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1、(10)申请公布号 CN 103038347 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103038347 A *CN103038347A* (21)申请号 201180036722.7 (22)申请日 2011.05.26 10-2010-0049691 2010.05.27 KR 10-2010-0062846 2010.06.30 KR 10-2011-0009529 2011.01.31 KR C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 蔚山大学校产学协力团 地址 韩国蔚山广域市 (72)。
2、发明人 金廷昱 (74)专利代理机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 11290 代理人 张淑珍 王维玉 (54) 发明名称 使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分 析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的 方法 (57) 摘要 本发明提供了对结核分枝杆菌和非结核分枝 杆菌进行检测的引物， 所述引物分别对结核分枝 杆菌特异性的 IS6110 基因和非结核分枝杆菌特 异性的 16S rRNA 基因具有特异性 ； 包含所述引 物的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测试剂 盒 ； 以及通过使用所述引物的双重实时聚合酶链 式反应和通过解链曲线分析检测结核分枝杆菌和 非结核分枝杆菌的方法。因为本。
3、发明不使用序列 特异性探针， 本发明可提供低成本地对结核分枝 杆菌和 / 或非结核分枝杆菌同时且更有效地进行 快速检测的临床诊断手段。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.01.25 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2011/003858 2011.05.26 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/149280 KO 2011.12.01 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 8 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 20 页 序列表 8 页 附图 5。
4、 页 1/2 页 2 1. 一种对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如 下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列的正向引物 ； 选自于由 SEQ ID NO:4-6 的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物 ； 以及 具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物。 2. 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:1 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的反向。
5、引物 ； 以 及 对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列的正向引物、 选自于由 SEQ ID NO:4-6 的核苷酸序列所组 成的组中的至少一个反向引物和具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物。 3. 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基 因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向 。
6、引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基 因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向 引物、 选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物 ； 将所扩增的 DNA 产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及 对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温度。 4. 一种对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如 下引物 ： 具有 SEQ ID NO:。
7、20 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列 的反向引物。 5. 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及 对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引 物。 6. 用于对结核分枝杆。
8、菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基 因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核苷酸序列的正 向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的 正向引物和具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物 ； 权 利 要 求 书 CN 103038347 A。
9、 2 2/2 页 3 将所扩增的 DNA 产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及 对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温度。 7. 一种对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如 下引物 ： 由具有 SEQ ID NO:38-40 的核苷酸序列的各引物组成的正向引物 ； 以及 具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 8. 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核。
10、苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及 对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 由具有 SEQ ID NO:38-40 的核苷酸序列的各引物组成的正向引物 ； 以及具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 9. 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基 因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 。
11、的核苷酸序列的正 向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序 列的各引物组成的正向引物以及具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物 ； 将所扩增的 DNA 产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及 对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温度。 权 利 要 求 书 CN 103038347 A 3 1/20 页 4 使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分析对结核分枝 杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法 。
12、技术领域 0001 本发明涉及结核分枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis）和非结核分枝杆菌 （nontuberculous mycobacteria） 的检测。 更具体而言， 本发明涉及能够对结核分枝杆菌和 非结核分枝杆菌的特异性核苷酸序列进行检测的引物组、 包含所述引物组的用于对结核分 枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒、 以及使用所述引物组通过双重实时 PCR 和解 链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌同时进行检测的方法。 背景技术 0002 非结核分枝杆菌广泛分布于环境中， 尤其是分布于湿土、 沼泽地和河流中， 并且在 发现其机会致病特征 （opport。
13、unistic character） 前认为其是非致病菌。在 20 世纪 80 年 代， 发现非结核分枝杆菌为获得性免疫缺陷综合征 （AIDS） 患者中的肺病的机会致病菌。另 外， 还已知所述细菌导致其他患者中的疾病。 随着对非结核分枝杆菌致病机制的报道， 已逐 渐认识到其临床意义。 0003 近年来， 在结核病患病率低的美国和许多欧洲国家可见由非结核分枝杆菌引起的 感染发病率的增高。韩国在结核病患病率方面已有所降低， 但是在非结核分枝杆菌感染数 方面相对增高。多亏韩国于 2009 年对进行结核病菌液体培养给予医疗保险的政策， 设计用 来进行液体培养的实验室数目增多。比起固体培养， 更常用液体。
14、培养来对非结核分枝杆菌 进行检测。报道显示， 当通过液体培养进行测定时， 在约 12% 的痰涂片阳性结核病病例中检 测到了非结核分枝杆菌， 而分离自痰中的非结核分枝杆菌占日本、 香港和韩国的肺病病例 的约 10 20%， 占美国、 加拿大和西欧的肺病病例的约 40 50%。 0004 由非结核分枝杆菌引起的肺病类似于结核病， 发展缓慢， 容易被误诊。然而， 由于 有效抑制结核分枝杆菌的药物不同于有效抑制非结核分枝杆菌的药物， 因此需要快速且准 确地分辨结核杆菌 （tubercle bacilli） 和非结核分枝杆菌， 以便可以选择合适的药物。 0005 当前所使用的检测试剂并不仅是非结核分枝杆。
15、菌所固有的， 而且还利用了结核分 枝杆菌的核苷酸序列。 传统试剂在检测和诊断的准确度方面有问题。 例如， 当仅存在一定浓 度的结核分枝杆菌时， 所述试剂不对用于检测结核分枝杆菌的引物起反应， 而是仅对用于 非结核分枝杆菌的引物起反应， 以致错误地将非结核分枝杆菌鉴定为结核杆菌。 另一方面， 当非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌同时存在时， 只有非结核分枝杆菌可通过传统试剂加以 检测。 因此， 需要能够识别在结核分枝杆菌中缺失、 但在非结核分枝杆菌中固有的核苷酸序 列的引物组， 以及使用所述引物组快速且准确地分别对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的方法。 发明内容 0006 技术问题 0007 。
16、本发明的目的是提供对结核分枝杆菌所独有的 IS6110 基因具有特异性的引物 说 明 书 CN 103038347 A 4 2/20 页 5 组， 以及对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 二者分别适用于对结核 分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。 0008 本发明的另一目的是提供用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试 剂盒， 所述试剂盒包含对结核分枝杆菌所独有的 IS6110 基因具有特异性的引物组以及对 非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组， 二者分别适用于对结核分枝杆菌和 非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。 0009 本发明的另。
17、一目的是提供用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测 和诊断的方法， 所述方法使用基于所述引物组的双重实时聚合酶链式反应及解链曲线。 0010 技术方案 0011 根据本发明的一个方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特 异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列的正向引物 ； 选 自于由 SEQ ID NO:4-6 的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物 ； 以及具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物。 0012 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的试剂盒。
18、， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列的正向引物、 选自于由 SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列 的反向引物。 0013 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的方法，。
19、 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时 PCR 使用如下引物组 对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:1 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的反向引 物） 和对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、 选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的 至少一个反向引物和具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物） ； 将所扩增的 DNA 产物。
20、加 热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温 度。 0014 根据本发明的另一方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特 异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的正向引物和 具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0015 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的。
21、核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引 物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0016 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 说 明 书 CN 103038347 A 5 3/20 页 6 行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时 PCR 使用如下引物组 对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基。
22、因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引 物） 和对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物） ； 将所 扩增的 DNA 产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及对所述解链曲线进行分析， 以确定 目标 DNA 的解链温度。 0017 根据本发明的又一方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特 异性的引物组， 所述引物组。
23、包含如下引物 ： 由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物 组成的正向引物 ； 以及具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0018 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引 物组， 所述引物组包含如下引物 ： 由具有SEQ ID 。
24、NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正 向引物以及具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0019 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时 PCR 使用如下引物组 对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引 物） 和对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 由具有 S。
25、EQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列 的反向引物） ； 将所扩增的DNA产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及对所述解链曲线 进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温度。 0020 有益效果 0021 如上所述， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的引物 组 （所述引物组能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列） 、 使用所述引 物组对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的检测试剂盒和基于双重实时 PCR 的方 法。因为不采用特异性探针， 本发明的方法可成为用于低成本地对结核分枝杆菌和。
26、非结核 分枝杆菌同时进行检测的更高效的临床诊断手段。 附图说明 0022 图 1 为根据实施例 1 针对 MTC 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 0023 图 2 为根据实施例 1 针对 NTM 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 0024 图3为根据实施例1针对MTC+NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。 0025 图 4 为根据实施例 2 针对 MTC 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 0026 图 5 为根据实施例 2 针对 NTM 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 0027 图6为根据实施例2针对MTC+NT。
27、M进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。 0028 图 7 为根据实施例 3 针对 MTC 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 说 明 书 CN 103038347 A 6 4/20 页 7 0029 图 8 为根据实施例 3 针对 NTM 进行双重实时 PCR 而获得的扩增子的解链曲线。 0030 图9为根据实施例3针对MTC+NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。 具体实施方式 0031 根据本发明的一个方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有 特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列。
28、的正向引物、 选自于由 SEQ ID NO:4-6 的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物。 0032 SEQ ID NO3 的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的 16S rRNA 的特异性正向引物。 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列 （5 -ggyrayctgccctgcac-3 ）是指包含如下引物的引物组 ： 5 -ggtaatctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:8） 、 5 -ggtaacctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:9） 、 5 -ggcaatctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:10。
29、） 、 5 -ggcaacctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:11） 、 5 -ggtgatctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:12） 、 5 -ggtgacctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:13） 、 5 -ggcgatctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:14） 和 5 -ggcgacctgccctgcac-3 （SEQ ID NO:15） 。例如， 所述引物组可为将如下引物以约 1:1:1:1:1:1:1:1 的比例混合的引物组 ： 5 -ggtaatctgccctgcac-3 、 5 -ggtaacctgccctgcac-3 、 。
30、5 -ggcaatctgccctgcac-3 、 5 -ggcaacctgccctgcac-3 、 5 -ggtgatctgccctgcac-3 、 5 -ggtgacctgccctgcac-3 、 5 -ggcgatctgccctgcac-3 和 5 -ggcgacctgccctgcac-3 。 0033 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 的核苷酸序列 （NTM-1） 均为 16S rRNA 的特异性反向引物。SEQ ID NO:7 的核苷酸序列 （NTM-2） 也是非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因的特异性反向引物。 非结核分枝杆菌16S 。
31、rRNA基因的所有所述反向引物均被设计来检 测所有的目标非结核分枝杆菌种。SEQ ID NO:7（5 -catcccacaccgctaccw-3 ） 的反向引 物是指包含 5 -catcccacaccgctacct-3 （SEQ ID NO:16） 和 5 -catcccacaccgctacca-3 （SEQ ID NO:17）的引物组。例如， SEQ ID NO:7 的核苷酸序列可为以约 1:1 的比例将 5 -catcccacaccgctacct-3 和 5 -catcccacaccgctacca-3 进行混合的引物组。 0034 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非。
32、结核分枝杆菌进 行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的核苷酸序列的正向引物、 选自于由 SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列 的反向引物。 0035 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对结。
33、核分枝杆菌 的 IS6110 具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 分别具有 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的正向引物和反向引物。IS6110 基因的所述特异性引物组被设计来 检测各种目标分枝杆菌种 （结核分枝杆菌复合群， MTC） 。 0036 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对非结核分枝杆 菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3 的 核苷酸序列的正向引物、 选自于由 SEQ ID NO:4-6 的核苷酸序列 （NTM-1） 所组成的组中的 说 明 书 CN。
34、 103038347 A 7 5/20 页 8 至少一个反向引物和具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列 （NTM-2） 的反向引物。非结核分枝杆 菌 16S rRNA 基因的所述反向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌种。 0037 在一个实施方式中， 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒 可以 1:1 的比例包含具有 SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物， 后者 以 1:1 的比例包含 SEQ ID NO:16 和 SEQ ID NO:17。因此， 在试剂盒中， SEQ ID NO:4 的引 物、 5 -catcccacaccgct。
35、acct-3 （SEQ ID NO:16） 和 5 -catcccacaccgctacca-3 （SEQ ID NO:17） 可按 2:1:1 的比例进行混合。 0038 在本发明的另一实施方式中， 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的 试剂盒可以 1:1 的比例包含具有 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物， 后者以 1:1 的比例包含 SEQ ID NO:16 和 SEQ ID NO:17。 0039 在本发明的另一实施方式中， 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的 试剂盒可以 1:1 的比例包含具有 SEQ ID NO:6 和 SEQ。
36、 ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物， 后者以 1:1 的比例包含 SEQ ID NO:16 和 SEQ ID NO:17。 0040 检测试剂盒可进一步包含通过 PCR 扩增 DNA 所必需的试剂。这一试剂可包括 DNA 聚合酶、 dNTPs、 PCR缓冲液等。 为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂 盒中， 引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测， 并可被设计使得 能够产生在解链温度方面差异很大的 PCR 产物。因为 PCR 产物的解链曲线因多种因素 （包 括 DNA 大小和 GC 比） 而异， 可在引物组的设计中兼顾这些因素。 0041 根据本发明的一。
37、个实施方式， 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的 试剂盒可进一步包含荧光染料， 如 SYTO9、 EvaGreen 或 LCGreen， 但不包含 SYBR Green， 因 为当以高浓度使用这种荧光染料时， 它不仅抑制聚合酶链式反应， 还在产物解链的过程中 重新分布， 对高分辨率解链曲线产生负面影响， 所述高分辨率解链曲线可以帮助确定基因 型。即， 用于 PCR 和解链曲线分析的反应混合物可包含荧光染料， 如 SYTO9、 EvaGreen 或 LCGreen。例如， PCR 和解链曲线分析可使用含有 EvaGreen 的反应混合物。在一个实施方式 中， 借助 Type-it HR。
38、M PCR 试剂盒 （QIAGEN Inc.， Germantown， MD， USA） 完成实时 PCR。这 一试剂盒含有 EvaGreen。 0042 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时 PCR 使用如下引物组 对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:1 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:2 的核苷酸序列的反向引 物） 和对非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因具有特异性的引。
39、物组 （包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、 选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的 至少一个反向引物和具有 SEQ ID NO:7 的核苷酸序列的反向引物） ； 将所扩增的 DNA 产物加 热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温 度。 0043 在本发明的一个实施方式中， 可通过测量 510nm 处的吸光度进行解链曲线的分 析。 0044 根据本发明的另一方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的 16SrRNA 基因具有特 异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ I。
40、D NO:20 的核苷酸序列的正向引物和 说 明 书 CN 103038347 A 8 6/20 页 9 具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0045 SEQ ID NO20 的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的 16S rRNA 的特异性正向引物。 非结核分枝杆菌的 16S rRNA 基因的所述正向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌 种。SEQ ID NO:20 的核苷酸序列是指包含比例为约 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 的如下引物的引物组 ： 5 -catgtcttgtgggggaaagctt-3 （SEQ ID NO:22） 、 5 。
41、-catgttttgtgggggaaagctt-3 （SEQ ID NO:23） 、 5 -catgtcttctgggggaaagctt-3 （SEQ ID NO:24） 、 5-catgtcttgtggtggaaagctt-3 （SEQ ID NO:25） 、 5 -catgtcttgtggggcaaagctt-3 （SEQ ID NO:26） 、 5 -catgttttctgggggaaagctt-3 （SEQ ID NO:27） 、 5-catgtcttctggtggaaagctt-3 （SEQ ID NO:28） 、 5 -catgtcttgtggtgcaaagctt-3 （SEQ I。
42、D NO:29） 、 5 -catgttttgtggggcaaagctt-3 （SEQ ID NO:30） 、 5-catgtcttctggggcaaagctt-3 （SEQ ID NO:31） 、 5 -catgttttgtggtggaaagctt-3 （SEQ ID NO:32） 、 5 -catgttttctggtggaaagctt-3 （SEQ ID NO:33） 、 5-catgttttctggggcaaagctt-3 （SEQ ID NO:34） 、 5 -catgttttgtggtgcaaagctt-3 （SEQ ID NO:35） 、 5 -catgtcttctggtgcaaa。
43、gctt-3 （SEQ ID NO:36） 和 5 -catgttttctggtgcaaagctt-3 （SEQ ID NO:37） 。 0046 SEQ ID NO:21的核苷酸序列用作非结核分枝杆菌的16S rRNA的特异性反向引物。 0047 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的试剂盒， 所述试剂盒包含 ： 对结核分枝杆菌的 IS6110 基因具有特异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物 ； 以及对非结核分枝杆菌的 16S rR。
44、NA 基因具有特异性的引 物组， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0048 在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中， 结核分枝杆菌 的 IS6110 基因的特异性引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种 （结核分枝杆菌复合群， MTC） ， 所述引物组包含如下引物 ： 具有 SEQ ID NO:18 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ ID NO:19 的核苷酸序列的反向引物。 0049 在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中， 非结核分枝杆菌 的16S 。
45、rRNA基因的特异性引物组被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌， 所述引物组包含 如下引物 ： 分别具有SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的核苷酸序列的正向引物和反向引物。 0050 检测试剂盒可进一步包含通过 PCR 扩增 DNA 所必需的试剂。这一试剂可包括 DNA 聚合酶、 dNTPs、 PCR缓冲液等。 为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂 盒中， 引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测， 并可被设计使得 能够产生在解链温度方面差异很大的 PCR 产物。因为 PCR 产物的解链曲线因多种因素 （包 括 DNA 大小和 GC 比） 而异， 。
46、可在引物组的设计中兼顾这些因素。 0051 根据本发明的一个实施方式， 用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的 试剂盒可进一步包含荧光染料， 如 SYTO9、 EvaGreen 或 LCGreen， 但不包含 SYBR Green， 因 为当以高浓度使用这种荧光染料时， 它不仅抑制聚合酶链式反应， 还在产物解链的过程中 重新分布， 对高分辨率解链曲线产生负面影响， 所述高分辨率解链曲线可以帮助确定基因 型。即， 用于 PCR 和解链曲线分析的反应混合物可包含荧光染料， 如 SYTO9、 EvaGreen 或 说 明 书 CN 103038347 A 9 7/20 页 10 LCGreen。
47、。例如， PCR 和解链曲线分析可使用含有 EvaGreen 的反应混合物。在一个实施方式 中， 借助 Type-it HRM PCR 试剂盒 （QIAGEN Inc.， Germantown， MD， USA） 完成实时 PCR。这 一试剂盒含有 EvaGreen。 0052 根据本发明的又一方面， 本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进 行检测的方法， 所述方法包含 ： 由测试对象中分离 DNA ； 通过双重实时 PCR 使用如下引物组 对所述DNA进行扩增 ： 对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向。
48、引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引 物） 和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组 （包含如下引物 ： 具有SEQ ID NO:20 的核苷酸序列的正向引物和具有 SEQ IDNO:21 的核苷酸序列的反向引物） ； 将所扩增 的 DNA 产物加热至不同温度， 以产生解链曲线 ； 以及对所述解链曲线进行分析， 以确定目标 DNA 的解链温度。 0053 根据本发明的又一方面， 本发明提供了对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特 异性的引物组， 所述引物组包含如下引物 ： 由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物 组成的正向引物 ； 以。
49、及具有 SEQ ID NO:21 的核苷酸序列的反向引物。 0054 SEQ ID NO:38（NTM-1） 、 SEQ ID NO:39（NTM-2） 和 SEQ ID NO:40（NTM-3） 的核 苷酸序列均为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物。 非结核分枝杆菌的16S rRNA 的所述特异性正向引物被设计来检测各种非结核分枝杆菌。 0055 所述正向引物可形成以约 1:1 的比例将 5 -tgtggtggaaagcttttgc-3 （SEQ ID NO:41） 和 5 -tttggtggaaagcttttgc-3 （SEQ ID NO:42） 混合的引物组。 0056 或者， 所述正向引物可形成包含比例为约 1:1 的 5 -ggtgagtggtgcaaagctt-3 （SEQ ID NO:43） 和 5 -ggtgtgtggtgcaaagctt-3 （S。