乙型肝炎病毒表面L蛋白相关肽.pdf

本发明涉及用于预防、治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除这些多肽抗原性的筛选方法以及通过该方法筛选得到的去抗原性衍生肽。HBV表面L蛋白pre-S1区含有病毒黏附细胞表面受体的关键性氨基酸序列以及与抗L蛋白抗体结合的抗原性氨基酸序列。本申请提供的HBV表面L蛋白pre-S1区的多肽可抑制HBV对细胞的感染。本发明同时提供了去除这些多肽抗原性的筛选方法，并筛选出既可抑制HBV感染又不与抗体结合的去抗原性衍生肽，不仅解决了天然L蛋白衍生肽与抗L蛋白抗体之间在抑制HBV感染时的相互干扰，而且使去抗原性衍生肽与抗HBV表面L蛋白抗体发挥协同抑制HBV感染的作用。

权利要求书
1.  一种HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，它具有通式X-Y-Z，其中，
X表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第1到第12个氨基酸构成的序列，或自该序列N末端缩短的序列，或完全缺失，其中，X的N末端可被修饰；
Y表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59个氨基酸序列，其中，Y的N末端和/或C末端可被修饰；
Z表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89氨基酸序列，或自该序列C末端缩短的序列或完全缺失，其中，Z的C末端可被修饰。

2.  如权利1所述的多肽，其特征在于，所述Y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。

3.  如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述序列选自SEQ ID NO：2-7，其中SEQ ID NO：3-7的第1个氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。

4.  一种HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，该多肽具有通式x-y-z，其中，
x表示甲硫氨酸，其可被修饰，或者x不存在；
y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32个氨基酸序列，其中，y的N末端和/或C末端可被修饰；
z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自该序列C末端缩短的序列或完全缺失，其中，z的C末端可被修饰。

5.  如权利4所述的多肽，其特征在于，其y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。

6.  如权利4或5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为SEQ ID NO：9，其第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。

7.  一种蛋白去抗原性衍生肽的筛选方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定属性，其特征在于，该方法包括：
(A)在待筛选的病毒蛋白中引入随机序列，建立该蛋白特定区域或全部蛋白随机编码的重组病毒库；
(B)在待筛选蛋白抗体存在的条件下，筛选仍具有感染能力的重组病毒亚群，并获得该重组病毒亚群中该蛋白的氨基酸序列，即获得该蛋白去抗原性候选肽序列；
(C)按获得的去抗原性候选肽序列合成相应的去抗原性候选肽，筛选可调节病毒感染能力却不与该病毒蛋白抗体结合的去抗原性的多肽，即获得蛋白去抗原性衍生肽。

8.  一种HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通过权利7所述方法对权利1所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽进行筛选而得到，其特征在于，它具有通式
α-β
式中，
α表示HBV表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自该序列N末端缩短的序列或仅为第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修饰；
β表示应用权利要求7所述的筛选方法对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列进行筛选获得的氨基酸序列，其中，所获得的氨基酸序列的N末端可被修饰和/或其C末端可被缩短或修饰。

9.  一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1或4所述的HBV表面L蛋白的多肽或权利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，和药学上可接受的载体。

10.  权利要求1或4所述的HBV表面L蛋白的多肽或权利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制备预防和/或治疗乙型肝炎的药剂中的用途。

说明书乙型肝炎病毒表面L蛋白相关肽
本发明专利申请是申请号为201210177978.6的中国发明专利申请的分案申请，该申请是2005年8月12日提交、发明名称为“乙型肝炎病毒表面L蛋白相关肽”的发明专利申请的分案。
技术领域
本发明涉及用于预防、治疗乙型肝炎病毒(human hepatitis B virus,HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除这些多肽抗原性的筛选方法以及通过该方法筛选得到的去抗原性衍生肽。特别是本发明涉及来源于B基因型adw血清型、C基因型adr血清型以及D基因型ayw血清型HBV的L蛋白pre-S1区多肽。同样特别地，本发明涉及去除HBV表面L蛋白衍生肽抗原性的筛选方法以及通过该方法获得的可阻断HBV感染却不与抗体结合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。该去抗原性衍生肽可与抗HBV表面L蛋白抗体协同抑制HBV感染。
背景技术
1.HBV的流行病学
HBV感染是全球最为严重的公共卫生问题之一，是仅次于性病和水痘的第三常见疾病。全球约有20亿人感染过HBV，75％的世界人口生活在乙型肝炎高发区，慢性HBV感染者超过3.5亿。每年与HBV感染相关的死亡人数高达100万(1)，每年新增感染估计是HIV新增感染的2.5～4倍。世界上75％的HBV慢性感染者集中在亚洲(约为2.87亿)，中国是乙型肝炎的高流行区，70年代末和90年代初两次全国肝炎流行病学调查的数据显示，我国感染过HBV者6.9亿，感染率为57.6％，全国长期携带HBV者1.2亿，HBV表面抗原携带率9.75％，现有的慢性乙型肝炎患者2000余万，且自1995年开始，中国人群乙型肝炎发病比例呈逐年升高趋势，因此在卫生部《2005年卫生工作要点》中已将乙型肝炎列入我国需要重点控制的四大疾病之一。
2.HBV感染的预防与治疗现状
HBV的重要性早已在世界范围内得到广泛公认，其预防和治疗也被置于优先地位。但迄今尚缺乏可清除体内HBV的药物，疗效相对确切的抗病毒药物主要是α干 扰素和核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和特必夫定等)。α干扰素主要通过免疫调节和诱生靶细胞内抗病毒蛋白而发挥抗病毒作用；核苷类似物则作用于HBV逆转录酶，抑制病毒DNA链的合成，从而抑制HBV DNA的复制。经过1年的标准疗程治疗，约33％的α干扰素治疗患者和约16％的拉米夫定治疗患者可获得彻底或部分血清学应答(HBsAg转阴、HBeAg均转阴、出现或不出现抗-HBe抗体)、完全的病毒学应答(HBV DNA转阴)和生化应答(丙氨酸氨基转移酶间隔1个月连续2次检测均正常，肝功能复常)。
自从1970年Krugman获得最早的乙型肝炎疫苗后，各国相继利用无症状HBsAg携带者的血浆提取血源性HBsAg制备HBV疫苗。血源性HBV疫苗经过长期使用被证明安全有效，但由于其来源有限，制备成本高昂，已被基因重组HBV疫苗取代。目前主要的重组疫苗包括酵母和中国仓鼠卵巢细胞表达的重组乙肝疫苗。这些疫苗免疫原性强，3针全程免疫后抗HBsAg抗体阳转率不低于85％。但其主要缺点是抗体应答较迟，HBV感染产妇的新生儿初次免疫若超过7天以上，则失去HBV疫苗对新生儿阻断垂直传播的作用。而且10％～15％接种者不产生应答或低应答，该人群仍可被HBV感染。
乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用经乙型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效价血浆或血清分离提取制备的免疫球蛋白制剂，其抗体效价在100IU/ml以上。适用于突发意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染产妇新生儿的被动免疫预防。我国的慢性HBV感染者约有30％-50％通过母婴传播，为阻断HBV母婴围产期传播，普遍将HBIG与乙肝疫苗联合应用，虽然保护率可达80％以上，但HBIG提供的阻断贡献并不明显，联合应用仅较乙肝疫苗单用提高5％～10％的阻断率，而且联合应用后HBV感染产妇新生儿HBV感染率仍较健康产妇新生儿高4倍。近年发现，宫内感染可能是母婴传播的重要途径，HBV感染孕妇引产胎儿肝脏或血液的HBV感染标志检出率可达40％，HBsAg阳性母亲的婴儿的宫内感染率约16％。因此国内有些医院在妊娠的最后3～4个月中对HBV感染孕妇每月一次注射大于200IU的HBIG，以期预防胎儿HBV宫内感染。但该方法宫内传播阻断效果并不理想，且可能导致HBV S区变异株的出现和免疫复合物病理免疫反应的发生。
HBIG还广泛应用于乙型肝炎相关肝移植术后HBV感染复发的预防。在没有预防措施的情况下，乙型肝炎相关肝移植术后6个月内HBV再感染率高达约40％，2年内再感染率高达约60％。多数再感染病例历经急性、慢性肝炎而发展为肝硬化、肝功能衰竭，远期预后不佳，需再次肝移植。单独采用拉米夫定预防肝移植术后乙型肝炎复发，其长期HBV-DNA、HBeAg及HBsAg转阴率约60～70％，且易发生HBV 基因突变，YMDD耐药变异率高达21％。加之患者移植前多长期使用抗病毒药物，多数出现抗病毒药物抵抗现象，增加了移植后病毒感染复发率和预防的难度。因此国外加用大剂量HBIG以预防乙型肝炎相关肝移植术后乙肝复发。肝移植术后没有接受HBIG治疗的受者中，术后早期体内出现不同滴度的HBsAb，随后血清HBsAb逐渐消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能长期维持较高滴度。高剂量无限制性HBIG单一治疗能阻止65％～80％患者复发，但HBIG价格昂贵，费用每年高达约130万元人民币。国内采用拉米夫定与小剂量HBIG联合应用阻止移植后HBV感染复发的疗效虽然显示良好，但未经大样本临床试验证实。且长期应用HBIG带来的免疫压力会造成HBV基因变异而出现免疫逃逸现象，使HBIG用于乙型肝炎相关肝移植术后HBV再感染的预防受到很大限制。
综上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸类似抑制物、抗病毒细胞因子和中和性抗体的主动被动免疫，缺少对HBV病毒其他感染环节的抑制手段。本发明所涉及的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽则可直接作用于HBV与肝细胞表面受体结合的最初感染环节，直接阻断病毒对肝细胞的感染，为HBV感染的治疗和预防提供新的手段。
3.HBV病毒学
1)概述
HBV属嗜肝DNA病毒科非细胞溶破性病毒。其基因组为部分双链的环状DNA，仅长约3.2kb，是已知最小的DNA病毒。高度重叠的4个基因区编码至少8种蛋白，即S区基因编码的L、M、S表面抗原HBs；C基因编码的pre-C、HBc、HBe；P基因编码的聚合酶和X基因编码的HBx。通常情况下HBV的感染和复制不引起肝细胞明显的病理性改变，产生的病毒颗粒以分泌方式释放。HBV产生的相关颗粒主要有3种形态，包括直径42-47nm的Dane颗粒、丰度高于Dane颗粒10,000-1,000,000倍的20nm球状颗粒和少量直径20nm长度不等的丝状纤维。其中只有Dane颗粒由基因组DNA、病毒DNA聚合酶、核衣壳和被膜构成，是HBV唯一具有感染活性的病毒性颗粒。
2)HBV基因型、血清型及其流行病学分布
目前HBV存在血清型和基因型两种不同的分型体系。1972年Lebouvier等根据HBV表面蛋白HBsAg的共同抗原决定簇a以及相互排斥的两对抗原决定簇d/y和w/r，将HBV分为adw，adr，ayw和ayr四个血清型。1978年Courouce Pauty等又将抗原 决定簇w分为w1～4，加上新发现的抗原决定簇q，将HBV进一步分为ayw1，ayw2，ayw3，ayw4，ayr，adw2，adw4，adrq+和adrq-等9个血清型(2)。1988年以来，依据HBV全基因系统进化分析的结果,以全基因核苷酸异源性≥8％为分型标准，将HBV分为8个基因型(A～H)(3,4)。各基因型之间的组合还可产生A/D、B/C、Ba和Bj等不同重组体。HBV血清型和基因型之间的对应关系见表1。
虽然HBV感染在世界各地均有不同程度的流行,国家间和国内地区间却存在非常明显的差异(表1)。我国A、B、C、D等基因型HBV感染均呈不同程度的存在，北方地区以C基因型为主，由北至南B基因型感染率逐渐增高，深圳B基因型和C基因型感染率比例相当，西藏等少数民族地区D基因型有较高的感染率。我国adr、adw2、ayr、ayw1、ayw2和ayw3等血清型HBV均有分布，但以adr和adw2为优势血清型。在我国B基因型与adw2血清型、C基因型与adr血清型存在明显对应关系。
表1.HBV基因型和血清学亚型、HBV蛋白、PC/BCP突变的关系及主要流行地域

4.介导HBV感染的表面L蛋白关键氨基酸序列及其衍生肽抑制病毒感染的机理
HBV病毒包膜含有大(L)、中(M)、小(S)三种表面抗原蛋白，这些蛋白由具有3个不同翻译起始位点的S区基因单一开放阅读框编码，即L(Pre-S1+Pre S2+S)、M(Pre S2+S)和S(S)。HBV S基因区801个碱基编码S蛋白266个氨基酸，Pre-S2区165个碱基编码M蛋白另外的55个氨基酸。Pre-S1区在A、B、C、F和H基因型为357个碱基，编码L蛋白另外的119个氨基酸。D、G基因型在该区分别缺失33个和3个碱基，分别编码L蛋白N末端的108和118个氨基酸。三种表面蛋白的表达量差异悬殊，且分布方式显著不同。S蛋白表达量高，是HBV感染患者循环血中HBs的主要蛋白，而M和L蛋白则含量甚微，分别只占全部HBs蛋白的5～15％和1～2％。20nm球状颗粒和丝状纤维的包膜蛋白主要由S蛋白和数量不等的M蛋白组成，几乎不含L蛋白，而Dane颗粒包膜的蛋白则主要为L蛋白。
HBV的L蛋白Pre-S1区存在与肝细胞特异性受体结合的关键氨基酸序列，定位于Pre-S1的第2到第77位氨基酸，Pre-S2区对病毒感染不发挥关键作用。L蛋白合成后在第2位甘氨酸进行豆蔻酰化翻译后修饰，如果该位置以不能被豆蔻酰化的丙氨酸替代甘氨酸，其L蛋白则不能被翻译后修饰，相应的突变病毒株也即失去了对肝细胞的感染能力，可见L蛋白的翻译后豆蔻酰化修饰对病毒感染的重要性。L蛋白特异地存在于Dane颗粒表面，而几乎不存在于20nm颗粒和丝状纤维，如此既可以避免20nm颗粒对肝细胞感染受体的竞争，又可以利用20nm颗粒吸引体内抗HBV表面蛋白的抗体，便于感染性Dane颗粒逃脱体液免疫的病毒清除作用。
依据竞争原理，来自L蛋白2-78位氨基酸的N末端豆蔻酰化修饰短肽可以阻断HBV对肝细胞和Hepa RG肝细胞系的感染，该短肽可进一步缩短至L蛋白的2-48位氨基酸。鸭乙型肝炎病毒DHBV表面L蛋白preS第2到第41位氨基酸对应的多肽对DHBV的感染也存在类似的阻断效应。狨猴乙型肝炎病毒WMHBV来源的类似短肽也可对HBV感染发挥交叉阻断效应。Pre-S1的该段序列具有很高的抗原性，含有与MA18/7、5a19等抗体结合的氨基酸序列。这些抗体可中和HBV病毒，阻断病毒对人肝细胞、树鼩(T.belangeri)肝细胞和Hepa RG肝细胞系的感染。其机理可能是抗体与该段序列结合，阻断了L蛋白与细胞受体结合的位点，从而抑制了HBV对细胞的感染。临床资料也证实，乙型肝炎病毒感染患者体内可产生抗preS1抗体，且其出现与乙型肝炎的临床预后密切相关。preS1抗体常出现于急性自限性HBV感染，而少见于慢性HBV感染病人，提示该类抗体在清除HBV和控制HBV感染慢性化过程中 发挥重要作用。
5.本发明的意义和应用的前景
目前治疗HBV慢性感染的药物均作用于HBV细胞内复制环节，而HBV表面L蛋白多肽可直接抑制HBV对细胞的感染，为HBV感染的防治提供新的策略。但是该类短肽具有强烈的抗原性，存在与中和性抗体结合的氨基酸序列，同时该段序列系HBV结合感染受体必须位点，也即L蛋白多肽抑制HBV对细胞感染受体的结合的关键序列。患者体内存在与该序列结合的中和性抗体，应用该类多肽对HBV感染患者治疗时，多肽将与抗体相结合，使多肽失去与肝细胞表面HBV受体结合的作用，阻碍多肽抑制HBV感染的效力。另一方面，与多肽的结合消耗了体内的中和性抗体，反而有利于HBV的感染。此外还可能产生抗原抗体复合物免疫病理等其他不良反应。
本发明一方面提供了东南亚(特别是中国)广泛流行的B基因型adw血清型、C基因型adr血清型HBV表面L蛋白13-59氨基酸序列多肽和D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白2-47氨基酸序列多肽对HBV感染的抑制作用，另一方面提供了去除HBV表面L蛋白多肽抗原性的筛选方法，并通过筛选获得了可阻断HBV感染却又不与抗HBV表面L蛋白抗体结合的去抗原衍生肽。本发明还提供了该去抗原性衍生肽与抗HBV表面L蛋白抗体对HBV感染的协同抑制作用。
发明内容
第一方面，本发明涉及一种HBV表面L蛋白的多肽，该多肽具有通式X-Y-Z，其中，X表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第1到第12个氨基酸序列，或自该序列N末端缩短的序列，或完全缺失，其中，X的N末端可被修饰；Y表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59个氨基酸序列，其中，Y的N末端和/或C末端可被修饰；Z表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89氨基酸序列，或自该序列C末端缩短的序列，或完全缺失，其中，Z的C末端可被修饰。
在一个实施例中，所述Y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。在另一些实施例中，所述多肽选自SEQ ID NO：2-7，其中SEQ ID NO:3-7的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。
第二方面，本发明涉及一种HBV表面L蛋白的多肽，该多肽具有通式x-y-z，其中，x表示甲硫氨酸，其可被修饰，或者x不存在；y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32个氨基酸序列，其中，y的N末端和/或C末端可被修饰； z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自该序列C末端缩短的序列或完全缺失，其中，z的C末端可被修饰。
在一个实施例中，该y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰。在另一实施例中，该多肽的序列为第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修饰的SEQ ID NO：9。
第三方面，本发明涉及一种蛋白去抗原性衍生肽的筛选方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定属性，该方法包括：
(A)在待筛选的病毒蛋白中引入随机序列，建立该蛋白特定区域或全部蛋白随机编码的重组病毒库；
(B)在待筛选蛋白抗体存在的条件下，筛选仍具有感染能力的重组病毒亚群，并获得该重组病毒亚群中该蛋白的氨基酸序列，即获得该蛋白去抗原性候选肽序列；
(C)按获得的去抗原性候选肽序列合成相应的去抗原性候选肽，筛选可调节病毒感染能力却不与该病毒蛋白抗体结合的去抗原性的多肽，即获得蛋白去抗原性衍生肽。
第四方面，本发明还涉及一种HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通过本发明第三方面所述的筛选蛋白去抗原性衍生肽的方法对本发明的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽进行筛选而得到，它具有通式
α-β
式中，
α表示HBV表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自该序列N末端缩短的序列或仅为第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修饰；
β表示应用本发明第三方面所述的筛选方法对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列进行筛选获得的氨基酸序列，其中，所获得的氨基酸序列的N末端可被修饰和/或其C末端可被缩短或修饰。
本发明还涉及一种药物组合物，它含有本发明第一方面或第二方面所述的HBV表面L蛋白的多肽或第四方面所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，和药学上可接受的载体。该药物组合物还可含有其他抗病毒物质，如抗HBV抗体、细胞因子等。
本发明还涉及本发明所述的HBV表面L蛋白的多肽或HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制备预防和/或治疗乙型肝炎的药剂中的用途。
附图说明
图1显示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白衍生肽 Myr 13-59对HBV肝细胞感染的抑制。
图2显示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47对HBV肝细胞感染的抑制。
图3显示HBV表面L蛋白去抗原性候选肽与抗体的结合率。
图4显示HBV表面L蛋白去抗原性候选肽抑制HBV对肝细胞的感染。
图5显示抗HBV表面L蛋白抗体对HBV表面L蛋白衍生肽及去抗原性衍生肽阻断HBV感染作用的影响。
图6显示HBV表面L蛋白衍生肽及去抗原性衍生肽对抗HBV表面L蛋白抗体阻断HBV感染作用的影响。
具体实施方式
如上所述，本发明第一方面提供了来源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白的衍生肽，该衍生肽可抑制HBV对肝细胞的感染。这些衍生肽序列可用通式X-Y-Z表示，这里X表示HBV表面L蛋白的第1到12位氨基酸序列，或自该序列的N末端缩短的序列或完全缺失，包括以上序列N末端修饰的衍生序列。所述“自该序列的N末端缩短”包括从该序列N末端的第1位氨基酸开始缩短，可缩短到只剩该序列第12位氨基酸，即X可以是所述序列的第a位到第12位氨基酸序列，其中a为1-11的整数，或者X仅为该第12个氨基酸。
Y表示B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白序列中第13到第59位氨基酸序列，并包括该序列N末端和/或C末端修饰的衍生序列。
Z表示B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89位氨基酸序列，或自C末端缩短的序列或完全缺失，包括以上序列C末端修饰的衍生序列。所述“自C末端缩短”包括从C末端的第1个氨基酸(即本发明所述的第89位氨基酸)开始缩短，可缩短到只剩该序列第60位氨基酸，即Z可以是所述序列的第60位到第b位氨基酸序列，其中，b为61-89的整数，或者Z仅为该第60个氨基酸。
本发明优选的衍生肽包含N末端缩短的X序列和/或C末端缩短的Z序列，更优选的衍生肽仅含有Y序列。
本发明提供的衍生肽，其序列优选来源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第1到第89氨基酸序列。更优选地来自于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第13到59氨基酸序列。
在本发明的一个优选方案中，本发明提供的衍生肽其序列来源于SEQ ID NO：1 所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第1到第89氨基酸序列。更优选地来自于SEQ ID NO：1第13到59位氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
以上所述的衍生肽优选地带有化学修饰的疏水基团，这些疏水基团优选地具有4个以上碳原子的饱和或不饱和脂肪酸的丙烯残基，更优选的是豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸或花生四烯酸。疏水基团另外还优选胆固醇及其类似基团。
在本发明的一个优选方案中，多肽的N末端经豆蔻酰化修饰。更优选地，本发明提供的HBV表面L蛋白衍生肽为SEQ ID NO：1第13到第59氨基酸序列且第13位甘氨酸连接有豆蔻酰基团的多肽Myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSN NPDWDFNPKKDHWPEANQVG(Myr 13-59,SEQ ID NO：3)。在另外一个优选方案中，本发明提供的多肽具有SEQ ID NO：4、5、6和7序列，它们的第1个氨基酸甘氨酸经豆蔻酰化修饰。
本发明第二方面提供来源于D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白的一组衍生肽，该组衍生肽可抑制HBV对肝细胞的感染。这些衍生肽序列可用通式x-y-z表示，这里x表示HBV表面L蛋白序列中第1位氨基酸M或完全缺失，包括以上序列N末端修饰的衍生序列。y表示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白序列中第2到第32位氨基酸序列，以及该序列N末端和/或C末端修饰的衍生序列。z表示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自C末端缩短的序列或完全缺失，包括以上序列C末端修饰的衍生序列。所述“自C末端缩短”包括从C末端的第1个氨基酸(即本发明所述的第47位氨基酸)开始缩短，可缩短到只剩该序列第33位氨基酸，即，z可以是所述序列的第33位到第c位氨基酸序列，其中，c表示34-47的整数，或者z仅为所述第33位氨基酸。
本发明包含来源于其他基因型血清型HBV表面L蛋白对应序列，符合上述定义的HBV表面L蛋白衍生肽。
本发明优选的衍生肽包含完全缺失的x序列，更优选的衍生肽含有的z序列在不影响多肽抑制HBV感染活性的条件，其C末端尽量缩短。
本发明提供的衍生肽序列优选来源于D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第2到47氨基酸序列。
在本发明的一个优选方案中，本发明提供的衍生肽序列优选来源于SEQ ID NO：8所述的D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第2到47氨基酸序列。
以上所述的衍生肽优选地带有化学修饰的疏水基团，这些疏水基团优选地具有4 个以上碳原子饱和或不饱和脂肪酸的丙烯残基，更优选的是豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸或花生四烯酸。疏水基团另外还优选胆固醇及其类似基团。
在本发明的一个优选方案中，多肽的N末端经豆蔻酰化修饰。更优选地，本发明提供的HBV表面L蛋白衍生肽为SEQ ID NO：8第2到第47氨基酸序列且第1位甘氨酸连接有豆蔻酰基团的多肽Myr-GQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKV(Myr 2-47,SEQ ID NO：9)。
本发明包括符合本发明定义的其他基因型/血清型HBV和非人类HBV来源的衍生肽，特别包含以上衍生肽对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV感染的抑制作用。
本发明第三方面提供一种蛋白去抗原性衍生肽的筛选方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定属性。该方法由A-B-C过程构成。这里A过程表示在待筛选的病毒蛋白中引入随机序列，建立该蛋白特定区域或全部蛋白随机编码的重组病毒库。B过程表示在待筛选蛋白抗体存在的条件下，筛选仍具有感染能力的重组病毒亚群，并获得该重组病毒亚群中该蛋白的氨基酸序列,即获得该蛋白去抗原性候选肽序列。C过程表示按获得的去抗原性候选肽序列合成相应的去抗原性候选肽，筛选可调节病毒感染能力却不与该病毒蛋白抗体结合的去抗原性的多肽，即获得蛋白去抗原性衍生肽。
本发明的去抗原性衍生肽筛选方法的筛选对象包含任何形式的蛋白和多肽，其蛋白和多肽的来源包含人、动物、植物、细菌、病毒等在内的所有生物和微生物。在本发明的一个优选方案中，应用本发明的筛选方法对HBV、人获得性免疫缺陷病毒、流感A病毒和副粘液病毒(paramyxoviruses)等病毒蛋白的去抗原性衍生肽进行筛选，进一步优选地对HBV的表面L蛋白的去抗原性衍生肽进行筛选，更优选地对HBV表面L蛋白Pre-S1区进行去抗原性衍生肽筛选。
在本发明的一个优选方案中，对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到58氨基酸序列的去抗原性衍生肽进行筛选。更优选地对如SEQ ID NO：1所述B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到58氨基酸序列TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO：10)的去抗原性衍生肽进行筛选。
本发明的蛋白去抗原性衍生肽筛选方法中，A过程包含在基因脱氧核酸碱基水平、信使RNA核酸碱基水平、蛋白氨基酸残基水平、多糖序列水平等生物分子水平引入随机序列，并包含能在以上各水平引入随机序列的方法。在本发明的一个优选方案中，本发明在病毒基因脱氧核酸碱基水平引入随机序列，在进一步的优选方案中通 过基因重组技术引入随机序列。
在本发明的一个优选方案中，在B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第28到46氨基酸序列所对应的基因序列利用基因重组技术引入随机序列(NNS)19，这里N表示A、T、G、C任意随机碱基，S表示G、C任意随机碱基。更优选地在SEQ ID NO：1所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第28到46氨基酸序列HQLDPAFGANSNNPDWDFN(SEQ ID NO：11)所对应的基因序列(SEQ ID NO：12)利用基因重组技术引入随机序列(NNS)19，这里N表示A、T、G、C任意随机碱基，S表示G、C任意随机碱基。
本发明的蛋白去抗原性衍生肽筛选方法的B过程中，重组病毒亚群该蛋白氨基酸序列的获得包含基因DNA测序、蛋白质氨基酸测序等任何测序手段。在本发明的优选方案中采用基因DNA测序获得重组病毒亚群蛋白序列，即获得病毒蛋白去抗原性候选肽序列。在本发明的一个优选方案中，获得四条B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白第13到58氨基酸序列(SEQ ID NO：10)的去抗原性候选肽序列(SEQ ID NO：15、16、17和18，其第1个氨基酸甘氨酸经豆蔻酰修饰)。
本发明的蛋白去抗原性衍生肽筛选方法中，C过程包含多肽化学合成、基因重组表达等任何多肽的产生方式。在本发明的优选方案中采用化学合成法生产去抗原性候选肽。在本发明的一个优选方案中，筛选获得HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽(SEQ ID NO：17)。
本发明第四方面提供可抑制HBV感染但不与表面L蛋白抗体结合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，并提供了该去抗原性衍生肽与HBV表面L蛋白抗体抑制HBV肝细胞感染的协同效应。
这些去抗原性衍生肽序列来源于应用本发明提供的去抗原性衍生肽筛选方法对本发明第一方面定义的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽的筛选结果及与原有B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白氨基酸序列的组合。
本发明提供的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白去抗原性衍生肽可用通式α-β表示，这里α表示HBV病毒表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自该序列N末端缩短的序列或仅为第13位氨基酸甘氨酸，包括以上序列N末端修饰的衍生序列，其中，所述的“自该序列N末端缩短的序列”的定义与上文所述相同。β表示应用本发明提供的去抗原性衍生肽筛选方法对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列筛选获 得的氨基酸序列，并包括该序列N末端修饰的衍生序列和/或C末端的缩短序列或修饰衍生序列。
在本发明的一个优选方案提供的去抗原性衍生肽中，α为SEQ ID NO：1序列中第1到13位氨基酸序列，或自该序列的N末端缩短的序列或仅为第13位氨基酸甘氨酸，包括以上序列N末端修饰的衍生序列。β表示应用本发明提供的去抗原性衍生肽筛选方法对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白(SEQ ID NO：1)第14到第58氨基酸序列TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO：10)筛选获得的氨基酸序列，并包括该序列N末端修饰的衍生序列和/或C末端的缩短序列或修饰衍生序列。
本发明包含经降低或去除抗原性改造的病毒蛋白衍生序列，特别包含经降低或去除抗原性改造的HBV病毒蛋白衍生序列，更特别地包含经降低或去除抗原性改造的HBV表面L蛋白的衍生肽序列。这里的“改造”是指利用包括本发明提供的去抗原性衍生肽筛选方法、氨基酸删除、氨基酸替换等在内的任何以降低衍生肽抗原性为目的的技术方法。
以上所述的衍生肽优选地带有化学修饰的疏水基团，这些疏水基团优选地指具有4个以上碳原子饱和或不饱和脂肪酸的丙烯残基，更优选的是豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸或花生四烯酸。疏水基团另外还优选胆固醇及其类似基团。
在本发明的一个优选方案中，多肽的N末端经豆蔻酰化修饰。更优选地，本发明提供的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽是第1位甘氨酸连接有豆蔻酰基团的多肽：
Myr-GTNLSVPNPLGFFPDCSLDWVWSWAPYFTPQWRTPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO：17)。
本申请所涉及多肽的任何同系物均为本申请的一部分,包括经过一个或多个氨基酸突变，如包括1-10个氨基酸、较佳1-8个氨基酸、更佳1-5个氨基酸、更佳1-3个氨基酸的删除、保守/非保守氨基酸替换而获得的多肽序列。更进一步地包括通过一个或多个(如1-10个、1-8个、1-5个等)L氨基酸-D氨基酸替换等获得的抗蛋白酶解的多肽修饰产物。本申请还包括以降低本申请多肽的抗原性为目的的修饰和改造。这里的“同系物”还包括与本申请涉及多肽具有大于30％(如40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更大)同源性的多肽或含有豆蔻酰修饰的甘氨酸和抗Pre-S1抗体的结合序列(或经过去抗原筛选得到的抗Pre-S1抗体结合序列对应的去抗原性序列)。这里的“同系物”还包括B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白相关多肽，这些多肽可在低于100mM的多肽浓度下产生大于50％ 的肝细胞HBV感染抑制率。
本申请还包括利用基因工程技术通过细胞表达的含有本申请提供序列多肽的混合物。本申请所涉及的SEQ ID NO:3-7、9和15-18的第一个氨基酸甘氨酸都经豆蔻酰化修饰。
本申请提供多肽的用途包括体内外通过阻断HBV颗粒对肝细胞的黏附或内化而抑制HBV感染。本申请还包括将提供的多肽用作阻断或防止HBV感染的药物以及与适当药物载体组成的药物制剂。本申请还包括含有所述多肽的疫苗组合物。
本申请特别包括所提供的多肽对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV肝细胞感染的阻断作用,本申请还包括其他基因型/血清型HBV和非人类HBV来源的衍生多肽，特别是Pre-S1来源的衍生多肽对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV感染的抑制作用。
本申请也包括以所提供的多肽作为治疗或预防HBV感染的措施，以及涉及本申请多肽在内的患者所需要的任何预防、治疗措施。本申请特别包含本申请多肽体内抑制HBV感染的预防和治疗措施，其中包括阻止HBV传播到生物体未受感染的细胞中。这里的预防措施是指降低或避免患者感染HBV的可能性，治疗措施是指改善或稳定患者状况的所有措施。所指的患者是任何被HBV感染、可能被HBV感染和可能即将被HBV感染的人。
本申请提供了HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽与其他抗病毒感染措施协同抗HBV感染的作用，这些抗病毒措施包括HBV疫苗免疫(包括预防性疫苗和治疗性疫苗等任何与HBV相关的主动、被动免疫措施)、抗HBV抗体(包括抗HBV任何蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体、HBV免疫球蛋白等任何与HBV病毒结合的抗体及抗体的成分)、细胞因子(包括α干扰素、白细胞介素等所有干预HBV的细胞因子及其组合物)、核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定等任何抑制病毒复制的化合物)以及其他所有干预HBV感染、复制、释放等任何HBV过程的药物及措施。在本申请的一个优选方案中，HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽与抗HBV表面L蛋白抗体协同抑制病毒感染。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽对HBV肝细胞感染的抑制
1、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽的制备
N末端豆蔻酰修饰的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽(SEQ ID NO：3第1位氨基酸甘氨酸经豆蔻酰修饰，表示为Myr 13-59)以AB 431A型多肽合成仪按标准Fmoc方案，以0.25mM HMP为起始树脂，自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成。为增强多肽的稳定性，多肽的C末端进一步酰胺化。肽合成结束后，经切割液切割，G6玻砂漏斗滤除树脂，滤液真空抽干。无离子水溶解多肽切割产物，explorer 100型中压液相色谱仪C18柱纯化，分步收集主峰。目标峰收集样以Delta 600型反相高压液相色谱Symmetry C18分析柱纯度鉴定，API2000LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。中压液相色谱纯化所得的收集液冻干，溶于100μM DMSO形成多肽储存液，0.20μM过滤除菌，-80℃冻存。
2、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV基因型血清型的测定
采集慢性HBV感染患者血清-70℃保存。取出50μl血清加310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50mmol/LTris-HCl(pH8.0),200mmol/L NaCl,10mmol/LEDTA,2％SDS,1μg/ml poly(A)]。60℃裂解1小时后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于无离子水中即为HBV DNA模板。PCR反应体系50μl，含HBV DNA模板5μl、1×PCR Buffer、MgCl21.5mmol/L、上游引物(SEQ ID NO:19，5’AGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3’，在HBV基因组中的位置为247-266，下同)25pmol/L、下游引物(671-690，5’-T(G/T)GCACTAGTAAACTGAGCC-3’，SEQ ID NO:20)25pmol/L、200μMol/L dNTPs、1.25U聚合酶TaqDNA。扩增条件：94℃30s、55℃30s、72℃45s、35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物443bp，直接测序获得其序列。根据HBsAg DNA序列转换的氨基酸序列，按122、127、134、159和160位氨基酸组成确定HBsAg的抗原决定簇序列特征，进而确定HBV的血清型(Yotsumoto S,Okamoto H,Tsuda F,Miyakawa Y,Mayumi M，“Subtyping hepatitis B virus DNA in free or integrated forms by amplification of the S-gene sequences by the polymerase chain reaction and single-track sequencing for adenine”,J Virol Methods，1990年5月，28(2):107-16；Norder H,Courouce AM,Magnius LO，“Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the four major subtypes”，J Gen Virol.，1992年12月，73(Pt 12):3141-5), 根据HBV S基因区型特异性核苷酸特征确定HBV基因型(Norder H,Courouce AM,Magnius LO，“Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the four major subtypes”，J Gen Virol.，1992年12月，73(Pt 12):3141-5；Norder H,Hammas B.J Gen Virol,1993,74:1341-1348；Kidd-Ljunggren K,Courouce AM,Oberg M,Kidd AH；“Genetic conservation within subtypes in the hepatitis B virus pre-S2region”，J Gen Virol.，1994年6月，75(Pt 6):1485-90，Erratum在J Gen Virol，1995年3月，76(Pt 3):727)。
3、人原代肝细胞的培养
非HBV相关的肝癌患者外科手术肿瘤切除物相邻的正常组织，按文献所述方法进行分离〔Guguen-Guillouzo,C.,和A.Guillouzo，1986.Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes,第1–12页，在A.Guillouzo和C.Guguen-Guillouzo编辑的“Isolated and cultured hepatocytes”中.Les E′ditions INSERM Paris,John Libbey and Co.,Ltd.，英国伦敦〕，培养于添加了3.5×106M氢化可的松琥珀酸单酯(hydrocortisone hemisuccinate)、2％二甲基亚亚砜、5％人血清和5％胎牛血清的H培养基中。
4、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的培养。
将确定为B基因型adw血清型和C基因型adr血清型的HBV病毒血清2ml加入培养3天的人原代肝细胞，37℃孵育感染24小时。感染完成后移除感染血清，洗涤细胞3次，补充新鲜培养基连续培养10天。收集培养上清，6％聚乙二醇(PEG8000)离心沉淀病毒颗粒，沉淀重悬于含有25％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，冻存于-80℃。
5、HBV感染后肝细胞培养上清HBsAg的检测
培养上清中的HBsAg通过三明治夹心法(in-house sandwich)酶联免疫分析(ELISA)检测。1ug/ml抗HBsAg单克隆抗体37℃包被96孔板2小时。充分洗涤后(0.1％Tween 20PBS洗涤3次、PBS洗涤2次)，10％胎牛血清37℃封闭1小时。去除封闭液，加入HBV感染的肝细胞培养上清100μl 4℃孵育12小时。去除培养上清，充分洗涤，加入过氧化物酶偶联的抗HBsAg抗体37℃孵育1小时。去除多余抗体，加入苯二胺-H2O2反应底物室温反应15分钟，2N H2SO4中止反应，测定反应产物的OD492，计算感染上清中HBsAg含量。
6、HBV表面L蛋白衍生肽(Myr 13-59,SEQ ID NO:3)对HBV肝细胞感染的抑制
人原代肝细胞于12孔培养板中培养3天，每孔约106细胞与L蛋白衍生肽Myr13-59预处理30分钟，加入B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒感染24小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养10天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图1所示，以未受Myr 13-59预处理肝细胞的HBV感染为对照，HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59以剂量依赖性方式抑制HBV对肝细胞的感染。5、10、20、40nM分别可抑制HBV对肝细胞感染的28％、74％、87％和95％，大于80nM的Myr 13-59可完全阻断HBV对肝细胞的感染。其50％感染抑制浓度(IC50)为7.63nM。
实施例二：源于D基因型ayw血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽对HBV肝细胞感染的抑制
1、N末端豆蔻酰修饰的D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47(SEQ ID NO：9)的合成及人原代肝细胞的培养同实施例一。
2、D基因型ayw血清型HBV病毒的培养
可分泌完整D基因型ayw血清型HBV感染病毒颗粒的2.2.15细胞系连续培养10天。收集培养上清，6％聚乙二醇(PEG8000)离心沉淀病毒颗粒，沉淀重悬于含有25％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，冻存于-80℃。
3、HBV感染后肝细胞培养上清HBsAg的检测(同实施例一)
4、HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47对HBV肝细胞感染的抑制
人原代肝细胞于12孔培养板中培养3天，每孔约106细胞与L蛋白衍生肽Myr2-47预处理30分钟，加入D基因型ayw血清型HBV病毒感染24小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养10天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图2所示，以未受Myr 2-47预处理肝细胞的HBV感染为对照，HBV表面L蛋白衍生肽Myr2-47以剂量依赖性方式抑制HBV对肝细胞的感染。5、10、20、40nM分别可抑制HBV对肝细胞的感染23％、69％、82％和97％，大于80nM的Myr 2-47可完全阻断HBV对肝细胞的感染。其IC50为8.33nM。
实施例三：HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽的筛选
1、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒基因型血清型测定、病毒培养、人原代肝细胞的培养(同实例一)。
2、携带HBV完整全基因组且具备HBV完整复制能力的重组质粒的构建。
50μl HBV病毒培养悬液加入310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50 mmol/LTris-HCl(pH8.0),200mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA,2％SDS,1μg/ml poly(A)]。60℃裂解1小时后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于H2O中为HBV DNA 溶液。以上游引物(Pst I)5’ctgactgcagCACTGGATGGGGCTTGGCTATTGG(SEQ ID NO:21，1202-1225)和下游引物(EcoR I)5’ttatggaattcCGACGCGGCGATTGAGACCTTC(2201-2180,SEQ ID NO:22)扩增含有完整EN II复制元件的C基因型adr血清型HBV基因组(1202-2201nt)。该扩增片断支持病毒完成复制，并含有大于单基因组的HBV基因序列(3996nt)。PCR反应体系50μl，含HBV DNA模板5μl，1×PCR Buffer,MgCl21.5mmol/L,上下游引物25pmol/L,200μMol/L dNTPs,高保真TaqDNA聚合酶1.25U。扩增条件：94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物4017bp。将扩增的HBV DNA片段克隆入pUC18质粒载体的Pst I和EcoR I酶切位点，形成pUC-HBV重组质粒。该质粒转染细胞后可产生具有感染能力的病毒颗粒。
3、表面L蛋白Pre-S1区随机编码的重组HBV库的建立。
化学合成DNA片段(SEQ ID NO：13和14)，对应于HBV DNA基因组Bse59 I和Bsu36 I限制性酶切位点之间片段，其中N代表A、T、G、C中的任何碱基，S代表G、C中的任何碱基。将两条合成的互补DNA片段退火后克隆入pUC-HBV限制性酶切位点Bse59 I和Bsu36 I之间，从而在HBV表面L蛋白Pre-S1区抗体结合氨基酸序列HQLDPAFGANSNNPDWDFN对应编码区内引入随机序列。再将带有随机编码区的重组质粒转染Hep G2细胞，连续培养10天。重组质粒在Hep G2细胞内形成的病毒颗粒分泌到培养上清中，即形成了表面L蛋白(SEQ ID NO：1)第28到46氨基酸HQLDPAFGANSNNPDWDFN对应序列随机编码的重组HBV库。其中DPAF和NSNNPDWDFN分别是抗HBV表面L蛋白中和性单克隆抗体MA18/7和5a19的结合序列。
4、HBV表面L蛋白抗体存在条件下，具有肝细胞感染能力的重组HBV亚群的筛选。
培养3天的人原代肝细胞加入10μg/ml抗HBV单克隆抗体MA18/7和5a19，孵育30分钟。将上述含有随机编码序列重组HBV库的Hep G2培养上清液加入肝细胞培养基中，感染24小时。移除感染上清，加入MA18/7和5a19抗体继续培养10天。培养上清转移到新培养的人原代肝细胞，在MA18/7和5a19抗体存在下继续筛选培养2轮，以筛选在抗HBV表面L蛋白抗体存在下仍具有肝细胞感染能力的重组HBV亚 群。
5、重组HBV表面L蛋白随机区编码序列，即去抗原性候选肽序列的测定。
50μl经过3轮筛选含有重组HBV亚群的培养上清，加入310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50mmol/LTris-HCl(pH8.0),200mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA,2％SDS,1μg/ml poly(A)]。60℃裂解1小时后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于H2O中为HBV DNA溶液。以上游引物(Pst I)5’ctgactgcagTTTCCGCACTCATTTACAAGA(1539-1561,SEQ ID NO:23)和下游引物(EcoR I)5’ttatggaattcATGCTCCCGCTC CTACCTGATTT(2032-2010,SEQ ID NO:24)扩增HBV表面L蛋白Pre-S1编码片段(494bp)。PCR反应体系50μl，含HBV DNA模板5μl，1×PCRBuffer,MgCl21.5mmol/L,上下游引物25pmol/L,200μMol/L dNTPs,高保真TaqDNA聚合酶1.25U。扩增条件：94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物515bp。将扩增的HBV DNA片段克隆入pUC 18质粒载体的Pst I和EcoR I酶切位点之间，转化感受态大肠杆菌，青霉素选择条件下培养，挑取单菌落，抽提所携带的重组质粒，对插入序列测序，获得在抗HBV表面L蛋白抗体存在条件下仍具有肝细胞感染能力的重组HBV表面L蛋白基因编码序列。
6、HBV病毒表面L蛋白去抗原性筛选肽的制备
依据以上重组HBV表面L蛋白基因编码序列，经翻译获得对应的氨基酸序列，截取其第12到58氨基酸序列为去抗原性候选肽氨基酸序列，本实例经过筛选获得4条HBV表面L蛋白去抗原性候选肽编码序列。以AB 431A型多肽合成仪按标准Fmoc方案合成N末端豆蔻酰修饰的候选肽(SEQ ID NO：15、16、17和18)，具体方法同实施例一。
7、HBV病毒表面L蛋白去抗原性候选肽抗原性的检测
溶于0.1M碳酸缓冲液(pH 9.6)、浓度为10μg/ml的HBV表面L蛋白去抗原性候选肽室温包被Immulon II ELISA板过夜。酶联板经含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，10％胎牛血清37℃封闭1小时。酶联板PBS漂洗2次，加入单克隆抗体MA 18/7或5a194℃孵育过夜。清洗酶联板，加入过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗，37℃孵育1小时。漂洗多余二抗，加入含有苯二胺和H2O2的柠檬酸磷酸缓冲液(pH 5.0)，室温反应5分钟。2N H2SO4中止反应，读取反应液OD492值，计算L蛋白去抗原性候选肽与抗L蛋白抗体的结合率。如图3所示，HBV表面 L蛋白去抗原性候选肽SEQ ID NO：15和18分别单独与5a19和M18/7有57％、34％的结合，而抗原性候选肽SEQ ID NO：16和17与两种抗体均不结合。因此进一步检测这两个候选肽阻断HBV感染肝细胞的能力。
8、HBV病毒表面L蛋白去抗原性候选肽对HBV感染的抑制效应
人原代肝细胞于12孔培养板中培养3天，每孔约106细胞与HBV病毒表面L蛋白去抗原性候选肽SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17预处理30分钟，加入B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒感染24小时。移除感染上清，洗涤细胞3次，继续培养10天后测定培养上清中HBsAg的浓度(测定方法同实施例一)。如图4A、B所示，HBV表面L蛋白去抗原性候选肽SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17均以剂量依赖性方式抑制两种基因血清型HBV对原代肝细胞的感染。两个L蛋白去抗原性候选肽在160nM时均可完全阻断HBV对肝细胞的感染，其中HBV表面L蛋白候选肽SEQ ID NO：16对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的IC50分别为12.06nM和10.79nM。而HBV表面L蛋白候选肽SEQ ID NO：17具有更高抑制HBV的活性，对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的IC50分别为8.34nM和7.89nM，因此获得SEQ ID NO：17为HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。
实施例四：HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽与抗体协同抑制HBV对肝细胞的感染
1、HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽对HBV感染抑制效应不受抗HBV表面L蛋白抗体干扰。
人肝细胞于12孔培养板中培养3天，每孔约106细胞，1：1加入抗HBV表面L蛋白Pre-S1单克隆抗体M18/7和5a19，孵育30分钟后，加入HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO：17或自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59(SEQ ID NO：3)，孵育30分钟，移除上清，洗涤细胞3次，加入HBV病毒感染10小时。移除感染上清，洗涤细胞3次，继续培养10天后测定培养上清中HBsAg的浓度(同实施例一)。如图5A所示，具有自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59(SEQ ID NO：3)在抗体存在条件下，其阻断HBV感染的能力明显下降，且下降程度与抗体的浓度存在依赖关系，2μg/ml的抗体使80nM Myr 13-59的病毒阻断效果下降50％，而8μg/ml的抗体则完全阻断160nM HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59的病毒感染阻断效应，显示HBV表面L蛋白衍生肽对HBV感染抑制效应明显受到抗HBV表面 L蛋白抗体的干扰。而HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO：17在0、2、4、8μg/ml抗体预先存在的条件下，仍然以剂量依赖性方式抑制HBV对原代肝细胞的感染(图5B)，其抑制曲线没有明显差别，各条件下IC50相近，可见HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽消除了抗HBV表面L蛋白Pre-S1抗体对病毒感染阻断效应的干扰。
2、HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽与HBV表面L蛋白抗体发挥协同阻断HBV感染的效应。
人原代肝细胞于12孔培养板中培养3天，每孔约106细胞，1：1加入抗HBV表面L蛋白Pre-S1单克隆抗体M18/7和5a19，孵育30分钟后，加入HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO：17或自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr13-59(SEQ ID NO：3)，孵育30分钟，加入HBV病毒感染24小时。移除培养上清，洗涤细胞3次，继续培养10天后测定培养上清中HBsAg的浓度(同实施例一)。如图6A所示，在没有Myr 13-59衍生肽条件下，抗HBV表面L蛋白Pre-S1抗体对HBV感染具有中和作用，且对病毒感染的抑制具有剂量依赖性。但是随着多肽浓度的增加，Myr 13-59剂量依赖性地降低了抗体的病毒中和作用，在20nM处几乎完全抵消抗体的病毒中和能力。这种病毒中和作用的抵消是由于HBV表面L蛋白衍生肽与抗体结合，使抗体消耗而不能与病毒结合。在抗体低浓度时出现的病毒感染阻断作用是由相对过量的Myr 13-59提供的，此时加入的Myr 13-59超过了抗体的结合能力，出现了Myr 13-59的过剩。随着抗体浓度的增加，当达到Myr 13-59与抗体结合能力相当时，多肽和抗体的混合物对HBV感染的抑制作用几乎消失。因此可见，HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59与HBV表面L蛋白抗体之间存在明显相互抵消现象。
而HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO：17与HBV表面L蛋白抗体之间的作用明显不同于前者。如图6B所示，SEQ ID NO：17剂量依赖性地增强HBV表面L蛋白抗体阻断HBV感染的作用，随着SEQ ID NO：17浓度的逐渐增加，完全阻断HBV感染所需HBV表面L蛋白抗体的剂量逐渐降低。2μg/ml抗体+10nM去抗原性衍生肽和4μg/ml抗体+5nM去抗原性衍生肽均可完全阻断HBV病毒对肝细胞的感染，抗体与去抗原性衍生肽之间存在明显的协同作用和互补关系。其原因是去抗原性衍生肽不与抗体结合，使两者抑制病毒感染的作用互不干扰。此外，去抗原性衍生肽与抗体抑制HBV感染的机理不同，前者结合于肝细胞病毒感染受体，而后者则与病毒结合，封闭病毒与肝细胞结合的Pre-S1关键序列。可见，HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽与HBV表面L蛋白抗体能够发挥协同阻断HBV感染的作用。