一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103966353 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966353 A (21)申请号 201410235609.7 (22)申请日 2014.05.29 201310207753.5 2013.05.29 CN C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 光明乳业股份有限公司 地址 201103 上海市闵行区吴中路 578 号 (72)发明人 陈万义 任婧 杭锋 穆海菠 艾连中 郭本恒 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 朱水平 。

2、沈利 (54) 发明名称 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒 和引物 (57) 摘要 本发明公开了一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的方法及其试剂盒和 引物。所述的方法包括以下步骤 ： (1) 提取待测 样品的基因组 DNA ； (2) 以步骤 (1) 所得的基因组 DNA为模板， 以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的引物对进行PCR反应 ； 和(3)检测步骤(2) 所得反应产物中 498bp 单一扩增产物的存在。所 述引物包括序列如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示的引物。所述试剂盒包括所述引物。本发。

3、明 的方法检测时间短， 成本低， 具有单一特异性， 检 测结果可靠， 结果判定简单 ； 为食品安全检测技 术领域提供了一种简单快速灵敏的检测阪崎克罗 诺杆菌的方法， 对我国的食品安全具有重要意义。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103966353 A CN 103966353 A 1/1 页 2 1. 一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter s。

4、akazakii) 的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 提取待测样品的基因组 DNA ； (2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板， 以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示 的引物对进行 PCR 反应 ； 和 (3) 检测步骤 (2) 所得反应产物中 498bp 单一扩增产物的存在。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述 PCR 反应的反应体系包括 ： 1PCR 反 应缓冲液， 10-15mmol/L Mg2+， 0.2-0.3mmol/L dNTP， 0.1-0.3mol/L 的序列分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.。

5、2 所示的引物， Taq 酶 0.05-0.1U/L， 和 DNA 模板 10-100ng/L ； 所述 PCR 反应的反应程序为 ： 94 95， 3 5min ； 94 95， 30 40s ； 60 62， 3040s ； 6872， 3040s ； 步骤至共3035个循环 ； 6872， 710min ； 4 15保存。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述 PCR 反应的反应体系包括 ： 1PCR 反 应缓冲液， 12.5mmol/L Mg2+， 0.25mmol/L dNTP， 0.2mol/L 的序列分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所。

6、示的引物， Taq 酶 0.04U/L， 和 DNA 模板 40ng/L ； 所述 PCR 反应的反应 程序为 ： 94， 5min ； 94， 30s ； 60， 30s ； 72， 30s ； 步骤至共 35 个循环 ； 72， 10min ； 12保存。 4. 一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的引物对， 其特征在于， 其由 序列如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示的引物组成。 5. 一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的试剂盒， 其特征在于， 其包 括如权利要求 4 所述的引物对。 6. 。

7、如权利要求 5 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒还包括 PCR 缓冲液， Taq 酶， dNTP 溶液和 Mg2+中的一种或多种。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和/或 阳性基因组 DNA。 权 利 要 求 书 CN 103966353 A 2 1/8 页 3 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物 技术领域 0001 本发明涉及微生物检测领域， 具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的方法及其试剂盒和引物。 背景技术 0002 阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii)。

8、 隶属于克罗诺杆菌属 (Cronobacter spp.)( 即原阪崎肠杆菌 )， 是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌。经临床 研究发现阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属临床感染病例中最常见的条件致病菌， 阪崎克罗 诺杆菌菌株能够引起婴儿致命的感染， 致死率高达 40 -80。它通常能导致婴儿严重的 临床症状， 例如脑脓疡， 脑膜炎， 坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉 中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。 阪崎克罗诺杆菌菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康 的重要条件性致病菌。 新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌进驻的婴 儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。。

9、在污染环节调查中发现， 整个婴幼儿配方粉 生产工艺流程中， 可检测到阪崎克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31。 因此， 对阪崎 克罗诺杆菌菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。 0003 克 罗 诺 杆 菌 属 (Cronobacter spp.) 于 2008 年 被 分 为 5 个 新 种 ( 其 中 将 Cronobacter sakazakii 称为新组合 )、 1 个阪崎克罗诺杆菌基因种 (Genomospeciese) 和 3 个新亚种， 到 2012 年克罗诺杆菌属经多序列比对发现， 最终确定将该属分为 7 个种。尽 管关于克罗诺杆菌的分类和名称已变， 但目前的检测仍然沿用程。

10、序式的阪崎肠杆菌标准检 测方法， 以传统生化反应进行鉴定， 一般需要 18 24h， 而且无法区分为哪一种， 这显然已 经不能满足对阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 检测的需求。在鉴别方面， 尽管 已有扩增片段长度多态性分析 (Amplified fragment length polymorphismas， AFLP)、 16S rRNA全序列比较、 DNA？DNA杂交实验及多位点测序等多种可靠方法， 但这些根据遗传特征 的分析方法耗时长、 工作量大。 因此， 本领域目前仍然缺乏对阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii) 菌种的高效率的鉴定与。

11、鉴别方法。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的对阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的检测方法耗时长、 操作繁琐等缺陷， 而提供一种新的检测阪崎克罗诺杆 菌的方法及其试剂盒和引物。以本发明的方法检测阪崎克罗诺杆菌菌株， 检测时间短， 成本低， 检测结果特异， 能够特异性地检测阪崎克罗诺杆菌菌株， 而不受克罗诺杆菌属 (Cronobacter spp.) 内的其他种的干扰， 结果判定简单， 在实际应用中非常方便。 0005 本发明提供的技术方案之一是 ： 一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺 杆菌 (Cronobacter sakaza。

12、kii) 的方法， 包括以下步骤 ： 0006 (1) 提取待测样品的基因组 DNA ； 0007 (2) 以步骤 (1) 所得的基因组 DNA 为模板， 以序列如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 说 明 书 CN 103966353 A 3 2/8 页 4 所示的引物对进行 PCR 反应 ； 和 0008 (3) 检测步骤 (2) 所得反应产物中 498bp 单一扩增产物的存在。 0009 根据本发明， 步骤 (1) 中， 所述的提取待测样品的基因组 DNA 的方法为本领域常 规， 如使用市售的各种基因组 DNA 提取试剂盒进行操作。 0010 步骤(2)中， 所述的PC。

13、R反应为本领域常规， 只要能够扩增出阪崎克罗诺杆菌特异 性的基因片段即可。 0011 较佳地， 所述 PCR 反应的反应体系包括 ： 1PCR 反应缓冲液， 10-15mmol/L Mg2+， 0.2-0.3mmol/L dNTP， 0.1-0.3mol/L 的序列分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示 的引物， Taq 酶 0.05-0.1U/L， 和 DNA 模板 10-100ng/L。所述 PCR 反应的反应程序为 ： 94 95， 3 5min ； 94 95， 30 40s ； 60 62， 30 40s ； 68 72， 30 40s ； 步骤至共 30 。

14、35 个循环 ； 68 72， 7 10min ； 4 15保存。 0012 更佳地， 所述 PCR 反应的反应体系包括 ： 1PCR 反应缓冲液， 12.5mmol/L Mg2+， 0.25mmol/L dNTP， 0.2mol/L的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物， Taq 酶 0.04U/L， 和 DNA 模板 40ng/L。所述 PCR 反应的反应程序为 ： 94， 5min ； 94， 30s ； 60， 30s ； 72， 30s ； 步骤至共 35 个循环 ； 72， 10min ； 12保存。 0013 步骤 (3) 中， 所述的检测可以采用本。

15、领域常规的方法， 优选为凝胶电泳检测法， 可 以是琼脂糖凝胶电泳， 也可以是聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据本领域常规可知， 在本发明中， 若步骤 (2) 所得的反应产物在 498bp 位置存在单一扩增产物， 则说明待检样品中含有阪崎 克罗诺杆菌菌株 ； 若步骤(2)所得的反应产物在498bp位置不存在单一扩增产物， 则说明待 检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌菌株。 0014 本发明的方法尤其适用于检测食品中的阪崎克罗诺杆菌菌株， 特别是奶粉中的阪 崎克罗诺杆菌菌株。 0015 本发明提供的技术方案之二是 ： 一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的引物对， 其由序列如 。

16、SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示的引物组成。 0016 本发明提供的技术方案之三是 ： 一种检测阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的试剂盒， 其包括前述引物对。 0017 本发明中， 较佳地， 所述的试剂盒还包括 PCR 缓冲液， Taq 酶， dNTP 溶液和 Mg2+中 的一种或多种。更佳地， 所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和 / 或阳性基因组 DNA。 0018 在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发明各较佳实 例。 0019 本发明所用试剂和原料均市售可得。 0020 本发明的积极进步效果在于 ： 采用。

17、本发明的检测方法及引物对和试剂盒检测阪崎 克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 菌株， 检测时间短、 检测成本低、 检测效率高 ； 本发 明的检测方法具有单一特异性， 能够对阪崎克罗诺杆菌菌株实现特异性扩增， 而对同属于 克罗诺杆菌属 (Cronobacter spp.) 内的其他种和其他近缘种均无任何扩增， 检测结果可 靠， 结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测阪崎 克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物， 对我国的食品安全具有重要意义。 附图说明 说 明 书 CN 103966353 A 4 3/8 页 5 0021 图 1 为实施例 1 。

18、中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳后的实验结果。泳道 1 9 为 ： 无菌水， 穆汀斯克罗诺杆菌 (Cronobacter muytjensii)ATCC51329， 克罗诺杆菌基因 种 I(Cronobacte.genomospecies I)NCTC9529， 丙二酸盐阳性克罗诺杆菌 (Cronobacter malonaticus)DSM18702， 苏黎世克罗诺杆菌 (Cronobacter turicensis)DSM18703， 都柏林 克罗诺杆菌都柏林亚种 (Cronobacter dublinensis subsp.Dublinensis)DSM18705， 都柏 林克罗。

19、诺杆菌洛桑亚种 (Cronobacter dublinensis subsp.Lausannensis)DSM18706， 都柏 林克罗诺杆菌乳粉亚种 (Cronobacter dublinensis subsp.Lactaridi)DSM18707， 阪崎克 罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii)ATCC29544， M 为 DNA Marker。 0022 图 2 为实施例 1 中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳后的实验结果。泳道 1 32 为 ： 阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii ATCC29544)， 鼠伤寒沙门氏菌 (salmone。

20、lla typhimurium ATCC14023)， 肠炎沙门氏菌 (Salmonella Enteritidis ATCC13311)， 阴沟肠 杆菌 (Enterobacter cloacae ATCC13047)， 大肠杆菌 (Escherichia coli ATCC43889)， 大 肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)， 奇异变形杆菌(Proteus mirabilis ATCC12453)， 普通变形杆菌 (Proteus vulgaris ATCC33420)， 枸橼酸杆菌 (Citrobacter freundii ATCC8090)， 肺炎克雷伯。

21、杆菌 (Klebsiella peneumoniae ATCC27336)， 肺炎克雷伯杆菌 (Pneumonia crayresearch ATCC46114)， 宋志氏志贺氏菌 (Shigella sonnei CMCC51334)， 痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae CMCC51335)， 福氏志贺氏菌 (Shigella Flexner ATCC51371)， 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa CDCB32116)， 蜡样芽胞杆菌 (Bacillus cereous ATCC1220)， 气味沙雷氏菌 (Serratia odorifer。

22、a ATCC33077)， 粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens ATCC14040)， 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida ATCC17485)， 产 碱假单胞菌 (Pseudomonas alcaligenes IQCC12604)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC29213)， 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC8095)， 屎肠球菌 (Enterococcus faecium ATCC14025)， 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis ATCC49452)。

23、， 产 气 肠 杆 菌 (Enterococcus aerogenes ATCC13048)，霍 乱 弧 菌 (Vibrio cholera SJTU32001)， 副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)， 副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus ATCC33846)， 创伤弧菌 (Vibrio vulnficus ATCC27562)， 单核增生李斯 特菌 (Listeria monocytogenes AB97021)， 单核增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes ATCC13313)， 无菌水， M 。

24、为 DNA Marker。 0023 图 3 是实施列 1 中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳后的图谱结果。泳道 1 44 依次为 ： 阪崎克罗诺杆菌 (ATCC29544)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS001)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS002)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS003)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS004)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS005)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS006)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS007)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS008)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS009)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS010)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS0。

25、11)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS012)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS013)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS014)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS015)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS016)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS017)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS018)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS019)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS020)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS021)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS022)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS023)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS024)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS025)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS026)， 阪崎克罗诺。

26、杆菌 (BDCS027)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS028)， 阪崎克罗诺杆 说 明 书 CN 103966353 A 5 4/8 页 6 菌 (BDCS029)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS030)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS031)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS032)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS033)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS034)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS035)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS036)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS037)， 阪崎克罗诺杆 菌 (BDCS038)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS039)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS040)， 阪崎克罗。

27、诺杆菌 (BDCS041)， 阪崎克罗诺杆菌 (BDCS042)， 无菌水 ； M 为 DNA Marker。 0024 图 4 是实施例 1 中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度的实验图谱 结果。 泳道110依次为 ： 711.0ng/PCR， 71.1ng/PCR， 7.11ng/PCR， 711pg/PCR， 71.1pg/PCR， 7.11pg/PCR， 711fg/PCR， 71.1fg/PCR， 7.11fg/PCR， ddH2O， M 为 DNA Marker。 0025 图 5 是实施例 2 中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳验证人工污染实验的图谱结 果。

28、。 0026 图 6 是实施例 3 中 PCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳验证实际样品检测的实验图 谱结果。其中， 泳道 1 30 依次为 ： 样品 1 样品 30， 泳道 31 32 ： ddH2O， 阪崎克罗诺杆 菌 (ATCC29544)， M 为 DNA Marker。 具体实施方式 0027 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 均按照常规方法和条件， 或按照 商品说明书选择。 0028 下述实施例中， 所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所用 Marker 购自天根生化科技 (。

29、 北京 ) 有限公司， 产品型号为 Marker I(MD101)。 0029 实施例 1 对阪崎克罗诺杆菌菌株的检测 0030 (1) 采用本发明的引物对和检测方法对阪崎克罗诺杆菌标准菌株 (Cronobacter sakazakii)ATCC29544 进行 PCR 检测。 0031 所用引物对的序列如下 ： 0032 SEN2-L ： 5 -ACTGGCTTGGGGCTAATA-3 (SEQ ID NO:1)， 0033 SEN2-R ： 5 -AGAGGCGGATAAATCTTGT-3 (SEQ ID NO:2)。 0034 采用上述引物对， 以阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC29544。

30、的基因组DNA为模板， 进 行 PCR 反应体系和反应程序的建立和优化， 经过单因素、 多因素试验和杂交试验， 从而建立 了适用于检测阪崎克罗诺杆菌菌株的反应体系及反应参数。 0035 所述的 PCR 反应体系为 ： 1PCR 反应缓冲液， 10-15mmol/L Mg2+， 0.2-0.3mmol/ L dNTP， 0.1-0.3M 引物 SEN2-L， 0.1-0.3M 引物 SEN2-R， Taq 酶 0.05-0.1U/L， DNA 模 板 10-100ng/L。所述的 PCR 扩增程序为 ： 94-95预变性 3-5min， 之后开始以下循环， 每 个循环的程序为 ： 94-95变性。

31、 30-40s， 60-62退火 30-40s， 68-72延伸 30-40s ； 循环共 30-35 个 ； 循环结束后， 68-72延伸 7-10min， 降温至 4-15， 结束。结果表明， 在所述的反 应体系和反应程序范围内都能得到单一的 498bp 的扩增产物。 0036 最优的PCR反应体系为 ： 1PCR反应缓冲液， 12.5mmol/L Mg2+， 0.25mmol/L dNTP， 0.2M 引物 SEN2-L， 0.2M 引物 SEN2-R， Taq 酶 0.04U/L， DNA 模板 40ng/L。最优的 PCR 扩增程序为 ： 94预变性 5min， 之后开始以下循环， 。

32、每个循环的程序为 ： 94变性 30s， 60退火 30s， 72延伸 30s ； 循环共 35 个 ； 循环结束后， 72延伸 10min， 降温至 12， 结 说 明 书 CN 103966353 A 6 5/8 页 7 束。在最优的反应体系和反应程序下， 其在 498bp 左右的扩增产物的产量最高， 电泳条带最 明显、 最清晰。 0037 因此， 本发明建立了最优的 PCR 检测方法如下 ： 先加入 16.1L 无菌水到反应 管中， 再依次加入 10PCR 反应缓冲液 2.5L， 25mmol/L 的 Mg2+2.0L， 2.5mmol/L 的 dNTP1.0L， 5M引物1.0L， 2。

33、.5U/L Taq酶0.4L， 最后加模板溶液2L， 使得体系总 体积为 25L， 并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后， 放入 PCR 反 应仪中， 按照以下PCR程序进行 ： 在94预变性5min， 接着作35个循环， 每个循环的程序包 括94变性30s， 退火温度63， 退火时间为30s， 然后在72延伸30s， 循环结束后在72 延伸 10min， 最后降温至 12， 结束所有操作程序。 0038 (2) 特异性评价试验 0039 取阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)标准菌株和42株食品分离株， 以及 同属于克罗诺杆菌属 (Cronobact。

34、er spp.) 内除 Cronobacter sakazakii 之外的其他几个 种 ( 如表 1 所示， 表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的 )， 按照基 因组 DNA 模板提取方法， 分别提取基因组 DNA。提取过程如下 ： 将所取菌株 ( 如表 1 所示 ) 分别接种至 5mL 的 TSB 液体培养基中， 在 37培养 8h 后， 取 1mL 菌液， 放入 1.5mL 离心管 中 ； 之后在 5,000r/min 离心 10min， 弃上清液。用无菌双蒸水重新悬浮菌体， 再在 12,000r/ min 离心 5min， 收集菌体。离心洗涤后加入 100L 无菌超纯水。

35、， 在沸水浴中煮 10min， 立即 取出， 在 -20放置 10min。在 37解冻后， 12,000r/min 离心 5min， 取上清液放置 -20备 用。本段中， 所述的食品分离株取自婴幼儿配方粉或乳清粉中， 先经 API20E 生化试剂条鉴 定属于克罗诺杆菌属， 然后这些分离菌株经16S rRNA测序后根据在线BLAST比对后得出属 于阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii)。 0040 每株菌株的 DNA 溶液 (DNA 浓度 50ng/L) 均取 2L 作为 PCR 反应模板添加到 PCR反应体系中进行扩增反应， 反应采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序。。

36、 采用琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物， 判断在 498bp 位置是否存在单一扩增条带， 结果见表 1， 电泳结 果见图 1 3。 0041 从表 1 中可知， 除了阪崎克罗诺杆菌菌株的标准菌株和食品分离株外， 其余菌株 均没有特异性扩增条带。表 1 中， - ： PCR 结果为阴性 ； + ： PCR 结果为阳性。表 1 中克罗 诺杆菌属 (Cronobacter spp) 使用了 8 株标准菌株， 代表了该属内所有种的典型标准菌 株。属内包括 6 个种 ( 其中 Cronobacter sakazakii 称为新组合 )， 即阪崎克罗诺杆菌 ATCC29544， 丙二酸盐阳性克罗诺杆菌 DSM。

37、18702， 穆汀斯克罗诺杆菌 ATCC51329， 苏黎世克 罗诺杆菌 DSM18703， 克罗诺杆菌基因种 1NCTC9529 和都柏林克罗诺杆菌。其中都柏林克罗 诺杆菌包括三个亚种， 即都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种 DSM18705， 都柏林克罗诺杆菌洛桑 亚种 DSM18706 和都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种 DSM18707。阪崎克罗诺杆菌属和肠杆菌属的 亲缘关系最近， 尤其和肠杆菌属内的阴沟肠杆菌亲缘关系最近。本次试验共使用了肠杆菌 属标准菌株 12 株， 志贺氏菌属标准菌株 3 株， 沙雷氏菌属标准菌株 2 株， 克雷伯属标准菌株 2 株， 葡萄球菌属标准菌株 2 株， 假单胞菌属标准。

38、菌株 3 株， 李斯特菌属标准菌株 2 株， 弧菌 属标准菌株 3 株及分离菌株 1 株。所使用的这些菌株都是食源性致病菌， 而且绝大多数都 属于肠杆菌科的， 它们和阪崎克罗诺杆菌菌株具有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发 明的引物通过 PCR 实验后扩增不到特异的片段， 那么其它的和阪崎克罗诺杆菌菌株亲缘关 说 明 书 CN 103966353 A 7 6/8 页 8 系较远的菌株更加难以扩增到目的片段 (498bp)， 因此经过这些亲缘关系较近的菌株的系 统生物学实验验证， 充分保证了本发明所述检测方法和引物的特异性。上述结果充分证明 本发明的方法仅能扩增阪崎克罗诺杆菌 (Cronobac。

39、ter sakazakii)， 对于同属于克罗诺杆 菌属内的任何菌种和其他的近缘种， 均没有任何扩增， 因此有非常高的特异性。 0042 表 1. 特异性评价所用菌株及试验结果 0043 0044 说 明 书 CN 103966353 A 8 7/8 页 9 0045 (3) 灵敏度评价试验 0046 提取阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 基因组的总 DNA， 经测定， 阪崎 克罗诺杆菌基因组总 DNA 溶液的浓度为 28.20g/mL， 用无菌水作 10 倍梯度稀释， 共稀释 10 个梯度， 每个浓度梯度分别取 5L 加入 PCR 反应体系， 采用前述最优的反应。

40、体系和最优 的扩增程序进行 PCR 反应， 凝胶电泳检测扩增产物， 在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果， 如 图 4 所示， 图中 ： 泳道 1 9 ： DNA 模板浓度分别为 711.0ng/PCR， 71.1ng/PCR， 7.11ng/PCR， 711pg/PCR， 71.1pg/PCR， 7.11pg/PCR， 711fg/PCR， 71.1fg/PCR， 7.11fg/PCR ； 泳道10 ： ddH2O ； M ： DNA marker。 由图4可知， 在第6条泳道可以看到清晰的条带， 所对应DNA浓度为7.11pg/ PCR， 而第7条泳道之后看不到扩增条带。 因此， 判定PCR检测。

41、灵敏度为7.11pg/PCR， 具有较 高的灵敏度。 0047 实施例 2 0048 人工污染阪崎克罗诺杆菌标准菌株 ATCC29544 的检测 0049 人工污染样品的制备 ： 将 100mL10的脱脂乳溶液经灭菌后， 分别取稀释度为 10-7， 10-8和 10-9的阪崎克罗诺杆菌 ATCC29544 纯培养菌液 (440cfu， 44cfu 和 4.4cfu) 各 1mL 加入上述灭过菌的脱脂乳溶液。放置摇床上， 在 37， 180r/min 条件下培养， 每隔 2h 取样 1 次， 共培养 10h。煮沸法 (Chen,W.,S.Yu,C.Zhang,J.Zhang,C.Shi,Y.Hu。

42、,B.Suo,H. 说 明 书 CN 103966353 A 9 8/8 页 10 Cao,and X.Shi， 2011， Development of a single base extension-tag microarray for the detection of pathogenic Vibrio species in seafood.Applied microbiology and biotechnology89(6):1979-1990.) 提取基因组 DNA， 采用前述最优的反应体系和最优的扩 增程序进行PCR反应。 结果如图5所示， 由图5可以明显看出， 人工接入440cf。

43、u阪崎克罗诺 杆菌 ATCC29544 纯培养液的脱脂乳溶液经增菌培养 4h 后即可检测到该菌， 人工接入 44cfu 和 4.4cfu 阪崎克罗诺杆菌 ATCC29544 纯培养液的脱脂乳溶液经增菌培养 6h 后即可检测到 该菌。 0050 实施例 3 0051 30 份食品样品 ( 包括奶粉和蔬菜等 ) 均购于上海的农贸市场和大型超市。将 50g 样品添加到 450mL 缓冲蛋白胨水 (buffer peptone water， BPW， pH8.0) 增菌培养基中进行 增菌培养， 37增菌 18h 后每份样品取 1mL 放入 1.5mL 离心管中， 并用煮沸法 (Chen,W.,S. Y。

44、u,C.Zhang,J.Zhang,C.Shi,Y.Hu,B.Suo,H.Cao,and X.Shi， 2011， Development of a single base extension-tag microarray for the detection of pathogenic Vibrio species in seafood.Applied microbiology and biotechnology89(6):1979-1990.)提取 基因组 DNA， 12， 000rpm/min 离心 5min 后取 2.5L 上清液作为 PCR 模板， 以无菌水作阴性 对照， 采用前述最优。

45、的反应体系和最优的扩增程序进行 PCR 检测。每个实验重复 3 次。同 时， 样品增菌1824h后， 按国标法GB4789.402010进行分离鉴定阪崎克罗诺杆菌， 并经 16S rRNA 测序后根据在线 BLAST 比对， 将属于阪崎克罗诺杆菌 (Cronobacter sakazakii) 的样品结果与 PCR 方法进行对照。如图 6 所示， 经本发明建立的 PCR 检测方法进行检测， 有 7份样品检测到目的条带(498bp)， 而该7份样品经国标方法及测序也分离和鉴定到了阪崎 克罗诺杆菌菌株， 由此可见本实验建立的方法具有非常高的可靠性。 说 明 书 CN 103966353 A 10 1/1 页 11 0001 序 列 表 CN 103966353 A 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103966353 A 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103966353 A 13 3/3 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103966353 A 14 。