MOL/L04L、P2。
16、10MOL/L04L、DNA模板1L和TAQ酶5U/L03L。0045PCR反应程序94变性2MIN，然后按9430S、5530S、7230S进行30个循环，最后在72下延伸10MIN。00464PCR扩增结果0047PCR扩增结果如图1所示泳道M为分子量标准，泳道1为760BP左右的目的条带。0048将电泳中的目的片段经过一系列本领域技术人员的常规操作，如切胶回收、T载体连接、转化大肠杆菌细胞和阳性克隆筛选等，将最终的阳性克隆送交测序。0049测序结果显示，本实施例得到一条长约762BP的序列，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，并命名为ATGLP15。0050将该序列与已发现的韧皮部特异性。
17、表达启动子序列进行比对，发现该序列为首次报道。0051实施例2植物韧皮部特异性启动子ATGLP15双元表达载体的构建0052将实施例1制备所得韧皮部特异性启动子与植物表达载体PBI101连接，得到重组表达载体PBAG；用PBAG转化大肠杆菌ECOLIDH5，筛选出阳性克隆，用阳性克隆质粒转化农杆菌ATUMEFACIENSEHA105，从而制备得到所需植物韧皮部特异性启动子双元表达载体命名为PBAG，具体构建流程图如图2所示。0053将重组表达载体PBAG提取质粒后，用SALI和SMAI进行双酶切检测，电泳结果如图3所示图1中泳道M为分子量标准，泳道1、2均为双元表达载体PBAG酶切后的产物。0。
18、054上述植物表达载体PBI101、大肠杆菌ECOLIDH5和农杆菌ATUMEFACIENSEHA105均为本领域技术人员常用的实验材料，上述操作中的载体连接、大肠杆菌细胞的转化以及农杆菌的转化均为本领域的常规操作。0055实施例3农杆菌介导的拟南芥遗传转化00561农杆菌介导的拟南芥遗传转化0057首先，将野生型拟南芥播种于直径10CM的花盆中，主茎高约3CM时去除其顶生花序，注意避免伤害腋生花序，待腋生花序长出，其下部的花开始授粉时进行转化。转化前，将已授粉的花及果荚去掉。然后，挑取实施例2中制备得到的双元表达载体阳性单菌落接种于5ML含有抗生素KAN和RIF的LB液体培养基中，28摇菌过。
19、夜。将培养得到的菌液倒入500ML含同样抗生素LB液体培养基中，28摇菌过夜。将菌液倒入6个50ML离心管中，4000G离心2MIN，收集菌体。用5蔗糖转化液悬浮菌体，然后浸泡转化野生型拟南芥，每组植物浸泡15MIN。用塑料膜覆盖转化后的植物1D以保持湿润。转化后的植株继续在培养室中生长，待成熟后收集种子。将收集的种子铺在含有50G/LKAN的MS平板筛选转基因植株。00582拟南芥的组织化学染色分析说明书CN102002498ACN102002509A5/7页70059取不同时期的拟南芥植株或组织置于GUS染液02MOL/LNA3PO4缓冲液内含62ML02MOL/LNA2HPO4和38ML。
20、02MOL/LNAH2PO4，PH70、01MOL/LK3FECN6、01MOL/LK4FECN63H2O、10MOL/LNA2EPTA和01W/V5溴4氯3吲哚葡萄糖苷XGLUC中，于37保温过夜后用体积浓度分别为70和95的乙醇梯度脱色，直到除去叶绿素。脱色后的样品在光学显微镜下拍照保存。0060染色结果如图4所示，图中，A为1D大的幼苗，B为3D大的幼苗，C为花药，D为花，E为3D的主根根尖，F为果荚。通过对拟南芥转基因植株T1代与T2代不同发育阶段的不同部位进行染色分析，表明ATGLP15基因在种皮、花药、花萼和萼片中没有表达，仅在主根、子叶、真叶、茎和花的维管组织中表达。00613拟。
21、南芥的石蜡制片0062为了更进一步确认ATGLP15基因的表达特异性，将生长了10天的植株进行石蜡切片，对ATGLP15基因的表达进行更加准确的定位。0063本实施例的石蜡制片制备，参考本领域的常规操作即可，具体石蜡制片步骤如下所示00641取材选取平板中生长710天的拟南芥的根、茎、叶，将材料剪成合适大小；00652染色将材料置于上述GUS染液染色过夜，不同材料，染色时间各有差异如叶的染色时间要16小时以上，根8小时即可；00663脱水将材料依次浸泡于30乙醇152小时、50乙醇152小时、70乙醇152小时、85乙醇152小时、95乙醇152小时、100乙醇I152小时和100乙醇II15。
22、2小时，逐级脱水，所述乙醇的百分比均为体积百分比浓度；00674透明将材料浸泡于乙醇和TO型生物透明剂的混合液中1小时所述混合液是将体积百分比为100的乙醇与TO型生物透明剂等体积比混合，换纯TO浸泡两次，每次30MIN，使乙醇完全脱除；00685浸蜡将材料放入TO型生物透明剂和熔蜡的混合液所述混合液是将TO型生物透明剂和熔蜡等体积比混合中，于60温箱中浸泡过夜，第二天再换纯石蜡4次，每次浸泡4H，直至TO完全挥发；00696包埋在预制的小盒中倒入熔蜡，用预热好的镊子将材料放入溶蜡中，调整好材料的位置，置4让石蜡冷凝。把包埋好的蜡块用刀片修切成小长方体；00707切片用切片机将蜡块切成8M厚的。
23、连续蜡带，用毛笔轻托蜡带放于纸上，用刀片将蜡带切成略短于盖玻片的蜡段；00718粘片将上述切片的蜡段展开后拖到载玻片上，置于40展片台上约1H，在40烘箱中干燥12H以上；00729脱蜡将附有材料的玻片用TO脱蜡；007310封片取出载玻片，趁TO还没有挥发完，迅速滴加23滴中性树胶，将镊子夹起盖玻片一端，倾斜地盖在载玻片上，在40烘箱中干燥24H以上。封片后即制成永久性玻片标本，显微镜下拍照观察。0074石蜡切片的结果如图5所示，图中A为根横切面，B为茎横切面，C为F图中方框所示叶脉纵切面部位的放大图，D为叶脉横切面，E为D图中方框所示叶脉横切面部位的放大图，F为叶脉纵切面。从图5中可以看出。
24、，ATGLP15基因在维管束的韧皮部中特异性表达。说明书CN102002498ACN102002509A6/7页80075实施例4叶盘转化法转化烟草00761烟草的组培与继代培养0077烟草种子经无菌水冲洗干净后，75乙醇体积百分比浓度表面消毒1MIN，用052的次氯酸钠质量百分比浓度消毒15MIN，无菌水洗净，无菌滤纸吸干，接种于1/2MS培养基上，12个月取其无菌细嫩叶片，剪去边缘及主脉，再剪成小块作为转化的起始外植体材料。00782农杆菌的培养及叶盘转化法转化烟草0079从80低温冰箱取出保存的含有目的质粒的农杆菌ATUMEFACIENSEHA105，在冰上溶化。在含100G/MLRIF。
25、和100G/MLKM的LB平板上划线，置28恒温箱内培养2天，长出菌落后挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB培养液中，于28恒温摇床210R/MIN振荡培养约24H，至OD60006左右收集菌体，用激活液1/2MS100M乙酰丁香酮蔗糖30G/L，PH52洗涤菌体并重悬，稀释10倍。将切成2MM2MM大小的烟草叶片浸入农杆菌菌液中，10MIN后将外植体取出，放在灭菌滤纸上，吸去多余的菌液，待风干后，转移到共培养基上1/2MS2MG/L6BA01MG/LNAA100M乙酰丁香酮30G/L蔗糖，PH55。黑暗，25下，共培养3天。00803抗化芽的筛选0081与农杆菌共培养后的叶片经无菌水加吐温2。
26、0至01体积百分比浓度洗涤4次，然后用含有250MG/L头孢霉素的无菌水洗一次，在无菌纸上吸干后转入筛选培养基中1/2MS2MG/L6BA01MG/LNAA50MG/L潮霉素500MG/L头孢霉素30G/L蔗糖PH58，光照，25下培养6周。00824抗性植株再生0083在筛选培养基上培养约6周后，切下长约1CM的芽转接到抗性芽生根培养基1/2MS02MG/LNAA300MG/L头孢霉素50MG/LKAN15G/L蔗糖，PH58，照光25下培养，3周后可观察到生根，得到抗性植株。00845抗性植株的移栽0085将生根的抗性植株从瓶子中取出，洗去根部的培养基，用纸巾包裹，置清水中培养3天，将小苗。
27、移到装有蛭石的盆中，覆盖保鲜膜，置培养室中保湿10天后，揭去保鲜膜，将分盆移至温室，4周后，可将苗移至温室土壤中栽培。00866烟草的组织化学染色分析0087取不同时期的烟草叶片和茎置于适量的GUS染液其配方与实施例3的GUS染液相同中，于37保温30H后用体积百分比浓度分别为70和95的乙醇梯度脱色脱色时间相对拟南芥要延长，直到除去叶绿素。脱色后的样品在光学显微镜下拍照保存。0088通过对烟草转基因植株T0代不同发育阶段的叶片进行染色分析，表明拟南芥ATGLP15基因仅在烟草的维管组织表达。00897拟南芥的石蜡制片0090为了更进一步确认ATGLP15基因的表达特异性，将在生根培养基上生长。
28、到适当大小的烟草叶片进行石蜡切片，对ATGLP15基因的0091在制成永久性玻片标本后，显微镜下拍照观察，结果如图6所示图中，A为叶片，B为茎，C为叶脉横切图，D为C图中方框所示叶脉横切面部位的放大图。从图中可以看出，说明书CN102002498ACN102002509A7/7页9ATGLP15基因仅在烟草维管组织的韧皮部表达。说明书CN102002498ACN102002509A1/2页10一种韧皮部特异性启动子及其应用序列表TXT华南师范大学一种韧皮部特异性启动子及其应用3PATENTINVERSION351762DNA拟南芥ARABIDOPSISTHALIANA1AATGTTATATCG。
29、TTTGGATAATTAAATTCTTATTATGATGTTAAAAAATTTAATTATCAA60AGATTGATGCTTTAGACTCTAAATCTATAATATATTAAAAATCATTTCTTTATCTTCACT120TTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACTAATATCTTCACTTTGTTATATCAAA180GAAATAAGTCATGTTTCACACTCTGCCTAAACCTTTACCACCGAAAAAATGATGTTCATG240TGCCTCTCTAATCATGCCTTGGAGATAACAAAAAGCTTAAGCAACAAATTCATCATTTTG3。
30、00AATATCATGGCATGCGCACACAGCACGCCTTATACGGGCCCCTGCTTCAGCCCAAGACAT360AGATTTGGTTATGCCTATACCAAAATTACATTATAAACCGGGATTGACACTAGGATCCGA420AACCTTGGACTCCAGTTATATTTCCATTTTTATGCACAATTGTATTAATTTGTAACTATG480AATTACATAGACGAATAGTAAATTCATAAGAGATGTGTCAATCAAGCCACAAAAGGGGTT540TATCAGTCAATGTACCGGCCTAACCACTCCCATAACCAAAACCACA。
31、TATCCAAACGTGGT600TTTTCATTTGGTACAAAAACCCACACCTTAATTTCACAGACGAAATTTTGGTTGATAAAA660AGTAACCATCTTAACCAGTCTCTCATTTACCCCCACCAGATATACATATGCTTATTTAAA720CCGGATGTAACACAACTCTTCTTCACATGGACCTCAAGTAAA762224DNA人工序列2GTCGACAATGTTATATCGTTTGGA24序列表CN102002498ACN102002509A2/2页11325DNA人工序列3CCCGGGTTTACTTGAGGTCCATGTG25序列表CN102002498ACN102002509A1/4页12图1图2说明书附图CN102002498ACN102002509A2/4页13图3图4说明书附图CN102002498ACN102002509A3/4页14图5说明书附图CN102002498ACN102002509A4/4页15图6说明书附图CN102002498A。