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1、(10)申请公布号 CN 103031322 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103031322 A *CN103031322A* (21)申请号 201110297156.7 (22)申请日 2011.09.30 C12N 15/60(2006.01) C12N 9/88(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12P 13/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学宁波理工学院 地址 31510。
2、0 浙江省宁波市高教园区钱湖南 路 1 号 (72)发明人 梅乐和 郁凯 胡升 黄俊 (74)专利代理机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 代理人 王菲 卢新 (54) 发明名称 谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因及其用 途 (57) 摘要 本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因， 其核苷酸序列在第 311 位有定点突 变。 研究发现， 此位点突变后得到的变体基因编码 的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明通 过在编码野生 GAD 酶基因基础上进行定点突变， 提高了其对应变体酶在在 60和 70下的热稳 定性。 随着酶热稳定性的提高， 在工业生产过程中 可以。
3、采用更高的操作温度， 以提高反应速率、 增加 底物溶解度， 有利于利用该酶通过生物转化生产 GABA。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 12 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 12 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因， 其特征在于 ： 所述基因的核苷酸序列在 第 311 位有定点突变。 2. 根据权利要求 1 所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因， 其特征在于 ： 所述基 因的核苷酸序列第 311 位的密码子 G。
4、GT 突变为 CCC。 3. 根据权利要求 2 所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因， 其特征在于 ： 所述基 因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 4.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因编码的谷氨酸脱羧 酶。 5. 根据权利要求 4 所述的谷氨酸脱羧酶， 其特征在于 ： 所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序 列如 SEQ ID NO.2 所示。 6.一种包含权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的谷氨酸 脱羧酶表达单元。 7.一种包含权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因的重组质 粒。 8. 一种包含权利。
5、要求 1-3 任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因的转化 子。 9. 权利要求 1-3 任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因在 60以上条件 下、 催化 L- 谷氨酸或其盐生成 - 氨基丁酸的方法中的应用。 10. 权利要求 4 或 5 所述的谷氨酸脱羧酶在 60以上条件下、 催化 L- 谷氨酸或其盐生 成 - 氨基丁酸的方法中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103031322 A 2 1/5 页 3 谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因及其用途 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学技术领域， 尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶变体 G311P 基因及 其用途。
6、。 背景技术 0002 定点突变(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在 目的 DNA 片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。它是研究蛋白质结构与功能之 间的复杂关系的有力工具， 也是在实验室中改造基因的常用手段。对某个已知基因的特定 碱基进行定点改变、 缺失或者插入， 可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特 征， 有助于了解蛋白质结构和功能的关系。 特别是在酶的理性设计中， 或利用随机突变等定 向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸位点后， 进行定点突变分析， 将有利于进一步 了解该位点在蛋白质结构和功能的。
7、关系中所发挥的作用。 0003 谷氨酸脱羧酶 (glutamate decarboxylase， 简称 GAD ； EC4.1.1.15) 是一种广泛地 存在于植物、 动物和微生物中的氨基酸脱羧酶， 它可以专一地催化 L- 谷氨酸的 - 羧基脱 羧反应生成-氨基丁酸(-aminobutyric acid， 简称GABA)。 GABA是哺乳动物神经系统 的一种关键的神经递质抑制剂， 具有抑制中枢神经系统过度兴奋、 解除神经紧张等生理功 能。由于身心紧张会导致人体血压升高、 免疫功能失调、 代谢紊乱， 因此 GABA 对人体具有镇 静安神、 促进睡眠、 健脑益智、 降低血压， 改善免疫功能， 延缓。
8、衰老等作用， 是一种在食品和 医药领域具有广泛应用的天然氨基酸， 已被国家卫生部批准为 “新资源食品” 。 目前， 利用谷 氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行 GABA 的生物制备正得到越来越多的重视。 0004 作为生物技术富集生产GABA的关键酶， 细菌GAD的热稳定性一直是限制其在大规 模生物反应器中应用的因素之一。 细菌GAD的最适温度一般在3050之间， 然而在60 以上酶的活力下降较快。 而在工业生产过程中， 往往希望采用更高的操作温度， 以提高反应 速率、 增加底物溶解度、 降低体系粘度， 从而提高生物催化与转化的效率。 0005 中国专利申请200510049189.4和中国专。
9、利申请200510049187.5公开了一种生产 -氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306， 对该菌株的GAD基因进 行克隆， 构建重组质粒， 转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 可实现可溶表达。但是， 该基因表达 的 GAD 在 60及以上的环境中很快失活， 不利于该酶在 GABA 生物制备中的应用。 发明内容 0006 本发明所解决的技术问题首先是提供一种谷氨酸脱羧酶的变体基因， 其编码对应 的变体酶在 60和 70下的热稳定性有明显提高， 从而在工业生产过程中可以采用更高 的操作温度， 以提高反应速率、 增加底物溶解度， 有利于利用。
10、该酶通过生物转化生产 GABA。 0007 本发明进一步的目的是提供上述变体基因编码的谷氨酸脱羧酶或包含上述变体 基因的表达单元、 重组质粒、 或转化子。 0008 为了达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 说 明 书 CN 103031322 A 3 2/5 页 4 0009 一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P基因， 其核苷酸序列在第311位有定点突变。 研究发现， 此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发 明研究的基础是来自短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306 中的 GAD 基因。其 中短乳杆菌 (Lactob。
11、acillus brevis)CGMCC NO.1306 已在中国专利申请 200510049189.4 和中国专利申请 200510049187.5 中公开， 由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中 心 ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 )。本申请使用的是浙江大学馈赠的。 0010 经研究发现， 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306 中的 GAD 基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， 本申请将该基因第311位甘氨酸(Gly)的密码子GGT突变 为脯氨酸 (Pro) 的密码子 CCC， 序列长度没有变化。得到的谷氨酸脱羧酶热。
12、稳定变体 G311P 基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0011 一种由上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因编码的谷氨酸脱羧酶。其氨基酸 序列优选如 SEQ ID NO.2 所示。 0012 一种包含上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体 G311P 基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、 重 组质粒或转化子。表达单元的启动子可以为常用的 T7 启动子、 lac 启动子或 araBAD 启动 子。在这些启动子的作用下， 突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞 ( 如 BL21(DE3) 中实现 胞内可溶表达。 0013 本发明通过在编码野生 GAD 酶基因基础上进行定点突变， 提高了其对应变体酶。
13、在 60和70下的热稳定性。 本发明特异性选择对编码GAD第311位氨基酸残基位点的密码 子进行替换， 且采用编码脯氨酸的密码子替换编码谷氨酸的密码子、 使GAD的第311位氨基 酸残基由野生型的谷氨酸突变为脯氨酸， 是因为采用分子设计方法对 GAD 上各氨基酸残基 对 GAD 热稳定性的影响进行了分析， 发现第 311 位氨基酸残基位点是一个对 GAD 的热稳定 性有重要影响的氨基酸。基于氨基酸性质与蛋白质结构和性质间的关系， 研究发现在该位 点采用脯氨酸替换甘氨酸可以增加 GAD 蛋白质结构的刚性、 提高 GAD 对热的稳定性。因此， 设计了引物， 并通过定点突变方法构建了谷氨酸脱羧酶的热。
14、稳定突变体G311P。 随着谷氨酸 脱羧酶热稳定性的提高， 在工业生产过程中可以采用更高的操作温度， 以提高反应速率、 增 加底物溶解度， 有利于利用该酶通过生物转化生产 GABA。 附图说明 0014 图 1 为质粒 pET28a(+)-gad 的基因图谱 ； 0015 图 2 为突变位点 Gly311 在 GAD 三级结构中的位置图 ( 以球表示 ) ； 0016 图 3 为定点突变原理示意图 ； 0017 图 4 为野生型 GAD 酶基因 PCR 扩增产物凝胶电泳图谱 ； 0018 图 5 为突变酶和野生型 GAD 在 60的热稳定性 ； 0019 图 6 为突变酶和野生型 GAD 在 。
15、70的热稳定性。 具体实施方式 0020 为进一步说明本发明， 结合以下实施例具体说明 ： 0021 一、 构建重组质粒 0022 将短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306 培养至对数生长中期， 取 说 明 书 CN 103031322 A 4 3/5 页 5 4.5mL 菌液 10000rpm 离心一分钟后弃去上清， 利用试剂盒 ( 上海生工 ) 按说明书提取基因 组 DNA。 0023 设计如下简并引物 ： 0024 上游简并引物 ： 5 -cgggatccatggcWatgttRtaYggWaaac-3 ( 如 SEQ ID NO.5 所 示 )。
16、 ； 0025 下游简并引物 ： 5 -gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3 ( 如 SEQ ID NO.6 所 示 ) ； 0026 其中， 上游引物中的 “ggatcc” 为BamH I酶切位点， 下游引物中的 “gaattc” 为EcoR I 酶切位点。 0027 分别用上游引物和下游引物配对， 选择和优化不同的模板 /Pfu/ 引物比例， 退火 温度， 循环次数， 以所得基因组 DNA 为模板进行 PCR， 以得到扩展片段大小合适、 丰度合适和 非特异条带少的 PCR 结果， 最终通过条件的优化， 得到了一个长度约为 1400bp 的 DNA 条带。 0028。
17、 所确定的 PCR 体系组成为 ： ddH2O， 38.5L ； 10Pfu buffer， 5L ； 上游引物 ： 0.5L ； 下游引物， 0.5L ； dNTP， 4L ； 模板 DNA， 1L ； Pfu， 0.5L ； 反应总体积为 50L。 0029 所用的 PCR 条件为 ： 94变性 5min 后进入扩增循环， 即 94变性 1.5min， 57退 火1min， 72延伸3.5min， 共循环32次， 最后再72延伸8min。 扩增产物经凝胶电泳检验， 结果如图 4 所示， 产物条带单一、 清晰、 明亮， 大小在 1400bp 左右。将克隆产物测序， 发现谷 氨酸脱羧酶基因的保。
18、守序列。 0030 用 BamH I 和 EcoR I 对扩增得到的目的基因和 pET28a(+) 进行双酶切， 酶切条件 如下 ： DNA 20L、 10K buffer 4L、 BamH I 4L、 EcoR I 4L、 ddH2O 8L， 酶切温度 为 35。 0031 质粒酶切 1h， PCR 产物酶切 4h。分别对酶切产物进行电泳纯化和切胶回收， 电 泳验证回收产物， 然后进行连接， 连接条件为 ： 10buffer 2L、 gad 10L、 质粒 1L、 PEG30006L、 T4 连接酶 1L， 连接温度为 16， 连接 16 小时。 0032 连接反应结束后 60保温 5min。
19、 灭活连接酶， 再分别取连接产物转化 E.coli DH5感受态细胞(氯化钙法)。 转化产物涂布于含有终浓度为30g/mL卡那霉素的LB固 定培养基， 37培养 18 小时后挑出阳性克隆， 分别在含有 30g/mL 卡那霉素的 LB 液体培 养基中过夜培养阳性克隆， 提取质粒后进行BamH I和EcoR I双酶切、 PCR验证， 转化子含重 组质粒 pET28a(+)-gad( 如图 1 所示 )。经测序， 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306 中 GAD 基因如 SEQ ID NO.3 所示， 编码的 GAD 氨基酸序列如 SEQ ID NO.4 。
20、所示。 0033 二、 野生型 GAD 的表达和纯化 0034 取构建的表达谷氨酸脱羧酶的质粒 pET28a(+)-gad 转化 E.coli BL21(DE3) 感受 态细胞， 得到表达短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的重组工程菌。挑取菌体在含有终浓度为 30g/ mL 卡那霉素的 LB 固体培养基平板上于 37活化 10 小时， 然后挑取单菌落接种 20mL 含有 30g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 在 37、 200rpm 摇床培养过夜后， 按 2的接种量 接种于 100mL 含有 30g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中在 37、 200rpm 摇床培养 2 3 小时。当发酵液中菌。
21、体浓度 (OD600) 达到 0.6 0.8 时， 向培养液中加入终浓度为 1.0mmol/ L 的异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)， 改变培养温度到 30， 继续培养 6 8 小时。培 养结束后， 在 4、 8000g 的条件下离心 10min 收集菌体。 说 明 书 CN 103031322 A 5 4/5 页 6 0035 然后采用破胞缓冲液重悬细胞， 然后用 Ni-NTA(QIAGEN) 进行金属螯合层析， 得到 野生型 GAD 纯酶， 其操作步骤和所用试剂如 “突变酶的表达与纯化” 。 0036 三、 定点突变 PCR 产物的获得 0037 向 200L 的 Eppendo。
22、rf 管中加入 200mol 的 dNTPs， 上、 下游引物各 1mol， 约 10ngpET28a(+)-gad 重组质粒作为模板 DNA， 5L 的 10Pfu Buffer， 2.5U 的 Pfu DNA 聚 合酶， 然后加无菌蒸馏水至总体积为 50L。反应参数是在 95预变性 5min 后， 95变性 1min， 53退火 2min， 72延伸 14min， 经过 18 个循环， 最后 72延伸 10min。 0038 上游引物 ： 5 -CTTGGGTCCCGAACTACCTACGATGGCC-3 ( 如 SEQ ID NO.7 所示 ) ； 0039 下游引物 ： 5 -GTAG。
23、TTCGGGACCCAAGTAGCTGACCT-3 ( 如 SEQ ID NO.8 所示 ) ； 0040 其中， 下划线标记的核酸序列组合为编码 GAD 第 311 位氨基酸残基的密码子。野 生型 GAD 基因在该位置处的密码子为编码甘氨酸的密码子 GGT ； 在所设计的引物中， 该位置 的密码子替换为编码脯氨酸的密码子 CCC。采用这对引物， 根据定点突变原理， 可以特异地 在所扩增获得的 GAD 基因中引入密码子替换、 使所得基因编码的 GAD 的第 311 位氨基酸残 基变为脯氨酸， 而不再是野生型的甘氨酸。定点突变的原理如图 3 所示。 0041 四、 定点突变 PCR 产物的转化与。
24、验证 0042 将上述获得的定点突变PCR产物用Dpn I酶进行消化， 以降解野生型质粒， 消除转 化子中野生型个体出现的可能。消化的体系为 ： PCR 产物 10L， 10buffer 2L， Dpn I 1L， 加 ddH2O 至总体积为 20L。 0043 将消化以后的产物用 CaCl2法转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 具体操作如下 ： 0044 (1) 从 -70冰箱中取 100L 的感受态细胞悬液， 冰上融化 ； 0045 (2) 加入定点突变 PCR 消化产物 5L， 轻轻混匀， 冰上放置 30min ； 0046 (3) 于 42水浴热激 110s， 然后立即冰上放置 2mi。
25、n ； 0047 (4) 向管中加入 900LSOC 培养基， 混匀， 37振荡培养 1h， 使细胞复苏 ； 0048 (5) 将上述菌液摇匀， 取适量涂布在含有 30g/mL 卡那霉素的 LB 平板上， 正面向 上放置半小时， 待菌液被培养基吸收后倒置平板， 37培养过夜。 0049 待转化子长出后， 随机挑选若干个克隆， 提取质粒， 进行全自动 DNA 测序， 证实突 变位点为 Gly311 Pro( 如图 2 所示 )。 0050 五、 突变酶的表达与纯化 0051 将转化子接种到 20mL 含有 30g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37， 180rpm 振荡过夜培养， 然后。
26、以1的接种量接种到含有30g/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基 中， 37， 180rpm 培养至 OD600为 0.6 0.8 时， 加入 IPTG( 终浓度为 0.5mM)， 30， 150rpm 继续诱导 8h。诱导结束后， 4下 5000g 离心 10min， 收集菌体沉淀。用 pH 8.0 磷酸缓 冲液洗涤两次， 除尽培养基后再用原发酵液体积 1/10 的破胞缓冲液 (50mM 磷酸钾缓冲液， 1mMPMSF， 300mM NaCl， 10mM 咪唑， pH 8.0) 重悬细胞， 在冰浴中超声破胞 90 次 (300W， 工作 3s， 间隙 6s)， 15000g 离心 10。
27、min 收集上清， 即得到含有 GAD 的粗酶液。 0052 采用 Ni-NTA 亲和层析对上步所得的粗酶液进行分离纯化。经上样 (loading)、 清 洗(washing)和洗脱(eluting)， 收集洗脱液， 透析除去小分子即得到纯酶。 适当稀释后， 以 考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。 0053 所用缓冲液配制如下 ： 说 明 书 CN 103031322 A 6 5/5 页 7 0054 裂解缓冲液 (disruption buffer) ： 50mM 磷酸二氢钠， 1mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)， 300mMNaCl， 10mM 咪唑， pH 8.0。 0055 洗 柱 缓 冲 。
28、液 (wash buffer) ： 50mM 磷 酸 二 氢 钠， 1mM 苯 甲 基 磺 酰 氟 (PMSF)， 300mMNaCl， 20mM 咪唑， pH 8.0。 0056 洗脱缓冲液 (elution buffer) ： 50mM 磷酸二氢钠， 1mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)， 300mMNaCl， 250mM 咪唑， pH 8.0。 0057 六、 突变酶的热稳定性考察 0058 将得到的 G311P 纯酶分别在 60和 70的情况下保温 0， 10， 30， 60， 90min 后， 冰 浴 10min。取 10L 纯酶， 加入于 48预热的 200L 底物溶液 (pH 4.。
29、8， 0.1M 柠檬酸 - 磷 酸氢二钠缓冲液， 含 0.01mM PLP， 50mM 底物 L-MSG)， 迅速混匀后在 48反应 10min， 反应结 束后迅速放入沸水浴中 10min 以终止反应， 离心， 收集上清液， 采用高效液相色谱法测定反 应生成的 GABA 的量， 以测定突变酶 G311P 的残余酶活力。在同样条件下， 以野生型 GAD 的 反应作为对照。HPLC 操作条件如下 ： 色谱分离柱为 Hypersil ODS2C18(250mm4.6mm)( 大 连依利特公司 )， 紫外检测波长为 254nm， 进样量为 10L， 控制柱温 25， 流动相 A 为甲醇， 流动相 B 。
30、为四氢呋喃甲醇 0.05M 醋酸钠 (pH 6.2)(5 75 420， V/V)。梯度洗脱程 序见下表 ： 0059 0060 得到结果如图 5 和 6。可见， 突变酶 G311P 与野生型酶相比， 能在更高的温度下更 好地保留谷氨酸脱羧酶活力， 这一特性将有利于 GAD 更好地用于 GABA 的工业制备。 0061 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通工程技术人员对本发明的技 术方案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 说 明 书 CN 103031322 A 7。
31、 1/12 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103031322 A 8 2/12 页 9 0003 序 列 表 CN 103031322 A 9 3/12 页 10 0004 序 列 表 CN 103031322 A 10 4/12 页 11 0005 序 列 表 CN 103031322 A 11 5/12 页 12 0006 序 列 表 CN 103031322 A 12 6/12 页 13 0007 序 列 表 CN 103031322 A 13 7/12 页 14 0008 序 列 表 CN 103031322 A 14 8/12 页 15 0009 序 列 表 CN 1。
32、03031322 A 15 9/12 页 16 0010 序 列 表 CN 103031322 A 16 10/12 页 17 0011 序 列 表 CN 103031322 A 17 11/12 页 18 0012 序 列 表 CN 103031322 A 18 12/12 页 19 序 列 表 CN 103031322 A 19 1/3 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103031322 A 20 2/3 页 21 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103031322 A 21 3/3 页 22 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103031322 A 22 。