一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法.pdf

本发明公开了一种利用腋芽增殖试管克隆快繁地灵的方法，具体步骤包括休眠芽发育诱导培养；腋芽增殖培养；芽苗再增殖；壮苗生根培养；炼苗和缓苗；起窝和栽种；地灵大田定植缓苗后进行常规方法管理。本发明利用地灵地下根茎为外植体建立无性繁殖系，通过腋芽增殖进行地灵试管克隆繁育，克服了传统地灵利用根茎繁殖用种量大、繁殖效率低及多代无性繁殖种性退化严重、产量、品质下降等缺陷。效率高、技术路线可行、能集约化、大规模生产，为地灵优良品种快速、高效的克隆繁育、种性保持和种苗生产提供了一个可行的、有效的方法，该技术芽增殖系数在4.2左右、生根率为100％，定植成活率在95％以上。

1.  一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)休眠芽发育诱导培养：在地灵收获期，选取大田栽培、生长健壮、单株产量高的地灵单株的地下根茎，经充分水洗后用质量分数为75％的乙醇消毒30秒，用每升含有0.1％的汞消毒10分钟，于无菌条件下切成带休眠芽的茎段，接种到地灵休眠芽发育诱导培养基上，于25℃～27℃温度、3000Lx光照条件下诱导地灵地下根茎休眠芽发育；
所述的地灵休眠芽发育诱导培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤；
调整休眠芽发育诱导培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm2)灭菌15分钟；
2)腋芽增殖培养：当休眠芽发育诱导培养基上的地灵根茎休眠芽发育到3～4片叶时，切下幼苗接种到地灵腋芽发育增殖培养基中，于温度25℃～27℃、3000Lx光照条件下诱导地灵无菌苗腋芽发育增殖；
所述的腋芽增殖培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤(KT)和0.5mg/L的吲哚乙酸(IAA)；
调整腋芽增殖培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；无菌苗经过腋芽增殖培养，一个无菌苗增殖到4～5个苗或枝条；
3)芽苗再增殖：切取腋芽增殖培养基上的单个枝条，接种到同一腋芽增殖培养基上，在同样培养条件下诱导腋芽发育再增殖；
腋芽发育增殖进行多次，每次为一代，根据增殖起始苗数、有效繁殖系数和年生产规模确定增殖代数；
4)壮苗生根培养：地灵腋芽发育增殖每一代的试管苗和增殖培养结束后所有试管苗，切下单个芽苗转入壮苗生根培养基中，于25℃条件下连续光照培养18天进行壮苗生根；
壮苗生根培养基以通用培养基MS为基础，将MS通用培养基的无机盐浓度降低一半，并附加0.5mg/L的α-萘乙酸(NAA)；
调整壮苗生根培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅灭菌15分钟(1.0kg/cm2)；
5)炼苗和缓苗：试管苗生根壮苗培养18天后，向培养瓶中加少量无菌自来水，于10～18℃遮阴条件下炼苗3～6天，然后取出试管苗，洗净根部琼脂，移栽于含30％沙子的沙质土壤营养钵中，置于10～18℃遮阴条件下缓苗10～15天；
6)起窝和栽种：地灵大田定植每亩按3000～5000株起窝，每窝浇足水，将去掉营养钵的地灵苗连同介质直接栽入并复土、浇水；
7)地灵大田定植缓苗后，按常规方法管理。

一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法
技术领域
本发明属于保健植物的试管快繁技术，具体涉及一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法。
背景技术
地灵(Stachys floridana)，又称银条，是唇形科水苏属多年生蓄根草本植物，主要产于我国西北、华北等地，生长于水位较高的沙土荒地、田间及草丛湿地，目前在我国西北地区的甘肃、宁夏、新疆、陕西延安、榆林以及河北、内蒙、东北等地有一定分布，处于半野生状态。地灵作为蔬菜人工栽培面积很小，地灵含有丰富的水苏糖；水苏糖属于低聚半乳糖，是一种能显著促进双歧杆菌增殖的功能性低聚糖，故被誉为“超强双歧因子”低聚糖。作为双歧因子的一种，水苏糖对人体胃肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌群有着极明显的增殖作用，能迅速改善人体消化道内环境，调节微生态平衡。通过获得大量增殖的双歧杆菌、乳酸杆菌，促进形成有益菌在消化道内的优势菌地位。双歧杆菌等有益菌具有能清除自由基及过氧化脂质的能力，抑制产气产酸梭状芽孢杆菌等腐败菌的生产，因而能够延缓细胞的衰老，另外产生大量生理活性物质，调节肠道pH值、灭杀致病菌，阻遏腐败产物生成，抑制内源致癌物的产生和吸收，起到延年益寿的作用，除此，双歧杆菌能非特异性地提高机体的免疫力，提高抗感染的能力，也有利于健康和长寿。地灵作为我国水苏糖生产的主要原料，和我国水苏糖产业的发展是紧密相关联的，我国近几年水苏糖产业的飞速发展，要求地灵的生产在产量和质量上要同步跟进。但由于地灵是通过播种地下茎进行无性繁殖的植物，像马铃薯这些无性繁殖作物一样，种性退化是其栽培的主要问题，近几年我国地灵由半野生的零星栽培到规模化的人工无性繁殖栽培，使地灵不同程度病毒累积、种性退化、成片死亡的问题日益凸现，给大规模生产带来了极大风险；同时地灵通过播种地下茎进行无性繁殖，繁殖系数很低，种源严重匮乏，这些都成为制约地灵大规模生产的瓶颈，因此加大地灵的生产规模，保证地灵的安全生产，提高地灵根茎生产量已经成为当前我国特有野生资源地灵栽培和水苏糖产业开发的当务之急。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题或不足，申请人进行了地灵腋芽发育试管克隆繁育的技术开发研究，经过实验研究和技术的集成优化，提出一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法。该方法利用植物克隆繁育技术，进行工厂化、规模化的地灵克隆繁育，克服了传统地灵利用根茎繁殖用种量大、繁殖效率低及多代无性繁殖种性退化严重、产量、品质下降等弊端，大幅度的提高地灵繁殖速度和繁殖效率，加快地灵产业的发展，保证地灵种性和生产潜力，大幅度的提高地灵的产量与品质。
为实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法，包括下列步骤：
1)休眠芽发育诱导培养：在地灵收获期，选取大田栽培、生长健壮、单株产量高的地灵单株地下根茎，经充分水洗后用质量分数为75％的乙醇消毒30秒，用每升含有0.1％的汞消毒10分钟，于无菌条件下切成带休眠芽的茎段，接种到休眠芽发育诱导培养基上，于25℃～27℃温度、3000Lx光照条件下诱导地灵地下根茎休眠芽发育；
所述地灵休眠芽发育诱导培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤；
调整休眠芽发育诱导培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟。
2)腋芽增殖培养：当休眠芽发育诱导培养基上的地灵根茎休眠芽发育到3～4片叶时，切下幼苗接种到地灵腋芽发育增殖培养基中，于温度25℃～27℃、3000Lx光照条件下诱导地灵无菌苗腋芽发育增殖；
所述的腋芽增殖培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤(KT)和0.5mg/L的吲哚乙酸(IAA)；
调整腋芽增殖培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；无菌苗经过腋芽增殖培养，一个无菌苗增殖到4～5个苗或枝条；
3)芽苗再增殖：切取腋芽增殖培养基上的单个枝条，接种到同一腋芽增殖培养基上，在同样培养条件下诱导腋芽发育再增殖；
腋芽发育增殖进行多次，每次为一代，根据增殖起始苗数、有效繁殖系数和年生产规模确定增殖代数；
4)壮苗生根培养：地灵腋芽发育增殖每一代的试管苗和增殖培养结束后所有试管苗，切下单个芽苗转入壮苗生根培养基中，于25℃条件下连续光照培养18天进行壮苗生根；
壮苗生根培养基以通用培养基MS为基础，将MS通用培养基的无机盐浓度降低一半，并附加0.5mg/L的α-萘乙酸(NAA)；
调整壮苗生根培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
5)炼苗和缓苗：试管苗生根壮苗培养18天后，向培养瓶中加少量无菌自来水，于10～18℃遮阴条件下炼苗3～6天，然后取出试管苗，洗净根部琼脂，移栽于含30％沙子的沙质土壤营养钵中，置于10～18℃遮阴条件下缓苗10～15天；
6)起窝和栽种：地灵大田定植每亩按3000～5000株起窝，每窝浇足水，将去掉营养钵的地灵苗连同介质直接栽入并复土、浇水；
7)地灵大田定植缓苗后，按常规方法管理。
本发明利用地灵地下根茎为外植体建立无性繁殖系，研发了通过腋芽增殖克隆繁育地灵的方法，克服了传统地灵利用根茎繁殖用种量大、繁殖效率低及多代无性繁殖种性退化严重、产量、品质下降等弊端。建立了效率高、技术路线可行、芽增殖系数在4.2左右、生根率为100％，定植成活率在95％以上，能集约化、大规模生产的地灵试管繁育技术体系，为地灵优良品种快速、高效的克隆繁育、种性保持和种苗生产提供了一个可行的、有效的方法。
附图说明
图1是地灵在试管腋芽增殖繁育的图片：
图2是试管克隆的地灵试管苗移入营养钵中生长情况图片；
图3是大田试管地灵繁育与常规根茎繁育生长比较。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
一、具体实施例
实施例1：
按照本发明的利用腋芽增殖试管快繁地灵的方法，包括下列步骤：
1)休眠芽发育诱导培养：在地灵收获期，选取大田栽培、生长健壮、单株产量高的地灵单株地下根茎，经充分水洗后用质量分数为75％的乙醇消毒30秒，用每升含有0.1％的汞消毒10分钟，于无菌条件下切成带休眠芽的茎段，接种到休眠芽发育诱导培养基上，于25℃、3000Lx光照条件下诱导地灵地下根茎休眠芽发育；
地灵休眠芽发育诱导培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L 6-呋喃基氨基嘌呤；
调整休眠芽发育诱导培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
通用培养基MS的配方为：硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸氨(NH4NO3)：1650mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)：440mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：27.8mg/L，乙二酸四乙钠(Na2EDTA)：37.3mg/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)：22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂5000mg/L；
2)腋芽增殖培养：当休眠芽发育诱导培养基上的地灵根茎休眠芽发育到3～4片叶时，切下幼苗接种到地灵腋芽发育增殖培养基中，于27℃、3000Lx光照条件下诱导地灵无菌苗腋芽发育增殖；
腋芽增殖培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤(KT)和0.5mg/L的吲哚乙酸(IAA)；
调整腋芽增殖培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅灭菌15分钟(1.0kg/cm2)。无菌苗经过腋芽增殖培养，一个无菌苗可增殖到4～5个苗或枝条；
3)芽苗再增殖：切取增殖培养基上的单个枝条，接种到同一腋芽增殖培养基上，在同样培养条件下诱导腋芽发育再增殖；
这一腋芽发育增殖要进行多次，每次为一代，增殖代数根据增殖起始苗数、有效繁殖系数和年生产规模来定。如起始增殖苗数为100个苗，有效繁殖系数为4，年生产规模160万株，则增殖代数应为7代；
4)壮苗生根培养：地灵腋芽发育增殖每一代一定试管苗和增殖培养结束后所有试管苗，切下单个芽苗转入壮苗生根培养基中，于25℃条件下连续光照培养18天进行壮苗生根；
壮苗生根培养基采用通用培养基MS，以通用培养基MS为基础，MS通用培养基的无机盐浓度降低一半，附加0.5mg/Lα-萘乙酸(NAA)；
调整壮苗生根培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
5)炼苗和缓苗：生根壮苗培养18天的试管苗后，打开培养瓶口，向培养瓶中加少量无菌自来水，于18℃遮阴条件下炼苗3天，然后取出试管苗，洗净根部琼脂，移栽于含30％沙子的沙质土壤营养钵中，置10℃遮阴条件下缓苗10～15天；
6)起窝和栽种：地灵大田定植每亩按5000株起窝，每窝浇足水，将去掉营养钵的地灵苗连同介质直接栽入并复土、浇水；
7)地灵大田定植缓苗后，按常规方法管理。
实施例2：
本实施例与实施例1步骤相同，二者区别在于步骤中的具体条件的控制，本实施例能够达到实施例1的技术效果，包括下列步骤：
1)休眠芽发育诱导培养：在地灵收获期，选取大田栽培、生长健壮、单株产量高的地灵单株的地下根茎，经充分水洗后用质量分数为75％的乙醇消毒30秒，用每升含有0.1％的汞消毒10分钟，于无菌条件下切成带休眠芽的茎段，接种到休眠芽发育诱导培养基上，于27℃、3000Lx光照条件下诱导地灵地下根茎休眠芽发育；
地灵休眠芽发育诱导培养基采用通用培养基MS，以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L 6-呋喃基氨基嘌呤；
调整休眠芽发育诱导培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
2)腋芽增殖培养：当芽诱导培养基上的地灵根茎休眠芽发育到3～4片叶时，切下幼苗接种到地灵腋芽发育增殖培养基中，于25℃、3000Lx光照条件下诱导地灵无菌苗腋芽发育增殖；
腋芽增殖培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤(KT)和0.5mg/L的吲哚乙酸(IAA)；
调整腋芽增殖培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力；1.0kg/cm2)灭菌15分钟。无菌苗经过腋芽增殖培养，一个无菌苗可增殖到4～5个苗或枝条；
3)芽苗再增殖：切取腋芽增殖培养基上的单个枝条，接种到同一腋芽增殖培养基上，在同样培养条件下诱导腋芽发育再增殖；这一腋芽发育增殖要进行多次；
4)壮苗生根培养：地灵腋芽发育增殖每一代一定试管苗和增殖培养结束后所有试管苗，切下单个芽苗转入壮苗生根培养基中，于25℃条件下连续光照培养18天进行壮苗生根；
壮苗生根培养基采用通用培养基MS，以通用培养基MS为基础，MS通用培养基的无机盐浓度降低一半，附加0.5mg/L的α-萘乙酸(NAA)；
调整壮苗生根培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
5)炼苗和缓苗：生根壮苗培养18天的试管苗后，打开培养瓶口，向培养瓶中加少量无菌自来水，于10℃遮阴条件下炼苗6天，然后取出试管苗，洗净根部琼脂，移栽于含30％沙子的沙质土壤营养钵中，置18℃遮阴条件下缓苗10～15天；
6)起窝和栽种：地灵大田定植每亩按3000株起窝，每窝浇足水，将去掉营养钵的地灵苗连同介质直接栽入并复土、浇水；
7)地灵大田定植缓苗后，按常规方法管理。
实施例3：
本实施例与实施例1步骤相同，二者区别在于步骤中的具体条件的控制，本实施例能够达到实施例1的效果，包括下列步骤：
1)休眠芽发育诱导培养：在地灵收获期，选取大田栽培、生长健壮、单株产量高的地灵单株的地下根茎，经充分水洗后用质量分数为75％的乙醇消毒30秒，用每升含有0.1％的汞消毒10分钟，于无菌条件下切成带休眠芽的茎段，接种到休眠芽发育诱导培养基上，于26℃温度、3000Lx光照条件下诱导地灵地下根茎休眠芽发育；
地灵休眠芽发育诱导培养基采用通用培养基MS，以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L 6-呋喃基氨基嘌呤；
调整休眠芽发育诱导培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
2)腋芽增殖培养：当休眠诱导发育培养基上的地灵根茎休眠芽发育到3～4片叶时，切下幼苗接种到地灵腋芽发育增殖培养基中，于26℃、3000Lx光照条件下诱导地灵无菌苗腋芽发育增殖；
腋芽增殖培养基以通用培养基MS为基础，附加2.0mg/L的6-呋喃基氨基嘌呤(KT)和0.5mg/L的吲哚乙酸(IAA)；
调整腋芽增殖培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅灭菌15分钟(压力；1.0kg/cm2)。无菌苗经过腋芽增殖培养，一个无菌苗可增殖到4～5个苗或枝条；
3)芽苗再增殖：切取腋芽增殖培养基上的单个枝条，接种到同一腋芽发育增殖培养基上，在同样培养条件下诱导腋芽发育再增殖；
这一腋芽发育增殖要进行多次；
4)壮苗生根培养：地灵腋芽发育增殖每一代一定试管苗和增殖培养结束后所有试管苗，切下单个芽苗转入壮苗生根培养基中，于25℃条件下连续光照培养18天进行壮苗生根；
壮苗生根培养基采用通用培养基MS，以通用培养基MS为基础，MS通用培养基的无机盐浓度降低一半，附加0.5mg/L的α-萘乙酸(NAA)；
调整壮苗生根培养基的pH值为5.6，置高压灭菌锅(压力：1.0kg/cm²)灭菌15分钟；
5)炼苗和缓苗：生根壮苗培养18天的试管苗后，打开培养瓶口，向培养瓶中加少量无菌自来水，于15℃遮阴条件下炼苗5天，然后取出试管苗，洗净根部琼脂，移栽于含30％沙子的沙质土壤营养钵中，置12℃遮阴条件下缓苗14天；
6)起窝和栽种：地灵大田定植每亩按4000株起窝，每窝浇足水，将去掉营养钵的地灵苗连同介质直接栽入并复土、浇水；
7)地灵大田定植缓苗后，按常规方法管理。
二、大田试验研究及试验结果
试验采用上述实施例1，进行了小规模地灵试管克隆繁育，用100个无菌苗起始繁育，增殖三代，获试管苗7500株，增殖系数达到了4.2；经生根壮苗获7500株生根苗，生根率为100％；经炼苗移栽和田间定植，共获得了7210个生长健壮、发育良好的移栽苗，定植成活率达96％。
参见图片1，地灵增殖：通过腋芽发育进行地灵试管增殖繁育，繁殖系数4～5；参见图片2，地灵试管克隆的试管苗移入营养钵中生长情况良好；参见图片3，大田试管地灵繁育与常规根茎繁育生长比较，试管繁育地灵(近端)生长远好于根茎繁育地灵(远处)。
综上，本发明利用地灵地下根茎为外植体建立无性繁殖系，通过腋芽增殖进行地灵试管克隆繁育，是一个效率高、技术路线可行、能集约化、大规模生产的地灵试管克隆繁育技术体系，为地灵优良品种快速、高效的克隆繁育、种性保持和种苗生产提供了一个可行的、有效的技术体系和方法。该技术芽增殖系数在4.2左右、生根率为100％，定植成活率在95％以上。克服了传统地灵利用根茎繁殖用种量大、繁殖效率低及多代无性繁殖种性退化严重、产量、品质下降等弊端。