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1、(10)申请公布号 CN 104328187 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328187 A (21)申请号 201410614985.7 (22)申请日 2014.11.05 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上大路 99 号 (72)发明人 刘战民 朱佳超 (74)专利代理机构 上海上大专利事务所 ( 普通 合伙 ) 31205 代理人 陆聪明 (54) 发明名称 单核细胞增生李斯特菌检。
2、测用引物对及其检 测方法 (57) 摘要 本发明涉及单核细胞增生李斯特菌检测用引 物对及其检测方法。该引物对中的上游引物为 SEQIDNO:2碱基序列， 下游引物为SEQIDNO:3所示 的碱基序列。采用本发明方法检测单核细胞增生 李斯特菌， 检测时间短， 成本低 ； 本发明的检测靶 点具有很强的特异性， 检测结果特异， 结果判断简 单。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328187 A CN 1。
3、04328187 A 1/1 页 2 1. 一种单核细胞增生李斯特菌检测用引物对， 其特征在于该引物对中的上游引物为 SEQ ID NO:2 碱基序列， 下游引物为 SEQ ID NO:3 所示的碱基序列。 2. 一种检测单核细胞增生李斯特菌的方法， 采用根据权利要求 1 所述的单核细胞增生 李斯特菌检测用引物对进行 PCR 扩增， 其特征在于该 PCR 检测体系为 ： 10PCR 反应缓冲 液 5L， dNTP 为 3L， 5M 上游引物和下游引物分别为 1L， 模板溶液为 1L， TAQ 酶为 1L， 最后补充ddH2O至50L ； PCR检测体系的具体参数为 ： 95C预变性2min,之。
4、后开始 扩增循环， 每个循环的程序为 ： 95 C 变性 45s， 53 C 退火 45s,72 C 延生 55s ； 循环 30 次后， 最后 72 C 延生 10min， 降温至 10 C， PCR 扩增结束。 权 利 要 求 书 CN 104328187 A 2 1/5 页 3 单核细胞增生李斯特菌检测用引物对及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种单核细胞增生李斯特菌检测用引物对及其检测方法。 背景技术 0002 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 简称单增李斯特菌是一种重 要的食源性人畜共患病源菌。它广泛分布于自然界中， 肉类、 禽类、 海。
5、产品类、 乳制品和蔬 菜中均有其存在。它能引起人、 畜的李斯特菌病， 感染后主要表现为败血症、 脑膜炎和单核 细胞增多， 特别对孕妇、 新生儿、 老年人和免疫缺陷病人危害还严重。被感染者也会出现和 流感类似的症状， 但并不常见。 孕妇感染后， 如果治疗不当， 会引发菌血症导致早产、 死婴等 严重后果。 虽然丹增李斯特菌在食物中毒和感染的事件发生的较少， 但其致死率较高， 平均 达 33.3%， 是细菌中致死率较高的一种， 如 2006 年法国因食物感染引起 67 人死亡。国内外 对单增李斯特菌的危害均给以高度重视， WHO 将其列为 20 世纪 90 年代食品中四大致病菌 之一。食品是导致人类。
6、受单核细胞增生李斯特菌感染的主要传播途径 , 该菌在 4 冰箱 保存的食物中仍可生长繁殖 , 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌。随着我国冷藏、 速 冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此在食 品卫生微生物检验中 , 必须加以重视。因此， 如何通过快速的检测单增李斯特菌来解决食 品安全问题成为了国家迫切的需求。 我国目前对食品中单增李斯特菌的检测仍使用传统的 平板培养法， 但是检测过程中， 制备培养基、 计算菌落数量和鉴定菌落的生化特征都耗时耗 力， 并且培养方法的成功依赖于样本中细菌的数量和状况、 培养基的灵敏度、 孵化条件和分 离培养基的选择性， 不适合。
7、当前食品快速检测的需求。 0003 PCR 技术以其操作简便、 快速、 灵敏度高、 特异性强等特点， 逐步应用于各种食源 性致病菌的检测之中去。聚合酶链式反应 ( Polymerase chain Reaction， PCR ) 最早 由 Mulhs 和 Cetus 公司的同事于 1985 年发明的 , 是一种通过在体外模拟自然 DNA 复制 过程快速扩增特定 DNA 序列的方。Bessesen MT 等于 1990 年建立了 PCR 检测单核细胞 增生李斯特菌的方法 , 通过扩增李斯特氏菌溶血素基因 hlyA 中 386 bp 的 PCR 方法检 测单核细胞增生李斯特菌 ,DNA 检测量为 。
8、25 ng， 详见 ： BESSESEN MT, LUO QA, ROTBART HA.,et al.“Detection of Listeria monoeytogenes by using the Polymerase chain reaction” J.Appl Environ Mierobiol,1990,56(9): 2930-2932.（BESSESEN MT,LUO QA,ROTBART HA.,et al 等 .“运用 PCR 检测单核细胞增生李斯特菌” ， 应用环境微生物学， 1990,56（9） ： 2930-2932 页。 发明内容 0004 本发明的目的之一在于克服现有。
9、检测技术的不足， 提供一种单核细胞增生李斯特 菌检测用引物对。 0005 本发明的目的之二在于提供采用该引物对检测单核细胞增生李斯特菌的方法， 该 方法检测时间短， 成本低， 检测结果特异， 结果判定简便， 满足现在食品安全检测的需求。 说 明 书 CN 104328187 A 3 2/5 页 4 0006 为达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种单核细胞增生李斯特菌检测用引物对， 其特征在于该引物对中的上游引物为 SEQ ID NO:2 碱基序列， 下游引物为 SEQ ID NO:3 所示的碱基序列。 0007 一种检测单核细胞增生李斯特菌的方法， 采用上述的单核细胞增生李斯特菌检。
10、测 用引物对进行 PCR 扩增， 其特征在于该 PCR 检测体系为 ： 10PCR 反应缓冲液 5L， dNTP 为 3L， 5M 上游引物和下游引物分别为 1L， 模板溶液为 1L， TAQ 酶为 1L， 最后补充 ddH2O 至 50L ； PCR 检测体系的具体参数为 ： 95 C 预变性 2min, 之后开始扩增循环， 每个 循环的程序为 ： 95C变性45s， 53C退火45s,72C延生55s ； 循环30次后， 最后72C 延生 10min， 降温至 10 C， PCR 扩增结束。 0008 本发明的单核细胞增生李斯特菌检测用引物对是根据单核细胞增生李斯特菌的 基因组DNA 序列。
11、中的特异性序列lmo0202 hly设计得到， 李斯特菌的核酸序列SEQID NO:3 如下 ； （a） 检测目的基因的序列特征 ： * 长度 ： 226bp * 类型 ： 核酸 * 链型 ： 双链 * 拓扑类型 ： 线形 (b) 分子类型 ： DNA (c) 最初来源 ： 单核细胞增生李斯特菌 (d) 序列描述 ： SEQ ID NO.1 ： ATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATC AAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCA。
12、GTAAATACATTAGTGGAAAGATGG AATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATC 序列中下划线部分的字母代表了引物hlyF和hlyR的位置， 进行PCR扩增 ； 再根据凝胶 电泳检测扩增产物， 判断样品是否含有单核细胞增生李斯特菌 ； 判断的方法具体如下 ： 如 果电泳结果出现相应的与设计大小一致的单一扩增条带， 则说明样品中含有单核细胞增生 李斯特菌 ； 反之， 如果电泳结果没有出现相应的与设计大小一致的单一扩增条带， 则说明样 品中不含有单核细胞增生李斯特菌。 000。
13、9 上游引物 hly-F 序列如 SEQ ID NO:1 所示， 下游引物 hly-R 序列如 SEQ ID NO:2 所示 ； SEQ ID NO:2 （a） 上游引物 hly-F 基因的序列特征 ： * 长度 ： 23bp * 类型 ： 核酸 * 链型 ： 单链 * 拓扑类型 ： 线形 (b) 分子类型 ： DNA (c) 最初来源 ： 人工合成 (d) 序列描述 ： SEQ ID NO.2 ： 说 明 书 CN 104328187 A 4 3/5 页 5 ATCAACCAGATGTTCTCCCTG SEQ ID NO:3 （a） 上游引物 hly-R 基因的序列特征 ： * 长度 ： 2。
14、3bp * 类型 ： 核酸 * 链型 ： 单链 * 拓扑类型 ： 线形 (b) 分子类型 ： DNA (c) 最初来源 ： 人工合成 (d) 序列描述 ： SEQ ID NO.3 ： GACGAAATGGCTTACAGTGAATC 与传统检测方法相比， 本发明有如下优点 ： 采用该法检测单核细胞增生李斯特菌， 检测 时间短， 成本低 ； 本发明的检测靶点具有很强的特异性， 检测结果特异， 结果判断简单。 附图说明 0010 图 1 为实施例 1 中 PCR 检测方法特异性评价凝胶电泳图 ； 图 2 为实施例 2 中 PCR 检测方法灵敏度评价凝胶电泳图。 具体实施方式 0011 结合具体的实施。
15、例， 进一步进行阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件， 例如 Sambrook 等分子克隆中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0012 实施例 1 ： 单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测方法的建立 步骤 1， 根据单核细胞增生李斯特菌的基因组 DNA 序列中的保守序列设计引物， 从单 核细胞增生李斯特菌基因组序列中找到特异性基因 lmo0202 hly基因， 将其作为单核细胞 增生李斯特菌基因的靶基因， 基因序列如 hlyID NO:1 所示 ； 将此基因序列输入引物设计软件 Prim。
16、er Premier 5.0 中设计引物， 产物大小范围为 100 500bp， 再从中筛选合适的引物， 引物序列如下 （引物由上海生工生物工程技术服务 有限公司合成） ： hly-F:5 -ATC AAC CAg ATg TTC TCC CTg TA-3 (hly ID NO:2) hly-R:5 - gAT TCA CTg TAA gCC ATT TCg TC-3 (hly ID NO:3) 步骤 2， DNA 模板的制备 将 39 株单核细胞增生李斯特菌和 8 株阴性菌株 （绵羊李斯特菌、 英诺克李斯特菌、 西 尔李斯特菌、 格氏李斯特菌、 威氏利斯特菌、 猪霍乱沙门氏菌、 鼠伤寒沙门氏。
17、菌株、 粘质沙雷 菌） 接入到 50mL 的 LB 液体培养基中， 在 37增菌 12h 后， 取 1mL 菌液， 放入 1.5mL 离心 管中， 2000r/min 离心 10min, 取上清液， 再在 12000r/min 离心 10min, 收集菌体。用双蒸水 进行洗涤菌体， 洗涤完后加入100L的无菌水， 并用氯仿抽屉法提取基因组。 加入10L溶 菌酶 （20mg/mL） ， 37 C 水浴 1h， 再加入 10L 蛋白酶 K （20mg/mL） 水浴 1h。加入 200L 的 说 明 书 CN 104328187 A 5 4/5 页 6 10%SDS， 沸水 10min。12000r。
18、/min 离心 5min， 取上清放至干净的 EP 管， 加入苯酚 ： 氯仿 ： 异 戊醇 （25:24:1） ， 然后12000r/min离心5min， 再取上清放至干净的EP管， 加入0.1倍体积的 乙酸铵 （2.5mol/L， PH5.4） ， 再加入2倍预冷的无水乙醇 （-20C放置10min） ， 然后12000r/ min 离心 5min。去上清， 加入 75% 的乙醇洗涤， 12000r/min 离心 5min， 重复 2 次。去上清， 晾干残余乙醇， 加 50L 灭菌超净水， 溶解 DNA， -20 C 保存。 0013 步骤 3， PCR 检测的特异性评定 加入 38L 的无。
19、菌水到 PCR 反应管， 再加入 5L10PCR 反应缓冲液， 3L 的 dNTP, 5M 上游引物和下游引物分别加入 1L， 加入 TAQ 酶 1L， 模板 1L， 并以无菌水为模板 作为反应的阴性对照。PCR 的循环参数如下 ： 95 C 预变性 2min, 之后开始扩增循环， 每个 循环的程序为 ： 95C变性45s， 53C退火45s,72C延生55s ； 循环30次后， 最后72C 延生 10min， 降温至 10 C， PCR 扩增结束。 0014 取 8 株阴性菌株以及 39 株单核细胞增生李斯特菌， 每株菌株 DNA 溶液均取 1L 作为 PCR 反应模板。 0015 图1所示。
20、为8株阴性菌株以及39株单核细胞增生李斯特菌的PCR的检测结果。 图中 1-39 为单核细胞增生李斯特菌， 40 为绵羊李斯特菌， 41 为英诺克李斯特菌， 42 为西尔 李斯特菌， 43为格氏李斯特菌， 44为威氏利斯特菌， 45为猪霍乱沙门氏菌， 46为鼠伤寒沙门 氏菌株， 47 为粘质沙雷菌， 48 为 ddH2O,M 为 5000bp Marker。图中表明 1-39 单核细胞增生 李斯特菌均有 226bp 的特异扩增条带， 而 8 株阴性菌株均没有相应的特异扩增条带。 0016 步骤 4， 灵敏度评价试验 纯化的单核细胞增生李斯特菌的总 DNA， 经 DU-800 紫外分光光度计测量。
21、， 起含量分别 为 32.6ng/L。将上述测定的单核细胞增生李斯特菌的总 DNA 溶液用无菌水 10 倍梯度 稀释， 从 32.6ng/L-0.326fg/LDNA 溶液分别取 2L 加入 PCR 反应体系 （50L） 。如 图 2 所示， 泳道 1-9 DNA 浓度分别为 ： 1.304ng/L,130.4pg/L， 13.04pg/L， 1.304pg/ L， 130.4fg/L， 13.04fg/L， 1.304fg/L， 0.1304 fg/L,0.01304 fg/L， 泳道10为 ddH20， 泳道 M 为 5000bp Marker。扩增结果如图 2 所示， 在第 7 条泳道可。
22、以看到清晰的条 带， 所对应 DNA 浓度为 1.304fg/L， 而第 8 条泳道之后看不到扩增条带。因此， 判定 PCR 检测灵敏度为 1.304fg/L， 具有较高的灵敏度。 0017 实施例 2 ： 单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测方法准确性评价 利用实施例 1 中建立的单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测方法， 检测人工污染肉类样品 是否含有单核细胞增生李斯特菌。从 LB 平板上挑取单核细胞增生李斯特菌的单菌落， 接入 到50mL LB 液体培养基中去， 在37C培养12h。 用生理盐水作10倍的梯度稀释， 并取1mL 稀释度为 10-8的菌液作平板计数， 计算单核细胞增生李斯特菌纯。
23、培养的起始浓度。40 份猪 肉样品， 无菌取样 25mL， 接入 1mL 10-2梯度稀释的单核细胞增生李斯特菌菌悬液。将 40 份 人工污染样品添加到 225mL LB 液体培养基中。在 37 C 的摇床 （120r/min） 中增菌。12h 后进行取样 1 次。每份样品取样 1mL， 放入 1.5mL 离心管中， 30000r/min 离心 10min， 沉淀 培养物中的食品残渣。取上清液， 在 12000g/min 离心 5min， 收集单核细胞增生李斯特菌菌 体。倒去上清液后， 用无菌双蒸水重新悬浮菌体， 离心洗涤 3 次。然后加入 100L 无菌超 纯水， 在沸水浴中煮 10min 。
24、然后取出， 在 -20 C 放置 30min。37 C 解冻后， 12000g/min 离 心 5min。上清液为 PCR 模板 DNA 溶液， 获得人工污染样品中 PCR 模板 DNA 溶液 , 进行 PCR 说 明 书 CN 104328187 A 6 5/5 页 7 检测。检测结果中都为阳性。因此利用单核细胞增生李斯特菌 PCR 检测方法具有较高的准 确性。 说 明 书 CN 104328187 A 7 1/1 页 8 单核细胞增生李斯特菌检测用引物对及其检测方法 5 1 21 DNA 引物 1 ATCAA CCAGA TGTTC TCCCT G 21 2 23 DNA 引物 1 GAC。
25、GA AATGG CTTAC AGTGA ATC 23 3 226 DNA 李斯特菌 1 ATCAA CCAGA TGTTC TCCCT GTAAA ACGTG ATTCA TTAAC ACTCA GCATT GATTT GCCAG 60 GTATG ACTAA TCAAG ACAAT AAAAT CGTTG TAAAA AATGC CACTA AATCA AACGT TAACA 120 ACGCA GTAAA TACAT TAGTG GAAAG ATGGA ATGAA AAATA TGCTC AAGCT TATCC AAATG 180 TAAGT GCAAA AATTG ATTAT GATGA CGAAA TGGCT TACAG TGAAT C 226 序 列 表 CN 104328187 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104328187 A 9 。