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1、(10)申请公布号 CN 104328161 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328161 A (21)申请号 201410520947.5 (22)申请日 2014.09.29 C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (71)申请人 哈尔滨工业大学 （威海） 地址 264209 山东省威海市文化西路 2 号哈 尔滨工业大学 ( 威海 ) (72)发明人 闫培生 王凯 王琢 史翠娟 (54) 发明名称 一种直观筛选抑制黄曲霉毒素的微生物菌种 的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种直观筛选抑制黄曲霉毒素的 微生物菌种的方法， 首先制备。
2、适宜海洋微生物、 陆 地微生物、 或植物内生菌等各类微生物生长的固 体培养基平板， 在平板四周点接接种 4 个不同的 微生物菌种， 在25-35度恒温培养箱中培养0-2天 后， 再在平板中央接种寄生曲霉 DM 菌株， 继续培 养 3-4 天后， 眼睛直接观察平板中 DM 菌株的菌丝 生长和橘红色降散盘衣酸的产生情况， 凡是能抑 制DM菌株菌丝中橘红色降散盘衣酸的产生和/或 菌丝生长的微生物菌种， 即是能抑制黄曲霉毒素 产生的微生物菌种。该发明是一种直观、 快速、 安 全、 低成本筛选高效抑制黄曲霉毒素的微生物菌 种的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 。
3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328161 A CN 104328161 A 1/1 页 2 1. 一种直观筛选抑制黄曲霉毒素的微生物菌种的方法， 其特征包括如下步骤 ： （1） 所使用的黄曲霉毒素指示菌株为寄生曲霉 DM 菌株 ； （2） 所使用的筛选培养基为能提供海洋微生物、 陆地微生物、 植物内生菌等各类微生物 生长的各种固体培养基 ； （3） 根据待筛选微生物种类的不同， 制备适宜的固体培养基平板 ； （4） 在平板四周点接接种 4 个不同的微生物菌种， 在 25-35 度恒温培养箱。
4、中培养 0-2 天 后， 再在平板中央接种 DM 菌株， 继续培养 3-4 天后， 观察培养结果 ； （5） 眼睛直接观察平板中 DM 菌株的菌丝生长和橘红色降散盘衣酸的产生， 凡是能抑制 DM 菌株菌丝中橘红色降散盘衣酸的产生和 / 或菌丝生长的微生物菌种， 即是能抑制黄曲霉 毒素产生的微生物菌种。 权 利 要 求 书 CN 104328161 A 2 1/2 页 3 一种直观筛选抑制黄曲霉毒素的微生物菌种的方法 技术领域 0001 本发明涉及应用微生物、 生物防治和真菌毒素等技术领域， 具体的说是一种直观 筛选抑制黄曲霉毒素的微生物菌种的方法。 背景技术 0002 黄曲霉毒素是由黄曲霉、 。
5、寄生曲霉等真菌产生的有毒次级代谢产物， 是自然界中 已发现的毒性最强的真菌毒素， 其急性毒性是剧毒化学药品氰化钾的 10 倍以上， 并且， 还 具有强致癌性， 免疫抑制性和致畸形性， 被国际癌症机构列为一类致癌物质。 黄曲霉毒素可 在作物收获前和贮藏期间广泛污染谷类作物， 油料作物， 豆类作物， 及其加工品， 对人类和 动物健康危害极大， 并导致农业经济损失严重。因此， 如何有效地防止黄曲霉毒素污染农 产品都是一个亟待解决的重大课题， 以往的防治黄曲霉毒素污染食品的方法主要是用物理 和化学方法清除食品中已污染的毒素或使其失去毒性， 不仅成本大， 而且效果也不理想， 利 用化学农药防治黄曲霉菌侵。
6、染作物和食品也曾被利用， 但近年来， 由于化学农药导致的环 境污染问题越来越被各国科学家和政府所重视， 利用对环境友好的生物防治已成为研究热 点。 生物防治黄曲霉毒素污染的关键是筛选出能高效抑制黄曲霉毒素产生菌生长和产毒 的生防微生物菌种， 由于黄曲霉毒素是极毒的真菌代谢产物， 产生后， 肉眼又不能直接观测 到， 必须借助相关仪器和分析手段才能检测到毒素的产生情况， 不仅手续繁琐， 而且容易造 成环境污染， 危害操作人员的健康， 因此， 建立一种直观、 快速、 安全、 低成本筛选能高效抑 制黄曲霉毒素的微生物菌种的方法非常重要。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的。
7、不足， 提供一种适合于从海洋 微生物、 陆地微生物、 植物内生菌等诸多不同生境来源的微生物中直观、 快速、 安全、 低成本 筛选出能高效抑制黄曲霉毒素的微生物菌种的方法。 本发明解决上述技术问题采用的技术方案是 ： 一种直观筛选抑制黄曲霉毒素的微生物 菌种的方法， 其特征包括如下步骤 ： （1） 所使用的黄曲霉毒素指示菌株为寄生曲霉 DM 菌株 ； （2） 所使用的筛选培养基为能提供海洋微生物、 陆地微生物、 植物内生菌等各类微生物 生长的各种固体培养基 ； （3） 根据待筛选微生物种类的不同， 制备适宜的固体培养基平板 ； （4） 在平板四周点接接种 4 个不同的微生物菌种， 在 25-35。
8、 度恒温培养箱中培养 0-2 天 后， 再在平板中央接种 DM 菌株， 继续培养 3-4 天后， 观察培养结果 ； （5） 眼睛直接观察平板中 DM 菌株的菌丝生长和橘红色降散盘衣酸的产生， 凡是能抑制 DM 菌株菌丝中橘红色降散盘衣酸的产生和 / 或菌丝生长的微生物菌种， 即是能抑制黄曲霉 毒素产生的微生物菌种。 说 明 书 CN 104328161 A 3 2/2 页 4 本发明与其他筛选方法显著不同在于第一是使用寄生曲霉 DM 菌株为指示菌株， DM 菌 株具有在菌丝体中累积人眼睛可见的橘红色的黄曲霉毒素生物合成途径中的中间产物降 散盘衣酸的能力， 因此， 可以通过眼睛直接观察寄生曲霉 。
9、DM 菌株的菌丝体中是否显示橘红 色而判断是否有中间产物降散盘衣酸的产生， 进而进一步判断是否有黄曲霉毒素的产生， 凡是能抑制橘红色降散盘衣酸产生的微生物菌种， 即具备抑制黄曲霉毒素产生的能力， 因 此， 结果观察直观、 简单、 方便、 快速 ； 第二是 DM 菌株不产生黄曲霉毒素， 因此， 不会对环境 和操作人员带来黄曲霉毒素的危害， 因此， 该发明操作安全 ； 第三是只需要人的眼睛观察结 果， 不需要复杂的仪器设备检测即可判断对黄曲霉毒素的抑制效果， 且培养时间只有 3-6 天， 具有快速、 低成本的特点， 可对大量样品进行筛选。 具体实施方式 0004 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
10、， 但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。 0005 实施例 1 ： 抑制黄曲霉毒素的海洋微生物菌种的筛选 按括号内的配方制备固体培养基平板 （酵母提取物 3 g， 麦芽膏 3 g， 蛋白胨 5 g， 葡萄 糖10 g， 琼脂15g， 天然海水1000mL） ， 在平板四周分别接种四个海洋微生物菌种， 在25度恒 温培养 2 天后， 在平板中央接种寄生曲霉 DM 菌株， 继续培养 4 天后， 观察培养结果， 凡是能 抑制橘红色降散盘衣酸在菌丝中产生的菌种， 即是能抑制黄曲霉毒素合成的海洋微生物菌 种， 如图 1 所示。 0006 图 1 是平板筛选能抑制橘红色降散盘衣酸产生的海洋微生。
11、物菌种的图。图 1 中正 向方的菌株为具有抑制橘红色降散盘衣酸产生的海洋微生物菌种， 亦即能抑制黄曲霉毒素 产生的海洋微生物菌种。 0007 实施例 2 ： 抑制黄曲霉毒素的陆地微生物菌种的筛选 按括号内的配方制备固体培养基平板 （酵母粉 5g， 酪蛋白 2 g， 可溶性淀粉 10 g， 蔗糖 10g， 琼脂 20g， 自来水 1000mL） ， 在平板四周分别接种四个陆地微生物菌种后， 在平板中央 接种寄生曲霉 DM 菌株， 在 32 度恒温培养 3-5 天后， 观察培养结果， 凡是能抑制橘红色降散 盘衣酸在菌丝中产生的菌种， 即是能抑制黄曲霉毒素合成的陆地微生物菌种， 如图 2 所示。 0。
12、008 图 2 是平板筛选能抑制橘红色降散盘衣酸产生的陆地微生物菌种的图。图 2 中左 侧图为对照， 显示产生大量橘红色降散盘衣酸， 右侧图显示能抑制橘红色降散盘衣酸产生 的 4 个陆地微生物菌种， 亦即能抑制黄曲霉毒素产生的 4 个陆地微生物菌种。 0009 实施例 3 ： 抑制黄曲霉毒素的植物内生菌菌种的筛选 按括号内的配方制备固体培养基平板 （酵母粉 5g， 葡萄糖 20g， 琼脂 18g， 花生种子提取 液 1000mL） ， 在平板四周分别接种四个植物内生菌菌种后， 在平板中央接种寄生曲霉 DM 菌 株， 在30度恒温培养3-5天后， 观察培养结果， 凡是能抑制橘红色降散盘衣酸在菌丝中产生 的菌种， 即是能抑制黄曲霉毒素合成的植物内生菌菌种， 如图 3 所示。 0010 图 3 是平板筛选能抑制橘红色降散盘衣酸产生的植物内生菌菌种的图。图 3 中左 侧图为对照， 显示产生大量橘红色降散盘衣酸， 右侧图显示能抑制橘红色降散盘衣酸产生 的 4 个植物内生菌菌种， 亦即能抑制黄曲霉毒素产生的 4 个植物内生菌菌种。 说 明 书 CN 104328161 A 4 1/1 页 5 图 1图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104328161 A 5 。