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1、(10)申请公布号 CN 104328135 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328135 A (21)申请号 201410569393.8 (22)申请日 2014.10.23 C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 青岛农业大学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700 号青岛农业大学海洋科学与工程 学院 (72)发明人 侯竹美 (54) 发明名称 鸭坦布苏病毒 E 蛋白和 LT。
2、B 的融合蛋白及其 应用 (57) 摘要 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒基 因工程亚单位疫苗， 即筛选获得鸭坦布苏病毒 E 蛋白具有优势抗原表位的 DomainIII 结构域， 并 通过 Lingker 与肠毒素 LTB 组成新型融合蛋白 LTB-Es， 并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布 苏病毒基因工程亚单位疫苗。本发明中鸭坦布 苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es， 其编码蛋白的氨 基酸序列为 SEQIDNO:1 ； 其中一种核苷酸序列为 SEQIDNO:2。 本发明利用原核表达载体构建了能表 达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的大肠杆 菌 BL21(DE3) 宿主菌。将重组表达的。
3、蛋白纯化后 制备成基因工程亚单位疫苗， 可使免疫后鸭群获 得免疫保护。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 (10)申请公布号 CN 104328135 A CN 104328135 A 1/1 页 2 1. 一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 基因， 其特征在于， 所述的基因的编码蛋白 的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1。 2. 如权利要求 1 所述的基因， 其特征在于， 所述的基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:2。 3. 一种鸭坦布苏。
4、病毒新型融合蛋白 LTB-Es， 其特征在于， 所述的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1。 4. 权利要求 1 所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 基因在制备疫苗中的应用。 5. 一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗， 其特征在于， 所述的疫苗的抗原为权利要求 3 所述 的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es。 6. 如权利要求 5 所述的疫苗， 其特征在于， 所述的疫苗中鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的浓度为 0.1-0.5mg/ml。 7. 权利要求 5 所述的疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述的制备方法包括有如下的步 骤 ： 1） 将 LTB-Es 基因连入原核表达。
5、载体中， 构建成重组表达质粒 ； 2）将构建的重组表达质粒转化宿主菌 , 构建能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的重组基因工程菌， 用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白 LTB-Es ； 3） 对重组表达的新型融合蛋白 LTB-Es 进行纯化后， 加入白油佐剂制成疫苗。 权 利 要 求 书 CN 104328135 A 2 1/5 页 3 鸭坦布苏病毒 E 蛋白和 LTB 的融合蛋白及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种鸭坦布苏病毒 E 蛋白和 LTB 的融合蛋白 及其应用。 背景技术 0002 我国是世界养鸭大国， 鸭肉年生产总量约占世界总量的70%。
6、， 自2000年的186.6万 吨增长到 2008 年的 258.1 万吨， 年均增长率约 3.8%， 大大高于世界平均水平。鸭坦布苏病 毒是 2010 年在中国率先发现的一种新发病毒， 主要引起鸭群采食量和产蛋大幅下降、 卵巢 出血、 神经症状等， 因此初期该病又称为鸭出血性卵巢炎、 产蛋下降综合征等。通过病毒分 离、 基因解析， 目前鸭坦布苏病毒定位于黄病毒科、 黄病毒属、 蚊媒病毒的恩塔亚病毒群。 据 不完全统计， 在蛋鸭和肉鸭主产区， 约有1.2亿只蛋鸭和1500多万只肉鸭发生该病， 累计经 济损失超过 50 亿元。同时作为新发病毒， 目前尚无商业化的鸭坦布苏病毒疫苗面世。 0003 。
7、鸭坦布苏病毒为单股正链 RNA 病毒， 基因组 10990bp， 95-10278bp 为 ORF 区域， 编 码 3 个结构蛋白 （衣壳蛋白 C、 膜蛋白 M、 包膜蛋白 E） 和 7 个非结构蛋白 (NS1、 NS2a、 NS2b、 NS3、 NS4a、 NS4b、 NS5)， 其中包膜蛋白 E 具有较高免疫原性， 含有多个重要的细胞受体结合 位点， 并能引起强烈和持久的免疫反应， 是黄病毒属病毒的主要基因工程疫苗开发候选蛋 白。黄病毒包膜 E 蛋白按其空间结构可分为 Domain I、 Domain II 和 Domain III 三个结构 域， 其中Domain III结构域可被病毒的。
8、中和抗体识别， 且基因大小适中， 更适于用于基因工 程亚单位疫苗开发。 Chu等构建了表达西尼罗病毒E蛋白结构域III的重组质粒， 并用寡脱 氧核苷酸 (CpG-DNA) 作为佐剂， 腹腔注射途径免疫 BALB/C 小鼠， 结果获得高滴度的西尼罗 病毒中和抗体， 表明辅以佐剂西尼罗病毒 E 蛋白 Domain III 可使小鼠产生免疫应答， 具有 疫苗开发的潜力。 0004 产肠毒素大肠埃希菌 （ETEC） 产生不耐热肠毒素 （heat-labile entero toxin， LT） 具有良好的免疫原性和免疫佐剂作用， 其又分为 A 亚 （LTA） 和 B 亚基 （LTB） 。LTB 是 L。
9、T 的免 疫原性部位， 是受体结合部位， 具有良好的免疫佐剂作用， 已有多篇文献报道其用于疫苗的 免疫佐剂。李润成等 （2009 年） 将肠毒素 LTB 蛋白基因与口蹄疫 VP1 蛋白基因进行融合表 达， 发现 LTB 可有效促进口蹄疫 VP1 蛋白的免疫效果， 增效明显。余兴龙等将 LTB 与猪圆环 病毒 ORF2 基因融合表达制备的融合蛋白制成基因工程亚单位， 免疫后也取得理想的免疫 效果。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒 E 蛋白和 LTB 的融合蛋白， 即通过筛选获 得优势抗原表位的鸭坦布苏病毒 E 蛋白 Domain III 部分， 并通过 Lingker（G。
10、GGSGGGS） 与 肠毒素 LTB 组成新型融合蛋白 LTB-Es， 并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因 工程亚单位疫苗。 0006 本发明首先提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白Domain III和LTB的融合蛋白LTB-Es， 说 明 书 CN 104328135 A 3 2/5 页 4 其编码蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1 ； 上述蛋白的一种核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ； 本发明还提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗， 其中的抗原为上述的新型融合 蛋白 LTB-Es， 其浓度为 0.1-0.5mg/ml 之间 ； 本发明的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗， 其制。
11、备步骤如下 ： 1） 将新型融合蛋白 LTB-Es 基因插入表达载体中， 构建成表达重组质粒 ； 2） 将构建的表达重组质粒转化宿主菌 , 构建了能表达新型融合蛋白 LTB-Es 的重组基 因工程菌 ； 用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白 LTB-Es ； 3） 对重组表达的 LTB-Es 蛋白进行纯化后， 加入白油佐剂制成疫苗。 0007 本发明利用 pET30a（+） 表达性载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的大肠杆菌 BL21(DE3) 宿主菌。经 SDS-PAGE 分析， 表达出了 26kD 重组目的蛋白。 将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗， 免疫 14。
12、 日龄鸭群， 免疫后可以使鸭群获得 免疫保护。 具体实施方式 0008 申请人在获得一个具有免疫特性的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es， 并进一步 通过大肠杆菌稀有密码子优化获得其基因， 然后通过 pET30a（+） 原核表达载体构建出能表 达蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21(DE3)重组基因工程菌， 通过对工程菌的诱导、 超声破碎、 蛋 白纯化、 定量、 与佐剂配比等制备和生产方法制备出了鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。 0009 下面结合具体实施方式来进一步描述本发明， 但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替。
13、换， 这些修改和替换均落入本发明保护范围内。 0010 实施例 1 鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的获得 1、 利用生物软件对鸭坦布苏代表毒株 ZJ-6 （GenBank 登录号 ： JF459991.1） 的包膜蛋白 E进行抗原表位分析， 选定E蛋白抗原性较强Domain III位置 （303-410aa） 与LTB序列进行 拼接， 中间设计 Lingker（GGGSGGGS） 进行连接， 获得一种新型鸭坦布苏病毒 E 蛋白 Domain III 和 LTB 的融合蛋白 LTB-Es， 其编码蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1， 并利用在线生物 软件 DNAWorks 进行。
14、大肠杆菌稀有密码子优化， 获得融合蛋白 LTB-Es 的核苷酸序列 SEQ ID NO:2。 0011 将新获得的融合蛋白 LTB-Es 的核苷酸序列进行全基因合成， 同时两端分别加上 BamH I 和 Hind III 酶切位点。 0012 实施例 2 基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得 1、 上述全基因合成的融合蛋白LTB-Es基因用BamH I和Hind III双酶切后连入pET30a 载体相应的酶切位点， 构建 pET30a/Es 表达载体。 0013 2、 用CaCl2法将pET30a/Es表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)， 涂布于含50g/ ml 卡那霉素的琼脂平板，。
15、 37过夜培养。选取 10 个单菌落提取质粒， BamH I 和 Hind III 双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。 将测序验证后的阳性克隆在 LB 培养基中发酵培 养至 0.6 0.8 时加入 0.3mM IPTG 诱导 4 5 小时， 离心收集菌体跑 SDS-PAGE 电泳， 同时 设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在 26kD 处多出一条蛋白条带， 与 说 明 书 CN 104328135 A 4 3/5 页 5 重组蛋白理论分子量一致， 表达量约为 30% 以上。经鸭坦布苏病毒抗体免疫印迹检定， 显示 阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌， 命。
16、名为 LE 株。 0014 实施例 3 发酵、 纯化与鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的制备规程 1 菌毒种 1.1 制造用菌种为鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗生产菌 LE 株 ； 检测用的强毒株 为鹅源坦布苏 SD 株。 0015 1.2 生产用菌种标准 1.2.1 形态和生化特性 含有卡那霉素的 LB 琼脂平板上过夜培养， 在培养板上呈现圆形、 边缘整齐、 突起、 乳白 色有光泽的光滑菌落， 革兰氏染色后， 镜下显示为革兰氏阴性短杆菌 ； 生化试验结果均为葡 萄糖发酵 +， 吲哚试验 +， 甲基红试验 +， VP -， 枸橼酸利用试验 -。 0016 1.2.2 培养特性 可在含有卡那霉素的。
17、培养基中生长。 0017 1.2.3 鉴别检验 1.2.3.1 PCR 检测 将本菌的 LB 液体培养物 3l 做模板， 用以下 PCR 引物进行 PCR 扩增， 应能扩增出 418bp 左右的片段。 0018 P1:5 - CTCTCAGAAAAAAGCGAT -3 P2 ： 5 - CAGGATGAAGGAGTCACC-3 扩增的条件如下 ： 94 5min 变性， 94 30S， 50 30S， 72 1min， 30 个循环， 72延 伸 10min。 1.2.3.2 Western-blot 检测 将 LB 固体培养平板上的重组菌单菌落接种于 5ml 含 有卡那霉素的 LB 液体培养。
18、基中， 培养至 OD600值在 0.6 1.0 之间时加入 0.8mM 的 IPTG 诱 导， 持续培养 4 小时， 收集菌体， 用 PBS 重悬后高压匀质破碎， 8000 r/min 离心去沉淀， 上清 液与抗鸭坦布苏病毒阳性血清进行 Western-blot 试验， 应出现特异性条带。 0019 1.2.4 纯粹 用适宜培养基检查， 应纯粹。 0020 1.2.6 基础种子代次 F5F8 代。 0021 1.2.7 保存 冻干菌种， -20， 保存期为 2 年。 0022 疫苗制造及半成品检验 2.1 生产用种子制备 2.1.1 一级种子繁殖和鉴定 将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的 LB 。
19、液体培养基中， 37振荡培养 810 小时， 然后划线接种于含卡那霉素的 LB 固体培养基上 37培养 1618 小时， 作为一级种子。在 2 8保存， 不超过 14 天 ； 在培养基上传代， 应不超过 2 代。 0023 2.1.2 二级种子繁殖 在一级种子中选取符合1.2.1项标准的典型菌落10个混 合于少量 LB 培养液中， 接种于含卡那霉素的 LB 培养液中， 37培养 8 10 小时， 进行纯粹 检验， 应纯粹。置 2 8保存， 应不超过 3 天。 0024 2.2 制苗用培养基 为改良 LB 培养基， 每 1000 ml 培养基中含胰蛋白胨 10g， 酵 母浸粉 5g， 氯化钠 1。
20、0 g， 葡萄糖 5g， MgSO4 7H2O 5g。 0025 2.3 制苗用抗原液制备 2.3.1 菌液培养 用培养罐通气培养， 按培养罐容积装入适量培养基 （70% 左右） 及消 泡剂， 灭菌后按培养基量的 5接种二级种子菌液， 37通气培养， 待菌液的 OD600值达到 说 明 书 CN 104328135 A 5 4/5 页 6 7.0 时， 加入 8g/L 的 - 乳糖诱导， 再继续培养 6 8 小时。使用 20%NaOH 调节 pH 在 7.0， 通过转速关联控制溶氧在 20% 以上。当溶氧迅速上升时， 流加补料。 0026 2.3.2 破菌 培养结束后， 离心收集菌体。 收集的。
21、菌体用PBS清洗2次， 将收集的 菌体用 PBS 制成 10% 的悬液， 在 4下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液， 8000r/min， 离心 15 分钟， 收集上清液。 0027 2.3.3 镍柱层析纯化 收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋， PBS 液作为透析外 液， 透析脱盐后即得重组蛋白液。 0028 2.3.4 灭活 将纯化的上清液中按比例加入 10% 的甲醛溶液， 甲醛溶液的最终 浓度为0.2%， 37灭活12小时， 以灭活残存的大肠杆菌。 取少量样品进行半成品检验。 2 8保存， 不超过 7 天 ； -15以下保存， 不超过 60 天。 0029 2.4 半成品检验 2.4.1 。
22、蛋白Es含量检测 用BCA法检测上清液蛋白浓度， 稀释至终浓度0.5mg/ml， 无 菌过滤， 待用。 0030 2.4.2 无菌检验 按现行 中国兽药典 进行检验， 应无菌生长。 0031 2.4.3 内毒素含量检测 按鲎试剂方法进行内毒素检测， 内毒素含量不高于 1000EU/ml 者方可用于制苗。 0032 2.5 疫苗制备 2.5.1 油相制备 取优质注射用白油 94 份， 硬脂酸铝 2 份。在油相罐中混合均匀， 加 热融化至半透明状， 再加司本-80 6份， 至温度达到125130时维持30分钟， 冷却至室温 备用。 0033 2.5.2 水相制备 取灭菌的吐温 -80 4 份， 加。
23、检验合格的半成品 96 份， 充分搅 拌至吐温 -80 完全溶解。 0034 2.5.3 乳化 取油相 3 份置于高速剪切机内， 开动电机低速搅拌， 同时缓缓加入 水相 1 份， 再以 3600r/min 乳化 40 分钟， 在终止搅拌前加入 1% 硫柳汞溶液， 终浓度达到 0.01%。乳化后， 取样 10ml 加入离心管， 以 3000r/min 离心 15 分钟， 管底析出水相应不超过 0.5ml。 0035 2.5.4 分装 定量分装， 密封瓶口。 0036 成品检验 3.1 物理性状 外观 为乳白色乳剂。 0037 剂型 为油包水型。取一清洁吸管， 吸取少量疫苗滴于冷水中， 除第 1 。
24、滴外， 均应 不扩散。 0038 稳定性 吸取疫苗 10ml 加入离心管中， 经 3000r/min 离心 15 分钟， 管底析出的水 相应不超过 0.5ml。 0039 黏度 按现行 中国兽药典 进行， 符合规定。 0040 装量检查 按现行 中国兽药典 进行， 符合规定。 0041 3.2 无菌检验 按现行 中国兽药典 进行， 无菌生长。 0042 3.3 安全检验 取 7-14 日龄健康易感鸭 10 只， 肌肉或颈部皮下注射疫苗 1ml/ 只， 观察 14 天， 不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。 说 明 书 CN 104328135 A 6 5/5 页 7 0043 3.4 效力检。
25、验 取 7-14 日龄健康易感鸭 20 只平均分为二组， 每组 10 只。第一组为免疫组， 用本发明 制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗进行颈部皮下或者肌肉注射免疫， 0.5ml/ 只， 第 二组为生理盐水对照组， 注射同等体积的无菌生理盐水。免疫 21 天后各组肌肉注射鸭坦布 苏强毒株 SD 株进行攻毒， 攻毒后 5 日剖检， 取脾脏进行分离病毒。对照组应至少 8 只分离 病毒阳性， 试验组则至少 7 只分离阴性。 0044 3.5 甲醛、 汞类防腐剂残留量测定 按现行 中国兽药典 进行， 均符合规定。 0045 实施例 4 鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的疗效试验 将 14 日龄健。
26、康易感鸭 60 只平均分为三组， 每组 20 只。第一组为免疫组， 用本发明制 备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗进行颈部皮下或者肌肉注射免疫， 0.5ml/ 只， 第二 组为阳性对照组， 即用重组表达的单独鸭坦布苏 E 蛋白 Domain III 参照实施例 4 方法制 备成基因工程亚单位疫苗， 颈部皮下或者肌肉注射免疫， 0.5ml/ 只， 第三组为生理盐水对照 组， 注射同等体积的无菌生理盐水。免疫 21 天后各组肌肉注射鸭坦布苏强毒株 SD 株进行 攻毒， 攻毒 14 天后统计攻毒保护率 （发病只数占总只数的百分率） 。其中发病标准 ： 临床出 现精神症状、 剖检脾脏肿大， 并可在脾脏。
27、分离出鸭坦布苏病毒。 0046 结果表明本发明制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗对鸭群的被动保 护期 在 21 天以上， 免疫后的鸭群在 14 天的攻毒保护率在 100%， 而阳性对照组攻毒保护率仅为 60%， 生理盐水对照组的攻毒保护率为0%。 证明本发明的疫苗对鸭群的具有良好的临床保护 效果， 可进行临床推广和应用。 0047 表 1 鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验 说 明 书 CN 104328135 A 7 1/1 页 8 碱基序列 ： GCGCCGCAGACCATCACCGAGCTCTGCTCTGAATACCGTAACACCCAGATCTACACCATCAACG。
28、ACAAAATC CTGTCTTACACCGAATCTATGGCGGGTAAACGTGAAATGGTTATCATCACCTTCAAATCTGGTGAAACCTTCCAGGT TGAAGTCCCGGGTTCTCAACACATCGACTCTCAGAAAAAAGCGATCGAACGTATGAAAGACACCCTGCGTATCACCT ACCTGACCGAAACCAAAATCGACAAACTGTGCGTTTGGAACAACAAAACCCCGAATTCTATCGCGGCGATCTCTATG AAAAACGTGCCGGGTGTTGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTTCTCCGATGTGCTCTAAC。
29、ACCTTCTCTCTGGTTAAAAA CCCGACCGACACCGGTCACGGTACTGTGGTTGTCGAACTCTCTTACGCGGGTACCGACGGTCCGTGCCGTGTTCCTA TCAGCATGTCTGCCGACCTGAACGACATGACCCCGGTTGGTCGTCTGATCACCGTTAACCCGTACGTTTCTACCTCT TCTACCGGTGCGAAAATCATGGTTGAGGTTGAGCCGCCGTTCGGTGACTCCTTCATCCTGGTTGGTTCCGGTAAAGG TCAGATCCGTTACCAGTGGCACCGTTCTGGCTCTACCATCGGTAAGGCGTTCACCTCT 氨基酸序列 ： APQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTL RITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNVPGVGGGSGGGSPMCSNTFSLVKNPTDTGHGTVVVELSYAGTDGPC RVPISMSADLNDMTPVGRLITVNPYVSTSSTGAKIMVEVEPPFGDSFILVGSGKGQIRYQWHRSGSTIGKAFTS 序 列 表 CN 104328135 A 8 。