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1、(10)申请公布号 CN 103952334 A (43)申请公布日 2014.07.30 CN 103952334 A (21)申请号 201410112899.6 (22)申请日 2014.03.25 CGMCC No. 8391 2013.10.24 C12N 1/20(2006.01) C12P 19/02(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 深圳市博大生物技术有限公司 地址 518028 广东省深圳市福田区华强北路 长兴大厦 B 座 706 房 申请人 河南大学 (72)发明人 朱龙华 刘宇鹏 李柱坚 潘龙 靳魁奇 朱晓宏 (74)专利代理机构 郑。
2、州联科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 41104 代理人 杨海霞 时立新 (54) 发明名称 一种微生物发酵生产 L- 赤藓酮糖的菌株 HD385 和方法 (57) 摘要 本 发 明 属 于 涉 及 一 种 微 生 物 发 酵 生 产 L- 赤藓酮糖的菌株 HD385， 其分类属醋酸杆 菌 科 （Acetobacteraceae）葡 萄 糖 酸 杆 菌 属 （Gluconobacter）Gluconobacterkondonii， 该菌 株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心的保藏号为 ： CGMCCNo.8391。本发明还给 出了利用该菌株发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖 的方法，。
3、 其在好氧条件下能显著地积累 L- 赤藓酮 糖， 最高达到 186.5g/L， 可实现工业化生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103952334 A CN 103952334 A 1/1 页 2 1. 一 种 微 生 物 发 酵 生 产 L- 赤 藓 酮 糖 的 菌 株 HD385， 其 分 类 属 醋 酸 杆 菌 科 （Acetobacteraceae） 葡萄糖酸杆菌属 （Gluconobacter）。
4、Gluconobacter kondonii， 该菌株 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 ： CGMCC No.8391。 2. 利用权利要求 1 所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 其特征在 于 ： 包括如下步骤 ： 将菌株 HD385 按 1 10% 的接种量接入液体发酵培养基， 在好氧条件下 于 28 30发酵培养 48 72 h ； 所述液体发酵培养基组成为 ： 赤藓糖醇 50 250 g/L， 氮源 6 20 g/L， 碳酸钙 0.1 15 g/L， KH2PO4 0.1 8 g/L， 余量为水， 培养基 pH 4 7。 3. 根据权。
5、利要求 2 所述发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 其特征在于， 将菌株 HD385 先按 1 10% 的接种量接种到一级种子培养基中， 于 28 30好氧培养 6 24 h ； 然后将培养好的一级种子按 1 10% 的接种量接入二级种子培养基中， 8 10 h 后将培养 好的二级种子按110%的接种量再接入液体发酵培养基 ； 其中， 所述一级种子培养基的组 成为 ： 赤藓糖醇 10 50 g/L， 酵母粉 5 15 g/L， KH2PO4 0.1 0.5 g/L， 余量为水， pH 自 然 ； 所述二级种子培养基的组成为 ： 赤藓糖醇1050 g/L， 酵母粉515 g/L， CaCO。
6、3 0.1 0.5 g/L， 余量为水， pH 4.0 7.0。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 其特征在于， 所述 赤藓糖醇为食品级赤藓糖醇或医药级赤藓糖醇。 5. 根据权利要求 2 或 3 所述发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 其特征在于， 所述 氮源为酵母粉、 牛肉膏、 蛋白胨、 玉米浆、 尿素或无机铵盐。 权 利 要 求 书 CN 103952334 A 2 1/7 页 3 一种微生物发酵生产 L- 赤藓酮糖的菌株 HD385 和方法 0001 技术领域 本发明属于生物制造领域， 具体涉及到一种好氧微生物发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓。
7、酮 糖用的菌株 HD385 和利用该菌株发酵生产赤藓糖醇的方法。 背景技术 0002 L- 赤藓酮糖是一种天然的丁酮糖， 是赤藓糖的酮糖形式。其分子式是 C4H8O4，分子 量为 120.10， 英文名称 ： L-erythrulose， 是一种黄色高粘稠液体， 有甜味。 0003 L- 赤藓酮糖可以与皮肤外部或老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应， 使皮肤变成 棕色而作为自然仿晒试剂， 同时它也是多种抗感染药物的前体化合物。其主要用途是用于 化妆品行业， 一般用作美黑剂。 与二羟基丙酮相比较， 其美黑效果更佳持久、 自然 ； 如果和二 羟基丙酮配合使用， 使颜色加深， 分布更为均匀。 0004 。
8、L- 赤藓酮糖的工业化生产主要是利用含有赤藓糖醇脱氢酶微生物以赤藓糖醇为 底物发酵生产。 报道最多的能产L-赤藓酮糖的微生物为葡萄糖酸杆菌属 （Gluconobacter） 和醋杆菌属 （Acetobacter） 。目前已报道的能产 L- 赤藓酮糖的微生物资源如下 ： Gluconobacter oxydans ATCC621、Gluconobacter oxydans DSM7145、Gluconobacter frateurii CHM43、Gluconobactermelanogenus LMG1387、Acetobacter suboxydans、 Acetobacter xylinu。
9、m等。国内外关于产 L- 赤藓酮糖的微生物资源及微生物生产报道较 少， 且很多菌株的转化率都较低， 例如利用Gluconobacter oxydans ATCC621 生产 L- 赤藓 酮糖时对底物的转化率仅为 4550%。因此， 自主创新地筛选出能够耐受高浓度赤藓糖醇的 微生物菌株， 并且研究出一种能够生产高浓度 L- 赤藓酮糖的方法迫在眉睫。 0005 发明内容 本发明目的在于提供一种对高浓度赤藓糖醇有一定耐受性的菌株 HD385， 该菌株可用 于微生物发酵生产 L- 赤藓酮糖。 0006 本发明还给出了利用该菌株HD385发酵生产L-赤藓酮糖的方法， 该方法以赤藓糖 醇为原料， 赤藓糖醇。
10、转化率较高。 0007 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一 种 微 生 物 发 酵 生 产 L- 赤 藓 酮 糖 的 菌 株 HD385， 其 分 类 属 醋 酸 杆 菌 科 （Acetobacteraceae） 葡萄糖酸杆菌属 （Gluconobacter）Gluconobacter kondonii， 该菌株 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 ： CGMCC No.8391 ； 保藏日期 为 2013 年 10 月 24 日 ； 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 0008 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮。
11、糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385按110%的接种量接入液体发酵培养基， 在好氧条件下于2830发酵培养48 72 h ； 所述液体发酵培养基组成为 ： 赤藓糖醇50250 g/L， 氮源620 g/L， 碳酸钙0.1 15 g/L， KH2PO4 0.1 8 g/L， 余量为水， 培养基 pH 4 7。 0009 或者， 也可以将菌株 HD385 先按 1 10% 的接种量接种到一级种子培养基中， 于 2830好氧培养624 h ； 然后将培养好的一级种子按110%的接种量接入二级种子 说 明 书 CN 103952334 A 3 2/7 页 4 培养基中， 810 h后将培养好的二。
12、级种子按110%的接种量再接入液体发酵培养基 ； 其 中， 所述一级种子培养基的组成为 ： 赤藓糖醇 10 50g/L， 酵母粉 5 15g/L， KH2PO4 0.1 0.5g/L， 余量为水， pH 自然 ； 所述二级种子培养基的组成为 ： 赤藓糖醇 10 50g/L， 酵母粉 5 15g/L， CaCO3 0.1 0.5g/L， 余量为水， pH 4.0 7.0。 0010 具体的， 所述赤藓糖醇优选为食品级赤藓糖醇、 医药级赤藓糖醇等。 所述氮源优选 为酵母粉、 牛肉膏、 蛋白胨、 玉米浆、 尿素或无机铵盐等。 0011 可通过本领域的常规方法来调节培养基的 pH 值， 如添加盐酸、 。
13、氢氧化钠等无机酸 碱。其中， 所述液体发酵培养基、 一级种子培养基和二级种子培养基的灭菌条件为 ： 107 121， 15 min。 0012 在本发明中， 建立了一个筛选高产 L- 赤藓酮糖的模型。由于具有赤藓糖醇脱氢 酶的微生物能利用赤藓糖醇做为碳源生长， 并产生 L- 赤藓酮糖， 因此设计出以赤藓糖醇为 唯一碳源的选择性平板， 筛选出能够利用赤藓糖醇的菌株。在平板上挑出较大的菌落至摇 瓶， 液体发酵筛选。本发明的特点是从腐烂的蔬菜中分离得到能有效产生 L- 赤藓酮糖的 Gluconobacter kondoniiHD385， 其在好氧条件下能显著地积累 L- 赤藓酮糖 （40 186 g。
14、/ L） ， 最高达到 186 g/L， 可实现工业化生产。 0013 本发明方法的突出优点是利用廉价的赤藓糖醇为原料来发酵生产高附加值产品 L- 赤藓酮糖， 该方法可持续生产， 且对环境友好。 附图说明 0014 图 1 为Gluconobacter kondoniiHD385 的平板菌落照片 ； 图 2 为Gluconobacter kondoniiHD385 的扫描电镜照片 （5000） ； 图 3 为 Gluconobacter kondoniiHD385 的 16S rDNA 全序列测序结果 ； 图 4 为基于 BLAST 结果构建的进化树。 具体实施方式 0015 （一）Gluco。
15、nobacter kondoniiHD385 的筛选 ： 1、 初筛 ： 从腐烂的蔬菜中取样， 粉碎后， 取 10 g 加入 90 mL 无菌生理盐水， 振荡 1 h， 取上清液， 稀释成一系列浓度梯度。取 10-5、 10-6、 10-7三个梯度 0.2 mL 涂布于平板培养基 （平板培养 基组成为 ： 赤藓糖醇 150 g/L， 酵母粉 15 g/L， 琼脂粉 15 g/L， KH2PO4 1g/L， 余量为水， pH 自 然） ， 28培养 34 d， 获得单菌落。选取菌落均匀的平板， 从其上挑取 10 20 个较大菌落 分别接种至发酵培养基 （每株菌株做一个摇瓶， 发酵培养基组成为 ：。
16、 赤藓糖醇100 g/L， 酵母 粉 10 g/L， CaCO3 3 g/L， 余量为水， pH 自然） ， 28发酵培养 48 h。 0016 然后取 1.5mL 发酵液 12000 转 / 分离心 5 min， 取上清液， 稀释后用 HPLC 法测定 L- 赤藓酮糖含量。HPLC 条件如下 ： 色谱柱 Aminex HPX-87C 柱 （7.8 mm300 mm， 9 m） ； 流动相 ： 去离子水 ； 检测器 ： RI 检测器， UV 检测器 （检测波长 277 nm） ； 柱温 60 ； 流速 0.4 ml/min ； 进样量 20 l。 0017 选取产 L- 赤藓酮糖较高的百余株菌。
17、株， 于 4条件下保存其相应斜面 （斜面培养 基组成为 ： 赤藓糖醇 30 g/L， 酵母粉 15 g/L， 琼脂粉 15 g/L， KH2PO4 1 g/L， 余量为水， pH 自 说 明 书 CN 103952334 A 4 3/7 页 5 然， 赤藓糖醇为食品级） 。 0018 、 复筛 ： 将初筛保留的菌株转接于装有 30 mL 发酵培养基的三角瓶中 （每株菌株做三个摇瓶平 行样， 发酵培养基组成与初筛中的发酵培养基相同） ， 200转/分， 28好氧培养48 h。 取1.5 mL 发酵液 12000 转 / 分， 离心 5 min， 取上清液， 稀释后用 HPLC 法测定 L- 赤藓。
18、酮糖含量。 0019 多数菌株 L- 赤藓酮糖含量较低， 仅有 3-8-5 号菌株 （实验室该菌株编号为 HD385） 产 L- 赤藓酮糖显著， 为 64.9 g/L。表 1 中给出了产 L- 赤藓酮糖效果较好的数十余株菌株。 0020 表 1 部分试验菌株的产 L- 赤藓酮糖情况 （二）Gluconobacter kondoniiHD385 的鉴定 ： 筛选得到的能有效积累 L- 赤藓酮糖且效果显著的微生物菌株 HD385 ： 该菌的细胞呈 短杆状， 不运动， 无芽孢。革兰氏阴性， 菌落在赤藓糖醇平板上 28条件下培养 3 4 d 后 菌落较小、 湿润、 圆形、 隆起、 边缘波形、 不透明、。
19、 正反面颜色一致呈淡黄色， 直径可达 13 mm （见图 1 和图 2） 。 0021 按 伯杰氏细菌鉴定手册 （第八版） 、葡萄糖酸杆菌属分类及其主要应用的研 究进展 （冯静等， 微生物学杂志， 2010, 30（2） :86-90） 和 Gluconobacter sphaericus (Ameyama 1975) comb. nov, a brown pigment-producing acetic acid bacterium in the Alphaproteobacteria （Taweesak Malimas et al., J Gen Appl Microbiol, 2008,。
20、54:211-220） 进行生理生化特性鉴定 （结果见表 2） 。 0022 根据革兰氏染色、 接触酶、 氧化酶、 还原硝酸盐、 液化明胶、 产吲哚、 氧化乙醇到 乙酸、 氧化乙酸盐到 CO2和 H2O、 多醇类生酮、 水解淀粉、 D- 木糖产酸、 D- 葡萄糖产酸等 Gluconobacter属的特征生理生化反应结果鉴定该菌株属于Gluconobacter属。根据形成 5- 酮基葡萄糖酸、 形成二羟基丙酮、 D- 阿拉伯糖醇生长、 赤藓糖醇生长等种间生理生化特 性鉴定该菌株属于Gluconobacter kondonii， 拟命名为Gluconobacter kondonii HD385。 。
21、0023 同时， 委托大连宝生物工程有限公司对 HD385 菌株进行 16S rDNA 全序列测序 （共 1398bp， 结果见图 3） 。在 NCBI 网站上用 BLAST 检索 GenBank 中相关菌株的 16S rDNA 基因 序列 （见表 3） ， 用 MEGA 4.0 软件构建进化树分析 （见图 4） 。基于 16S rDNA 序列分析和构建 进化树分析得出 HD385 与Gluconobacter kondonii、Gluconobacter albidus亲缘关系较 说 明 书 CN 103952334 A 5 4/7 页 6 近， 菌株 HD385 可以确定为Gluconob。
22、acter属。 0024 由上述鉴定结果可知， 菌株HD385属醋酸菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌 属 （Gluconobacter） ， 该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号 为 ： CGMCC No. 8391。 0025 表 2 生理生化特性鉴定结果对照表 表 316S rDNA 序列同源性 （或相似性） 比较 说 明 书 CN 103952334 A 6 5/7 页 7 （三） 利用菌株 HD385 发酵生产 L- 赤藓酮糖 ： 实施例 1 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385 先。
23、 按 10% 的接种量接种到一级种子培养基中 （所述一级种子培养基的组成为 ： 赤藓糖醇 30 g/ L， 酵母粉 15 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， 余量为水， pH 自然） ， 于 28好氧培养 24 h ； 然后将培养 好的一级种子按 5% 的接种量接入二级种子培养基中 （所述二级种子培养基的组成为 ： 赤藓 糖醇 30 g/L， 酵母粉 15 g/L， CaCO3 0.3 g/L， 余量为水， pH 6.0） ， 8 h 后将培养好的二级种 子按 5% 的接种量分别接入含不同赤藓糖醇浓度的液体发酵培养基中 （250 mL 三角瓶， 装液 量 50 mL） 。转速 200 转。
24、 / 分， 28条件下发酵 48 h， 测定 L- 赤藓酮糖含量， 实验结果见表 4。 0026 其中， 所述液体发酵培养基组成为 ： 赤藓糖醇 50250 g/L， 酵母粉 10g/L， KH2PO4 1 g/L， CaCO3 3g/L， 余量为水， pH 6.0， 赤藓糖醇为食品级。种子灭菌温度为 115， 15 min。 发酵培养基的灭菌温度 115， 20 min， CaCO3 160干热灭菌 1 h。 0027 表 4 不同赤藓糖醇浓度下菌株 HD385 的 L- 赤藓酮糖产量 实施例 2 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD3。
25、85 按 4% 的接种量直接接入液体发酵培养基 （所述液体发酵培养基组成为 ： 食品级赤藓糖醇 100g/L， 蛋白胨8g/L， KH2PO4 3 g/L， 碳酸钙3g/L， 余量为水， 培养基pH 7） ， 在好氧条件下于 30发酵培养 72 h ； 测得发酵液中 L- 赤藓酮糖含量为 79.4 g/L。 说 明 书 CN 103952334 A 7 6/7 页 8 0028 实施例 3 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385 按 8% 的接种量直接接入液体发酵培养基 （所述液体发酵培养基组成为 ： 医药级赤藓糖醇 100 g/L，。
26、 玉米浆 20 g/L， KH2PO4 5 g/L， 碳酸钙 8 g/L， 余量为水， 培养基 pH 5.5） ， 在好氧条件下 于 30发酵培养 72 h ； 测得发酵液中 L- 赤藓酮糖含量为 81.0 g/L。 0029 实施例 4 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385 按 2% 的接种量直接接入液体发酵培养基 （所述液体发酵培养基组成为 ： 食品级赤藓糖醇 100 g/L， 尿素 6 g/L， KH2PO4 8 g/L， 碳酸钙 10 g/L， 余量为水， 培养基 pH 4） ， 在好氧条件下于 28发酵培养 48 h ； 。
27、测得发酵液中 L- 赤藓酮糖含量为 12.2 g/L。 0030 实施例 5 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385 按 10% 的接种量直接接入液体发酵培养基 （所述液体发酵培养基组成为 ： 食品级赤藓糖醇 100 g/L， 牛肉膏15 g/L， KH2PO4 3 g/L， 碳酸钙15 g/L， 余量为水， 培养基pH 7） ， 在好氧条件下于 28发酵培养 48 h ； 测得发酵液中 L- 赤藓酮糖含量为 74.1 g/L。 0031 实施例 6 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将培。
28、养好的二级 种子按 5% 的接种量接入装液量为 3L 的 7 L 发酵罐 （发酵培养基配方为 ： 食品级赤藓糖醇 150 g/L， 酵母粉 15 g/L， KH2PO4 5 g/L， CaCO3 3 g/L， 余量为水， pH 6.0） 中， 转速 400 转 / 分， 通气量 2.0 vvm。28条件下发酵 48 h， 测得发酵液中 L- 赤藓酮糖含量为 130.6 g/L。 一、 二级种子培养基组成与实施例 1 相同。 0032 实施例 7 利用所述菌株 HD385 发酵赤藓糖醇生产 L- 赤藓酮糖的方法， 具体为 ： 将菌株 HD385 按 4% 的接种量接种到一级种子培养基中， 200。
29、 转 / 分， 28条件下好氧培养 24h。然后按 5% 的接种量将培养好的一级种子接入装有二级种子培养基的 250 mL 三角瓶中 （装液量为 50 mL） ， 8 h 后按 5% 的接种量将培养好的二级种子接入装液量为 30 L 的机械搅拌发酵罐中进 行补料分批发酵。发酵罐转速 200 转 / 分， 通气量 1.0 vvm， 28条件下发酵 48 h， HPLC 法 测定发酵液中L-赤藓酮糖和残余赤藓糖醇含量。 一、 二级种子培养基组成与实施例1相同。 0033 初始发酵培养基配方 ： 赤藓糖醇 50 g/L， 酵母粉 15 g/L， KH2PO4 3 g/L， CaCO3 3g/ L， 。
30、余量为水， pH 调至 6.0。补料液赤藓糖醇浓度 300 g/L， 115灭菌 20 min 备用。当发酵 液中初始赤藓糖醇浓度下降到10 g/L以下时， 开始流加补入补料液将发酵液中赤藓糖醇浓 度控制在 5 15 g/L， 所用赤藓糖醇为食品级。 0034 分别在发酵第 0 h、 2 h、 4 h、 6 h、 8 h、 16 h、 20 h、 24 h、 28 h、 32 h、 36 h、 40 h、 44 h、 48 h 测定发酵液中 L- 赤藓酮糖和残余赤藓糖醇含量， 实验结果见表 5。 0035 发酵48 h， 下罐时L-赤藓酮糖含量186.5 g/L， 总计投入赤藓糖醇 （初始培养基中 赤藓糖醇加上补料赤藓糖醇） 折算后为 193 g/L， 残余赤藓糖醇 0.4 g/L， L- 赤藓酮糖转化 率 （L- 赤藓酮糖 / 投入赤藓糖醇， w/w） 为 96.6 %。 0036 表 5 菌株 HD385 于 30 L 罐补料分批发酵的 L- 赤藓酮糖产量 说 明 书 CN 103952334 A 8 7/7 页 9 。 说 明 书 CN 103952334 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103952334 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103952334 A 11 。