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1、(10)申请公布号 CN 103993025 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103993025 A (21)申请号 201310736967.1 (22)申请日 2013.12.24 C12N 15/56(2006.01) C12P 19/14(2006.01) (71)申请人 北京伟嘉人生物技术有限公司 地址 100085 北京市海淀区上地三街 9 号 D 座 803 申请人 北京联合盛邦生物技术有限公司 (72)发明人 刘海燕 申大伟 (54) 发明名称 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码 基因与应用 (57) 摘要 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码 基因与。
2、应用， 采用易错 PCR 突变文库中筛选方法 产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基础上进 行位点突变产生的 ； 有效突变位点的确定， 通过 比较不含突变位点、 含一个突变位点和含两个突 变位点四种木聚糖酶的活性发现突变位点 G200C 为有效突变， 由易错 PCR 文库中筛选出的含两个 突变位点的木聚糖酶是由于 G200C 位点的组合效 应引起， 提高突变木聚糖酶的性能。 突变基因与原 基因相比， 具有较强的耐热性、 pH 耐受性及酶比 活。 此木聚糖酶可以水解半纤维素生产低聚木糖。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局。
3、 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103993025 A CN 103993025 A 1/1 页 2 1. 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 其特征在于 ： 采用易错 PCR 突变文库中筛选方法产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基因基础上进行位点突变 产生的。 2. 根据权利要求 1 所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 其 特征在于有效突变位点的确定， 通过比较不含突变位点、 含一个突变位点和含两个突变位 点四种木聚糖酶的活性发现突变位点 G200C 为有效突变， 由易错 PCR 文库中筛选出的含两。
4、 个突变位点的木聚糖酶是由于 G200C 位点的组合效应引起。 3. 根据权利要求 1 所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 其 特征在于所述的突变木聚糖酶基因与原基因相比， 具有较强的耐热性、 pH 耐受性及酶比活。 4. 根据权利要求 2 所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 其 特征在于 G200C 的突变， 正是由于这种突变， 是突变木聚糖酶的性能有所提高。 5. 根据权利要求 1 所述的一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 其 特征在于此木聚糖酶可以水解半纤维素生产低聚木糖。 权 利 要 求 书 CN 103993025 A 2 。
5、1/7 页 3 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于蛋白质工程改造木聚糖酶基因技术， 通过这种技术对木聚糖酶基因进 行耐热性能改造， 生产高耐热性的木聚糖酶。 0002 背景介绍 0003 我国是饲料生产大国， 饲料的年产量居世界第二位。 然而我国饲料资源并不丰富， 随着人畜争粮矛盾的日益突出， 我国能量饲料缺口逐渐增大。充分利用我国丰富的非常规 饲料资源， 提高现有饲料资源的消化利用率， 将成为我国畜牧业长期、 持续、 健康发展的关 键。 0004 随着动物营养学的， 越来越多的研究结果表明在动物日粮中添加木聚糖酶无论对 单胃动物还是反刍动物， 均。
6、可提高饲料的消化利用率及家畜的生产性能。 目前， 国外对木聚 糖酶的研究已经逐渐成熟和产业化并在 1992 年就实现了酶制剂的工业化生产。 0005 到目前为止， 细菌、 真菌和放线菌来源的木聚糖酶都得到了广泛而深入的关注和 研究目前已发现原核生物和真核生物中共几十个属、 几百个种的微生物可以产生木聚糖 酶。不同来源的木聚糖酶其功能有着较大差异。细菌所产的木聚糖酶主要是大分子的酸 性木聚糖酶和小分子的碱性木聚糖酶， 而真菌所产的木聚糖酶主要是小分子的碱性木聚糖 酶。 对于饲用木聚糖酶而言， 对其性质的主要要求是 ： 在较广的pH环境中有较好的耐受性， 以便适应动物胃肠道不同的 pH 环境。其次。
7、， 在制粒过程中， 还要能够适应短暂的高温制粒 环境， 因此对木聚糖酶的耐热性具有一定的要求。在饲用酶的应用过程中， 稳定性是影响 应用效果的重要因素。目前可以通过改进生产工艺使酶的稳定性得以提高， 但主要技术指 标发酵酶活则主要取决于菌种生产性能和酶本身。 目前普遍采用的包被技术不能从根 本上改变酶的热稳定性， 而基因工程和蛋白质工程的发展为改造木聚糖酶提供了新手段。 0006 对木聚糖酶产生菌研究较多的是丝状真菌， 如曲霉属和木霉属， 其次是细菌中的 芽孢杆菌属。基于结构和遗传信息， 已知并定性的木聚糖酶均属于家族 GH10 或 GH11， 也有 其他的类型属于 GH5， GH7， GH8。
8、 和 GH43 家族。目前木聚糖酶的生产主要依靠真菌发酵， 细菌 等微生物发酵生产， 但所选用菌株的酶产量一般较低， 或木聚糖酶耐热性能不够好， 或在产 木聚糖酶的同时也分泌纤维素酶， 限制了工业应用可操作性， 高活性、 热稳定性强， 适应高 温高湿环境特性以便于饲料加工的木聚糖酶成为一直以来的研发热点。 然而木聚糖酶作为 一种生物蛋白， 其固有缺点也是热稳定性差、 易失活。为解决这一问题， 也成了国内外科学 家的科研热点。 总体来讲， 主要分为以下几个方向 ： 采用筛选培养基从各种环境中筛选具有 嗜热特性的能产生木聚糖酶的菌株 ； 通过各种方法克隆及筛选嗜热特性的木聚糖酶基因 ； 优化不同的。
9、载体系统与表达系统 ； 蛋白质化学修饰， 如功能集团的修饰、 酶分子内或分子间 交联、 与大分子结合等及后处理工艺， 如加入稳定剂、 包被技术、 液体后喷涂技术等 ； 从根本 上改变木聚糖酶的分子结构， 如对木聚糖酶基因序列进行修饰如定点突变、 随机突变、 易错 PCR、 DNA 改组、 序列优化等。 0007 随着基因工程、 蛋白质工程及的广泛应用， 人们对酶的热稳定性性研究越来越深 入。 如何提高木聚糖酶的热稳定性受到了广泛的关注， 通过比较12个不同热稳定性的GH11 说 明 书 CN 103993025 A 3 2/7 页 4 家族木聚糖酶的晶体结构， 提出了一些结构因素， 比如更高的。
10、 Thr Ser 的比例， 带电荷的 氨基酸的数目， 片层上的氨基酸数目和 螺旋的稳定对于 11 家族木聚糖酶的稳定性有 很大的影响。另外人们通过定点突变， 例如增加二硫键， 增加芳香类氨基酸的结合， 增加蛋 白质表面的带电氨基酸来增强木聚糖酶的热稳定性， 另外定向进化技术也是获得热稳定性 高的木聚糖酶的常用手段。 但是我们可以看到这些影响酶热稳定性的结构因素和氨基酸位 点大部分都是分布在蛋白质的表面。其实不只 GH11 家族的木聚糖酶， 在其他的一些蛋白质 中导致热稳定性提高的突变位点大部分都是发生在蛋白质的表面。 这是因为在同一蛋白质 家族中， 不同热稳定性的蛋白质的内部疏水核心的序列和结。
11、构是非常保守的， 热稳定性不 高的蛋白质的疏水核心同 样堆积得非常有效， 这导致在蛋白质内部疏水核心进行的突变 常常导致热稳定性的降低。 0008 由于G11木聚糖酶结构较小， 所以对这个家族的酶学性质研究也较多。 1995年， 根据 T.reeseii 两个木聚糖酶晶体结构的差异， 推测同活性位点在空间位置上较近的氨基 酸对于酶最适pH值有影响， 从而造成了这两个酶最适pH值的不同。 1998年， 对A.kawachii 木聚糖酶 C 进行定点突变将 Asp100 替换为 Asn， 使酶的催化反应从最适 pH2 显著提高到 5 ； 但是酶催化活性下降到野生型酶的 15， 同时发现在酶表面有大。
12、量酸性氨基酸存在。2000 年， 研究者又将 B.circulans 木聚糖酶 A 的 Asn100 突变为 Asp， 从而将其最适 pH 值 5.7 向 下移到 4.6。实验证实在 T.reesei 木聚糖酶 II“Ser Thr” 表面引入 Arg， 这个突变将催 化反应 pH 向碱性方向偏移了 0.5-1.0 个单位。在酶的热稳定性方面， 1993 年， 运用随机突 变方法提高了 B.pumilus 木聚糖酶 A 的热稳定性， 并且分离出 4 个突变酶。由分析结果可 以看出这些热稳定性突变发生在木聚糖酶序列氮端， 同时结果表明 Gly 突变为 Asp 或 Ser 从而可能形成了氢键。19。
13、96 年对于 A.niger 木聚糖酶 A 的结构分析， 发现二硫键存在于 Cys92 和 Cys111 之间， 从而将 “弦” 同蛋白结构中大的 - 折叠片连接起来。1998 年， 通过 对嗜热性Thermomyces lanuginoseus G11木聚糖酶A三维结构的分析， 认为它的热稳定 性是由于二硫键存在于 Cys100 和 Cys154 之间 ； 同时在整个蛋白中显示出带电荷氨基酸密 度有增加现象。对于嗜热性蛋白质结构的研究， 发现其螺旋区域的结构要比温性蛋白的螺 旋区域更加稳定。2000 年， 在 T.fusca 嗜热性木聚糖酶和 S.lividans 嗜温性木聚糖酶基 因之间，。
14、 采用随机基因重组方法产生了嵌合酶。嵌合酶最适温度比嗜温性野生型木聚糖酶 高出 20， 同时保留了野生型木聚糖酶较高催化活性。这个结果显示蛋白质氮端在酶热稳 定性方面有重要作用。 根据对嗜热嗜温性木聚糖酶三维结构的对比分析结果及差异性比 较， 发现了嗜热性木聚糖酶所含有的热稳定性结构 ： Y11-Y16 芳香族相互作用。通过对中温 菌的木聚糖酶基因定向突变， 将11位苏氨酸突变为酪氨酸， 于16位酪氨酸形成芳香族相互 作用， 提高了这个木聚糖酶的嗜热性和热稳定性， 结果突变酶的最适温度由原来的 60提 高到 70， 57时酶的热稳定性比原来提高了 6 倍。 0009 Claire Dumon 。
15、采用 Gene site saturation mutagenesis 方法对突变氨基酸序列活 性进行测定显示， 有活性的突变， 主要集中在 N 端附近， 但 N 端的保守型不强。 0010 目前使蛋白质热稳定性提高的方法主要是对蛋白质表面表面的氨基酸进行替换， 特别是蛋白质的环和和转角处。但是以蛋白质的疏水核心为出发点， 改变蛋白质内部的核 心氨基酸， 同样可以提高酶的热稳定性以及比活性。 0011 通过对原始序列 FJ593504.1 分析发现， 其含有 GH11 水解酶家族的保守部位。如 ： 说 明 书 CN 103993025 A 4 3/7 页 5 109-111 位的 YGW， 1。
16、18-120 位的 EYY， 158160 位的 PSI， 168-173 位的 QYWSVR( 在氨基酸 序列中用阴影表示 )， 主要是芳香族氨基酸， 其中大部分芳香族氨基酸是底物的结合位点。 发明内容 0012 以gb|FJ593504.1|为原始序列， 通过输入www.swissmodel.expasy.org网站预测 其三维结构， 运用swiss-pdbviewer显示结构并进行分析。 在http:ca.expasy.org 网站上找到该木聚糖酶的活性位点 ： 第 118 位谷氨酸 E 为亲核中心， 第 210 位谷氨酸 E， 为 质子供体。通过易错 PCR 方法， 产生了一种酶耐热性。
17、和酶比活行均强于原始木聚糖酶的蛋 白， 通过测序结果发现， 突变位点不是木聚糖酶的活性中心。 0013 一种具优越耐热性能及比活的木聚糖酶编码基因与应用， 采用易错 PCR 突变文库 中筛选方法产生的含两个突变位点的突变木聚糖酶基础上进行位点突变产生的 ； 有效突变 位点的确定， 通过比较不含突变位点、 含一个突变位点和含两个突变位点四种木聚糖酶的 活性发现突变位点 G200C 为有效突变， 由易错 PCR 文库中筛选出的含两个突变位点的木聚 糖酶是由于 G200C 位点的组合效应引起， 提高突变木聚糖酶的性能。突变基因与原基因相 比， 具有较强的耐热性、 pH 耐受性及酶比活。此木聚糖酶可以。
18、水解半纤维素生产低聚木糖。 附图说明 0014 图 1 木聚糖酶的热稳定性 0015 图 2 酶的 pH 稳定性 0016 图 3xynA G200C 木聚糖酶的表达与纯化 ( 其中 1 为 marker， 2,3,4 分别为粗酶 液， 对照， 纯化产物 ) 具体实施方式 0017 实施例 1 活性克隆子的筛选 0018 设计引物， 为了在pet28a+载体中表达， 将NcoI酶切位点所产生的粘性末端的atg 作为起始氨基酸， 为避免引入移码突变， 根据大肠杆菌表达密码子偏好性， 在粘性末端的 g 后添加 tg， 将第二个氨基酸突变为缬氨酸， 从第三个氨基酸开始不变， 同时为方便后期产物 的纯。
19、化， 加入 6his 标签。以 pET28a xynA 为模板进行易错 PCR 扩增。引物的上下游分 别添加 NcoI 和 XhoI 酶切位点， 用下划线表示， 序列如下所示 ： 0019 1-F ： ccatggtgatcggtattacctcctttgctctc 1-R ： ctcgagttaatgatgatgatgatgat ggccgacgtcagcgacg 0020 PCR 扩增反应体系如下 ： 0021 易错 PCR 反应体系 50L 如下 ： 0022 1TaqDNA 聚 合 酶 缓 冲 液、 0.2mmol LdATP 和 dGTP、 1mmol LdCTP 和 dTTP、 3。
20、-7mmol LmmolMg2+、 0.15 0.3mmol LMn2+、 1pmol L 上下游引物、 模板 DNA。其中， Mg2+ 和 Mn2+ 的浓度被调整， 可以得到不同突变频率的文库。 0023 反应程序为 ： 94 3min ； 94 30s， 57 1min 和 72 1min， 30 个循环后 72延伸 10min， 然后冷却至 4。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物， 大小与预期一致。在紫外下观察目 的片段大小与预期相符， 切下目标 DNA 片段， 康为世纪试剂盒进行凝胶回收。 说 明 书 CN 103993025 A 5 4/7 页 6 0024 上述易错 PCR 产物经胶。
21、回收纯化后， 经 NcoI 和 XhoI 双酶切， 与同样双酶切的载体 pET28a相连接， 转入Top10感受态细胞， 提取质粒， 将质粒分别引入大肠杆菌BL21(DE3)。 菌 落接种到每孔含 50LLB+Amp 液体培养基的 96 孔板中进行初筛 ； 37摇床培养 18h, 加入 50L底物1木聚糖溶液， 50反应0.5h， 加入50LDNS终止反应， 充分混合， 置沸水浴中 煮沸 5rnin， 用冷水将其冷却至室温。进行比色。有活性的克隆子将呈现亮砖红色。 0025 筛选出有活性且颜色较深的克隆子， 于 37试管培养 10h， 进行酶活测定。将活性 最高的克隆子送往北京诺赛测序。 00。
22、26 经过测序结果与原序列进行序列比对发现， 在活性克隆子存在以下两个突变 ： Q56R， G200C， 将该克隆子命名为 pET。为了进一步探讨两个突变位点中活性位点， 本研究进 一步设计两对引物， 获得以下两种蛋白序列 ： 0027 序列名称引物对 xynA Q56R2-F 2-R xynA G200C3-F 3-R 0028 对活性克隆子质粒进行双酶切， 酶切体系如下 ： 0029 0030 37水浴锅中反应 2h。 0031 琼脂糖电泳检测， 出现 700bp 和 5.4k 的片段， 回收小片段， 与 pMD18-T vector 相 连， 连接体系如下 ： 0032 0033 将测序。
23、正确的克隆， 将其命名为 pMD18-T-xynQ56R G200C， 以其为模板， 分别以 2-F， 2-R， 3-F， 3-R为引物对， 进行扩增， 扩增体系与上一致。 其中第二对引物用于在原始木 聚糖酶蛋白序列 Q56R， 第三对引物用于原始木聚糖酶蛋白序列 G200C。引物序列如下 ： 0034 2-F-5 GAACGTTAACGGTGACCACTACTACCA3 0035 2-R ： 5 AGTGGTCACCGTTAACGTTCAAACC 0036 3-F ： 5 GGTGGAGCCCAGGCCACGTACACC3 0037 3-R ： 5 ACGTGGCCTGGGCTCCACCGT。
24、CAC3 0038 以 2-F 2-R 为引物扩增的产物分别命名为 xynA Q56R 和 xynA G200C 扩 增产物采用无酶克隆的方式直接转化 DH10 感受态细胞， 氨苄抗性平板筛选， 随机挑 取平板上长出的克隆， 抽提克隆质粒以 T 载体通用引物测序， 将阳性质粒分别命名为 pMD18-T-xynA Q56R 和 pMD18-T-xynA G200C。 0039 以 1-F 和 1-R 为引物， 以 pET28a xynA 为模板进行常规 PCR 扩增， 扩增 xynA 基 因。扩增反应体系如下 ： 说 明 书 CN 103993025 A 6 5/7 页 7 0040 PCR 扩。
25、增反应体系如下 ： 0041 0042 酶切质粒 pMD18-T-xynA Q56R， pMD18-T-xynA G200C 和 pET28a(+) 以及扩增 的 xynA 基因。酶切体系如下 ： 0043 0044 37水浴锅中反应 2h。 0045 琼脂糖电泳检测， xynA Q56R 和 xynA G200C 质粒出现的酶切片段片段大小为 700bp 和 2.9kbp， pET28a(+) 酶切后的片段大小为 5.4k， 与预期大小一致。 0046 实施例 2 原核表达载体构建 0047 将 pET28a(+) 双酶切后大片段分别与 700bp 的小片段相连， 连接体系如下 ： 0048。
26、 0049 16过夜连接。转化 Top10 感受态细胞， 转化程序相同涂布于卡那抗性的平板上。 随机挑取平板上的克隆， 抽提质粒， 酶切鉴定结果显示， 片段大小与预期一致。载体构建正 确， 含四种基因的载体分别命名为 ： pET-xynA、 pET-xynA Q56R、 pET-xynA G200C。 0050 实施例 3 木聚糖酶的表达 0051 一酶的表达与纯化 0052 将四种质粒分别转化 E.coli BL21-CodonPlus(DE3) 感受态细胞， 涂布于卡那抗性 的平板， 37倒置过夜培养。 0053 挑取单克隆， 接种于 5mL 液体卡那抗性 (50g ml) 的 LB 培养。
27、基中， 过夜培养， 再以2的接种量转接到50ml卡那抗性(50gml)的LB培养基中， 30振荡培养， 当培 养液 OD600nm 达到 0.5-0.6 时， 加入 IPTG 至终浓度为 1mmol L， 诱导培养 10-20h 后， 离心 收集细胞。再用超声波破碎仪破碎细菌细胞， 离心收集上清即为粗酶液。 0054 二测定粗酶液的酶活特性 0055 (1) 酶活测定方法 ： 0056 取出10支干净的具塞试管， 将其分别编号为0， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10。 按从0到 0.1mg mL 的浓度梯度加入木糖溶液 2mL， 加入 DNS 溶液 3mL， 充分混合。
28、， 置沸水浴中煮沸 5rnin， 用冷水将其冷却至室温。在 540nm 下以 0 号管为参比， 测定其它试管溶液的吸光值。 说 明 书 CN 103993025 A 7 6/7 页 8 以木糖量 x(mg) 对吸光值 Y 作图， 得出木糖量与吸光值关联的标准曲线。1 个国际酶活力 单位 ： 在 60和 pH6.5 条件下， 每分钟水解木聚糖产生 1mol 还原糖所需酶量。在此分析 中， 还原糖以木糖为标准。原糖所需要的酶量为 1 个酶活力单位。 0057 蛋白定量采用 BSA 蛋白定量法。首先以牛血清蛋白为标准， 制备标准曲线， 按照以 下表格配置不同 BSA 浓度的标准曲线。 0058 00。
29、59 每个点三个重复， 测定吸光值， 制备吸光值与 BSA 蛋白浓度的标准曲线。将待测样 品进行梯度稀释， 每个点三个重复， 每个孔加入 200LR-250， 在 1h 以内以空白管为对照， 酶标仪 595nm 下比色， 被测样品的 OD595 值在 0.1-0.05 之间。如果 OD595 值太大， 将样品 再进行稀释比色。 0060 根据吸光值和标准曲线， 计算样品的蛋白浓度。 0061 粗酶液名称粗酶液体积 (mL)酶活 (U mL)总酶活总蛋白比酶活 xynA46.3174.38070.09552.7514.6 xynA Q56R46.8110.65176.08424.2712.2 x。
30、ynA G200C46.2280.512959.1689.3118.8 xynA Q56R-G200C46220.110124.6632.3915.01 0062 (2) 最适作用温度及温度稳定性将木聚糖酶 0063 分别在不同温度条件与底物反应下， 检测粗酶液的活力。 结果表明， 木聚糖酶xynA 的最适反应温度为 65， 木聚糖酶 xynA Q56R 的最适反应温度为 50， 木聚糖酶 xynA G200C 的最适反应温度为 80， 木聚糖酶 xynA Q56R-G200C 的最适反应温度为 70 ； 将 三种粗酶液在不同的温度条件下， 保温 30min， 检测剩余木聚糖酶的活力， 未经处。
31、理酶活力 定为 100。结果如图 1 所示， 木聚糖酶 xynA M354 和 xynA M630 酶在 50以下保温处 理后， 活力损失不到 10， 而 60保温 30min， 活力丧失近 60， 含有一种突变的酶的温度 稳定性较差。木聚糖酶 xynA M354-M630 在 50以下保温处理后， 活力损失不到 10， 而 60保温 30min， 活力丧失 30， 经过两个位点突变后， 酶的温度稳定性有所提高。 0064 (3) 最适作用 pH 值及 pH 稳定性 0065 配置 pH 值为 3-10 的 PBS 缓冲液， 以 HCl 和 NaOH 调整 PBS 缓冲液的 pH。以不同 pH。
32、 值缓冲液配制木聚糖底物， 在 50条件下检测粗酶液的木聚糖酶活力。结果表明木聚 糖酶 xynA 及 xynA Q56R 的最适 pH 为 7.0， 木聚糖酶 xynA G200C 和木聚糖酶 xynA Q56R-G200C 的最适 pH 为 6.5， 其中 xynA G200C 的 pH 耐受性更广， 在 pH4-pH10.5 范围内 都具有 50以上的活力。如图 2 所示。 0066 综合选择来看， xynA Q56R 性能相对于原始蛋白酶， 性能下降 ； 木聚糖酶 xynA G200C 性能优于其他酶， 而木聚糖酶 xynA Q56R-G200C 性能优于原始基因， 这很有可能是 说 明。
33、 书 CN 103993025 A 8 7/7 页 9 是由于 G200C 组合效应引起。综合评价， 木聚糖酶 xynA G200C 是效果最好的突变。 0067 三粗酶液的纯化 0068 采用美国全式金公司产品 ProteinIsoNi-NTAResin 进行纯化。用 5-10 倍柱体积 的平衡缓冲 液 (50mmol L， pH8.0， 磷酸缓冲液， 0.3mol L NaCl) 平衡层析柱。对于结合 能力强的 His 标签重组蛋白， 或为了提高特异性结合， 平衡液中可加入低浓度 20mM 咪唑。 0069 将上述粗酶液以与平衡好的 Ni 柱混合， 密封后， 放置于旋转器中旋转混合， 并将。
34、 旋转器至于层析柜中， 3h后取出， 离心， 分离上清与Ni珠 ； 接着用50mmolL、 100mmolL、 150mmol L、 200mmol L、 300mmol L 的咪唑溶液对 Ni 珠进行梯度洗脱， 收集梯度洗脱 液。对上述收集的每管样品分别进行 SDS-PAGE 电泳， 判断目标蛋白的最佳咪唑洗脱浓度。 收集各个咪唑浓度洗脱的蛋白样品， 装入透析袋中， 于 pH8.0 的 1PBS 缓冲液中磁力搅拌 器透析， 每天换液 3-4 次， 除去咪唑分子。测定纯化后蛋白酶的活力。结果如下 ： 0070 0071 实例 4 木聚糖酶的应用 0072 分别以燕麦木聚糖和玉米芯为底物， 加入。
35、粗酶液 ,50保温 3h 后， 煮沸灭酶活后， 进行薄层层析分析。 展层剂(正丁醇吡啶水=643)， 显色剂(2二苯胺丙酮2 苯胺丙酮 85磷酸 =5 5 1)。将样品点至硅胶板上， 自然干燥。将干燥好的硅胶板 置于薄层层析缸中， 下端浸于新配制的展层剂中， 使展层剂由下而上扩展。展开 2 次后， 自 然干燥。均匀喷上显色剂， 85烤 5min， 观察结果。 0073 将粗酶液适当稀释， 然后分别以燕麦木聚糖和玉米芯为底物， 50保温 3h 后， 煮 沸灭酶活。用薄层层析对酶解产物进行分析， 结果表明木聚糖酶水解燕麦木聚糖的产物以 三糖、 四糖和五糖为主 ； 而水解玉米芯的产物主要是二糖、 三糖和四糖， 因此该酶可用于水 解半纤维素生产低聚木糖。 说 明 书 CN 103993025 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103993025 A 10 。