一种核酸快速提取试剂盒及其应用 【技术领域】
本发明属于生物核酸检测技术领域， 具体涉及一种从生物样本中快速提取 DNA 或 RNA 的试剂盒。背景技术
自 PCR 技术 1985 年在美国问世以来， 被迅速广泛地应用于分子生物学相关领域， 特别是近几年， 随着个体化医疗概念的提出和在临床的推广， 通过 RT-PCR 来研究患者样本 中不同基因表达水平的差异， 从而找出关键基因或者预后基因变化趋势， 帮助医生指导用 药， 更使得 RT-PCR 进入了临床诊疗。
然而， RT-PCR 扩增必须用 RNA 做模板才能进行。目前经典的 RNA 抽提方法是 TRIZOL 试剂， 直接从细胞或组织中提取总 RNA。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整 性。加入氯仿后离心， 样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样 层后， RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。
但是因为用 TRIZOL 试剂抽提 RNA， 需用到较多有挥发性的化学试剂， 对实验者有 害， 因此目前也有利用吸附过柱的方法提取 RNA 的商业化试剂盒， 因为需要蛋白酶 K 处理过 程， 一般需要经过 3-4 小时的抽提过程， 才能进入后续的 RT-PCR 反应。
随着 RT-PCR 不断在临床推广和应用， 人们对快速简便的 RNA 纯化方法的需求越来 越强烈。 RNA 的完整性和纯度不再是考量 RNA 抽提纯化方法的唯一标准， 只要快速、 简便， 不 影响后续的 RT-PCR 反应， 都是可以接受的 RNA 抽提纯化方法。
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织 (formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET)， 为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔 马林固定后的蜡块包埋组织 RNA 降解严重， 存档 FFPET 组织切片取量有限， 传统提取 RNA 步 骤繁杂， 提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用。 如何高效、 高 质量提取微量石蜡组织中 RNA 对利用石蜡组织进行分子研究及诊断至关重要。
传统从石蜡组织里抽提 RNA 需要先用二甲苯脱蜡， 然后用无水乙醇去除二甲苯， 脱蜡过程繁琐， 至少需要 3 ～ 4 小时， 而且二甲苯是有机溶剂， 对实验操作者的身体有害。 脱 完蜡后， 标本也需要再经过 3 ～ 4 小时的抽提， 才能进入后续的 RT-PCR 反应。
Chelex-100 是一种由苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的螯合树脂， 其悬液在碱 性环境 (pH10 ～ 11) 和 100 ℃条件下， 可导致细胞膜破裂并使 DNA 变性释放出来， 并且 Chelex-100 可高选择性的结合多价阳离子， 去除样品和缓冲液中的多价金属离子， 避免煮 沸过程中模板 DNA 的降解。Chelex-100 提取 DNA 具有经济、 简便、 高效等优点， 目前已广泛 被用于从全血或血液、 精液或精斑、 混合斑、 毛发、 培养细胞等提取 DNA。 发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种核酸快速提取试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。本发明的第三发明目的在于提供该试剂盒的应用。
本发明涉及一种核酸快速提取试剂盒， 所述试剂盒包含研磨棒、 提取液、 抽提柱、 微型超滤器和离心管 ； 其中， 所述提取液为含有 chelex-100 的 DEPC 水溶液。
本发明的第一优选技术方案为 ： 所 述 的 提 取 液 中 含 有 2 ～ 50g/100ml 的 chelex-100 和 0.1％ DEPC。
本发明的第二优选技术方案为 ： 所述的 chelex-100 的浓度为 2 ～ 30g/100ml， 优 选为 3 ～ 10g/100ml。
本发明还涉及该试剂盒的使用方法， 所述方法包括以下步骤 ：
(1) 取少量生物样本， 所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、 血斑精斑精液样 本、 组织液样本、 脑脊液样本、 血液样本、 血清样本、 血浆样本、 尿液样本、 积液样本、 组织细 胞样本
(2) 将生物样本置于 chelex-100 的 DEPC 水溶液中， 所述的 chelex-100 的 DEPC 水 溶液的浓度为 1 ～ 80g/100ml ；
(3)80 ～ 100℃条件下加热 1 ～ 50 分钟 ；
(4) 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 (3) 中获得的液体加入到抽提柱中， 1000 ～ 20000 转 / 分钟， 离心 2 ～ 120 秒 ；
(5) 收集离下的液体， 用于 PCR 或 RT-PCR 反应。
其中， 优选的， 所述的抽提柱为， 在抽提柱中底部有一层起物理阻挡的膜。
该制备方法进一步优选为 ： 所述的加热温度为 90 ～ 100℃， 优选 90 ～ 95℃ ； 所述 的加热时间为 5 ～ 30 分钟， 优选 8 ～ 10 分钟 ；
所述的离心的时间为 2 ～ 120 秒， 优选 10 ～ 30 秒 ；
所述的离心的转速为 5000 ～ 20000 转 / 分钟， 优选 10000 ～ 20000 转 / 分钟， 更 优选 15000 ～ 20000 转 / 分钟。
本发明所述的试剂盒在用于提取病理组织石蜡切片样本、 血斑精斑精液样本、 组 织液样本、 脑脊液样本、 血液样本、 血清样本、 血浆样本、 尿液样本、 积液样本、 组织细胞样本 中的 DNA 或 RNA 的应用。
下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明 ：
本发明的试剂盒含有研磨棒、 提取液、 抽提柱、 微型超滤器和离心管 ； 其中研磨棒、 抽提柱、 微型超滤器和离心管均为市售， 抽提柱优选为市售圆柱形柱子， 离心管优选为市售 1.5mleppendorf 管， 微型超滤器优选市售截留分子量小于 20000 道尔顿的超滤器。
当采用组织细胞样本提取 RNA 时， 研磨步骤需要在冰上进行， 以减少 RNA 的降解。
本发明的技术优势为 ：
1. 本发明的试剂盒的使用方法简单， 时间短， 且不使用有害有机溶剂。 传统方法中 一般从石蜡包埋组织中抽提 DNA 或 RNA 需要先用二甲苯脱蜡， 然后用无水乙醇去除二甲苯， 而且二甲苯是有机溶剂， 对人体有 所用的时间长， 过程繁琐， 至少需要 3 ～ 4 小时才能完成， 害。脱完蜡后， 标本需要再经过蛋白酶 K 的处理， 以去除蛋白质， 这个过程也需要 3 ～ 4 小 时， 故通常方法抽提石蜡包埋组织中 DNA 或 RNA， 进入后续 PCR 或 RT-PCR 反应， 需要 6 ～ 8 小时以上。 本发明的方法简便易行， 不使用挥发性有害有机溶剂二甲苯， 不会对实验人员造 成伤害， 并且所需时间大为缩短， 仅需 10 余分钟即可完成 ；2. 本发明的试剂盒采用高温加热对 DNA 或 RNA 进行提取， 不仅使石蜡变成液态， 而且使组织中的蛋白质变性， 从而使 DNA 或 RNA 被释放出来， 省去了需要蛋白酶 K 水解需要 3 ～ 4 个小时的过程 ；
3. 本发明的试剂盒可将液态石蜡和 chelex-100 截留在抽提柱的膜上， 从而消除 了液态石蜡和 chelex-100 对 PCR 或 RT-PCR 反应的不良影响， 提高了 PCR 或 RT-PCR 反应的 灵敏度。
下面对本发明的具体实施方式做进一步的解释和说明， 但并不对本发明的内容构 成限制。本发明所用的试剂均为市售试剂， 所用的实验仪器均为实验室常用仪器。 具体实施方式
实施例 1
1. 用两种方法提取石蜡包埋组织切片中的 DNA， 每种方法抽提 3 个标本， 平行比 较。
1. 用北京百泰克生物技术有限公司生产的石蜡组织切片 DNA 提取试剂盒抽提石 蜡包埋组织切片中的 DNA ： a) 取 2 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公司生产 ) 包埋组织切片放入 1.5mL 的离心管中。
b) 加入 1ml 二甲苯， 震荡混匀， 55℃水浴 10 分钟。13000 转 5 分钟， 吸弃上清。
c) 重复第 2 步一到三次。
d) 加 1ml 无水乙醇， 震荡混匀。13000 转 5 分钟， 吸弃上清。
e) 重复第 4 步一次。
f) 将沉降下来的标本烘干。
g) 加入 200μl Buffer 1， 混匀。
h) 加入 25μl Proteinase K， 震荡混匀。55℃水浴消化过夜。
i)13000 转离心 5 分钟， 上清转移到一干净的 1.5mL 离心管中。
j) 加入 220μl Buffer 2， 震荡混匀。70℃水浴 10 分钟
k) 加入 220μl 无水乙醇， 混匀。
l) 将抽提柱放入收集管中， 移入第 5 步的混合液体， 室温静置 3 分钟。
m)13000 转离心 2 分钟， 把液体重新转入柱子， 重新过柱。
n)13000 转离心 2 分钟， 弃液体。
o) 把柱子移入新的收集管内， 加入 500μl Buffer 3。
p) 把柱子移入新的收集管内， 13000 转离心 1 分钟， 弃液体。加入 600μl Wash Buffer。(Wash Buffer 按包装预加适量无水乙醇 )
q)13000 转离心 1 分钟， 弃液体。加入 600μl DNA Wash Buffer。
r)13000 转离心 1 分钟， 弃液体。13000 转离心 2 分钟， 开盖挥发 4-5 分钟。
s)、 把柱子移入 1.5mL 的带盖离心管中， 在膜中央加入 40μl Elution Buffer( 须 70℃预热 )。室温静置 3 分钟。
t)13000 转离心 1 分钟， 收集液体， 取 5ul 用于 PCR 反应。
2. 采用本发明的试剂盒提取石蜡包埋组织切片中的 DNA
a. 取 2 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公司生产 ) 包埋组织切片 ；
b. 置于 200ul 的溶液 1 中， 所述的溶液为 10％ chelex-100(sigma 公司 ) 的水溶 液；
c.90℃条件下加热 20 分钟 ；
d. 将抽提柱放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱里， 12000 转 / 分 钟离心 30 秒 ； 所述的抽提柱为 ：
e. 收集离下的液体， 取 5ul 用于 PCR 反应。
2.DN A 鉴定方法 ：
2.1DNA 质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ：
因为石蜡切片中的 D N A 含量较低， 用普通琼脂糖凝胶电泳方法不能检测到 DNA 的量， 因此将用每种方法抽提的三个标本基因组 DNA， 各取 20μL 混合， 真空抽去部分水分 后， 加 5μL 的 DNA loading buffer 混匀上样， 在 2％的琼脂糖凝胶中 80V 电泳 30min， 在紫 外凝胶成像仪下观察所提取 DNA 基因组的质量并拍照存档。
2.2 荧光定量 PCR 检测所提取 DNA 基因组的浓度
选 择 针 对 人 β-2actin 基 因 组 DNA 的 引 物 和 TaqMan 荧 光 探 针， 采 用 Primer Express 软件自行设计， 由上海生物工程公司 (Sangong) 合成。引物序列见表 1。
表1： 引物和探针的序列表
上游引物 5′ -GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3′ 下游引物 5′ -CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′ 探针
5′ Fam-CACCG AGCGCGGCTACAGCTTC-TAMARA 3′PCR 反应体系 ： 模板 DNA 2μl， 10×buffer( 无 Mg2+)2.5ul， 2.5mmoL/L dNTP 2ul， 25mmoL/L MgCl21.5ul， 引 物 10mmol/L 0.5ul， 10mmol/L 探 针 0.4ul， 5U/ul Taq 聚 合 酶 0.5μl， 余下由灭菌去离子水补足
PCR 扩增条件 ： 94℃ 3min， 94℃ 15s， 60℃ 60s， 40 个循环， 60℃检测荧光， 每次 PCR 反应均设阳性、 阴性对照。
共选了三个标本， 每个标本重复 5 次， 分别用荧光定量 PCR 检测人每个标本中 β-2actin 基因组 DNA 的量， 用 Ct 值表示， 比较两种抽提方法所获得的 DNA 的质和量， 实验 结果如表 2 所示。
从表 2 可见， 用本发明方法抽提得到的基因组 DNA 所扩增的 β-2actin 的 Ct 值较 试剂盒抽提的 Ct 值小， 提示用本发明方法抽提得到的基因组 DNA 含量和质量都较试剂盒抽 提的好。
表2： 采用两种方法提取 DNA 的 Ct 值
实施例 2
1. 采用本发明的试剂盒快速提取石蜡包埋组织切片中的 RNA ：
1.1 取 3 片 5um 的医用石蜡 ( 型号 ： BX12M311398， 北京中西远大科技有限公司生 产 ) 包埋组织切片在冰上研磨后， 放入 1.5mL 的离心管中 ；
1.2 置于 200ul 的溶液 1 中， 所述的溶液为 10％ chelex-100 的 DEPC 水溶液 ；
1.390℃条件下加热 20 分钟 ；
1.4 将抽提柱管放入离心管中， 将步骤 3 中获得的液体加入到抽提柱管里， 12000 转 / 分钟离心 30 秒 ；
1.5 收集离下的液体， 取 5ul 用于 RT-PCR 反应。
2. 荧光定量 RT-PCR 检测所提取 RNA 的浓度
选择针对人 GAPDH 引物和 TaqMan 荧光探针， 采用 Primer Express 软件自行设计， 由上海生物工程公司 (Sangong) 合成。引物序列见表 3。
表 3 为引物、 探针的核苷酸序列 ：
上游引物 下游引物 探针
5′ -CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′ 5′ -TGTTGTCATACTTCTCAT-3′ 5′ Fam-CCTCACCACCATGGAGAAGGCT-TAMARA 3′40μL 反应体系中含有 ： 2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg2+free)， 3mmol/L Mg2+， 0.125mmol/L dNTP， 0.25μmol/L 引物， 0.156μmol/L 探针， 聚合酶 2U， UNG 酶 0.2U， RT 酶 100u， 模板量为 3μL， 补充水至 40μL。
PCR 扩增条件 ： 42℃ 30min， 94℃， 5min ； 94℃ 15s， 60℃ 60s， 40 个循环， 60℃检测荧 光， 每次 PCR 反应均设阳性、 阴性对照。
随机选取 8 个石蜡包埋组织切片， 进行 RT-PCR 针对 GAPDH 的 mRNA 扩增， 每个标本都能扩增出 GAPDH， 提示该方法是快速可行的， 见表 4。
表 4 为本发明样本的 Ct 值 ：
标本号 1 2 3 4 5 6 7 8 Ct 值 32.1382 32.694 29.1025 28.9604 24.662 24.5847 21.0877 21.14148